DIAGNOSA MOLEKULER

Syahrial Harun
Biologi Molekuler
 Ilmu pengetahuan yang mempelajari
konsep mahluk hidup pada tingkat
molekuler.
 Kehidupan manusia, tumbuh-tumbuhan
dan semua organisme terdiri dari
molekul tersusun dari carbon, hydrogen,
oxygen, nitrogen , phosphor, sulfur and
elemen lain pada proporsi yang kecil.
WATSON and CRICK
 1952 : menguraikan struktur DNA
 Era dari molekular biologi,diikuti dengan
kemajuan dibidang genetic engineering,
kemudian DNA cloning pd 1970-an
 Genomic – Proteomic – Biotechnology
 HUGO projects – pemetaan genetik
manusia dan organisme lain.
DNA
DNA membawa informasi genetik berupa sikuens
nukleotida yang disusun 4 basa N: adenin (A),
timin (T), guanin (G), sitosin (C)  komplementer

Informasi genetik didistribusikan melalui 2 jalur :

1. Dari generasi satu ke generasi berikutnya

melalui proses replikasi.

2. Diubah menjadi informasi bentuk lain &

didistribusikan ke bagian-bagian sel / lingkungan

selmelalui transkripsi & translasi  expresi gen.

Informasi genetik ditranskripsi menjadi
kode genetik dalam RNA (mRNA 
kodon).

Kode genetik diterjemahkan (ditranslasi)

menjadi protein & didistribusikan ke
seluruh bagian sel atau lingkungan sel 
tampak sebagai fenotip.
Replikasi dijalankan oleh enzim DNA polimerase
Transkripsi dijalankan oleh enzim RNA polimerase
Translasi berlangsung pada ribosom
Transkripsi balik (reverse transcription) dijalankan oleh enzim
Riverse transkriptase
Teknik Biomolekuler
 Deteksi materi genetik (DNA atau RNA )
* Gene-Probe / Hybridization
* PCR
* Sequencing
 Deteksi Molekul protein
* Western Blot  Analisa protein
* Hibridoma  Monoklonal Antibodi
 Gene - Probe

 Gene-Probe / Hybridization;
Menggunakan potongan DNA spesifik
yang diberi label ( radio isotop atau
enzym )
 DNA spesifik ( DNA probe) akan
berikatan dengan DNA sampel jika
komplementer dengan DNA probe .
 DNA – PROBE (DNA berlabel)

DNA berlabel: TGG AAA GTG TAA GAA ACG GAA ... dst

Target : ACC TTT CAC ATT CTT TGC CTT GCA ... dst

Kalau DNA target komplementer dengan DNA berlabel akan

terjadi hibridisasi dan hasil hibridisasi dapat dideteksi sesuai
label ( radio isotop atau enzim )  positif
PCR ( Polymerase Chain Reaction )
 Reaksi memperbanyak (amplifikasi)
fragmen DNA spesifik dengan bantuan
enzyme secara in-vitro. Dikenalkan
pertama kali oleh Kary Mullis ( l985 )
 Hasil PCR dievaluasi dengan
elektroforesis pada agarose (conventional
PCR) atau dengan monitor (real-time
PCR)
 Lebih sensitif dibandingkan DNA Probe
Berbagai macam teknik PCR
 PCR konvensional
 Multiplex PCR
 Nested PCR
 RT-PCR
 Kuantitatif PCR (qPCR) atau Real Time
PCR (rPCR)
PCR Untuk Deteksi Virus RNA
(RT-PCR)
 Virus flu burung = virus RNA => RT-PCR
(Reverse Transcriptase PCR)
 RNA RT cDNA
 RT-PCR :
* RT-PCR konvensional (gel base analysis)
* Real time RT-PCR (rRT-PCR)
Aplikasi PCR
 Deteksi agen penyakit ( virus, bakteri dan
parasit)
 Deteksi mutasi gen (marker keganasan )
 Kloning
 Saat ini sudah tersedia mesin PCR otomatis
dan robotik
 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan sekuen pendek tertentu

dari utas ganda molekul DNA.

