Rinjani Ayundatika Putri 24030118140073 - Aktivitas Enzim Lipase
Rinjani Ayundatika Putri 24030118140073 - Aktivitas Enzim Lipase
Rinjani Ayundatika Putri 24030118140073 - Aktivitas Enzim Lipase
NIM : 24030118140073
REVIEW JURINT
ENZIMOLOGI
Purification and Characterization of Lipase by Bacillus methylotrophicus PS3 Under
Submerged Fermentation and its Application in Detergent Industry
(Sharma et al., 2017)
A. Pendahuluan
Lipase (triasilgliserol asilhidrolase) berfungsi sebagai katalis dalam hidrolisis
ikatan karboksil ester dalam triasilgliserol untuk menghasilkan diasilgliserol,
monoasilgliserol, asam lemak dan gliserol dalam kondisi berair dan sintesis ester
dalam pelarut organik (Kaur et al., 2016). Lipase yang berasal dari mikroba memiliki
kepentingan komersial yang cukup besar, karena fleksibilitas yang tinggi dan
stabilitas yang tinggi, selain itu Lipase yang berasal dari mikroba mudah diproduksi
dalam hasil yang tinggi (Shaini & Jayasree, 2016). Banyak lipase mikroba, contohnya
pada spesies bakteri (Bacillus, Pseudomonas, dan Burkholderia), ragi (Candida
rugosa, Yarrowia lipolytica, dan Candida antarctica) dan kapang (Aspergillus,
Trichoderma viride) menghasilkan lipase dengan sifat enzimologis dan spesifisitas
yang berbeda (Choo et al., 1998).
Lipase memiliki berbagai aplikasi industri seperti industri makanan
(peningkatan rasa), deterjen (hidrolisis minyak dan lemak) (Veerapagu et al., 2013),
farmasi (sintesis obat kiral), kertas (kontrol pitch), obat-obatan (trigliserida
pengukuran), kosmetik (pengecualian lipid), air limbah (penguraian dan penghilangan
minyak), kulit (penghilangan lemak dari kulit hewan) (Das et al., 2016). Alasan utama
meningkatnya minat pada lipase adalah karena sifatnya yang enantio-selektif, regio-
selektif dan chemo-selective (Francois N Niyonzima & More, 2015). Oleh karena itu
pada penelitian ini telah dilakukan upaya isolasi bakteri penghasil lipase yang
potensial,pemurnian dan karakterisasi serta aplikasinya sebagai deterjen.
B. Material dan Metode
1. Organisme dan persiapan inoculum
Sampel Tanah dikumpulkan dari daerah terdekat Solan, Himachal Pradesh,
India dan disimpan pada 4⁰C. Sampel tanah diperkaya dengan menambahkan 1%
tributirin ke dalam sampel, disimpan pada 37⁰C dan diinkubasi selama 3 hari.
Sampel diencerkan secara serial dengan sampel yang diperkaya pada media agar
nutrisi yang mengandung 1% tributirin, disimpan pada suhu 37⁰C dan di inkubasi
selama 24 jam. Kultur murni yang diperoleh dipertahankan pada suhu 4⁰C pada
media PDA. Strain bakteri yang berbeda disaring untuk produksi lipase
menggunakan uji hidrolisis Tributyrin untuk menyaring bakteri hiper-lipolitik
(Yamada et al., 1962).
Strain bakteri pembentuk zona selanjutnya disaring untuk analisis kuantitatif
lipase menggunakan metode titrimetri (Lawrence et al., 1967). DNA genom
diisolasi menggunakan DNA Kit DNA prep. Gen 16S rRNA secara selektif
diamplifikasi dari DNA genom menggunakan PCR dengan primer universal
oligonukleotida. Strain diidentifikasi berdasarkan urutan gen 16S rRNA
menggunakan perangkat lunak BLAST.
