Microbiologia

de Alimentos
Análise Microbiológica de Alimentos

Responsável pelo Conteúdo:

Prof.ª Dr.ª Elisa Mara Prioli Ciapina Rochedo

Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Luciene Oliveira da Costa Granadeiro
 Análise Microbiológica de Alimentos

• Microrganismos Indicadores de Qualidade de Água e Alimentos;

• Meios de Cultura para Contagem Microbiana;
• Métodos para Análise Microbiológica de Água e Alimentos;
• Análise dos Resultados.

OBJETIVOS

DE APRENDIZADO
• Entender a importância dos microrganismos indicadores de contaminação para o monito-
ramento da qualidade da água e alimento;
• Conhecer os padrões microbiológicos de água e alimentos estabelecidos em legislação;
• Conhecer técnicas de contagem de microrganismos.
UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos

Contextualização
Os alimentos e a água são importantes veículos de transmissão de patógenos,
sendo responsáveis por diversos surtos de doenças. Fazer análise microbiológica
de alimentos/água é fundamental para garantir a segurança para o consumo.
No entanto, são vários os microrganismos patogênicos e é inviável a análise de
todos eles. Dessa forma, foram escolhidos alguns microrganismos indicadores de
qualidade microbiológica. Quer dizer que, se esse microrganismo indicador estiver
no alimento/água, sugere-se que as condições higiênico-sanitárias estão insatisfató-
rias; o processo de higienização foi ineficiente; pode ter ocorrido uma contaminação
pós-processamento; ou, ainda, condição higiênica inapropriada dos manipuladores.

A legislação de água e alimentos estabelece os padrões microbiológicos aceitáveis

para consumo, onde é possível fiscalizar os estabelecimentos e a qualidade do produto
servido em diferentes situações.

Para fazer as análises microbiológicas, são utilizados meios de cultura e técnicas

apropriadas para obter um resultado confiável e poder comparar com os valores
da legislação.

Nesta unidade, você terá uma visão geral de como fazer as análises microbio-
lógicas em alimentos e água, e como interpretar os resultados de acordo com a
legislação pertinente.

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Microrganismos Indicadores de
Qualidade de Água e Alimentos
Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que,
quando presentes em água/alimentos, podem fornecer indicações sobre as condições
higiênicas durante o processamento, produção ou armazenamento de alimentos; pro-
vável presença de patógenos; deterioração de alimentos; ocorrência de contaminação
de origem fecal, indicando condições higiênicas sanitárias inadequadas.

Os indicadores são utilizados, também, devido à inviabilidade técnica de detecção

de todos os microrganismos importantes, tanto os que são patogênicos como os
deteriorantes. Lembrando que a água é um veículo de contaminação para os alimentos,
desta forma, deve-se ter a preocupação de realizar análises microbiológicas de água
e alimentos.

A contagem dos microrganismos indicadores pode ser feita de diversas maneiras,

que será discutido posteriormente, e o resultado pode ser expresso em Unidade
Formadora de Colônia (UFC)/g ou mL (quando se utiliza um meio de cultura sólido
e conta-se as colônias crescidas) ou Número Mais Provável (NMP)/100mL (quando
se utiliza meio de cultura líquido).

Podemos destacar a contagem de alguns indicadores para a análise microbiológica

de água e alimentos.

Indicadores Gerais de Contaminação do Alimento

• Contagem Total de Microrganismos Aeróbios Mesófilos: Também chamada
de Contagem Padrão em Placas, é o método mais utilizado para verificar popu-
lações microbianas, de um modo geral. Essa contagem não diferencia gêneros
ou espécies de bactérias, e fornece informações sobre a qualidade do alimento,
matérias-primas utilizadas, condições de processamento, manipulação, práticas
de manufatura e vida útil do alimento. É importante ressaltar que não são
indicadores de segurança, pois não está diretamente relacionado à presença
de patógenos ou toxinas. Mesmo que os patógenos estejam ausentes, e que
não tenha alteração organolética do alimento, o elevado número indica que o
alimento é insalubre (não é bom para a saúde). Em alimentos, onde é possível
verificar processos de deterioração, encontram-se valores entre 106 UFC/g do
alimento até a 108 UFC/g de alimento. Dessa forma, se a carga microbiana
(quantidade de microrganismos) inicial de um alimento está próxima a esses
valores, deve-se ter cuidado, pois o alimento pode estar próximo a se deteriorar
e terá uma vida útil menor. Em alimentos fermentados, outros valores devem
ser considerados na deterioração do alimento.
Em água, a contagem desses microrganismos indica integridade do sistema
de distribuição de água e reservatório (tubulação e caixas de armazenamento),