PCR menggunakan sepasang primer. Masing-masing primer bersifat

komplementer dengan sekuen tertentu pada salah satu utas dari utas
ganda DNA.

Kedua primer ini dipanjangkan oleh DNA polimerase sehingga masing-

masing membentuk utas salinan yang bersifat komplementer dengan
utas templat.

Proses ini berlangsung berulangkali sehingga mengakibatkan terjadinya

pelipatgandaan sekuen tertentu DNA secara logaritmik.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Siklus PCR
 Denaturation ; Double strand  Single
strand - 96 C
 Annealing ; Proses penempelan
Primer - 72 C
 Elongation ; Pemanjangan rantai DNA

( Sintesa DNA ) - 56 C
SIKLUS PCR
DENATURASI DAN RENATURASI

Denaturasi

Renaturasi
JUMLAH SIKLUS DAN AMPLIKON
Jumlah DNA berlipat untuk setiap siklus

Setelah 2 siklus: 2x2 atau (22) atau 4 kali

Setelah 3 siklus: 2x2x2 atau (23) atau 8 kali

Setelah 4 siklus: (24) atau 16 kali

Setelah N siklus jumlah DNA menjadi (2N)

kali.

Namun reaksi ini tidak berlangsung tanpa

batas melainkan akhirnya akan mencapai
fase plateau
Prosedur Kerja

1. Ektraksi DNA/RNA
2. Amplifikasi DNA
3. Evaluasi Hasil :
- Gel based, melalui pembentukan

pita/band pada gel elektroforesis

- RealTime, melalui nilai CT
Ekstraksi Asam Nukleat (DNA/RNA)
 Lysis sel
 DNA/RNA keluar
 Purifikasi dan isolasi DNA/RNA dari
protein, komponen sel lainnya
Ekstraksi Asam Nukleat
 Lysis sel; - panas/ 100 0 C
- zat kimia/ Triton 100 X,
proteinase K, Guanydine
Thiocyanate, Cheelex dsb

 Purifikasi/isolasi
Teknik ekstraksi asam nukleat
 Boom methode
 Tersedia berbagai Kit komersil
(Invitrogen, Qiagen, Promega dsb)
 KOMPONEN REAKSI PCR

 DNA templat : sebagai cetakan

 Primers (Forward and Reverse) : mengawali utas baru

 dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) : sumber basa nukleotida

 MgCl2 : menyediakan ion Mg2+ untuk aktivitas DNA polimerase

 Bufer : mempertahankan pH (8.3 - 8.8)

 Taq Polimerase : mengkatalisis penggandaan DNA

__________________________________________________________
 PERANCANGAN PRIMER
Gen X
1 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaaca gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc
61 attggttacc atgcaaacaa ttcaacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtc
121 actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta
181 gatggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac
241 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat
301 ccagccaatg gcctctgtta cccagggaat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta
361 ttgagcagaa taaatcattt tgaaaaactt cagataatcc ccaaaagttc ttggtccgat
421 catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc tgggaaggtc ctccttcttt
481 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatacatacc caacaataaa gaggagctac
541 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgca
601 gcagagcaga caaggctata tcaaaaccca accacttata tttccgttgg gacatcaaca
661 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaatgg gcaaagtgga
721 aggatggaat tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat
781 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtaa agaaagggga ctctgcaatt
841 atgaaaagtg aattggaata tggtgactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg
901 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa
961 tatgtgaagt caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag
1021 agaagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga agggggatgg
1081 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac
1141 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg
1201 atcattaaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacctagaa
1261 aggagaatag agaatttaaa caagaaaatg gaagatggat tcctagatgt ctggacttat
1321 aatgctgaac tactggttct catggaaaat gagagaactt tggactttca tgattcaaat
1381 gttaagaacc tctatgacaa ggtccgatta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggc
1441 aatggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tataagaaac
1501 ggaacgtata actacccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga ggaaataagc
1561 ggagtaaaac tggaatcaat aggaatttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg
1621 agttccctag cactggcaat catgatggct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga
1681 tcgttacaat gcagagtttg catttaa
 PERANCANGAN PRIMER
515
501 5’-CATACCCAACAATAAAGAGG-3’
3’-...GTTTTTCTTGTTAT TCGATG... //
//

