2

3
4
5
6
DAFTAR ASISTEN | 2

TATA TERTIB | 3

KARTU KONTROL | 5

DAFTAR ISI | 7

PRAKTIKUM 1 | 8

PRAKTIKUM 2 | 14

PRAKTIKUM 3 | 22

PRAKTIKUM 4 | 26

PRAKTIKUM 5 | 37

7
SAMPUL

8
 Digesti dan Dekontaminasi
Spesimen Sputum

Prinsip: Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri dengan pertumbuhan yang

lambat dan “susah” (tidak tumbuh sembarangan). Pengambilan mikrobakteri dari
spesimen klinis memerlukan pencairan spesimen (digesti) dan menghilangkan organisme
yang mengkontaminasi (dekontaminasi). Spesimen didekontaminasi dengan NaOH 4%
ditambah N-acetyl-L-cysteine (NALC adalah agen mukolitik yang dapat dengan cepat
mendigesti sputum yang sifatnya lengket).

I. Bahan
1 Tabung polipropilena kerucut yang steril dengan tutup yang bisa dipelintir
(Tabung Falcon)
2 Tempat sampah anti air
3 Tempat sampah untuk sampah padat dengan desinfektan
4 Lysol (20 %)
5 Pipet transfer yang steril
6 Pipet serologis 25 mL
7 Sarung tangan sekali pakai
8 Rak tabung 50 mL
9 Underpad

II. Alat
1 Lemari Biosafety
2 Alat sentrifus
3 Mesin Vortex
4 Timbangan (Balance)
5 Alat pengukur pH
6 Kulkas, freezer
7 Autoklaf

III. Larutan Kimia

9
 1. Persiapkan larutan stok NaOH-Natrium Sitrat:
a. Sediakan larutan NaOH (dalam hal ini gunakan produk Merck, KgaA
Jerman) 1 N, 20 gr NaOH dalam 500 mL air (Air Steril, Otsuka)
b. Sediakan Natsium Sitrat Dihidrat (dalam hal ini gunakan produk Merck,
KgaA Jerman) 14.5 gr dalam 500 mL dalam air steril
c. Campurkan 250 mL NaOH dengan 250 mL Natrium Sitrat Dihidrat. Autoclaf
campurannya dengan suhu 121oC selama 20 mins dalam tabung falcon.
d. Semua pembuatan bahan kimia tersebut akan dilakukan di laboratorium
pusat Hasanuddin University Medical Research Center (HUM-RC), kecuali
NALC (Merck, KgaA Germany) karena dibutuhkan lab dengan kriteria
Biosafety Level 2+ untuk laboratorium Tuberkulosis. Serbuk sari NALC
sebanyak 1 gr dicampurkan dengan 200 ml dari larutan NaOH-Natrium
sitrat di dalam botol berukuran 250 mL.

2. Buffer fosfat, 0.067 M, pH 6.8

a. Sediakan buffer alkali (Na2HPO4 (dalam hal ini menggunakan produk
Merck, KgaA, Jerman), anhidrat sebanyak 9,47 gr dalam 1000 mL air steril).
b. Sediakan buffer asam (KH2PO4 (dalam hal ini gunakan produk Merck,
KgaA, Jerman) 9,07 gr dalam 1000 ml air steril).
c. Membuat buffer fosfat (pH 6,8): Campurkan 300 mL buffer alkali dengan
200 mL buffer asam yang akan menghasilkan volume 500 mL. Periksalah
pH larutan dengan pH meter. Tambahkan sedikit buffer alkali untuk
menaikkan pH atau sedikit buffer asam untuk menurunkannya. Autoklaf
campuran tersebut dengan suhu 121o C selama 20 menit.
Catatan:
• Jangan autoklaf N-acetyil-L-cycteine (NALC)
• Larutan steril, bahan sekali pakai dan bahan pecah belah (Sangat bersih) yang
harus digunakan untuk menonaktifkan aktivitas DNAse.
• PERHATIAN! NaOH bersifat korosif! Selalu menggunakan alat pelindung diri

IV. Prosedur
A. Persiapan Reagen
Mempersiapkan larutan NaOH-NALC

10
 Larutan NaOH-NALC memiliki masa pakai yang pendek dan oleh karena itu, perlu
dibuat lagi saat akan digunakan.
1) Larutkan seperti yang ditunjukkan pada tabel di bawah ini.
Total volume needed Amount of Amount of

(ml) NaOH-Natrium sitrat (ml) NaLC (gr)

25 25 0.25

50 50 0.5

100 100 1.0

2) Larutan campuran ini hanya bisa digunakan hingga 24 jam. Berikan label
dengan keterangan waktu persiapan larutan tersebut.

B. Pengolahan sampel
1. Tuangkan sputum (dahak) kurang dari 10 mL dengan pelan dan hati-hati dari
wadah spesimen ke dalam tabung sentrifus polipropilena kerucut yang steril.
Sebagai alternatif, semua sampel sputum dapat ditransfer dengan
menggunakan pipet transfer. Sebelum memindahkan sputum, mulut botol
penampung harus dibersihkan dengan disinfektan (Lysol 20%). Sebelum dan
sesudah mentransfer sputum dan bahan kimia harus dibersihkan oleh
desinfektan untuk menghindari kontaminasi.
2. Tambahkan larutan NaOH-NALC pada sampel dengan perbandingan 1: 1 dalam
tabung kerucut 50 mL. Tetapi jika larutan campuran (sputum + NaOH - NALC)
lebih dari 10 ml maka selalu bagi larutan tersebut ke dalam tabung terpisah
(tabung kerucut 50 mL baru). Pastikan tertutup dengan erat. Jika spesimen
terlalu kental untuk dituang, tambahkan bubuk NaLC (0,1 gr) pada sputum
dalam wadah spesimen dan campuran dituangkan dengan hati-hati ke dalam
tabung berbentuk kerucut. Kita bisa mengulangi langkah ini (tambahkan 0,1 gr)
tiga kali.
3. Guncangkan tabung pada mesin vortex selama tidak lebih dari 30 detik.
Kemudian balikkan tabung sehingga NaLC-NAOH bersentuhan dengan seluruh
permukaan bagian dalam tabung. PERHATIAN: Hindari guncangan yang
berlebihan, karena NALC tidak stabil bila terdapat oksigen.