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UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos

sendo que não deve exceder 500 UFC/mL, segundo legislação (Portaria nº
2.914/2011);
• Contagem Total de Microrganismos Aeróbios Psicrotrófilos e Termófilos:
Os psicrotrófilos são os microrganismos que se multiplicam em alimentos refri-
gerados, podendo atingir a faixa de temperatura dos mesófilos. Essa contagem
fornece informações sobre o grau de deterioração de alimentos refrigerados.
Os termófilos são os microrganismos que crescem em temperaturas mais
elevadas. Essa contagem fornece informações sobre o grau de deterioração de
alimentos submetidos a tratamento térmico;
• Contagem de Bolores e Leveduras: Maioria dos bolores e leveduras é encon-
trada no solo e ar. Podem provocar deterioração e torna-se um perigo a saúde
pública devido à produção de micotoxinas pelos bolores. Em alimentos ácidos e
de baixa atividade de água, o crescimento do fungo é observado.

Indicadores de Contaminação Fecal ou da

Qualidade Higiênico-Sanitária dos Alimentos
• Contagem de Enterobactérias: São bactérias que pertencem à família
Enterobacteriaceae, por isso são chamadas de enterobactérias. Essa família
inclui as bactérias Gram negativas na forma de bastonetes (bacilos), que não
produzem endósporos, são anaeróbias facultativas e apresentam características
bioquímicas típicas dessa família como produtoras de ácidos e gás na fermen-
tação da glicose ou de outros açúcares. Nessa família, estão vários gêneros
importantes em alimentos como Escherichia, Salmonella, Serratia, Shigella,
Yersinia, Erwinia, Citrobacter, Enterobacter, Proteus, Klebsiela e outras.
São encontradas em solo, água, plantas, frutas, vegetais, carnes, ovos, animais,
grãos, insetos e no homem. Muitas são deteriorantes e outras patogênicas.
As enterobactérias são utilizadas como indicador de condições de higiene dos
processos de fabricação, porque são facilmente destruídas pelos sanificantes
(agentes utilizados para higienização). Dessa forma, sua presença indica falhas
no processo de higienização, seja de utensílios, ambientes, como também de
processamento de alimentos;
• Contagem de Coliformes Totais: Coliformes totais são um grupo de bac-
térias, que fazem parte das enterobactérias, capazes de fermentar lactose
com produção de gás a 35-37ºC, por 48 horas de incubação. Nesse grupo,
estão tanto bactérias do trato gastrointestinal de humanos e outros animais de
sangue quente como a Escherichia coli (E. coli), como também Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella, Serratia e outras, encontradas em plantas e solo. Sua
presença no alimento não indica contaminação fecal, mas pode ser considerado
com condições higiênicas insatisfatórias, evidenciando falhas de processo e de
contaminação pós-processo em alimentos pasteurizados, porque são facilmente
eliminados por calor;

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 • Contagem de Coliformes Termotolerantes e E. coli: São bactérias que con-
seguem fermentar lactose com produção de gás, quando incubadas a 44-45ºC.
É um grupo de bactérias mais restrito dentro dos coliformes totais. No início, os
coliformes termotolerantes eram chamados de coliformes fecais, para indicar
contaminação fecal. No entanto, sabemos que os termotolerantes incluem bac-
térias de origem não fecal. A pesquisa apenas de E. coli é utilizada também.
Ela fornece informações sobre as condições higiênico-sanitárias do produto,
já que seu habitat natural é o trato intestinal de animais de sangue quente,
mas também pode ser introduzida nos alimentos a partir de fontes de fecais.
Apesar de seu uso ser questionado por alguns autores, a legislação adota a
análise de E.coli para verificar qualidade de água e alimentos, principalmente,
alimentos in natura;
• Presença de Enterococos: Essas bactérias estão presentes no trato intestinal
como também em ambientes diferentes. Podem ser utilizadas como indicadores
de contaminação fecal, apesar de seu uso ser questionado. Indica práticas sani-
tárias inadequadas ou exposição do alimento a condições inadequadas.