//...GGTCAACTCGATCATTAACAAAATGAACACTCAGTTTGAG...-3’
3’-TAGTAATTGTTTTACTTGTG-5’
1230
1220

H5-F : CATACCCAACAATAAAGAGG

H5-R : GTGTTCATTTTGTTAATGAT

CATATAN: PRIMER DITULIS DARI ARAH 5’ KE 3’

 PRIMER PERLU DI UPDATE

CONTOH PERUBAHAN GEN HA

714
 Amplifikasi DNA (1)
 Primer
1.
H5/HA-F:5-TGG AAA GTG TAA GAA ACG GAA CGT-3
H5/HA-R:5-TGA TTG CCA GTG CTA GGG AAC T-3
Amplikon yang dihasilkan: 150 bp

2.
H5/515 : 5- CAT ACC CAA CAA TAA AGA GG-3
H5/1220: 5- GTG TTC ATT TTG TTA ATG AT-3
Amplikon yang dihasilkan: 708 bp


Amplifikasi DNA (2)
 Master mix:
2X PCR mix 12,5 ul

Forward primer (10 uM) 0,5 ul

Reverse primer (10 uM) 0,5 ul
Taq Polymerase (5 U/ul) 1,0 ul
Water (molecular grade) 5,5 ul
Sample (RNA template) 5 ul
Amplifikasi DNA (3)

 PCR condition ;
94 0C 3 min
94 0C 30 sec
)
50 0C 30 sec )
40 cycles 72 0C 1 min
) 72
0 C 7 min and then 4 0C 
Deteksi/analisa produk PCR
(amplicon)
 Gel Electrophoresis 1,5 – 2,0 %
 Ethidiumbromide/Syber green stain
 Hasil ; adanya pita fragmen DNA pada
gel dengan ukuran (bp=base pair) yang
telah diketahui dengan menggunakan
DNA marker sebagai patokan.
 Untuk primer 1 , produk 150 bp
primer 2 , produk 708 bp
DETEKSI HASIL PCR
 Gel: 07-12-05

1 kb Ladder 1 kb Ladder

480 NS 054 TS
Mutiara

481 TS 068 BS

Maya
482 TS 483 TS

RNA Std 1 484 NS

Run: 07-12-05, BioRad PCT100

Firdaus

RNA Std 2 485 TS

RNA Std 3 486 TS

RNA Std 4 052 TS

RNA Std 5 053 NS

Herdi Setiawan

NTC 476 TS

477 NS
In Juju

478 P

479 TS
Vervanya

306 bp
452 bp
306 bp
452 bp
 Interpretasi
Gel Based :
Hasil
Adanya hasil amplifikasi PCR yang terlihat sebagai
band/pita pada gel agarosa menandakan adanya
materi genetik virus flu burung pada spesimen,
tetapi bila tidak ada band/pita diinterpretasikan tidak
adanya materi genetik virus flu burung.
PC
 Interpretasi hasil RT-PCR
Dapat diiterpretasi jika
•Kontrol negatif memberi hasil negatif (tidak ada pita DNA)
•Kontrol positif memberi hasil positif (ada pita DNA)

Hasil negatif hanya menjatakan bahwa tidak ditemukan materi

pada spesimen yang diperiksa.
 REAL TIME PCR
Real-Time PCR: merupakan PCR kuantitatif (juga disebut PCR Kinetika)
yang memanfaatkan adanya pancaran flourescen selama reaksi PCR
berlangsung sebagai indikator adanya amplifikasi DNA pada setiap siklus
PCR yang diamati saat proses berlangsung (in a real time)

Sinyal flourescen meningkat secara proporsional dengan peningkatan

jumlah produk PCR

Dengan cara mencatat jumlah flourescen yang dipancarkan pada tiap

siklus, maka dimungkinkan untuk memonitor fase eksponensial PCR
terutama saat jumlah produk PCR berkorelasi dengan jumlah templat
target di awal

