Mutagênese Dirigida Por Oligonucleotídeos: Bases Históricas e Suas Aplicações em Engenharia Genética

Documentos
ISSN 1518-4277
Dezembro, 2017 217
Mutagênese Dirigida por

Oligonucleotídeos: Bases Históricas
e suas Aplicações em Engenharia
Genética
Emprego da recombinação homóloga na edição de genomas
nucleases
engenheiradas
(ZFN, TALEN, CRISPR-Cas9)

ISSN 1518-4277
Dezembro, 2017
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Embrapa Milho e Sorgo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Documentos 217
Mutagênese Dirigida por

Oligonucleotídeos: Bases
Históricas e suas Aplicações
em Engenharia Genética
Maria José Vilaça de Vasconcelos

José Edson Fontes Figueiredo

Sete Lagoas, MG
2017
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Normalização bibliográfica: Rosângela Lacerda de Castro
Tratamento de ilustrações: Tânia Mara Assunção Barbosa
Editoração eletrônica: Tânia Mara Assunção Barbosa
Foto(s) da capa: José Edson Figueiredo Fontes
1ª edição
Formato digital (2017)
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te, constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Vasconcelos, Maria José Vilaça de.
Mutagênese dirigida por oligonucleotídeos: bases históricas

e suas aplicações em engenharia genética / Maria José Vilaça
de Vasconcelos, José Edson Fontes Figueiredo. -- Sete Lagoas :
Embrapa Milho e Sorgo, 2017.
43 p. : il. -- (Documentos / Embrapa Milho e Sorgo, ISSN
1518-4277; 217).
1. Melhoramento genético. 2. Genética. 3. Genoma. I.

Vasconcelos, Maria Jose Vilaça de. II. Figueiredo, José Edson
Fontes. III. Título. IV. Série.
CDD 631.52 (21. ed.)

© Embrapa 2017
Autores
Maria José Vilaça de Vasconcelos

Farmacêutica/Bioquímica, Ph.D, Pesquisadora
na Embrapa Milho e Sorgo, Rod MG 424 Km 45,
Zona Rural, CEP 35701-970 Sete Lagoas, MG,
mariajose.vasconcelos@embrapa.br
José Edson Fontes Figueiredo

Biólogo/Bioquímico, Ph.D,, Pesquisador na Em-
brapa Milho e Sorgo, Rod MG 424 Km 45, Zona
Rural, CEP 35701-970 Sete Lagoas, MG,
jose.edson@embrapa.br
Apresentação
A adaptação das culturas em um ambiente dinâmico impõe a

necessidade de diversificação das estratégias de melhoramento
genético visando o aumento da produtividade das culturas.
Na segunda metade do século XX, as mutações aleatórias no

DNA, induzidas por agentes físicos e químicos, tiveram grande
relevância no melhoramento vegetal como fonte de introdução
de variabilidade genética em populações de plantas cultivadas.
A partir dos anos 1970, foram estabelecidos os pilares para

a manipulação da molécula de DNA e a transformação de
microrganismos, plantas e animais, possibilitando vislumbrar
uma nova era para a manipulação genômica.
O desenvolvimento da técnica de mutagênese sítio-dirigida,

baseada nos princípios da complementaridade de bases
do DNA e na recombinação gênica, possibilitou a geração
de alterações planejadas, precisas e eficientes em qualquer
genoma. Em decorrência dessa inovação, grandes avanços
foram obtidos no melhoramento de diferentes espécies.
Nesse documento apresentamos os princípios da mutagênese

sítio-dirigida, os avanços científicos e práticos do uso dessa
técnica e as perspectivas do seu emprego para o melhoramento
vegetal, com ênfase em milho e sorgo.
Antonio Alvaro Corsetti Purcino

Chefe-Geral
Sumário
Introdução. ......................................................................................................... 7
Histórico . ............................................................................................................ 9
Recombinação Gênica ...............................................................................11
Recombinação Homóloga (RH) ou Geral ..................................... 12
Recombinação não Homóloga ou “Ilegítima”........................... 13
Recombinação Sítio-Específica ........................................................... 14
Recombinação Replicativa e não Replicativa. ............................ 16
Estratégias de Engenharia Genética Empregando
Recombinação Homóloga (RH) .......................................................... 18
Mecanismos da Mutagênese Dirigida por
Oligonucleotídeos (ODM) ...................................................................... 20
PCR e Montagem de Fragmentos de DNA sem Uso de
Enzimas de Restrição................................................................................. 24
Método Isotérmico para Mutagênese ............................................. 25
Métodos Usados de Introdução do Gene Mutado
no Hospedeiro ............................................................................................... 26
Recombinação Homóloga Intragenômica ................................... 28
Aplicações da Mutagênese Dirigida por
Oligonucleotídeos (ODM) ....................................................................... 29
Referências ....................................................................................................... 31
Mutagênese Dirigida
por Oligonucleotídeos:
Bases Históricas e suas
Aplicações em Engenharia
Genética
Maria José Vilaça de Vasconcelos1
José Edson Fontes Figueiredo2
Introdução
No último século, os avanços nas áreas da herança genética,

