Metodologias para a realização do Hemograma Completo

Para a realização do hemograma completo existem as técnicas manuais

e as técnicas automatizadas. A contagem manual de eritrócitos ao microscópico
na câmara de Neubauer é inexata e por isso está abandonada, a contagem de
leucócitos quando feita por técnicos experientes, é aceitável, para fins clínicos,
porém, com os processos de automação atuais, também está em desuso. A
automação do hemograma possibilitou a realização de exames muito mais
precisos e reprodutíveis, porém, o conhecimento das técnicas manuais antigas
é de suma importância, uma vez que imprevistos podem ocorrer em qualquer
laboratório.

Métodos manuais do processo de determinação do hemograma:

Manualmente, a contagem de eritrócitos, leucócitos e plaquetas é feita
na câmara de Neubauer, após diluição da amostra em líquidos específicos e
multiplicando o valor obtido pelos fatores correspondentes. A câmara de
contagem de Neubauer consiste em uma lâmina retangular de vidro espesso,
contendo dois retículos.
O retículo é um quadradinho que por sua vez é subdividido em nove
quadrados. Os quatro quadrados externos são subdivididos em 16 quadrados
menores onde são contados os leucócitos. A contagem de hemácias é feita no
quadrado central que é subdividido em 25 quadrados menores. Já as plaquetas
são contadas em todo o retículo central. A contagem é realizada em um
microscópio.
A dosagem manual da hemoglobina mais recomendada é feita após a
lise dos eritrócitos e estabilização da hemoglobina. Em seguida, é realizada a
leitura colorimétrica. A absorbância da solução é medida no espectrofotômetro
ou em fotocolorímetro.
A Determinação manual do hematócrito é feita por meio da centrifugação
(método do hematócrito de Wintrobe) de capilares de vidro contendo a amostra
de sangue do paciente (micro-hematócrito). Após a centrifugação é feita a leitura
utilizando escala própria.
Já o Cálculo dos Índices Hematimétricos são obtidos por meio de cálculos:

VCM = (Ht / Hem) x 10

HCM = (Hb / Hem) x 10
CHCM = (Hb/Ht) x 100
Onde: Ht = Hematócrito; Hb = Hemoglobina e Hem = número de eritrócitos
A análise da extensão sanguínea e das alterações morfológicas dos eritrócitos,
leucócitos e plaquetas é realizada por esfregaço, via microscopia.
Métodos do processo de automação do hemograma:
1) Impedância elétrica: Contam os pulsos de condutividade causados pelos
glóbulos ao cruzarem um orifício pelo qual flui uma corrente elétrica. Neste
método, um volume constante de solução constituída de sangue e
diluente passa através de um orifício, onde ocorre a passagem de
corrente elétrica, provocando um aumento considerável da impedância
elétrica à medida que cada célula passa pelo campo, sendo que esse
aumento é proporcional ao volume celular. Por este método também
podem ser contados plaquetas e leucócitos. Neste caso, o aparelho
também registra um pico correspondente ao tamanho dessas células.
Esse método pode causar deformações e turbilhonamento nas hemácias,
as quais são descontadas e podem chegar a 30% do total, provocando
perda na sensibilidade.

2) Impedância elétrica focada: A impedância elétrica focada, ao contrário

do método tradicional, usa alguns diluentes que contém reagentes como
o reagente Sheath que cria um fluxo laminar de células pelo orifício,
permitindo que elas passem pelas tubulações sem sofrer deformações
que ocorrem no método tradicional. Algum desses contadores eletrônicos
de células determinam, além dos parâmetros habituais como número de
eritrócitos e leucócitos por mm3 e concentração de hemoglobina, o valor
real do VCM, HCM, CHCM, RDW e o PDW e fornecem os histogramas de
distribuição de volume dessas células.

3) Técnica de dispersão a laser: Atualmente os computadores eletrônicos

são capazes de realizar a contagem diferencial dos leucócitos por meio
da técnica denominada Ponto Final. Neste método, a amostra é diluída
com uma solução hipotônica, causando a lise dos eritrócitos, e em
seguida os leucócitos passam por um processo chamado esferotização,
onde é utilizado um reagente leucoprotetor. Eles são carreados para uma
zona sensitiva onde são diferenciados por suas características de volume,
condutividade elétrica e dispersão da Luz.