Semakin tinggi jumlah templat target di awal semakin cepat akumulasi

produk PCR terdeteksi. Adanya peningkatan pancaran flourescen
secara signifikan di atas nilai “baseline” menandakan adanya akumulasi
produk PCR.
Real-Time PCR ( r-PCR )
 Amplifikasi DNA dan deteksi hasil PCR
 Digunakan zat berfluoresen yang
dilabel pada probe
 Kuantitatif
Real-Time Chemistry
 SYBR Green I Dye
* Terikat dengan semua ddDNA =>
tidak spesifik
 Probe
* fragmen DNA berlabel => apesifik
 Real-time PCR

Primer Probe

Template ×
Primer Mutation

 
 
 
PCR
   
   
 
 
   
   
Probe is cleaved Probe is not cleaved
Increased fluorescence None fluorescence
fluorescence intensity

   
 
Real-time monitoring Real-time monitoring

Positive False-negative
Negative

PCR cycle number

 Real-time PCR chemistry
Probe

1) Denature
Primer F Q
Fluorescence Quencher

  Annealing
F Q
2) Polymerase
Hybridize

F
Q
3) Extension
Cleavage

F
Q
Hasil rRT-PCR
Hasil rRT-PCR . A12-A15 pengenceran
RNA 10 3, 10 4, 10 5 dan 10 6
Real Time :

Adanya materi genetik virus flu burung pada suatu

specimen (Positif H5) ditandai dengan nilai CT yang
lebih kecil dari nilai cutoff, sedangkan bila nilai CT diatas
cutoff maka specimen tersebut tidak mengandung
materi genetik virus flu burung (negative H5).
Tabel 2. Contoh Interpretasi hasil Real Time RT-PCR dari kit CDC Atlanta

Nilai CT Interpretasi hasil

< 40 Positif H5
> 40 Negatif H5
40 Borderline (pemeriksaan harus diulang
atau diperiksa dengan sets primer yang
lain)
PCR Laboratory Layout
Connecting Hallway

Clean Room Sample Prep Master Mix PCR Machine and

for Reagent Room + Analysis Room
Preparation (BSC-2) Sampel (Electrophoresis)
(BSC-1)

Direction of sample and personnel flow to minimize contamination

Laboratory Layout
Work place for Post-PCR
Work place for Pre-PCR

Cent Auto Frid Sink Sink Thermal cycler

Scale Camera
Storage rifug clav ge (3+1)
e e Reagents preparation
Therm
al
Safety RNA preparation Frid
cycler Sin Electrophoresis
ge
Cabine for k chamber
t Freezer real-
(-20C) time
PCR
Freezer Mixing of
(1+1)
(-80C) Freezer
Anteroom (-80C)
master mix Microwave
with positive oven
control
Amplificati Detection
on
Mixing of master mix Safety Computer
with sample solution Cabinet Freeze
r
(-20C)
Change shoes
Fridg
Fridg Here!!
e
e

Corridor
Biosafety Cabinet Class II
UV Cabinet PCR Workstation
Thermalcycler(PCR machine)
Electrophoresis Equipment
Real Time PCR machine (ABI)
 WESTERN BLOT

* Perinsip : Reaksi Ag - Ab dimana

Protein Antigen terlebih dahulu diseparasi
(dipisahkan ) berdasarkan berat molekul
pada SDS-PAGE Elektroporesis dan
ditransfer ( blot ) pada kertas
Nitrocellulose
* Sangat sensitif , dapat mendeteksi
kosentrasi yang sangat kecil ( picogram)
 Proses Western Blot:

1. Separasi Protein Antgen pada SDS – PAGE

2. Transfer ke Nitrocellulose
3. Reaksi dengan Antibodi
SDS – PAGE ELECTROPHORESIS
REAKSI DENGAN ANTIBODI
Profil Western Blot pada HIV
Contoh Pada HIV
Aplikasi
1. Penelitian Protein Antigen Agen
penyakit
2. Penelitian Immunologi
3. Penelitian Vaksin
4. Diagnosa
* Untuk Diagnosa saat ini sudah tersedia
Strip (Nitrocellulose ) yang
mengandung protein antigen yang
sudah diseparasi yang dapat langsung
dilakukan reaksi dengan serum antibodi