da bioquímica dos ácidos nucleicos e dos fenômenos naturais
de recombinação gênica possibilitaram o surgimento de
várias técnicas para manipulação de genes e genomas. Entre
essas técnicas, Oligonucleotide Directed Mutagenesis (ODM)
ou mutagênese sítio-dirigida criou novas alternativas para o
melhoramento de microrganismos, animais e plantas.
ODM tem sido utilizada para corrigir ou fazer alterações

em sítios específicos no DNA, permitindo gerar alterações
na sequência de aminoácidos das proteínas, silenciamento
gênico e modificações de sequências regulatórias, acarretando
alterações no padrão da expressão gênica. Essa gama de
possibilidades gerou grande quantidade de alterações em
diferentes genomas visando o estudo das funçoes gênicas
e obtenção de novas combinações de nucleótídeos para o
melhoramento de qualquer organismo. Em algumas espécies
de plantas, os métodos de cultivo de células e a regeneração
8 Mutagênese Dirigida por Oligonucleotídeos: Bases Históricas e suas Aplicações em
Engenharia Genética
de plantas ainda representam entraves para utilização dessa

técnica. Contudo, ODM tem sido utilizada com bastante
sucesso para produzir milho, trigo, tabaco e colza resistentes
a diferentes tipos de herbicida. Entre as perspectivas para o
uso de ODM destacam-se o aumento da vida útil de variedades
de plantas, tolerância aos estresses abióticos, resistência a
pragas e doenças, melhoramento do desempenho agronômico
de cultivares, alteração do teor de ácidos graxos nas células e
composição de aminoácidos das proteínas. Em milho, um dos
principais objetivos consiste do melhoramento da qualidade
nutricional, pela adição de aminoácidos essenciais às proteínas
de reserva.
Até o início do século XX, as mutações espontâneas eram

a única fonte de variação que podia ser explorada para
o melhoramento genético de animais e plantas. Com os
fundamentos da genética estabelecidos pelos trabalhos
de Gregor Mendel com ervilha (1865), e os resultados de
estudos sobre os efeitos das radiações ionizantes e de agentes
químicos sobre os organismos, vislumbrou-se uma nova
era para o melhoramento genético. Os trabalhos pioneiros
de Stadler no final da década de 1920 marcaram o início do
melhoramento de plantas baseado nas mutações induzidas
(STADLER, 1928a, 1928b). Em razão do volume de variedades
mutadas (aproximadamente 77) acumuladas ao longo de
aproximadamente três décadas (AUERBACH; ROBSON,
1944), foi criada em 1964 a Divisão de Técnicas Nucleares
na Agricultura (Division of Nuclear Techniques in Food and
Agriculture) com o apoio da FAO (Food and Agriculture
Organization of the United Nations) e da IAEA (International
Atomic Energy Agency), possibilitando a criação de grupos
de melhoramento de plantas por mutações induzidas em
Mutagênese Dirigida por Oligonucleotídeos: Bases Históricas e suas Aplicações em 9
diferentes países do mundo. No Brasil, foi criado, em 1964, o

Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), sediado na
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ/USP, que
passou a coordenar e executar estudos realizados por diversos
pesquisadores brasileiros trabalhando com diferentes culturas.
Como resultado desse esforço, até o final do ano de 2009,
o número de variedades comerciais, criadas por mutações
induzidas, alcançou a marca de 3.088 em todo o mundo (FAO,
2011). Durante os últimos vinte anos, com o desenvolvimento
da biologia molecular, diferentes técnicas foram incorporadas
às pesquisas de mutagênese em plantas. Mutantes induzidos
por meio dessa abordagem se tornaram parte fundamental dos
estudos na área de genômica funcional (BISHOP et al., 2004;
BOCK, 2001; KHARKWAL, 2011; FORSTER; SHU, 2011; OLADOSU
et al., 2016; STADLER, 1928a, 1928b; STUCKEY; STORICI, 2013;
SZTUBA-SOLINSKA et al., 2017; TERADA et al., 2007).
Histórico
As descobertas científicas que culminaram com o

estabelecimento da função da molécula de DNA como
portadora das informações necessárias para o funcionamento
e herança celular tiveram início em 1869, quando o bioquímico
suíço Johann Friedrich Miescher estudou os componentes
químicos do núcleo de células linfoides isoladas do pus de
bandagens de infecções (DAHM, 2005). Miescher conseguiu
identificar uma molécula composta de hidrogênio, oxigênio,
nitrogênio e fósforo e demonstrou a existência de uma única
ligação entre o fósforo e o nitrogênio presentes na molécula, a
qual chamou de nucleína. Em 1881, o bioquímico alemão
Albrecht Kossel determinou o caráter ácido da nucleína, que
passou a ser chamada de ácido desoxirribonucleico ou DNA.
Na realidade, Kossel não sabia que suas amostras consistiam

