PENDAHULUAN

DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA

ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. DNA
kromosom memiliki ukuran yang besar (>0,5 Mb) dibandingkan dengan DNA
plasmid (± 2 kb). Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA
di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid
banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam
penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak
berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Ukuran plasmid bervariasi antara 1 kb sampai 200 kb. Dalam penelitian rekayasa
genetika, plasmid digunakan sebagai kendaraan molekuler untuk memasukkan
gen dari luar ke dalam sel inang (Palomares et al. 2004; Yadav et al. 2011).
Plasmid mempunyai 3 komponen penting yaitu: 1) Origin of replication (ORI),
sehingga plasmid dapat bereplikasi secara mandiri, 2) mempunyai daerah unik
sebagai situs pemotongan enzim endonuclease, yang biasa disebut multiple
cloning site (MCS), 3) membawa penanda seleksi (biasanya resistensi terhadap
antibiotika) untuk membedakan antara sel inang yang mengandung plasmid atau
tidak. Klasifikasi plasmid berdasarkan karakteristik gen yang dikodenya. Terdapat
5 jenis plasmid (Brown 2010), yaitu: 1) plasmid fertilitas atau F, membawa gen
tra sehingga plasmid dapat berpindah secara konyugasi, contoh plasmid F pada E.
coli, 2) plasmid resisten atau R, membawa gen resistensi terhadap antibiotika,
contoh: resistensi terhadap kloramfenikol, ampisilin, dan zeocin, 3) Plasmid Col
mempunyai gen pengkode protein kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri
lain, contoh ColE1 pada E. coli, 4) plasmid degradatif memungkinkan sel inang
memetabolisme senyawa yang tidak umum (toluene dan asam salisilat), contoh:
Tol pada Pseudomonas putida, 5) plasmid virulensi, memungkinkan sel inang
dapat menginfeksi organisme lain. Contoh plasmid Ti pada Agrobacterium
tumefaciens sehingga dapat menginfeksi tanaman dikotiledon.

Sejak ditemukan plasmid, telah banyak metode dikembangkan untuk mengisolasi

plasmid. Metode isolasi plasmid yang tepat sangat penting untuk mendapatkan
plasmid dengan konsentrasi dan kemurnian yang tinggi. Beberapa metode isolasi
plasmid antara lain: lisis alkali, lisis dengan pemanasan, menggunakan bahan
kimia sesium klorida, metode dengan menggunakan microwave (Dederich et al.
2002), dan metode kromatograpi (Birnboim dan Doli 1979).

Metode isolasi plasmid perlu dilakukan karena merupakan dasar untuk dijadikan
sebagai vektor pada proses kloning, produksi protein, terapi gen dll. Metode
isolasi plasmid sangat berpengaruh terhadap kualitas hasil isolasi DNA. Dengan
demikian perlu adanya metode yang tepat sehingga perlu adanya penelitian untuk
mengetahui metode isolasi serta analisis kualitas DNA hasil isolasi plasmid
tersebut. Dengan harapan akan mendapatkan hasil yang maksimal dan dapat
dijadikan sebagai bahan untuk penelitian bidang terkait.
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi plasmid rekombinan pGEM dari
bakteri Escherichia coli

METODE

Waktu danTempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 20 agustus 2019

sampai dengan hari Kamis tanggal 29 Agustus 2019 berlokasi di laboratorium
bioteknologi, Gedung PAU, Jurusan Bioteknologi Fakultas Multidisiplin Institut
Pertanian Bogor.

Bahan

Bahan yang dibutuhkan pada praktikum antara lain isolate batkteri

Eschericia coli gen Gol, kit isolasi plasmid (sol 1, sol 2, dan sol 3), es pendingin,
ETOH, RNAse, Gel Agarose 1%, EtBr (EtidiumBromida), Buffer TAE, ddH2O,
aquades dan larutan P:C:I (phenol, Kloroform, danisoamilalkohol).