Vantagens dos métodos automatizados em relação aos manuais:

• Grande número de células contadas e avaliadas;

• Os hemogramas anormais são sinalizados por “flags” que
indicam a necessidade de revisão pela microscopia
convencional;
• Os “flags” fornecem subsídios morfológicos sobre todas as
séries do hemograma que auxiliam na avaliação das lâminas.

Metodologias para a realização do Perfil Lipídico

Metodologias empregadas para o Colesterol Total:
Liebermann-Buchard:

Reação de cor verde ou verde-azulado do colesterol com o H2SO4 e anidrido

acético. Sofre interferência de bilirrubina, proteínas e hemoglobina.

Abell-Kendall:

Método multietapas que constitui uma melhoria do método anterior, sendo capaz
de minimizar os efeitos interferentes positivos e negativos. Envolve a
saponificação do colesterol éster por uma base forte (hidróxido), extração com
éter de petróleo, com finalmente o desenvolvimento da cor por adição de H2SO4
e anidrido acético.

Método Enzimático Colorimétrico:

Sequência de reações sobre o éster de colesteril que envolvem as enzimas

colesteril-éster, colesterol oxidase e peroxidase, respectivamente, resultando em
um produto que é um corante chamado de quinonimina. Como a reação é
colorimétrica, absorbância é medida, em espectrofotômetro em cerca de 500nm
ou por automação. Os métodos enzimáticos estão sujeitos a interferências de
outros compostos coloridos ou daqueles que competem com a reação de
oxidação tais como a bilirrubina, o ácido ascórbico e a hemoglobina. Esse tipo
de reação não é inteiramente específica para o colesterol.

Metodologia para a Dosagem de Triglicerídeos

Método de referência (Complexação):

Para dosagem de triglicerídeos, antigamente era usado o método de

complexação, mais este caiu em desuso por causa do uso do clorofórmio, que é
tóxico para o pulmão. Foi o primeiro teste a ser feito e é bem sensível, sendo
usado, hoje, para validar novos kits de dosagem. Neste método, os triglicerídeos
sofrem uma série de reações que culminam em um produto cromogêno que é
quantificado espectrofotometricamente.
Método Enzimático:

É um método enzimático colorimétrico, indireto (o resultado final não é a

substância de interesse, mas o indicativo dela). Os triglicerídeos sofrem uma
sequência de reações pelas enzimas lipase, glicerolquinase, glicerolfosfato
oxidase e peroxidase, respectivamente, culminando em um produto chamado
corado chamado de quinonimina. A absorbância desse produto é medida pelo
espectrofotômetro (em torno de 505 nm) e é diretamente proporcional a
concentração de triglicerídeos.

Metodologias para a dosagem das lipoproteínas - Métodos de

ultracentrifugação
Ultracentrifugação preparativa:

O plasma é centrifugado sequencialmente em densidades diferentes (d=

1,006 kg/L e d= 1,063 kg/L) e as concentrações de colesterol da flutuação
respectiva de VLDL e das frações LDL são quantificadas como índice das
concentrações dessas lipoproteínas. O colesterol no infranadante, em d= 1,063
kg/L corresponde quase que exclusivamente ao HDL.
Emprega-se então uma equação que é capaz de estabelecer uma
correlação entre a concentração de colesterol total e triglicerídeos totais com a
concentração de cada lipoproteína. Neste método, os valores do colesterol total
(CT), triglicerídeos (TAG) e colesterol HDL (HDL-C), são medidos e o colesterol
LDL (LDL-C) é calculado a partir das mensurações primárias por meio do uso da
equação empírica de Friedewald, onde todas as concentrações são dadas em
mg/dl:
CT= [HDL-C] + [LDL-C] + [VDL-C]

[LDL-C] = CT – [HDL-C] - [TAG]/5

É preciso ressaltar que, na prática, essa equação não deve ser usada
quando as amostras de triglicerídeos apresentam valores acima de 400 mg/dl,
ou as amostras contém quilomícrons em quantidades significativas o paciente
apresenta uma disbetalipoproteinemia.