de uma mistura de moléculas de DNA e RNA e por isso isolou
delas cinco nucleotídeos: adenina (A), citosina (C), guanina (G),
timina (T) e uracil (U). Hoje sabemos que a timina é encontrada
apenas no DNA e o uracil, no RNA (Kossel 1881).
Em 1928, Frederick Griffith descobriu o princípio genético

da transformação ao demonstrar que extratos de linhagens
virulentas da bactéria Streptococcus pneumoniae mortas pelo
calor eram capazes de transformar linhagens avirulentas (-)
em virulentas (+), portanto capazes de causar pneumonia em
camundongos. Embora não tenha conseguido isolar o princípio
transformante, Griffith supôs que alguma substância na capa
de polissacarídeo das bactérias mortas tinha sido responsável
pela transformação de bactérias avirulentas em virulentas
(GRIFFITH, 1928).
Nos anos seguintes, os esforços de vários cientistas se

concentraram na descoberta da natureza química dessa
molécula cuja função permanecia desconhecida. Assim,
entre os anos de 1943-1944, Oswald Avery, Colin MacLeod,
e Maclyn McCarty conseguiram demonstrar que o princípio
transformante nos experimentos de Griffith era o DNA.
Em 1953, após reunirem informações de diferentes grupos
independentes (Phoebus A. T. Levene, Erwin Chargaff, Rosalind
Franklin e Maurice Wilkins), James Watson e Francis Crick
conseguiram determinar a estrutura helicoidal do DNA
(ALDRIDGE, 2003).
Após ter sido estabelecida a estrutura do DNA e o seu

papel como portador de toda informação necessária para
o funcionamento celular e hereditariedade, teve início uma
nova corrida visando determinar os efeitos de mutações

aleatórias induzidas por agentes físicos e químicos no
DNA, suas consequências nas funções celulares e o seu
papel no melhoramento genético de plantas (SMITH 1958;
GOODSPEEDE; OLSOM, 1928; DATTA, 2012).
No início da década de 1970 estudos de manipulação enzimática

do DNA forneceram os pilares para o vasto campo da
engenharia genética de seres vivos. Após quase meio século de
avanços, a tecnologia do DNA recombinante tornou realidade
a transgenia, a genômica e a possibilidade da clonagem
reprodutiva (COHEN et al., 1972; JACKSON et al., 1972; SMITH;
WELCOX, 1970).
Atualmente, em oposição às mutações aleatórias produzidas

por agentes químicos e físicos, o desenvolvimento da técnica
de melhoramento genético por mutagênese sítio dirigida,
empregando os princípios da complementaridade de bases e
recombinação gênica, tem possibilitado introduzir alterações
planejadas, precisas e eficientes em qualquer genoma
(PARCKER, 2017).
Recombinação Gênica
Na natureza, pelo menos quatro tipos diferentes de

recombinação gênica foram identificados: recombinação
geral ou homóloga (RH); não homóloga, também denominada
heteróloga ou ilegítima; recombinação sítio-específico e
recombinação replicativa. Os aspectos particulares de cada uma
delas serão resumidamente descritos a seguir.
Recombinação Homóloga (RH) ou

Geral
Esse tipo de recombinação ocorre entre moléculas de DNA

com sequências de nucleotídeos muito similares, como, por
exemplo, entre os cromossomos homólogos em organismos
diploides. A RH, que pode acontecer ao longo de todo o
genoma de um organismo, envolve a participação de enzimas
recombinatórias. Como consequência, a RH aumenta a
diversidade genética e desempenha papel crucial no reparo
de danos físicos e químicos na molécula de DNA, mantendo a
estabilidade do genoma (VAN GENT et al., 2001; WEST, 2003).
RH também pode gerar a transferência unilateral da informação

genética resultando na conversão de um ou mais alelos
de um dos cromossomos homólogos, na forma alélica do
outro cromossomo (Figura 1). Essa variante da RH é também
denominada de conversão gênica. Na recombinação entre dois
cromossomos homólogos, sendo um deles portador dos genes
A B D e o outro com a constituição a b d, pode resultar um
novo arranjo a B d sem ocorrência de alteração no cromossomo
parental A B D. Nessas situações, claramente ocorreu uma
conversão do alelo b em B. A troca não foi recíproca, pois
teria originado as combinações a B d / A b D, caso tivesse
ocorrido recombinação dupla envolvendo as duas regiões
cromossômicas envolvendo os genes A e B e B e D. Exemplos
de conversão gênica intracromossômica têm sido amplamente
descritos na literatura científica para genes de gama globulinas
humana (CHEN et al., 2007; HOFFMANN et al., 2008).
Figura 1. Tipos de Recombinação homóloga. O pareamento

entre os segmentos de DNA ocorre por alta homologia das
sequências de nucleotídeos entre os DNAs da célula e envolve a

participação de enzimas específicas ou recombinases. Na figura,
as letras maiúsculas representam os alelos selvagens e as letras
minúsculas indicam as formas alélicas mutantes. O X indica
o ponto de formação de quiasma entre as cromátides irmãs
(apenas uma cromátide de cada cromossomo foi representada
na figura).
Recombinação não Homóloga ou