Bakteri penghasil lipase ditumbuhkan dalam media nutrien agar yang
mengandung media tributirin 1% sebagai sumber karbon dan pH dipertahankan
pada 7,0. Kultur diinkubasi pada suhu 40⁰C selama 72 jam dengan ukuran
inokulum 10% dengan ion divalen Ca2+, tween 80 sebagai surfaktan dengan
konsentrasi substrat 1%. Media kultur dihilangkan setelah 12, 24, 36, 48, 60 dan
72 jam untuk menentukan pola pertumbuhan dan aktivitas lipase. Pola
pertumbuhan strain bakteri diambil di O.D. pada 540 nm dengan
spektrofotometer.
2. Uji untuk aktivitas lipolitik
Aktivitas lipase ditentukan secara titrimetri berdasarkan hidrolisis minyak
zaitun. Satu ml supernatan kultur ditambahkan ke dalam campuran reaksi yang
mengandung 1 ml buffer TrisHCl 0,1 M (pH 8,0), 2,5 ml air deionisasi dan 3 ml
minyak zaitun dan diinkubasi pada 37⁰C selama 30 menit. Kedua tes (di mana
semua campuran reaksi ditambahkan dengan enzim) dan kosong (di mana semua
campuran reaksi ditambahkan tanpa enzim) dilakukan. Setelah 30 menit larutan
uji dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer 50 ml. Ditambahkan 3 ml etanol 95%
untuk menghentikan reaksi. Asam lemak yang dibebaskan dititrasi dengan NaOH
0,1 M menggunakan indikator fenolftalein. Titik akhir adalah munculnya warna
merah muda. Satu unit lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim, yang
melepaskan satu mikromol asam lemak per menit dalam kondisi pengujian
tertentu.
3. Pemurnian lipase
Kultur bakteri yang ditumbuhkan dalam medium nutrisi dan tributirin 1%
disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4⁰C dalam sentrifugal
berpendingin. Supernatan bebas sel dijenuhkan dengan (0-70%) amonium sulfat
dengan pengadukan terus menerus pada 4⁰C diikuti dengan sentrifugasi pada
14.000 rpm selama 20 menit. Fraksi amonium sulfat didialisis terhadap buffer
fosfat (pH 7,0) selama 6 jam pada 4⁰C dalam kantong dialisis. Enzim pekat
setelah dialisis dimuat ke kolom Sephadex G-100. Lipase dielusi dari kolom pada
laju alir 3 ml/menit. Fraksi enzim (masing-masing 5 ml) dikumpulkan dan
kandungan protein diukur secara spektrofotometri pada 280 nm. Uji lipase
dilakukan dengan menggunakan fraksi yang mengandung kadar protein tertinggi.
4. Karakterisasi Enzim Lipase
Pengaruh pH pada aktivitas dan stabilitas
Pengaruh pH pada aktivitas enzim ditentukan dengan menginkubasi
campuran reaksi pada berbagai pH mulai dari 4,0 hingga 11,0 pada 50 ±
2⁰C selama 30 menit. Buffer yang digunakan adalah buffer sitrat fosfat
(pH 4,0 hingga 7,0), buffer Tris HCl (pH 8,0) dan buffer glisin-NaOH (pH
9,0 hingga 11,0).
Suhu optimal dan stabilitas termal
Untuk mengevaluasi suhu optimal untuk aktivitas enzim, pengujian
dilakukan pada suhu yang bervariasi mulai dari 35 hingga 121⁰C. Lipase
diinkubasi pada suhu yang berbeda mulai dari 30, 40 . . .. .,121⁰C selama
0–180 menit.
Pengaruh ion logam
0,5 ml lipase murni dalam 2,5 ml 20 mM buffer Tris HCl (pH 8,0)
diinkubasi selama 30 menit dengan berbagai ion logam (1 mM) Ca2+,
Mg2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, dan Zn2+.