Metodologias empregadas no exame de urina:

Análise Física:

A urina pode ser avaliada pela aparência física (cor, turbidez, odor e volume),

chamada também de análise macroscópica.

Cor: Examinar a amostra com boa fonte de luz;

Turbidez: Realizado pelo exame visual da amostra com boa fonte de luz;

Odor: Embora raramente tenha significado clínico, um odor de urina forte pode
ser indicativo de infecções bacterianas e presença de corpos cetônicos do
diabetes (odor adocicado ou de frutas).
Volume: A determinação se faz através de provetas graduadas, rigorosamente
limpas. Na análise, o volume só tem valor clínico se o volume total de urina for
colhido nas 24 horas.

Densidade: Existem vários métodos para medir a densidade específica: Fitas

reativas, refratômetro e urinomêtro.
Refratômetro: Determina a concentração das partículas dissolvidas na amostra

medindo o índice de refratividade. Esse índice é uma comparação da velocidade

da luz na solução, que, por sua vez, depende da concentração das partículas

presentes e determina o ângulo de passagem da luz através da solução. A leitura

é feita em escala específica. A densidade depende do grau de hidratação do

paciente, variando de 1001 à 1035. O refratômetro tem a vantagem de

determinar a densidade usando um pequeno volume de amostra (1 a 2 gotas).