“Ilegítima”
Esse tipo de recombinação ocorre entre regiões cromossômicas

não homólogas, ou seja, que não apresentam similaridade de
sequências de nucleotídeos. A ocorrência de recombinação
ilegítima é comum em segmentos cromossômicos translocados
ou apresentando deleções gênicas e funciona como um sistema
de reparo aleatório, de danos físicos no DNA (BUKHARI et al.,
1977; ROTH et al., 1985; KUSANO et al., 1997). A existência de
pequenas regiões de similaridade entre os pontos de quebra
e o cromossomo íntegro pode gerar recombinação entre
genes diferentes que estão localizados em pontos bastante
distantes, muitas vezes separados por milhares de pares de
bases, no mesmo cromossomo ou em cromossomos não
homólogos (BUKHARI et al., 1977; WILSON, 2006). Os eventos
de recombinação ilegítima podem gerar inversões, duplicações
e deleções cromossômicas e pode ser de três tipos ou classes
diferentes: 1- Recombinação sítio-específica, cujo rearranjo
genômico ocorre por recombinação entre pequenas sequências
homólogas de DNA; 2- Ligações de extremidades não
homólogas ou rearranjos nos quais as novas sequências ligadas
compartilham homologia envolvendo menos do que três pares
de bases e não possuem homologia com sítios-específicos,
portanto aleatórias, 3- arranjos associados com elementos

transponíveis (BUKHARI et al., 1977; WILSON, 2006) (Figura 2).
Figura 2. Recombinação não homóloga ou ilegítima. O DNA

é inserido aleatoriamente no genoma bastando que existam
algumas poucas bases complementares para realizar o
pareamento das extremidades do DNA.
Recombinação Sítio-Específica
É aquela que ocorre entre sequências curtas de DNA

contendo aproximadamente 12 a 24 pb divergentes nas
moléculas parental e mutada envolvidas no processo de
recombinação. O sistema de integração de alguns bacteriófagos
(ʎ 1) no cromossomo bacteriano e o rearranjo dos genes
de imunoglobulinas de vertebrados são exemplos de
recombinação sítio-específica na natureza (Figura 3).
Figura 3. Recombinação sítio-específica. Na figura, attP

(attachment Phage) corresponde ao sítio de integração do fago.
Ele interage com o sítio attB (attachment Bacteria) da bactéria. A
homologia entre os sítios attP e attB é apenas parcial, em uma
região de 15 pb complementares em ambos os sítios (região
O). Após a integração (profago) são gerados dois novos sítios
(attL e attR). In vitro, nesse tipo de recombinação o vetor de
clonagem e o inserto são digeridos por uma única enzima de
restrição e a ligação entre inserto e o vetor é feita pela enzima
DNA ligase.
Recombinação Replicativa e não

Replicativa
Esses dois tipos de recombinação constituem o quarto

mecanismo de recombinação, os quais geram novas cópias de
um segmento de DNA (Figura 4).
Figura 4. Recombinação não replicativa e replicativa. Na

recombinação não replicativa (A), o elemento genético se move
de um lugar para outro como uma entidade física e permanece
inalterado; em (B), o elemento genético produz uma cópia
fiel de si mesmo e integra em outro local, que pode ser um
plasmídeo ou cromossomo.
Muitos elementos transponíveis utilizam o sistema de

recombinação replicativa para gerar novas cópias de
transposons que são inseridas em diferentes locais nos
cromossomos (HALLET; SHERRATT, 1997) (Figura 5).
Figura 5. Transposição por recombinação replicativa. O

transposon replicado é integrado em um local diferente no
mesmo cromossomo ou em cromossomo diferente.
A tecnologia do DNA recombinante emprega outros tipos

de recombinação baseados no corte do DNA com enzimas
de restrição, inserção de sequência de DNA de interesse em
vetores de clonagem, religação com a enzima DNA ligase e
transformação do organismo hospedeiro. Nos casos em que o
DNA é clonado em plasmídeo, bacteriófago ou qualquer vetor
capaz de se replicar de modo autônomo no hospedeiro, o DNA
recombinante se comportará de maneira independente, não
ligado ao cromossomo. Para que a transformação seja estável,

o DNA clonado precisa ser integrado ao cromossomo do
organismo hospedeiro.
Nas células, a recombinação homóloga funciona reparando a

molécula de DNA danificada por fatores físicos ou químicos
utilizando a fita intacta como molde. Dessa forma, a integridade
da informação genética é restabelecida e preservada (POTEETE,
2001).
Estratégias de Engenharia Genética