Outros Indicadores: Microrganismos Patogênicos

para Verificar o Risco à Saúde das Pessoas
• Contagem de Staphylococcus (Estafilococos): Indica perigo à saúde pública
por causa da enterotoxina estafilocócica e condição de higienização questionável
de manipuladores de alimentos;
• Contagem de Salmonella: Importante e muito frequente agente de doenças
de origem alimentar. Seu principal habitat é o trato intestinal de humanos e
animais e pode contaminar diversos alimentos, atingindo toda a cadeia de pro-
dução de alimentos, desde a matéria-prima até os produtos finais;
• Contagem de Clostridium: São bactérias termófilas, liberam esporos e toxi-
nas que indicam risco à saúde da população;
• Contagem de Listeria Monocytogenes: Bactéria patogênica potencialmente
letal para o indivíduo, com severo risco para gestantes e indivíduos com o sistema
imunológico debilitado.

Meios de Cultura para Contagem Microbiana

Uma das maneiras de realizar a contagem dos microrganismos é por meio de
cultivo em meios de cultura apropriados. Meios de cultura são soluções que contém
nutrientes para atender às exigências nutricionais dos microrganismos. Esses meios
de cultura podem ser sólidos (quando tem ágar que confere densidade firme), líquidos
ou semissólidos (menor quantidade de ágar).

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UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos

Figura 1
Fonte: Getty Images

Na figura, observa-se meio de cultura líquido em tubos e meio de cultura

sólido em placas de Petri (ao fundo), que são placas apropriadas para esse fim.

Os meios de cultura sólidos são utilizados para verificar o crescimento e realizar

contagem microbiana. Isso é possível devido à formação de colônias dos microrga-
nismos visíveis a olho nu nesses meios. Uma única célula de microrganismo é neces-
sária para a formação de uma colônia. A colônia é visível a partir do momento que
aquela célula inicial começou a dividir e aumentou o número de células. Dessa forma,
quando se tem uma colônia, é porque inicialmente tinha uma célula microbiana,
isto é, uma Unidade Formadora de Colônia (UFC). Assim, contando as colônias,
sabemos quantos microrganismos tinham na amostra.

Figura 2
Fonte: Getty Images

Na imagem, observa-se crescimento de várias colônias de microrganismos,

em meio de cultura sólido. Cada colônia visível foi formada pelo crescimento
de uma célula bacteriana inicial invisível.

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 Os meios de cultura semissólidos são utilizados, por exemplo, para verificar a
motilidade dos microrganismos, por causa do flagelo.

Os meios líquidos servem para verificar crescimento e quantificar microrganismos.

O resultado é expresso em Número Mais Provável (NMP) de microrganismos presente
na amostra.

Existem vários tipos de meios de cultura a serem considerados: meio de enrique-

cimento, meio de cultura completo, meio seletivo, meios diferencial, meio de cultura
para anaeróbios.

Os meios de cultura completos são ricos em nutrientes e permitem o crescimento

do maior número possível de microrganismos, muito utilizados para as contagens
de microrganismos totais. Os meios de enriquecimento são utilizados em amostras
com pequeno número de microrganismos. Os meios de cultura seletivos possuem
compostos que inibem um determinado grupo de microrganismos e favorece outro,
por exemplo, meios de cultura seletivos para Gram negativas, que favorecem o
crescimento das enterobactérias que são Gram-negativas. Temos, também, meios
seletivos que favorecem o crescimento apenas de bactérias ou de fungos. Os meios
seletivos para fungos têm pH ácido. Meios de cultura diferenciais permitem distin-
guir espécies ou gêneros de bactérias pela alteração da cor do meio ou da colônia.
Algumas vezes, um meio de cultura pode ser seletivo e diferencial.