11
4. Biarkan tabung dalam posisi tegak selama 15 min dalam lemari Biosafety untuk
mendekontaminasi spesimen. PERHATIAN: NaOH bersifat korosif maka dari
itu, gunakan hanya pada saat dibutuhkan.
5. Setelah sampel dicairkan, encerkan campuran sampai tercapai volume 50 mL
dengan buffer fosfat 0,067 M steril (pH 6,8). Ini akan mengurangi reaksi
lanjutan NaOH dan menurunkan viskositas campuran. PERHATIAN: Untuk
menghindari kontaminasi silang, jangan biarkan wadah pengencer menyentuh
tabung spesimen.
6. Pastikan tabung tertutup dengan erat, dan bolak-balikkan beberapa kali untuk
mencampur isinya.
7. Sentrifuspada kecepatan 3000 xg selama 15 menit. Sebelum disentrifus,
seimbangkan tabung dalam ember untuk menghindari insiden yang disebabkan
oleh tabung yang tidak seimbang.
8. Tuangkan supernatan ke dalam wadah sampah yang anti air yang sudah diisi
desinfektan (Lysol 20 %). Lap bibir tabung dengan kapas yang diberikan
desinfektan (Lysol 20% ). PERHATIAN: Jangan biarkan desinfektan mengalir ke
dalam tabung.
9. Tambahkan buffer fosfat 1-1.5 mL menggunakan pipet transfer lalu gunakan
mesin vortex untuk menghomogenkan sampel. Transfer semua volume ke
dalam tabung eppendorf yang steril (1.5 mL). Sampel dekontaminasi yang
homogen (sebanyak 100 µL dengan pipet tetes) dapat digunakan untuk di
mikroskop smear (prosedur lebih rinci dapat dilihat pada protokol 02
persiapan slide mikroskop smear).
10. Bagian dari sampel yang didekontaminasi dapat diinokulasi pada media
Lowenstein Jensen. Setiap tabung diinokulasi dengan 20 µL sampel. Selain itu,
sisa 500 μl sampel dekontaminasi dapat diinokulasi ke dalam tabung MGIT
(Mycobacteria Growth Indicator Tube).
Sisa sedimen dapat disimpan pada suhu -80°C sebagai cadangan jika ada
kontaminasi dalam sampel. Sampel yang didekontaminasi juga dapat
digunakan untuk metode molekuler di masa depan.

12
V. REFERENCE
1. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr.
Mycobacteria. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Fifth edition,
1997. Lippincott.
2. Hongkong University Procedures, 1980
3. Internal Optimisation Trial, 1998. Chou Kau et al.
4. BD USAID, MGIT Liquid System Training, 2013.

13
SAMPUL

14
 Mycobacterium tuberculosis

Tujuan
Setelah menyelesaikan praktikum ini, diharapkan mahasiswa sudah mampu:
• Mengenal bentuk dan sifat tahan asam dari M. tuberculosis
• Dapat menjelaskan perbedaan gambaran mikroskopis dari preparat sputum yang
belum dan yang sudah dikonsentrasi.
Disediakan
Preparat Pewarnaan Ziehl-Neelsen dari sputum yang belum dikonsentrasi dan
yang telah dikonsentrasi dibawah mikroskop.
Kerjakan
Lihatlah di bawah mikroskop kedua preparat tersebut. Perhatikan dan bandingkan
apa yang saudara lihat di bawah mikroskop.

Hasil pengamatan

Hasil pengamatan Sputum biasa Sputum konsentrasi

Sel-sel lekosit/lpk ………………….. …………………..

Basil tahan asam

jumlah ………………….. …………………..
cara berkelompok ………………….. …………………..

Bakteri lain ………………….. …………………..

Gambar

15
1. Mengenal Medium Spesifik untuk Isolasi Mycobacterium tuberculosis dan Melihat
Bentuk Koloninya.
Tujuan
Setelah menyelesaikan praktikum ini, diharapkan mahasiswa sudah mampu:
• Mengenal salah satu medium yang dipakai untuk isolasi M. tuberculosis,
• Dapat menjelaskan morfologi M. Tuberculosis di atas medium Lowenstein-Jensen.
Disediakan
Biakan Mycobactreium tuberculosis pada medium Lowenstein-Jensen.
Dikerjakan
Perhatikan medium dan koloni yang tumbuh di atasnya:
Catat penampilan medium (warna dan bentuk) serta bentuk, warna koloni yang
tumbuh pada medium tersebut dan catat.
Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan koloni Gambar

Bentuk ……………………………….

Tepi ………………………………….

Permukaan ……………………………

Warna …………………………………

2. Melihat Preparat Sputum dengan Pewarnaan Gram

Tujuan
Setelah menyelesaikan praktikum ini, diharapkan mahasiswa sudah mampu:
• Menyebutkan bakteri-bakteri yang bsia ditemukan pada sputum penderita dengan
infeksi saluran respirasi,
• Menjelaskan morfologi, cara berkelompok dan sifat pewarnaan bakteri yang bisa
dilihat pada spautum penderita dnegan infeksi saluran respirasi.
Disediakan
Satu preparat sputum dengan pewarnaan Gram di bawah mikroskop.