Empregando Recombinação
Homóloga (RH)
Ao longo dos anos, foram desenvolvidas várias estratégias

de engenharia genética utilizando o sistema de recombinação
homóloga das células hospedeiras (GERLAI, 2016). Em bactérias
e leveduras, mas não em plantas e animais, a integração do
DNA pode ser feita com relativa facilidade por recombinação
homóloga. Em células somáticas de mamíferos e plantas, que
apresentam baixa frequência de RH, o emprego de métodos de
clonagem gênica baseados nessa propriedade celular é muito
restrito (KUWAYAMA, 2012). Outra limitação do uso de RH em
engenharia genética de animais e plantas reside no fato de que,
em muitos casos, a molécula de DNA introduzida se integra
de forma aleatória nos cromossomos da célula hospedeira, e,
embora produza transgênicos estáveis, estes poderão ser úteis
ou não.
Mutagênese dirigida por oligonucleotídeos (ODM, do inglês,

oligonucleotide directed mutagenesis) ou mutagênese sítio-
específica é uma ferramenta utilizada em engenharia genética
para induzir alterações específicas e intencionais em sequências

de nucleotídeos de DNAs alvo no genoma de microrganismos,
plantas e animais (HO et al., 1989; HUTCHISON et al., 1978;
LANDT et al., 1990; SMITH, 1982; THOMAS; CAPECCHI, 1987).
ODM tem sido utilizada para corrigir ou fazer alterações sítio-
específicas no genoma, alterar a sequência de aminoácidos
das proteínas, eliminar a expressão de um gene (códons de
parada ou mutações frameshift que provocam deslocamento
do quadro de leitura para valores diferentes de múltiplos de
três) e modificar a expressão gênica (mudanças nas sequências
promotoras). Em uma proteína, pequenas mudanças específicas
na sequência de aminoácidos dentro de um local crítico são, em
muitos casos, responsáveis pelas diferenças no seu rendimento
e alteração do fenótipo do organismo (YANG et al., 2014).
A tecnologia ODM, que teve seus fundamentos básicos

estabelecidos nos anos de 1970, permite que mudanças sejam
feitas na molécula de DNA, muitas vezes consistindo de um
único nucleotídeo ou alterações extensas no genoma de
interesse. Esse método foi desenvolvido por Hutchison et al.
(1978), que conseguiram introduzir uma única troca de bases,
de G para A, no gene E do bacteriófago øX174 am3. Os autores
também demonstraram que a mutação foi capaz de produzir
um bacteriófago defectivo para o gene mutado. Posteriormente,
Ruvkun e Ausubel (1981) empregaram esse método para
introduzir mutações gênicas em bactérias Gram-negativas. Em
1987, pesquisadores do laboratório de genética da Universidade
de Wisconsin publicaram resultados de dois estudos
independentes, utilizando ODM para corrigir mutações no gene
HPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) em
células tronco de camundongo (DOETSCHMAN et al., 1987;
THOMAS; CAPECCHI, 1987). Em 2007, os líderes desses estudos,
Mario Capecchi e Oliver Smithies, receberam o prêmio Nobel

por suas pesquisas. Em seguida, as aplicações dessa tecnologia
foram estendidas para a terapia gênica (GRAHAM; DICKSON,
2002; KREN et al., 1998; PIERCE et al., 2003; XU et al., 2015) e
transformação de plantas (BEETHAM et al., 1999; DONG et al.,
2006; HAAG et al., 1993; NOVAK; BRUNNER, 1992; OKUZAKI;
TORIYAMA, 2004; SAUER et al., 2016; ZHU et al., 1999).
Mecanismos da Mutagênese
Dirigida por Oligonucleotídeos
(ODM)
O procedimento padrão para execução dessa técnica inclui a

realização PCR e a clonagem do fragmento amplificado em
um vetor (plasmídio, bacteriófaco, etc.). Os oligonucleotídeos
iniciadores (primers), cujos tamanhos variam entre 20 e 30
nucleotídeos, são sintetizados com as modificações que se
deseja incorporar ao gene alvo. Essas modificações consistem
em substituições, deleções ou adições de bases. Durante
o processo de amplificação os oligonucleotídeos contendo
as mutações, são incorporados ao amplicom, alterando a
sequência de nucleotídeos do gene original (WEINER et al.,
1994). O uso de iniciadores longos com aproximadamente 200
nucleotídeos também é possível, mas apresenta uma série de
limitações. Uma delas consiste no tamanho da mutação que
se deseja introduzir que é limitada ao tamanho do iniciador
a ser utilizado. Além disso, existe uma relação inversa entre
o tamanho do oligonucleotídeo e o produto amplificado por
PCR (JAJESNIAK; WONG, 2015). Por último, oligonucleotídeos
longos não são muito eficientes para amplificar regiões do
genoma ricos em G-C ou que formam estruturas secundárias
(HO et al., 1989; REIKOFSKI; TAO, 1992).
O princípio do funcionamento da técnica de mutagênese sítio-

