Milagros Quintana Cáceda

La identificación de los genes de respuesta a condiciones extremas como altas temperaturas, alta concentración de metales de arsénico, pH muy bajo permitiría el establecimiento de procesos mas rápidos y eficientes de tratamiento de minerales mediante biominería. En este proceso los sulfuros metálicos insolubles son oxidados a sulfatos metálicos solubles (Rawlings & Silver, 1995). En el presente informe se presentan los avances en el aislamiento y caracterización de las poblaciones de microorganismos acidófilos y quimilitotróficos bioxidantes de fierro y sulfuros actuantes en la biooxidación de arsenopirita. Se han aislado microorganismos del género Acidithiobacillus y Leptospirillum en cultivos de 105 ufc/ml en placa (proporción 1.5:1) identificados por morfología en coloración Gram y visualizados en el microscopio óptico (1000X).

La biooxidación en tanques industriales para la recuperación de oro refractario de la arsenopirita es un proceso eficiente aplicado en la industria minera por ser costo-efectiva y por tener un menor impacto ambiental que la extracción de oro por métodos convencionales. En este proceso los sulfuros metálicos insolubles son oxidados a sulfatos metálicos solubles facilitando la extracción del oro ocluido en el mineral. Las microorganismos quimioautotrofos más importantes usadas en procesos de biooxidación son Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, las cuales forman parte de la biodiversidad de microorganismos observados en los depósitos de minerales y efluentes ácidos ambientales. El presente estudio tiene como objetivo el aislamiento, la identificación y la caracterización molecular de las poblaciones de microorganismos actuantes en la biooxidación de arsenopirita para la recuperación
de oro en los tanques industriales de la mina Tamboraque y en drenajes ácidos de la mina. Los resultados indican que la biooxidación en los reactores y en los drenajes ácidos de la mina es llevado a cabo por un consorcio de microorganismos entre los que se encuentran los géneros
Acidithiobacillus y Leptospirillum, los cuales han sido cultivados en condiciones de laboratorio y caracterizados microbiológicamente por coloración gram y microscopia electrónica.

Working with amplification by polymerase chain reaction (PCR) of bacterial 16S rRNA gene, it has been possible to identify the main acidophilic chemolithoautotrophic iron and sulfur oxidizing microorganisms that participate in the biooxidation of arsenopyrite in
industrial tank of the Tamboraque mine as well as in the acid drainage of the same mine. The microorganisms recognized in the biooxidation industrial tank were: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp., Acidithiobacillus caldus-like organism and one Archaebacteria (possibly Ferroplasma-like organism) whereas in the culture of acid mine drainage they were: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp and Acidithiobacillus caldus-like organism.

As an advance towards the design of a strategy for bioremediation of the mine "El Dollar", the study of the quality of water flushing out of the mine and their impact in the Lagoon San Francisco (Huancavelica, Perú) was carried out. Analytic results obtained from field sampling in 2006 indicated that the water of the lagoon has not undergone significant impact due to heavy metal concentration. The concentration of Mg, Na and Ca in water suffered very little transformation during their journey from the mine entrance to the lagoon. The biggest transformation occurred with Zn, Cu, Fe, and Mn which are retained inside the terrestrial ecosystem. On basis of the observed results, Pb and Mn should be considered as elements of importance inside the plan of bioremediation of this ecosystem. Resumen Con el propósito de elaborar la estrategia de bioremediación de la mina "El Dollar", se desarrolló el estudio de la calidad del agua que sale de la mina y su impacto en la Laguna San Francisco. Los resultados analíticos obtenidos del muestreo de campo en 2006 indicaron que el agua de la laguna no ha sufrido un impacto significativo por la concentración de metales pesados. La concentración de Mg, Na y Ca en agua sufrió una transformación muy pequeña durante su viaje desde la entrada de la mina hasta la laguna. La mayor transformación ocurrió con el Zn, Cu, Fe y Mn, los que son retenidos dentro del ecosistema terrestre. En base a los resultados observados, el plomo y el manganeso deberían ser considerados como elementos de importancia dentro del plan de bioremediación de este ecosistema.

El objetivo de esta investigación fue aislar e identificar las bacterias que viven en el fondo de la pileta auxiliar del reactor nuclear RP-10 del Centro Nuclear RACSO. Se colectaron muestras de bacterias a partir del agua y de la superficie de un tapón de aluminio y se inocularon sobre diferentes medios de cultivo para su aislamiento. Para la caracterización fenotípica se usaron técnicas microbiológicas como la coloración de Gram, coloración de esporas y pruebas bioquímicas. Esto ha permitido identificar presencia de diferentes géneros bacterianos tales como Bacillus, Staphylococcus y bacilos gram negativos. A su vez se muestran avances en la identificación molecular así como en la estandarización de la extracción de ADN y amplificación parcial del gen 16S rRNA por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Cell-based Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) with anti-endoglin VHH antibodies microarray on a gold-covered biochip was used to characterize the binding to endoglin expressed on the surface membrane of SC cells. SPRi showed the specific capture of SC cells by the immobilized anti-endoglin VHHs, but not of THP-1 cells that do not express endoglin on their plasmatic membrane. The SPRi reflectivity shifts with SC cells bound by anti-endoglin VHHs ranged from 3.59 to 5.54% (average 4.66 ± 1.18%) and with THP-1 cells from 2.23 to 3.05% (average 2.62 ± 1.32% (p < 0.001)) and the SC cell densities with anti-endoglin VHHs ranged from 417 to 747.7, (average 548 cells/2.28 × 105 μm2 ± 132). Anti-endoglin VHHs bind epitopes located in the extracellular domains of endoglin with different avidity as suggested by the differences in SC cell densities. The cell-based SPRi of anti-endoglin VHH microarrays can be used both in studies aimed at a better understanding of endoglin function in living cells and in VHH applications as nanoprobes.