16
Dikerjakan
Perhatikan dan catat hasil pengamatan saudara pada preparat sputum dengan
Gram .

Hasil Pengamatan

Yang Diamati Gambar

Sel-sel lekosit/lpk …………………..

Warna : Inti ……………………

sitoplasma …………………….

Jumlah …………………….

Bakteri 1
Morfologi …………………..
Cara berkelompok …………………..

Sifat Gram …………………..

Bakteri 2

Morfologi …………………..
Cara berkelompok …………………..

Sifat Gram …………………..

Bakteri 2

Morfologi …………………..
Cara berkelompok …………………..

Sifat Gram …………………..

17
CATATAN

18
CATATAN

19
 Mycobacterium tuberculosis
Features:

1. Tipis, umumnya agak melengkung, berbentuk batang

2. Aerobik, non-motil, tidak membentuk spora

3. Asam tidak dapat melunturkan zat warna  Basil Tahan Asam (BTA)

20
Characteristics :

1. Hidup dalam beberapa minggu pada kondisi kering

2. Tidak menghasilkan endotoksin dan eksotoksin

3. Penyebaran secara hematogenik

4. Tumbuh lambat (24-32 jam)

5. Manifestasi klinis tidak spesifik

6. Aerob, organ predileksi adalah paru-paru

7. Dapat mengalami dormansi

Transmission

1. Transmisi dari manusia ke manusia melalui udara oleh droplet)

2. TB Pulmoner: batuk, bersin, berbicara, atau bernyanyi

3. Droplet: Mengandung 2-3 basil, ukuran kecil (1-5 ), dan bertahan di udara
dengan periode panjang

TB droplet nuclei

21
SAMPUL

22
 Klebsiella pneumoniae
Disediakan

1. Satu seri yang terdiri dari preparat Gram dan biakan dari Klebsiella pneumonia, pada
lempeng agar McConkey dan lempeng agar Brain Heart Infusion dan tes-tes biokimia.

2. Daftar reaksi biokimia dari basil-basil Enterobacteriaceae

Hasil pengamatan

a. Gambaran Mikroskopis

Klebsiella pneumonia

b. Gambaran koloni pada McConkey & Brain Heart Infusion Agar:

Klebsiella pneumoniae
Ciri-ciri Koloni
NA McConkey

Bentuk

Tepi

Permukaan

Kejernihan

Elevasi

23
 Warna

Gambar

d. Hasil Tes-tes Biokimia

TES BIOKIMIA Interpretasi

Slant

Butt
Reaksi TSI :
H2S

Gas

Produksi Indol

SIM: H2S

Motility

Tes Methyl Red

Tes Voges Proskauer

Tes Citrat

Tes Urea

24
Penylalanine diaminase

Lysine decarboxylase

Arginine dehydrolase

Ornitine decarboxylase

Asam

Gas

Peragian: Glukosa : Laktose

Sukrose

Maltose

Tes Oksidase

Tes katalase

25
SAMPUL

26
 Antimicrobial Susceptibility Test (AST) by

BACTEC MGIT 960 System

Principles:

The BBL ™ MGIT ™ 7 mL Mycobacteria Growth Indicator Tube adalah tabung yang
mengandung kaldu dari modifikasi Middlebrook 7H9 Broth yang membantu
pertumbuhan dan deteksi Mycobacteria (Coba lihat bagian Insert dari paket BBL MGIT 7
mL). Tabung MGIT mengandung senyawa fluorescent yang tertanam di silikon di bagian
dasar tabung bulat 16 x 100 mm. Senyawa fluorescent sangat sensitif terhadap
keberadaan oksigen terlarut dalam kaldu. Konsentrasi awal oksigen terlarut
memadamkan emisi dari senyawa, dan oleh karena itu sedikit fluoresensi yang dapat
dideteksi. Kemudian, mikroorganisme yang tumbuh aktif dan bernafas mengonsumsi
oksigen yang memungkinkan senyawa tersebut berfluoresensi.

BACTEC MGIT 960 SIRE Kit adalah tes kualitatif 4 - 13 hari. Tes ini didasarkan dari
pertumbuhan isolat Mycobacterium tuberculosis yang diisolasi dalam tabung yang
mengandung obat yang dibandingkan dengan tabung tanpa obat (Growth Control). Alat
BACTEC MGIT 960 terus memantau tabung untuk setiap peningkatan fluoresensi. Analisis
fluoresensi dalam tabung yang mengandung obat dibandingkan dengan fluoresensi
tabung tanpa obat (Kontrol Pertumbuhan) digunakan untuk menilai hasil suseptibilitas.
Alat BACTEC MGIT 960 secara otomatis akan menginterpretasikan dan melaporkan hasil
suseptibilitas atau resistensi.