Alat

Alat yang digunakan pada praktikum yakni mikropipet, mikrotube,

sentrifuge, freezer, Vacum dry, spektrofotometer, elektroforesis.

ProsedurKerja

Isolasi DNA Plasmid

Sebanyak 1,5 ml kultur bakteri Eschericia coli gen Gα disentrifugasi selama

5 menit pada kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 200C. Pelet hasil sentrifuge
ditambahkan dan diresuspensi dengan larutan SOL 1 sebanyak 100 µl pada
vortex. Larutan yang sudah divortex ditambahkan dengan 200 µl SOL 2,
dihomogenkan dengan cara bolak-balik dan didiamkan selama 5 menit. Sebanyak
150 µl larutan SOL 3 ditambahkan pada larutan sebelumnya dan dilakukan
inkubasi pada es selama 10 menit. Setelah 10 menit dilanjutkan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit padasuhu 200C. Hasil
dari sentrifugasi diambil fase cair berupa supernathan dan dipindahkan pada tube
baru. Volume supernathan diukur untuk mengetahui jumlah P:C:1 perbandingan
antara volume supernathan dan P:C:I ialah 1:1. Campuran larutan tersebut
disentrifugasi dengan menggunakan kecepatan sebesar 10000 rpm, pada suhu 40 C
selama 10 menit. Fase atas diambil kembali dari hasil sentrifuge dan diresuspensi
dengan ETOH 70% sebanyak 1000 µl, dihomogenkan dengan cara dibolak-balik
dan didiamkan selama semalam sebagai tahap overnight. Setelah tahap overnight
dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 25
menit, dari hasil sentrifuge supernathan dibuang dan disisakan pellet DNA. DNA
berupa pellet dicuci kembali dengan menggunakan larutan ETOH 70% sebanyak
500µl dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 5
menit. ETOH yang menjadi larutan pencuci dibuang dan disisakan pellet DNA
sebagai hasil dari proses isolasi. Pelet DNA dioven agar ETOH yang masih tersisa
pada pellet menguap sehingga pellet DNA bersih dari ETOH 70%. Pelet yang
telah bersih dari ETOH diresuspensi dengan larutan ddH2O sebanyak 15 µl .

Uji Kualitatif

Pembuatan Gel Agarose

Gel agarose dibuat dengan melarutkan sebanyak 0,35 gram agarose bubuk
kedalam 35 ml buffer TAE. Proses melarutkan agarose dilakukan dengan
menggunakan suhu panas menggunakan microvawe hingga mendidih. Gel agarose
yang telah mendidih didinginkan pada suhu ruang. Gel dituang kedalam cetakan
yang sudah terdapat sisir (comb ) dan ditunggukan sampai gel benar benar
mengeras sehingga dapat dimasukan ke dalam chamber elektroforesis.

Elektroforesis DNA

DNA hasil isolasi dielektroforesis pada gel agarose dengan konsentrasi 1%

(b/v). Praktikum ini menggunakan 2 marker berukuran 1kb dengan konsentrasi
masing masing 1 µl dan 3 µl. Sampel DNA yang dirunning sebanyak 5µl dengan
loading dye sebanyak 2 µl pencampuran antara sampel DNA dengan loading dye
dilakukan diatas kertas parafilm. Proses running pada gel elektroforesis dilakukan
selama 28 menit dengan voltase 100 volt menggunakan fase gerak berupa buffer
TAE. Hasil elektroforesis berupa gel agarose direndam menggunakan pewarna
DNA berupa larutan EtBr (EtidhiumBromida) selama 10 menit dan
divisualisasikan dalam Gel Documentation. Pita DNA yang tergambar menjadi
indikasi berhasil atau tidaknya proses isolasi dna plasmid.