dirigida se baseia na propriedade de hibridização de moléculas
de DNA por homologia do pareamento de bases. Dessa
forma, pequenos oligonucleotídeos complementares ao DNA
de interesse, mas contendo uma ou algumas diferenças na
composição das bases nitrogenadas, podem ser sintetizados
e empregados para gerar mutações sítio-dirigidas (Figura 6).
Em seguida, o oligonucleotídeo é introduzido no interior do
núcleo celular e após hibridização por homologia e reparo
da cadeia original de DNA a mutação desejada é incorporada
ao genoma hospedeiro, o oligonucleotídeo é degradado e a
mutação desejada será transmitida às gerações seguintes. O
resultado final do processo é a alteração ou melhoramento
de um ou mais caracteres do organismo mutado (ERIKSSON;
SCHIEMANN, 2016).
A tecnologia ODM possui muitas variações, entre as quais

a mais simples envolve uma sequência curta de DNA de
cadeia simples (oligonucleotídeo) sintetizado quimicamente
a partir de uma sequência conhecida (ELLIS et al., 2001).
O oligonucleotídeo é introduzido nas células por processo
químico mediado por polietilenoglicol, eletroporação ou
biobalística e no interior da célula, o oligonucleotídeo contendo
a alteração desejada hibridiza com a sequência homóloga do
DNA alvo, e por recombinação introduz a alteração desejada no
DNA alvo. Apenas uma única incompatibilidade de pareamento
entre nucleotídeos mutados e nativos é suficiente para ativar
o sistema celular de reparo do DNA e gerar mudanças na
sequência de DNA alvo. Contudo, essa forma muito simples de
ODM utilizando DNA de cadeia simples provou ser ineficiente
por causa do baixo rendimento na seleção das formas
mutantes. Na realidade, após a transformação, o que se tem
é uma mistura, tanto do molde não mutado original como da

cadeia mutante, produzindo uma população mista de progênies
mutantes e não mutantes. Além disso, o DNA molde é metilado
enquanto a cadeia mutante não é. Consequentemente,
os mutantes podem ser contra-selecionados em razão da
presença de um sistema de reparo que favorece o DNA molde
metilado, resultando em menos mutantes. Por conseguinte,
outros modelos de oligonucleotídeos foram desenvolvidos
compreendendo misturas de RNA e DNA de cadeia simples,
RNA de cadeia única, ou oligonucleotídeos formando hélice
tripla.
Melhoramento significativo no método de mutagênese dirigida

foi obtido com o desenvolvimento de técnicas que possibilitam
a síntese comercial de longas cadeias sintéticas de DNA dupla
fita (dsDNA) (PENGPUMKIAT et al., 2016; SOBOLEWSKI et al.,
2011). dsDNA com mais de 3 kb, incorporando as mutações
desejadas, são compatíveis, tanto com os métodos clássicos
de mutagênese (PCR, clonagem por enzimas de restrição)
quanto com os novos métodos que utilizam longas cadeias de
DNA sintético (montagem isotérmica). Dentre as vantagens
dessa nova abordagem destaca-se a economia de tempo
para produzir sequências selvagens e mutadas dos genes de
interesse. A um custo razoável, os cientistas podem desenhar
qualquer tipo de sequência e receber suas solicitações em curto
espaço de tempo. Outra vantagem do método consiste do fato
de que a síntese da molécula de DNA não requer a existência de
um DNA molde.
Figura 6. Princípio da técnica de mutagênese sítio-dirigida.

Oligonucleotídeos sintetizados, contendo as alterações
desejadas (destacados na cor vermelha), são introduzidos
nas células. Após o pareamento por homologia parcial e
recombinação homóloga, os oligonucleotídeos iniciadores
são degradados pelas células hospedeiras e as alterações
sítio-dirigidas são incorporadas no DNA alvo e transmitidas às
gerações seguintes.
O uso de dsDNA para mutagênese empregando PCR pode

ser exemplificado pela clonagem sem o uso de enzimas de
restrição (RF, do inglês, restriction-free) descrito por Unger et
al. (2010). Na abordagem RF, os iniciadores são substituídos por
longas sequências de DNA em que as extremidades 5’ contem
sequências homólogas ao sítio de clonagem do vetor (Figura