I. Specimen Preparation:
All preparations detail below is from culture of M. tuberculosis. Culture from the
positive tubes should be confirmed by the molecular test (SD Bioline) and Acid-Fast
Staining (AFS).
a. Preparation of the isolate from Solid Media:

1. Add 4 ml of BBL Middlebrook 7H10 broth to a 16.5 x 128 sterile tube with cap
containing 8-10 glass beads.

27
 2. Scrape with a sterile loop as many colonies as possible from growth up to 14
days old, trying not to remove any solid medium. Suspend the colonies in the
Middlebrook 7H10 Broth. The suspension should exceed in turbidity a 1.0
McFarland standard.
3. Vortex the suspension for 2-3 min to break up the larger dumps.
4. Let the suspension in the rack for 20 min.
5. Transfer the supernatant to another tube with cap and let them for 15 min.
6. Transfer again the supernatant fluid by smooth, free of any clumps to the third
sterile tube with cap.
7. Adjust the suspension to a 0.5 McFarland standard with add into the sterile tube
with cap containing 2 ml DW.
8. Dilute 1.0 ml of the 0.5 McFarland adjusted suspension in 4 ml of sterile saline
or DW (1:5 dilution). The inoculum is now ready. Proceed to “Inoculation
Procedure for Susceptibility Test”.

b. Preparation from a Positive BACTEC MGIT 7 mL Tube:

NOTE: It is important to prepare the inoculum using the following time references
to obtain the appropriate organism concentration for the susceptibility test.

1. The first day of an instrument positive MGIT tube is considered Day 0.

2. For the preparation of the test inoculum, a positive 7 mL MGIT tube should be
used the day after it first becomes positive on the BACTEC MGIT 960 instrument
(Day 1), up to and including the fifth day (Day 5) after instrument positivity. A
tube which has been positive longer than five days should be subcultured to a
fresh 7 mL MGIT tube containing BACTEC MGIT 960 Growth Supplement and
tested on the BACTEC MGIT 960 instrument until positive, and used from one to
five days following positivity.
3. If the tube is a Day 1 or Day 2 positive, mix well and proceed to “Inoculation
Procedure for Susceptibility Test.”
4. If the tube is a Day 3, Day 4, or Day 5 positive, mix well then dilute 1 mL of
positive broth in 4 mL of sterile saline (1:5 dilution). Use the diluted suspension
for the inoculation procedures. Proceed to “Inoculation Procedure for
Susceptibility Test.”

28
II. Material
A. Preparation for SIRE drugs BACTEC MGIT 960 System

BACTEC MGIT 960 SIRE Kit contains one each lyophilized vials of streptomycin,
isoniazid, rifampin and ethambutol, and eight vials of SIRE Supplement.

Approximate Formula∗ Per Vial Lyophilized drug:

Streptomycin ....................................... 332 µg.

Isoniazid ................................................ 33.2 µg.

Rifampin ................................................ 332 µg.

Ethambutol .......................................... 1660 µg.

BACTEC MGIT STR 4.0 Kit contains one vial lyophilized streptomycin and two vials
of SIRE Supplement.

Approximate Formula∗ Per Vial Lyophilized drug:

Streptomycin ....................................... 664 µg.

BACTEC MGIT 960 SIRE Supplement contains 20 mL Middlebrook OADC

enrichment

Approximate Formula∗ Per L Purified Water

Bovine albumin .................................. 50.0 g

Catalase ................................................. 0.03 g

Dextrose ................................................ 20.0 g

Oleic Acid .............................................. 0.6 g

∗ Adjusted and/or supplemented as required to meet performance criteria.

Storage and reconstitution of reagents: BACTEC MGIT 960 SIRE Drug vials – On
receipt, store the lyophilized drug vials at 2 - 8° C. Once reconstituted, the antibiotic
solutions may be frozen and stored at -20° C or colder up to six months, not to exceed the
original expiration date. Once thawed, use immediately. Discard unused portions.

29
 BACTEC MGIT SIRE Supplement – On receipt, store in dark at 2 - 8° C. Avoid
freezing or overheating. Open and use prior to the expiration date. Minimize exposure to
light.

Directions for Use:

• Reconstitute each BACTEC MGIT 960 SIRE Kit Streptomycin lyophilized drug vial
with 4 mL of sterile distilled/deionized water to make a stock solution of 83 µg/mL.
• Reconstitute each BACTEC MGIT 960 SIRE Kit Isoniazid lyophilized drug vial with
4 mL of sterile distilled/deionized water to make a stock solution of 8.3 µg/mL.
• Reconstitute each BACTEC MGIT 960 SIRE Kit Rifampin lyophilized drug vial with
4 mL of sterile distilled/deionized water to make a stock solution of 83 µg/Ml
• Reconstitute each BACTEC MGIT 960 SIRE Kit Ethambutol lyophilized drug vial
with 4 mL of sterile distilled/deionized water to make a stock solution of 415 µg/mL

B. Preparation for Second Line Drugs BACTEC MGIT 960

1. SystemPreparation of Ofloxacin

Drug Sigma # Storage Potency Solvent

Ofloxacin O8757 – 2-8°C 100% 0.1N NaOH
1G
Drug potency = 100%
No correction is required for drug potency

Preparation 0,1 N NaOH

According to WHO report, dissolve 40 gr NaOH in 1000 ml Destilated Water became 1 N

NaOH.

In this protocol we make it 0,1 N NaOH (0,4 gr NaOH in 100 ml DW).

Ideally, drug stock solutions should be prepared and stored at -30--70°C. Stock solutions
keep better when more concentrated. For any drug, a stock solution of 100 mg active drug
in 10 mL solvent (10 mg/mL) should be prepared and stored in clearly labelled amounts
of 1 mL.