Uji Kualitatif Spektrofotometer

Metode spektrofotometer digunakan untuk mengukur kuantitas DNA yang

berhasil diisolasi. Uji ini dilakukan pada dua panjang gelombang λ260 nm dan λ
280 nm dengan larutan blanko berupa aquades sebanyak 700 µl dan sampel
sebanyak 3µl DNA dengan pelarut sebanyak 697 µl . Daya absorbansi pada
masing-masing gelombang dicatat pada buku pengamatan dan dimasukan dalam
rumus perhitungan kemunrnian dan konsentrasi DNA dibawah ini :
 Kemurnian DNA :Absorbansi DNA λ 260
Absorbansi DNA λ 280

Jumlah Volume Total

Konsentrasi DNA : ×50× Absorbansi λ 260
3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Pada praktikum kali
ini kami melakukan isolasi DNA plasmid bakteri Escherichia coli. Plasmid
merupakan materi gen yang memiliki kemampuan untuk melakukan replikasi
secara otonom. Pada teknologi DNA rekombinan, plasmid digunakan sebagai
vektor untuk menyisipkan DNA yang siklon sehingga perlu diperoleh plasmid
yang tidak terkontaminasi dengan kromosom.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel

sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal
serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus
dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.
Metode yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis,
lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion
(Lodish , 2000).