7). Nesse caso, o procedimento de linearização do vetor é
desnecessário e o inserto pode ser integrado em qualquer parte
do vetor. Uma grande vantagem dessa técnica consiste no fato
de que o vetor copiado pela célula bacteriana é metilado e o
vetor empregado na transformação não apresenta metilação.
Dessa forma, muito tempo é poupado na etapa de seleção dos
clones positivos, pois vetores negativos, metilados, podem ser
removidos pelo tratamento com a enzima DpnI.
Figura 7. Clonagem livre de PCR e enzimas de restrição. Em A,

o inserto de DNA dupla fita que será clonado possui regiões de
homologia com o vetor, representado por I e II, distantes entre
si por no mínimo 50 pb. O inserto pareia com o vetor na região
de homologia (B), e após recombinação e reparo ocorre sua
integração ao vetor de clonagem (C).
PCR e Montagem de Fragmentos

de DNA sem Uso de Enzimas de
Restrição
A maioria dos projetos envolvendo DNA recombinante

precisa lidar com a necessidade de se ligarem dois ou mais
fragmentos de DNA. Em muitos casos, isso não pode ser feito
simplesmente com a digestão dos fragmentos com enzimas
de restrição e uso de adaptadores, ou sem que nucleotídeos
indesejados sejam incorporados nas junções das sequências

ligadas (SHEVCHUK et al., 2004). Além disso, os protocolos
para sobreposição de sequências amplificadas baseados em
PCR apresentam sérias limitações quanto ao tamanho do DNA
a ser clonado, que é restrito a aproximadamente 3,4 kilobases
(Kb) (HO et al., 1989; PONT-KINGDON, 1997; KUWAYAMA et al.,
2002).
Entre as vantagens da mutagênese por dsDNA podemos

destacar a possibilidade de adição de quantidades muito
grandes de DNA, tais como novos genes, promotores,
sequências regulatórias, etc. Esse procedimento elimina ou
reduz a necessidade de se fazer mutagênese sequencial,
preservando a sequência de interesse livre de erros
incorporados pela polimerase durante os ciclos de PCR, de
ocorrência comum quando se utiliza primers (oligonucleotídeos
iniciadores) e PCR de fragmentos muito longos de DNA (UNGER
et al., 2010; GIBSON et al., 2009).
Método Isotérmico para

Mutagênese
O mecanismo de mutagênese isotérmico possibilita a

montagem de um ou mais fragmentos lineares de DNA,
tais como plasmídeo e inserto que possuem extremidades
homólogas entre si (GIBSON et al., 2009). O nome desse
método de mutagênese origina-se do fato de que múltiplas
reações podem ser feitas em um único frasco em uma mesma
temperatura de incubação. Nesse processo, os fragmentos
de DNA são misturados e as extremidades coesivas são
criadas por atividade de uma exonuclease. Os fragmentos
originados anelam entre si por complementariedade de
bases determinando a orientação precisa dos fragmentos. Em

seguida, a enzima polimerase preenche as lacunas (gaps) nas
duas ou mais sequências e a enzima DNA ligase sela as duas
cadeias (Figura 8). Esse procedimento cria a possibilidade de
ligação perfeita entre dois ou mais fragmentos de DNA sem que
ocorra introdução de nucleotídeos indesejados nas construções.
O plasmídeo empregado como vetor pode ser linearizado por
enzimas de restrição ou PCR, e possibilita a integração de
inserto em qualquer ponto do vetor, independentemente da
existência de sítios de restrição. Contudo, o maior benefício
da linearização do vetor por PCR está relacionado com o fato
de que qualquer plasmídeo recircularizado sem a presença do
inserto pode ser removido pela digestão com a enzima DpnI,
reduzindo o tempo de screening pela eliminação de falsos
clones (GIBSON et al., 2009).
Métodos Usados de Introdução do

Gene Mutado no Hospedeiro
O produto de PCR empregando oligonucleotídeo homólogo ao

DNA alvo e contendo alterações planejadas é clonado em um
vetor, introduzido nas células e incorporado ao genoma pelo
mecanismo intracelular de reparo. Os oligonucleotídeos podem
ser desenhados para produzir substituições de nucleotídeos
sítio-específicos, inserções ou deleções em um gene alvo.
Figura 8. Mecanismo de mutagênese isotérmico. Ver descrição

no texto.
A inserção de mutações cromossômicas precisas foi

estabelecida como padrão para análise da função de genes
bacterianos. Os protocolos publicados são geralmente
baseados em dois ciclos sucessivos de recombinação: (i)
no primeiro passo, a integração de um marcador que pode
ser selecionado positivamente (por exemplo, um gene de
resistência a antibióticos); (II) seleção para perda de marcador
(“counter selection”) no último passo de recombinação
(REYRAT et al., 1998). Alguns dos métodos “counter selection”
funcionam em conjunto com a recombinação dos fragmentos
de DNA sintéticos evitando o tedioso requisito para a