Background: Human adipose tissue-derived stem cells (ASCs) are widely used in regenerative medicine and tissue engineering. Magnetic-activated cell sorting (MACS) with monoclonal antibodies (mAbs) that bind surface markers of stem cells such as CD105, CD73, and CD90 is currently applied for the enrichment and isolation of ASCs. Alternatives to mAbs are the variable domains of heavy chain antibodies (VHHs), which are naturally produced in camelids. We report the application of an anti-CD105 VHH conjugated to magnetic beads in the isolation of ASCs in vitro. Results: Two identical anti-CD105 VHHs (EngVHH17) were screened by phage display from a VHH cDNA library constructed from the PBMCs of an alpaca immunized with a lysate of human bladder cancer cell line (T24 cells). EngVHH17 was cloned in pET22b(+), expressed in Escherichia coli BL21 and purified in Ni-NTA chromatography resulting in a $15 kDa VHH antibody. EngVHH17 binds CD105 with high affinity (Kd = 3.9 Â 10 À10 M). The specific binding of EngVHH17 to CD105 was visualized by fluorescence inmunolabeling of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated THP1 cells using FITC labeled anti-6 Â His Tag IgG1 mouse mAb. EngVHH17-magnetic beads selectively sorted human ASCs from osteoblasts in a mixed culture in vitro. The selective recovery of ASC cells using different ASC/Osteoblast ratios was higher than 85%.

Los microorganismos nativos de ambientes mineros han sido siempre de interés por su capacidad de adaptación a la extrema acidez y concentración de minerales. Los estudios de diversidad microbiana se han incrementado por la importancia de estos microorganismos en procesos industriales de biooxidación y por el interés en determinar la forma de modificar un ambiente minero hacia un resultado deseado. En
ésta investigación se determinó la diversidad microbiana de los drenajes ácidos de las minas Sipán, Casapalca y Julcani, de los drenajes minero termales de Huancahuasi y Picoy y de los tanques de incremento de inóculo y de biooxidación industrial de arsenopirita de la mina Tamboraque, utilizando técnicas microbiológicas y técnicas dependientes de amplificación por PCR del 16S ARNr bacteriano (T-RFLPs, primers específicos y comparación de secuencias génicas). El autótrofo presente en todas las muestras fue Acidithiobacillus ferrooxidans y fue
también el de mayor abundancia en todas las muestras excepto en la proveniente del tanque de incremento de inóculo de Tamboraque donde fue Leptospirillum ferrooxidans. A. thioxidans no estuvo en ninguna muestra, mientras que A. caldus se halló en drenajes ácidos y en los tanques de Tamboraque. Otros microorganismos identificados fueron el mixótrofo Sulfobacillus sp. y los heterótrofos Acidisphaera rubrifaciens, Acidicaldus organivorans, Acidocella sp. y Acidiphilum sp. Las abundancias relativas de los 3 principales microorganismos encontrados en las muestras obtenidas por T-RFLPs fueron comparadas con las obtenidas por cuantificación de ellos con FISH hallándose resultados similares.

Se obtuvieron diecinueve VHHs (dominios variables únicos de los anticuerpos de cadena pesada) que unen a CD105 (endoglina) humano, un co-receptor endotelial de TFG-β implicado en la regulación de la angiogénesis y el desarrollo de tumores, mediante screening por phage display de una biblioteca de ADNc de VHH obtenida de alpacas inmunizadas con un lisado de una línea celular de cáncer de vejiga que
sobreexpresa CD105 (T24). Las secuencias de los VHH se analizaron con ExPASY, GeneDoc y BLAST y mostraron las características estructurales típicas de los VHHs. Ellas se clonaron y expresaron en pET22b(+)/E.coli y los VHHs recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad. Trece VHHs anti CD105 fueron microarreglados en biochips para determinar la especificidad y afinidad a CD105 unido a membrana celular por SPRi, Los datos de SPRi mostraron que los VHHs unen a las células SC, que sobreexpresan CD105, pero no o poco a las células THP-1, que no lo hacen, demostrando especificidad. Los VHHs se agruparon según su especificidad y aproximación de afinidad por SPRi. Los seis VHHs anti-CD105 mejor clasificados, que se unen con alta especificidad y afinidad a CD105 en solución y unido a membrana celular, pueden utilizarse tanto en
estudios de la función de CD105 como en nanosondas para el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades en que la angiogénesis desempeña un papel importante.

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