Stabilitas simpan lipase
Stabilitas simpan lipase ditentukan dengan menginkubasi enzim pada 4⁰C
dalam 20 mM buffer Tris HCl (pH 8,0). Aktivitas enzim ditentukan setiap
3 hari sampai 9 hari.
Efek aditif media
Untuk menentukan pengaruh aditif yang berbeda yaitu. SDS, EDTA,
CTAB, Tween 20, Tween 80, Triton X 100 dan Gliserol dll., lipase murni
dalam buffer fosfat 1 M (pH 7,0) diinkubasi selama 30 menit pada 50 ± 2
C.
5. Pemurnian lipase
Pemurnian lipase dilakukan untuk mendapatkan protein yang diinginkan dan
menghilangkan yang tidak perlu. Proses pemurnian lipase terjadi secara berurutan.
Enzim yang dihasilkan selama 48 jam kultur dimurnikan dengan pengendapan
amonium sulfat untuk salting out protein untuk meningkatkan aktivitas enzimatik;
desalting dilakukan untuk menghilangkan jejak garam. Sebuah lipase ekstraseluler
dari B. methylotrophicus PS3 dimurnikan dengan pengendapan amonium sulfat
dan kromatografi kolom Sephadex G-100 dengan hasil total 24,10% dan
pemurnian 2,90 kali lipat.
Ditentukan aktivitas enzim yang dipekatkan dan dikenai SDS-PAGE dengan
massa molekul lipase murni dari B. methylotrophicus PS3 adalah 31,40 kDa pada
elektroforesis gel SDS-poliakrilamida.
Bae (Razak et al., 2012) lipase murni dari Pichia lynferdii Y-7723 dengan 33
kali lipat pemurnian menggunakan teknik kromatografi dan lipase murni mewakili
aktivitas lipolitik maksimum. Tripati (Francois Niyongabo Niyonzima & More,
2015)lipase murni dari Microbacterium sp. dengan metode berurutan
pengendapan amonium sulfat dan kromatografi kolom gel Sephadex G-75.
Prosedur pemurnian ini menghasilkan pemurnian lipase 2,1 kali lipat dengan hasil
akhir 20,8%. Lipase yang dimurnikan menunjukkan aktivitas hidrolitik maksimal
pada suhu 50⁰C dan pH 7,0.
6. Karakterisasi Lipase yang Dimurnikan
Pengaruh suhu pada lipase
Aktivitas lipase diperiksa pada kisaran suhu 35-100 C, dengan aktivitas
maksimum pada 55⁰C seperti yang diamati pada Gambar 3 dengan
98,44% aktivitas relatif dan 752,97 IU/mg aktivitas spesifik. Lipase juga
aktif 55 – 80⁰C mempertahankan sejumlah kecil aktivitas dengan aktivitas
relatif di kisaran 52,5 %. Aktivitas enzim menurun hampir setengah pada
100⁰C sekitar 7,62% dari aktivitas relatif. Pada suhu tinggi terjadi
denaturasi protein enzimatik dan menurunkan aktivitas lipase. Aktivitas
relatif tetap hampir stabil dari 35 C hingga 55 C yaitu 93,82% hingga
98,44%.
Pengaruh pH
Enzim menjadi protein sensitif terhadap perubahan lingkungan di mana
mereka bekerja, yang mempengaruhi aktivitas enzim. pH optimum untuk
lipase dieksplorasi pada suhu konstan 50 C. Lipase murni dari B.
methylotrophicus PS3 paling stabil pada pH 7 dan aktivitas tetap stabil
dari pH 7 hingga 9. Aktivitas mulai menurun di atas 9 dan pada kisaran
asam yang lebih rendah dari pH, menunjukkan perilaku netral lipase
murni. Perubahan pH memiliki efek yang bervariasi pada aktivitas enzim,
seperti mengubah struktur enzim dan substrat dan menghambat katalisis
reaksi (Gbr. 4).