Urinomêtro (urodensimêtro): É constituído por uma boia com peso ligada a

uma régua calibrada em termos de densidade urinária. A boia pesada desloca
um volume de líquido igual ao seu peso e é projetada para afundar até nível
1,000 em água destilada. O restante da massa, representado pelas substâncias
dissolvidas na urina, faz com que a boia desloque um volume de urina menor
que o de água destilada. O nível até o qual o urodensimêtro afunda, representa
a massa da amostra ou sua densidade. A desvantagem é que necessita grandes
volumes de urina (10-15ml).
Análise Química:
São realizados por meio de tiras reagentes, constituídas de pequenos quadrados
de papel absorvente impregnados com substancias químicas e presos a uma tira
de plástico. São interpretadas por comparação com a tabela cromática fornecida
pelo fabricante, permitindo a obtenção de um resultado semiquantitativo:
vestigial, 1+, 2+, 3+ e 4+.
pH: A reação da urina é verificada pelas tiras reagentes, que medem o pH em
variações de 1 unidade, entre 5 e 9.
Proteínas: O método da fita reagente utiliza o princípio do "erro dos indicadores
pelas proteínas" e, dependendo do fabricante, a área para a determinação de
proteínas na tira contém tetrabromofenol ou tetraclorofenol e um tampão ácido
para manter o pH em nível constante. Mergulha-se a urina homogenizada na tira
e a leitura é feita após 60 segundos.
Pesquisa de proteínas pelo método ácido sulfossalicílico:
Coloca-se 1 ml da urina limpa (sobrenadante de urina após centrifugação) e
acrescenta-se 6 ml de ácido sulfossalicílico a 3%. Agita-se suavemente e deixa-
se em repouso por 5 minutos. Quando positivo, haverá turvação do líquido
diretamente proporcional à quantidade de proteína na urina.
Cetonas: O teste com fita utiliza a reação do nitroprussiato de sódio que irá
reagir com o ácido acetoacético e a acetona em meio alcalino, produzindo
coloração, Como não detecta o beta-hidroxibutírico, o resultado positivo pode ser
confirmado pelo teste de Imbert. É importante saber que a ação das bactérias
degrada o ácido acetoacético tanto in vivo como in vitro. A acetona, que é volátil,
é perdida em temperatura ambiente, mas isso não ocorre se amostra estiver num
recipiente fechado e refrigerado.
Bilirrubina: O teste para bilirrubina é baseado numa reação de diazotização, a
reação baseia-se na conjugação da bilirrubina com o sal azóico em meio ácido.
A urina deve ser fresca.
Glicose: Feito com fitas reativas, utiliza o método da glicose oxidase, peroxidase
e tampão para produzir uma reação enzimática dupla sequencial. As fitas diferem
em relação ao cromogêno utilizado. O teste de glicose oxidase é específico para
glicose, não reage com lactose, galactose, frutose ou metabólitos redutores de
drogas. A reação, sendo positiva, deve ser confirmada pelo método de Benedict.
Urobilinogênio: O teste é feito com tira reagente e utiliza-se um sal de diazônio
estável que produz, em presença do urobilinogênio, um composto azóico que
varia de rosa até vermelho. O Resultado positivo deve ser confirmado pelo teste
pelo método de Erlich.
Sangue: As análises químicas da fita para detecção de sangue utilizam as
atividades da peroxidase da hemoglobina. Existem duas escalas cromáticas
separadas para hemácias e hemoglobina. Na presença de hemoglobina livre,
aparecerá uma cor uniforme. Em contraposição, as hemácias íntegras são
lisadas ao entrarem em contato com a área da tira que determina a presença ou
ausência de sangue e a hemoglobina liberada produz uma reação isolada que
resulta na formação de pequenas manchas (traços). A análise da fita estabelece
a diferença de hemoglobinúria e hematúria e não sua quantificação. Se positivo
para hemácias, sua quantificação é realizada na câmara de Neubauer.
Leucócitos: O teste com fita reagente utiliza as esterases presentes nos
granulócitos. Possui uma sensibilidade de 81 a 94% e uma especificidade de
69% a 83% quando a fita apresenta resultado positivo para leucócitos, a
quantificação deve ser realizada na câmara de Neubauer.
Exame microscópio da urina
Exames qualitativos e quantitativos do sedimento urinário:
Os componentes do sedimento urinário são: As de hemácias, as células
epiteliais, os leucócitos e os cilindros.
Metodologia: São utilizadas a mostras recentes ou corretamente conservadas.
Após o exame físico-químico. medir 10 ml de urina homogeneizada em um tubo
cônico; centrifugar 1500 rpm por 5 minutos; retirar 9 ml do sobrenadante e
reservar (para as provas complementares); após deixar 1 ml, agitar o sedimento
vigorosamente.
Exame qualitativo: Após homogeneizado o sedimento, colocar uma gota 50 µl
do sedimento na lâmina de microscopia, e cobrir com uma lamínula. Examinar
ao microscópio, pelo menos 10 campos, verificando se a destruição dos
elementos está uniforme. O resultado será dado em elementos figurados, por
campo microscópio, estabelecendo uma média. A contagem deve ser feita em
aumento de 40 vezes.
Exame quantitativo: Após homogeneizar o sedimento preenche-se a câmara
de Neubauer e, com a objetiva de 10x, percorre-se a câmera em toda sua
extensão, para verificar se a distribuição dos elementos está uniforme ,e após
isso, faz a contagem em aumento de 40x. Para a obtenção do número de células
epiteliais por ml de urina, conta se os 4 quadrantes laterais da câmera de
Neubauer, multiplicando-se o número de células contadas por 250. Para
obtenção do número de leucócitos por ml, conta-se os 4 quadrantes laterais da
câmara de Neubauer, multiplicando o seu número de células contadas por 250.
A contagem de hemácias é realizada no retículo central da câmera de Neubauer,
multiplicando-se o número de células por 1000.

Exame parasitológico de fezes:

1. Método direto: Método onde as fezes são examinadas ao microscópio,
diluídas em densidades determinadas. As fezes devem estar frescas ou
bem conservadas;
2. Método de concentração de fezes: Facilitam o encontro de parasitas
diminuindo as matérias fecais na preparação a ser observada ao
microscópio. Envolvem três outros métodos:
• Método da Sedimentação (Método de Hoffman): Os parasitas
são concentrados nos sedimentos obtidos por gravidade ou
centrifugação;

• Método de Flutuação (Método de Ritchie - fezes frescas;

Método de Ritchie – fezes conservadas; Método de Faust;
Método de Willis): Os parasitas flutuam ou são condensados no
sedimento por meio de uma solução de densidade diferente da
sua. A desvantagem desse método de flutuação é que se as fezes
forem preservadas, podem causar distorção em cistos de
protozoários e larvas ou mesmo causar a abertura de opérculos,
impedindo o parasita de flutuar. Se a amostra for primeiramente
fixada em formalina, esta inconveniência não ocorre;

• Método de Migração (Método de Baermann; Método de Rugai;

Método de contagem de ovos nas fezes): Certas larvas vivas
migram para fora do material fecal e são coletadas no fundo de um
funil.