30
Ofloxacin

Stock solution 10.0 mg/ml (10,000 μg/ml)

Amount of drug required per MGIT (manual) 2.0 μg/ml

10,000 μg/ml Ofloxacin

Add 100,000 μg (100 mg) of pure ofloxacin to 10 ml of 0.1N NaOH

Store in cryotubes at -30--70°C

Label with name of drug, concentration, and date of preparation

Preparation of working solution

Dilution required 10,000 μg/ml / 100.0 μg/ml

Add 0.5 ml of 10,000 μg/ml OFL to 4.5 ml of sterile distilled water = 1,000 μg/ml

Add 0.5 ml of 1,000 μg/ml OFL to 2.1 ml of sterile distilled water = 168 μg/ml

2. Preparation of Amikacin

Drug Sigma # Storage Potency Solvent

Amikacin A1774-1G 2-8°C ~72% Sterile distilled water

Drug potency must be considered as there is batch variation from the same manufacturer
and also product variation from one manufacturer to another. It depends on (i) purity of
the drug, (ii)

the water content, and (iii) the salt / counter-ion fraction. Potency can be calculated or
sometimes obtained from the manufacturer’s website

Potency = (assay purity) x (1 – water content)

31
Worked Example: A drug manufacturer provided the following information on a batch
of amikacin drug powder
• Assay purity of amikacin was 0.716
• Water Content (usually 0 unless stated otherwise)
• To obtain 100mg of pure amikacin drug powder, weigh out 100 mg x 1/0.710 =
144 mg

Ideally, drug stock solutions should be prepared and stored at -30-70°C. Stock solutions
keep better when more concentrated. For any drug, a stock solution of 100 mg active drug
in 10 mL solvent (10 mg/mL) should be prepared and stored in clearly labelled amounts
of 1 mL.

Amikacin

Stock solution 10.0 mg/ml (10,000 μg/ml)

Amount of drug required per MGIT (manual) 1.0 μg/ml

10,000 μg/ml Amikacin

Add 144,000 μg (144 mg) of pure amikacin [POTENCY FACTOR] to 10 ml of sterile

distilled water

Store in cryotubes at -30--70°C

Label with name of drug, concentration, and date of preparation

Preparation of working solution

Dilution required 10,000 μg/ml / 84.0 μg/ml

Add 0.5 ml of 10,000 μg/ml AMK to 4.5 ml of sterile distilled water = 1,000 μg/ml

Add 0.5 ml of 1,000 μg/ml AMK to 5.4 ml of sterile distilled water = 84 μg/ml

32
3. Preparation of Kanamycin

Drug Sigma # Storage Potency Solvent

Kanamycin K1377-1G 2-8°C ~75% Sterile distilled water

Drug potency must be considered as there is batch variation from the same manufacturer
and also product variation from one manufacturer to another. It depends on (i) purity of
the drug, (ii)

the water content, and (iii) the salt / counter-ion fraction. Potency can be calculated or
sometimes obtained from the manufacturer’s website.

Potency = (assay purity) x (1 – water content)

Worked Example: A drug manufacturer provided the following information on a

batch of kanamycin drug powder

• Assay purity of kanamycin was 0.785

• Water Content (usually 0 unless stated otherwise)
• To obtain 100mg of pure kanamycin drug powder, weigh out 100mg x 1/0.785
= 127.4 mg

Ideally, drug stock solutions should be prepared and stored at -30-70°C. Stock solutions
keep better when more concentrated. For any drug, a stock solution of 100 mg active drug
in 10 mL solvent (10 mg/mL) should be prepared and stored in clearly labelled amounts
of 1 mL.

Kanamycin

Stock solution 10.0 mg/ml (10,000 μg/ml)

Amount of drug required per MGIT (manual) 2.5 μg/ml

10,000 μg/ml Kanamycin

33
Add 127,400 μg (127.4 mg) of pure kanamycin [POTENCY FACTOR] to 10 ml of sterile
distilled water

Store in cryotubes at -30--70°C

Label with name of drug, concentration, and date of preparation

Preparation of working solution

Dilution required 10,000 μg/ml / 210.0 μg/ml

Add 0.5 ml of 10,000 μg/ml KAN to 4.5 ml of sterile distilled water = 1,000 μg/ml

Add 0.5ml of 1,000 μg/ml KAN to 1.8 ml sterile distilled water = 210.0μg/ml

III. Procedure
1. Beri label lima tabung MGIT 7mL untuk masing-masing isolate tes.
• Labeli satu sebagai GC (Kontrol Pertumbuhan), satu sebagai STR, satu sebagai INH,
satu sebagai RIF, dan satu sebagai EMB. Tempatkan tabung sesuai urutan AST set
carrier yang benar dengan ukuran yang sesuai (lihat BACTEC MGIT 960 User's
Manual, Instruksi AST).
• Labeli satu sebagai GC (Kontrol Pertumbuhan), satu sebagai OFL, satu sebagai
KAN, satu sebagai AMK. Tempatkan tabung sesuai urutan AST set carrier dengan
ukuran yang sesuai (see BACTEC MGIT 960 User’s Manual, AST Instructions).
2. Masukkan 0.8 mL dari BACTEC MGIT SIRE Supplement secara asepsis ke pada tiap
tabung.
CATATAN: Penting untuk menggunakan suplemen syang ada bersama kit yang
digunakan.