Langkah pertama yang dilakukan adalah mengambil pellet yang telah

dipersiapkan oleh asisten dengan menggunakan mikropipet dan memasukkannya
ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml. Kemudian ditambahkan larutan I 100 µL yang
berisi EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM, dan sukrosa 15%. untuk mensuspensi
pelet sampai larut dengan cara divortex. Di sini penmabahan larutan A akan
membuat berat molekul sel menjadi lebih besar sehingga nantinya akan terendap
sebagai pellet setelah disentrifuge. EDTA 10 mM yang berfungsi sebagai perusak
sel dengan cara mengkelat ion magnesium. Tris-HCL berperan sebagai buffer
untuk menjaga pH DNA berada dalam keadaan optimum. Sedangkan sukrosa
15% berfungsi memecah dinding sel bakteri (Ausubel et al. 1994). Kemudian
larutan dihomogenkan dengan dislentik-slentik dilanjutkan dengan inkubasi dalam
penangas es selama 5 menit. Larutan II dimasukkan setelah inkubasi
dihomogenkan kembali dengan membolak-balik tabung eppendrorf dalam
penangas es. Setelah optimalisasi reaksi pada suhu dingin, maka ditambahkan
larutan untuk mengendapkan dinding sel. Larutan tersebut adalah SOL 2 yang
terdiri dari NaOH dan sodium dodesil sulfate (SDS). Penambahan NaOH akan
menyebabkan pH menjadi 12.0 - 12.5 sehingga ikatan hidrogen pada molekul
DNA tidak berlilitan akan pecah dan menyebabkan heliks ganda terurai dan rantai
polinukleotida memisah. Penambahan Na-asetat yang bersifat asam menyebabkan
DNA bakteri yang terdenaturasi akan mengelompok kembali menjadi benang
kusut sehingga dengan proses sentrifugasi dapat terpisah (Brown 2003).
Penambahan larutan II ini bertujuan untuk melisiskan dinding sel bakteri di mana
SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein
serta NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai
menghidrolisis RNA. Sehingga DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya
setelah terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini kemungkinan
besar adalah DNA plasmid.
Inkubasi dilakukan kembali selama 15 menit, selanjutnya ditambahkan
larutan III dan di inkubasi selama 15 menit. Penambahan kalium asetat akan
menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena
molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam
tinggi serta pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan
mudah terbuang. Penambahan juga berfungsi untuk menetralkan pH sehingga
DNA plasmid tidak rusak. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan
kecepatan 12.000 rpm sehingga terbentuk pelet dan supernatan. Prinsip-prinsip
dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan
berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya
sentrifugal menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan
terendap di dasar tabung yang biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul
yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan berada pada lapisan yang atas yang
biasa disebut dengan supernatan. Setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 12.000
rpm, dilakukan penambahan larutan netralisasi IV ini dihindari penggunaaan
vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA
kromosomal yang mungkin masih ada akan menjadi lebih kecil sehingga akan
terlarut pada supernatan yang berisi DNA plasmid. Jadi, pada akhir tahap isolasi
ini bagian yang diambil adalah supernatan yang mengandung DNA plasmid dan
membuang pellet yang mengandung debris molekuler. Supernatan diambil
sebanyak 300µL dengan perbandingan 1:1 untuk penambahan larutan IV.
Selanjutnya dikocok bolak-balik hanya beberapa detik saja dan dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Dihasilkan supernatan
dan pelet.
Pada bagian ini yang akan dilanjutkan untuk dilakukan percobaan adalah
supernatan ( fasa cair yang diambil pada bagian atas ), ditambahkan etanol
absolute dengan perbandingan 2:1 dengan supernatan yang dihasilkan 0,3 mL dan
etanol absolute yang digunakan yaitu 0,6 mL. Inkubasi kembali dalam penangas
es selama 1 jam kemudian di sentrifugasi kembali. Penambahan ethanol absolut
berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas. Ethanol yang
ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap.
Prinsip pengendapan dengan menggunakan ethanol absolut dingin yaitu : Saat
penambahan garam yaitu Sod Asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge
pada gula fosfat DNA, maka ion-ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai
+
DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion
(Na+) dan -
(DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan
dengan air atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.
Sehingga penambahan pelarut organik seperti ethanol dapat menurunkan
konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+
sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Hasil yang diperoleh adalah
pelet yang mengandung DNA plasmid dan supernatan yang mengandung larutan
NaOAc dan ethanol absolut. Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah bagian
pellet dan yang dibuang adalah bagian supernatan.
Tahap terakhir adalah tahap pembilasan DNA plasmid yang diperoleh
dengan cara pelet yang didapat ditambahkan ethanol 70 % . Tujuannya yaitu
untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan
plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni. Kemudian
membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering
selama ± 5 menit. Setelah itu, menambahkan ±30 µL ddH2O pada DNA plasmid.
Langkah terakhir, memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan
memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam
freezer.
 Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan
suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit
mengandung sulfat. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul
DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Gel agarose sendiri
berfungsi untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 100bp (sebagai
penyaring). Konsentrasi agarose mempengaruhi hasil elektroforesis, karena
semakin tinggi konsentrasi maka ruang antar molekul pada gel agarose lebih kecil
sehingga mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya.
Setiap larutan baik pada proses isolasi plasmid maupun running, memiliki
fungsi masing-masing. Loading dye juga berguna sebagai penambah densitas
DNA, pewarna dan tanda migarsi DNA. Sedangkan ETBR berfungsi untuk
mengikat molekul DNA dan dapat menangkap sinar UV. Secara umum hasil
pengamatan isolasi DNA plasmid dengan elektroforesis berhasil, dilihat dari
pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis. Berdasarkan dari hasil
pengamatan, foto kelompok kami menunjukkan adanya pendaran pita yang cukup
jelas dan sama dengan kelompok yang lain. Hal ini menunjukkan keberhasilan
percobaan isolasi DNA yang telah kami lakukan. Hasil pengamatan hanya bisa
melihat keberadaan pita DNA, tidak bisa mengukur panjang dan ukuran DNA.