mutagênese e clonagem à base de PCR que visa gerar alelos
mutantes para a segunda etapa de recombinação.
Recombinação Homóloga
Intragenômica
Recentemente, o emprego de recombinação homóloga

intragenômica ou IGHR (do inglês, Intra-Genomic Homologous
Recombination) integra os métodos de melhoramento
tradicional e transformação genética, com o uso de nucleases
específicas desenhadas para cada tipo de finalidade. A grande
vantagem dessa estratégia consiste no fato de possibilitar
a conversão de genes não ligados, portanto localizados em
cromossomos diferentes ou separados por milhares de pares
de bases em um mesmo cromossomo que se comportam como
unidades independentes, em genes ligados (Figura 9), criando
verdadeiros cassetes gênicos contendo blocos únicos de
genes, que facilitam o melhoramento convencional por causa
da exclusão da necessidade de seleção e cruzamentos entre
progênies segregantes para diferentes caracteres (KUMAR et
al., 2016a).
Figura 9. Recombinação homóloga intragenômica. Na figura

está sendo representado um conjunto de três cromossomos de
uma espécie hipotética indicados pelos números de 1 a 3. As
letras representam os genes alvo que serão agrupados em um
cassete. A seta indica a direção das reações e a “estrela” indica
o evento de recombinação homóloga mediado por nucleases
engenheiradas (ZFN, TALEN ou CRISP) que são ligadas às
extremidades do cassete gênico. Ao final das manipulações,
um conjunto de genes não ligados (A, B, d e P) ou que se
comportam como unidades segregantes independentes (B e d)
são ligados entre si (dBPa) de maneira adjacente em um único
cromossomo.
Aplicações da Mutagênese Dirigida

por Oligonucleotídeos (ODM)
Entre as aplicações dessa técnica, destacam-se a análise da

estrutura e função de proteínas e ácidos nucleicos (DNA e RNA)
e a engenharia de moléculas proteicas para aperfeiçoar suas
atividades ou até mesmo para criar novas funções celulares
(RAO, 2008; SAIKA et al., 2011; TURANLI-YILDIZ et al., 2012).
O método ODM para gerar alterações em sequências de

DNA permite que os pesquisadores investiguem os efeitos
das mudanças de nucleotídeos na molécula, tais como
polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), ou para inserir ou

eliminar sítios específicos em um gene, por exemplo, o local
de ligação de uma proteína regulatória ou mesmo um sítio
de restrição. A mutagênese dirigida pode ser utilizada para
criar uma biblioteca gênica variante para pesquisa visando
determinar a sequência de nucleotídeos ideal para ser usada
em estudos específicos. Essa técnica tem sido utilizada para os
organismos como as bactérias e leveduras, em mamíferos e, no
futuro, terapia genética.
Em várias espécies vegetais, o potencial da tecnologia ODM

tem sido pouco explorado em razão de diferentes motivos, tais
como: a relativa ineficiência dos métodos de transformação
atualmente disponíveis para introduzir o DNA exógeno no
interior das células (polietilenoglicol, eletroporação, biobalística,
vesículas de lipídios catiônicos); o baixo índice de integração
dos genes “engenheirados” nos cromossomos da planta
hospedeira; a baixa regeneração de plantas; e a existência de
genótipos recalcitrantes (HIMMEL et al., 2007; KUMAR et al.,
2016a, 2016b; YODER; GOLDSBROUGH, 1994).
Os primeiros relatos da utilização de ODM no melhoramento

vegetal surgiram no final dos anos 1990 (CLEMENTE;
MÁRQUEZ, 1999; HORNUNG et al., 1999; TOROSER et al.,
1999; VITRY et al., 1999). Entre as aplicações comerciais da
ODM destaca-se a produção de variedades de plantas, tais
como milho, trigo, tabaco e colza resistentes aos herbicidas.
No melhoramento do milho, uma abordagem importante
consiste em adicionar aminoácidos essenciais às proteínas de
armazenamento para aumentar o seu valor nutritivo (FORSTER;
SHU 2011; HAIQUAN et al., 2017; HSIEH; VAISVILA, 2013). Essa
técnica também tem sido utilizada com bastante sucesso
para estudos de genética reversa em que determinado gene é

silenciado (knock out) com o objetivo de descobrir sua função
celular (ERIKSSON; SCHIEMANN, 2016). Como exemplos
de áreas que podem ter seu uso potencializado pela técnica
ODM destacam-se: o aumento da vida útil de variedades de
plantas, tolerância aos estresses abióticos, resistência a pragas,
melhoramento do desempenho agronômico, alteração do teor
de ácidos graxos nas células e aminoácidos das proteínas.
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CGPE - 14337

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