3. Teteskan secara asepsis, gunakan micropipet,

• 100 μL dari larutan MGIT STR 83 μg / mL ke dalam tabung MGIT berlabel yang
sesuai. Secara aseptis teteskan 100 µL larutan MGIT INH 8,3 µg / mL ke dalam
tabung MGIT berlabel yang sesuai. Secara aseptik teteskan 100 μL dari larutan
MGIT RIF 83 µg / mL ke dalam tabung MGIT berlabel yang sesuai. Secara aseptik
teteskan 100 µL larutan EMB EMIT 415 µg / mL ke dalam tabung MGIT berlabel
yang sesuai. Penting untuk menambahkan obat yang benar ke tabung yang sesuai.
Tidak boleh ada antibiotik yang ditambahkan ke dalam tabung MGIT GC

34
 • 100 μL dari larutan MGIT OFL 168 μg / mL ke dalam tabung MGIT berlabel yang
sesuai. Secara aseptis teteskan 100 µL larutan MGIT KAN 210 µg / mL ke dalam
tabung MGIT berlabel yang sesuai. Secara aseptik teteskan 100 μL dari larutan
MGIT AMK 84 µg / mL ke dalam tabung MGIT berlabel yang sesuai.
4. Persiapan dan Inokulasi Tabung Kontrol Pertumbuhan: Secara asepsis teteskan 0,1
mL suspensi organisme (lihat “Persiapan Spesimen”) ke dalam 10 mL saline steril
untuk mempersiapkan suspensi Kontrol Pertumbuhan 1: 100. Campurkan suspensi
Kontrol Pertumbuhan secara menyeluruh. Inokulasi 0,5 mL suspensi Kontrol
Pertumbuhan 1: 100 ke dalam tabung MGIT berlabel "GC."
5. Inokulasi tabung berisi obat: Secara asepsis teteskan 0,5 mL suspensi organisme
(lihat “Persiapan Spesimen”) ke dalam masing-masing EMPAT tabung obat yang
tersisa (STR, INH, RIF, EMB) & TIGA tabung obat yang tersisa (OFL, KAN, AMK)
6. Tutup kembali tabungnya dengan rapat. Campurkan isi tabung secara menyeluruh
dengan cara dibolak-balik secara perlahan 3 sampai 4 kali.
7. Masukkan set AST ke dalam BACTEC MGIT 960 menggunakan fitur entri set AST (lihat
Panduan Pengguna BACTEC MGIT 960, Petunjuk AST). Pastikan bahwa urutan tabung
di dalam AST Set Carrier sesuai dengan ketentuan karier set yang dipilih saat
melakukan fitur entri set AST.

Menonaktifkan akses barcode :

1. Ambil AST carrier yang baru ke instrumen. Buka kotak yang diinginkan.
2. Tekan tombol “tube entry”.
3. Pemindai barcode aktif dan ikon barcode muncul di bagian utama layar. Letakkan
carrier set dengan label barcode menghadap pemindai. Jika perlu, putar tabung
sedikit sehingga pemindai dapat membaca label. Sistem akan berbunyi sekali untuk
menunjukkan pemindaian yang baik.
4. Stasiun yang ditentukan dan nomor urut yang terpindai ditampilkan di bagian utama
layar. LED pada stase yang ditentukan pada kotak akan menyala HIJAU.
5. Masukkan tabung ke dalam stase yang ditunjuk secara hati-hati dan menyeluruh.
6. Ulangi langkah 3 - 5 untuk setiap AST carrier baru yang akan dimasukkan.

35
IV. Interpretation Of Results
BACTEC MGIT 960 akan memonitor set AST sampai ditentukannya yang peka atau
resisten. Setelah pengujian set selesai, hasilnya akan dilaporkan oleh instrumen BACTEC
MGIT 960 (lihat Panduan Pengguna BACTEC MGIT 960, Petunjuk AST). Instrumen
BACTEC MGIT 960 akan melaporkan hasil set AST sebagai Error (X), tidak ada interpretasi
kerentanan, ketika kondisi tertentu terjadi yang dapat mempengaruhi hasil uji. Kondisi
yang dapat mengakibatkan hasil Error (X) dijelaskan dalam Petunjuk AST, Bagian 7
Pemecahan masalah dari Panduan Pengguna BACTEC MGIT 960.

Ketika melaporkan hasil, penting untuk memasukkan metode tes, nama obat dan
konsentrasi, apakah hasilnya diperoleh dengan BACTEC MGIT 960 atau metode lain.
Spesialis Paru dan / atau Penyakit Infeksi dalam pengendalian TB harus dikonsultasikan
mengenai regimen dan dosis terapi yang tepat.

V. Rerefence
1. Abe, c., A. Aono, K. Hirano. 2001. evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for
drug susceptibility testing of M tuberculosis isolates compared with the
proportion method on solid media. Kekkak7u. Oct;76(10:657-62).

2. Richard Lumb. Ofloxacin SOP Manual MGIT

3. BACTEC, BBL, MGIT, MycoPrep, PANTA and TAXO are trademarks of Becton
Dickinson and Company.

36
SAMPUL

37
 Deteksi M. Tuberculosis secara cepat oleh GeneXpert

Prinsip :

Tuberkulosis adalah salahsatu ancaman kesehatan masyarakat yang paling

mematikan saat ini secara tardisional, tuberkulosis sebagian besar didiagnosis dengan
kombinasi sinar-X dada, pewarnaan dahak dengan pewarna khusus diikuti oleh
mikroskopi pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis dalam kultur dan uji Mantoux.
Mikroskop sputum smear mudah dilakukan dan sangat murah dan dikombinasikan
dengan sinar-X dada telah digunakan untuk waktu yang lama oleh TB Control Agencies di
seluruh dunia. Namun tes mikroskop sputum smear (Sputum AFB) memiliki beberapa
masalah pada pasien HIV-Positif dan anak-anak juga pada pasien dengan jumlah bakteri
rendah.