Gambar 4.2.1 Hasil elektroforesis sinar UV isolasi DNA

Langkah pertama dalam proses isolasi DNA plasmid setelah disentrifugasi dan
mendapatkan pellet adalah perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri
yang dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku
leleh maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis (Brown, 2003).
Pada praktikum kali ini isolasi DNA plasmid menggunakan metode kimiawi yakni
penambahan bahan-bahan mekanik seperti EDTA, buffer TE, etanol,
PCI(Phenol/chloroform/isoamilalkohol, potasium asetat. Pada praktikum ini,
perusakan dinding sel dilakukan dengan pemberian larutan lisis dan SDS pada
kultur bakteri. Larutan lisis atau SOL 1 yang digunakan mengandung EDTA 10
mM, Tris HCl 25 mM, dan sukrosa 15%. EDTA 10 mM yang berfungsi sebagai
perusak sel dengan cara mengkelat ion magnesium. Tris-HCL berperan sebagai
buffer untuk menjaga pH DNA berada dalam keadaan optimum. Sedangkan
sukrosa 15% berfungsi memecah dingding sel bakteri (Ausubel et al. 1994).
Setelah optimalisasi reaksi pada suhu dingin, maka ditambahkan larutan untuk
mengendapkan dinding sel. Larutan tersebut adalah SOL 2 yang terdiri dari NaOH
dan sodium dodesil sulfate (SDS). Penambahan NaOH akan menyebabkan pH
menjadi 12.0 - 12.5 sehingga ikatan hidrogen pada molekul DNA tidak berlilitan
akan pecah dan menyebabkan heliks ganda terurai dan rantai polinukleotida
memisah. Penambahan Na-asetat yang bersifat asam menyebabkan DNA bakteri
yang terdenaturasi akan mengelompok kembali menjadi benang kusut sehingga
dengan proses sentrifugasi dapat terpisah (Brown 2003). Plasmid yang diperoleh
masih belum murni sehingga perlu dilakukan pemurnian dari berbagai
kontaminan. Setelah penambahan fenol, kecepatan sentrifugasi ditingkatkan agar
kontaminan protein yang terdapat dalam ampel dapat dihilangkan. Kecepatan
yang semakin tinggi diperlukan untuk mengendapkan asam nukleat karena
densitas DNA yang lebih tinggi yakni sekitar 1.7 g cm dibanding protein dan
molekul lain yang densitasnya berkisar kurang dari 1 g cm (Albert et al 2004).
Saat sentrifugasi, dilakukan penmbahan etanol absolut agar proses presisipitasi
DNA menjadi lebih sempurna. Berbagai penambahan pelarut dilakukan sebagai
upaya dalam pemurnian plasmid. Menurut Ausubel et al . (1994) bahwa
penambahan etanol 70% akan menghilangkan berbagai pelarut yang telah
ditambahkan selama tahapan pemurnian sehingga diharapkan yang tersisa
hanyalah DNA plasmid (Ausubel
et al
. 1994).

Berbagai macam bentuk plasmid itu akan mempengaruhi kecepatan

migrasi plasmid dalam elektroforesis. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid
tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated,
relaxed circular, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil
atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan
mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari
plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk
kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan
jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama
pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya
marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki
copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu.
Karena plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka
ada banyak cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid
yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini
preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah
yang lebih besar (100-200µg) digunakan midi preparation dan maxi preparation
untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.
Birnboim HC, Doli J (1979) A rapid alkaline
extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic
Acids Res 7:1513-1523

Brown TA (2010) Gene Cloning and DNA

Analysis: An Introduction, ed. Ke-6.
Graphicraft Limited. Hongkong.13-17

Yadav P, Yadav A, Garg V, Datta TK, Goswami

SL, De S (2011) A novel method of
plasmid isolation using laundry detergent.
Indi J Exp Biol 49:558-560

Palomares LA, Mondaca ST, Ramirez OT

(2004) Production of recombinant
proteins: challenges and solutions. In:
Methods in Molecular Biology: Recombinant

Gene Expression Reviews and

Protocols, vol 267. Balbas P & A Lorence
(ed). Humana Press Inc., New Jersey

Ausubel FM
et al.
1990.
Current Protocols in Molecular Biology
. Kanada (US): John Willey & Sons. Brown TA. 2003.
Pengantar Kloning Gen
. Muhammad SA, penerjemah. Terjemahan dari:
Gene Cloning an Introduction
. Yogyakarta (ID): Yayasan Essentia Medika