Uji Xpert MTB / RIF menunjukkan sensitifitas dan spesifitas tinggi untuk
mendeteksi penyakit TB paru. Sebuah studi invitro menunjukkan batas deteksi hanya
sebanyak 131 CFU / mL MTB,dibandingkan dengan sekitar 10.000 CFU / mL dengan
mikroskop smear konvensional. [5] [1] Kerentanan obat hanya bisa didiagnosis dari
pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis dalam budaya yang bisa memakan waktu
selama 6 minggu dan membutuhkan laboratorium bio safety yang tinggi dan mahal.

Penentuan kerentanan obat sangat relevan karena Mycobacterium tuberculosis

menjadi semakin resisten terhadap dua obat anti-tuberkulosis utama,isoniazid dan
rifampisin.bentuk tuberkulosis ini disebut TB yang resisten terhadap banyak obat (MDR-
TB) dengan cepat menigkat secara global. Kasus TB-MDR memerlukan antibiotik yang
berbeda dan lebih sulit diobat karena biaya obat yang lebih tinggi dan rejimen yang lebih
panjang.

Xpert MTB / RIF adalah diagnostik otomatik berbasis kartrid yang dapat
mengdentifikasi DNA Mycobacterium tuberculosis (MTB) dan ketahanan terhadap
rifampisin (RIF) dengan teknik penguat asam nukleat (NAAT). Ini dikembangkan oleh
laboratorium Profesor David Aland di University of Medicine Dentistry of New Jersey
(UMDNJ). [1] Cepheid I nc.dan Foundation for innovative New Diagnostics, dengan
dukungan tamabahan dari US National Institutes of Health (NIH).

38
 The Xpert MTB / RIF mendeteksi urutan DNA yang spesifik untuk resistensi
Mycobacterium tuberculosis dan rifampisin dengan reaksi berantai polimerase [4] [6] ini
didasaran pada sistem Cepheid GeneXpert, sebuah platfrom untuk tes amplifikasi asam
nukleat yang cepat dan mudah digunakan (NAAT). Xpert MTB / RIF memurnikan dan
mengkonsentrasikan basil Mycobacterium tuberculosis dari sampel sputum, mengisolasi
bahan genomik dari bakteri yang ditangkap dengan sonikasi dan kemuadian menguatkan
DNA genom dengan PCR. Proses ini mengidentifikasi semua resistansi Rifampisin yang
relevan secara klinis yang menginduksi mutasi pada gen RNA polymerase beta (rpoB)
pada genom Mycobacterium tuberculosis dalam format real time menuggunakan
pemeriksaan fluoresen yang disebut moleculer beacons. Hasil diperoleh dari sampel
dahak yang tidak diolah dalam 90 menit, dengan biohazard minimal dan sangat sedikit
pelatihan teknis yang dibutuhkan untuk beroperasi. [7] Tes ini dikembangkan sebagai near
patient technology yang dibuat sesuai permintaan bahkan bisa dilakukan bahkan di
kantoe jika perlu.

Sebuah tinjauan untuk menilai kakuratan diagnostik TB Xpert menentukan bahwa

ketika digunakan sebagai tes awal untuk menggantikan mikroskopi smear, tes ini
menumpulkan senitivitas 88% dan spesifisitas 98%. Namun bila TB Xpert digunakan
sebagai add-on untuk kasus mikroskopi smear negatif sensitivitasnya hanya 67 dan
spesifisitas 98%. [8] Dalam studi klinis yang dilakukan, sensitivitas uji MTB / RIF hanya
pada 1 sampel dahak adalah 92,2% untuk kultur TB positif; 98% untuk kasus BTA dan
kasus kultur positif; Dan 72,5% untuk kasus BTA-negatif, kultur positif, dengan
spesifisitas 99,2%. Sensitivitas dan spesifisitas yang lebih tinggi sedikit lebih tinggi bila 3
sampel diuji [9]

I. Bahan
Saraf GeneXper meliputi:

1. Modules Thermal and optical system

2. Cartridge Self-Contained Disposable
3. Computer System Software Barcode Scanner
4. Optinal Accessories Printer UPS
II. Prosedur
Deteksi DNA kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTB) dan TB
Mycobacterium resisten Rifampisin.

39
 • Tes Diagnostik Semi Kuantitatif secara in vitro
• Spesimen: Sputum dan sputum yang diinduksi
• Mendeteksi – gen rpoB yang bertanggung jawab untuk menentukan
daerah resistansi terhadap Rifampisin untuk jenis Mycobacterium
tuberkulosis liar
Uji Xpert MTB / RIF dimaksuskan untuk digunakan dengan spesimen dari pasien
yang tidak diobati yang memiliki dugaan klinis tuberkulosis.

MTB / RIF assay. Uji MTB / RIF

Secara singkat, sampel reagen ditambahkan ppada rasio 2:1 terhadap spesimen
klinis. Wadah spesimen tertutup secara manual diaduk dua kali selama periode 15 menit
pada suhu kamar, sebelum 2 ml bahan yang tidak aktif (setara dengan 0,5 ml pelet yang
didekontaminasi) dipindahkan ke test cartrdge.

Semua spesimen yang bersifat kultur positif dan MTB / RIF assay positive ditest
ulang dua kali. Hasil terakhir digunakan untuk analisi.

Protokol MTB / RIF Otomatis Xpert

1. Letakkan sampel yang dielusi dalam kartrid, kemuadian masikkan kartrid ke

galam.
2. Sampel pengkombinasikan dengan sampel proccening (SPC)
3. Filter menangkap sampel dan SPC.
4. Ultrasonically lysed cells melepaskan asam nukleat
5. Campuran DNA dicampur dengan reagen kering.
6. Seacara serentak amplifikasi dan deteksi PRC terjadi
7. Hasilnya siap dilihat dan di print kurang dari 2 jam

A. Sample Sputum
1. Pengambilan sputum harus dalam keadaan duduk atau berdiri
2. Bilas mulut pasien dua kali dengan air

40
 3. Jelaskan kepada pasien bagaimana cara membuka dan nenutup alat
pengeloksi, menghasilkan bahak air liur, yang terdapat didalam
meludahkan dan menutup wajah
B. Penimpanan dan penanangan sample
1. Jangan mengumpulkan kurang dari 1 mL sputum spesimen
2. Jangan menerima specimen dengan partikel atau partikel makanan atau
partikel padat ainnya.
3. Jangan biarkan pada suhu 35º C lebih dari tiga hari (stabil 4 sampai 10 hari
pada sushu 4ºC).
4. Spesimen harus dimasukkan dala ada suhu 2-8ºC bila memungkinkan
termasuk selama transportasi ke aboratorium.
5. Simpan kit Xpert pada 2-28ºC
6. Cartridgenya stabil sampai 2 minggu pada suhu 2-28º setelah kantong
dibuka.
7. Xpert kit tidak bisa digunakan setelah melewati tanggal kadalueatse.
C. Peringatan dan tindakan pencegahan
1. Kenierja Xpert MTB / RIF untuk deters MTB kompleks belum ditunjukkan
dari specimen dari specimen nonpernafasan seperti darah, CSF, kotoran
atau urine.
2. Hasil uji Xpert MTB / RIF belum dievaluasi dengan specimen yang diproses
dengan metode lain dijelaskan dalam sisispan paket.
3. Buka penutup cartridgenya Xpert MTB / RIF saat menambahkan sample
yang telah dikombinasikan
4. Cartrid harus harus diproses dalam jangka waktu 4 jam setelah sample
ditambahkan ke dalam catridgenya.
5. Jangan gunakan Cartridge :
• Jika tampak basah atau jika tutup segel nampaknya telah rusak
• Yang sudah jatuh atau terguncang setelah anda menamnambahkan
sample lain
• Yang memiliki tabung reaksi yang rusak
• Yang sudah diproses; setiap Cartrid digunakan sekali dan tidak
dapat digunakan kembali setelah di scan.

41
 • Buang Cartridge Xpert MTB / RIF bekas sesuai dengan pedoman
keselamtan instiusu dan guideline yang aman untuk bahan
berbahaya.
III. Results Interpretation
1. MTB detected but RIF not resistant

42
2. MTB detected and RIF resistant

43
3. Negative result

44
4. Invalid results

45
IV. REFERENCES

1. "Frequently asked questions on Xpert MTB/RIF assay" Retrieved on 12 June 2012

2. "WHO endorses new rapid tuberculosis test" 8 December 2010. Retrieved on 12
June 2012
3. Small, P. M., Pai, M. (2010) "Tuberculosis diagnosis - time for a game change" N.
Engl. J. Med. 363: 1070-1071
4. Van Rie, A., Page-Shipp, L., Scott, L., Sanne, I., Stevens, W. (2010) "Xpert® MTB/RIF
for point-of-care diagnosis of TB in high-HIV burden, resource-limited countries:
hype or hope?" Expert Rev. Mol. Diagn. 10: 937-946
5. http://www.medscape.com/viewarticle/745030_2
6. Helb, D., et al (2010) "Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin
resistance by use of on-demand, near-patient technology. J. Clin. Microbiol. 48:
229-237
7. Boehme, C. C., et al. (2010) "Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin
resistance" N. Engl. J. Med. 363: 1005-1015
8. Steingart KR et al.(2013) "Xpert® MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and
rifampicin resistance in adults" Cochrane Database of Systematic Reviews 2013:
DOI: 10.1002/14651858.CD009593.pub2.
9. Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis
and rifampin resistance. N Engl J Med. 2010;363:1005-1015. Epub 2010 Sep 1.
10. "Negotiated prices for Xpert® MTB/RIF and FIND country list". FIND Diagnostics.
FIND. October 2013. Retrieved 6 April 2014.
11. "WHO monitoring of Xpert MTB/RIF rollout" World Health Organisation.
Retrieved on 1 Sept 2013

46
 REAKSI BIOKIMIA BASIL-BASIL NEGATIF-GRAM

Providencia stuartii

Alkaligenes faecalis
Proteus mirabilis

Salmonella typhi
Proteus vulgaris

Shigella flexneri
Escherichia coli

Vibrio cholerae
Pseudomonas
agglomerans
Enterobacter

alkalifaciens
pneumoniae

Providensia

aeruginosa
Klebsiella
REAKSI
BIOKIMIA

Slant As As As As Alk Alk Alk Alk Alk Alk Alk As

TSI Butt As As As As As As As As As N N As

H2S - - + + + - - - - - - -

Gas + + ± + -+ - -+ -+ -+ + + -

Indol + - + - - - -+ + +
SIM H2S - - + + + - - - - - - -

Motility + - + + + - -+ + + + +

MR + -+ + + + + -+ + + - -

VP - + - - - - + - -

CITRAT - + -+ + -+ - D + + ±

UREA - + + + - - D - - -

Phenylalanin
- - + + - - -+ + +
diaminase

Lysine
+ + - - + - - - - - -
decarboxylase

Arginin
+ - + -
dihydrolase

Ornithine
+ - - + + -+ - - - +
decarboxylase

Glukosa-
+ + + + + + + + + - +
peragian

Gas + + ± + - - -+ - - -
KH
Laktose + + - - - - D + + - -+ -

Sucrose + - - - - - +

Mannitol + - - + - +

Oksidase - - - - - - - - - + +

Katalase - - - - + - - - - - -

47
48