Figura 3
Fonte: Getty Images

Na figura acima, observa-se um meio de cultura diferencial, onde a alteração

de cor das colônias e do meio de cultura permite distinguir os microrganismos.

Assim, utilizar os meios de cultura adequados é uma das maneiras de fazer a

quantificação dos microrganismos indicadores.

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UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos

Métodos para Análise Microbiológica

de Água e Alimentos
Para realizar uma análise confiável de água e alimentos, devemos ter critérios
rigorosos nas etapas de amostragem, preparação da amostra para análise e a escolha
dos métodos de contagem/identificação.

Para a coleta da amostra, vários cuidados devem ser tomados. Alimentos refrige-
rados devem ser mantidos em baixa temperatura até o momento da análise. Produtos
prontos, em embalagem fechada, devem ser mantidos na embalagem original.
Alimentos que estejam em embalagens abertas devem ser coletados com utensílios
esterilizados (conchas, espátulas) e acondicionados adequadamente para evitar con-
taminação do ambiente e do manipulador.

A coleta de amostras de utensílios de cozinha ou superfícies pode ser feita com o

Swab, que são hastes esterilizadas, com algodão na superfície. É necessário delimitar
uma área de 10 cm2 ou 1 cm2, passar a haste nesta área, armazenar em tubo e levar
para o laboratório para plaqueamento.

As figuras abaixo mostram o Swab e o plaqueamento da amostra sendo realizados

em meio de cultura.

Figura 4
Fonte: Adaptado de Getty Images

As amostras devem ser preparadas mantendo o cuidado para evitar contaminação

externa de modo a não interferir na contagem microbiana presente no alimento.
A porção de amostra a ser analisada é de 25g, 50g ou 100g (mL). Nas amostras
sólidas, elas devem ser diluídas e homogeneizadas adequadamente com uma solução
própria, esterilizada. Muitas vezes, é necessário fazer diluições da amostra para con-
seguirmos contar os microrganismos sem deixar dúvidas nos valores. Vários são os
protocolos para seguir uma correta preparação de amostra.

Com a amostra preparada, alguns métodos de contagem podem ser utilizados

como a contagem por plaqueamento e a técnica do Número Mais Provável (NMP).

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 A contagem por plaqueamento é um método convencional, que consiste no
plaqueamento de quantidades (alíquotas) conhecidas da amostra líquida (previa-
mente diluída em caso de alimentos sólidos), nos meios de cultura selecionados de
acordo com o interesse da análise. O plaqueamento pode ocorrer na superfície do
meio de cultura (colocado numa placa de Petri), técnica conhecida como Spread
Plate ou plaqueamento em superfície, ou a amostra pode ser colocada numa
placa de Petri e, depois adicionada o meio de cultura, técnica Pour Plate, de
profundidade. Em seguida, as placas devem ficar acondicionadas em estufas com
temperatura controlada, normalmente em 36ºC, por 24 horas, para permitir o
crescimento dos microrganismos e formação das colônias. A partir daí, realiza-se
a contagem das colônias, como mostra a figura, e obtêm-se o resultado expresso
em Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g ou mL).

Figura 5
Fonte: Getty Images

A imagem mostra a contagem manual das colônias (UFC), das bactérias que
estavam na amostra coletada. Lembrando que, quando se tem uma colônia,
é porque inicialmente havia uma célula microbiana, isto é, uma Unidade
Formadora de Colônia (UFC). Assim, contando as colônias, sabemos quantos
microrganismos tinham na amostra.

A contagem por Numero Mais Provável (NMP) é muito utilizada para estimar a
contagem de coliformes totais e Escherichia coli. Nela, as alíquotas das amostras
diluídas são adicionadas a uma série de tubos, contendo meio de cultura líquido.
Os tubos são incubados em estufa e espera-se o crescimento. A combinação da
quantidade de tubos que apresentaram crescimento é verificada e, por meio de uma
tabela específica, obtém-se o NMP.

Essas técnicas são trabalhosas e demoradas. Existem alguns métodos mais

modernos que facilitam o preparo e execução da contagem microbiana. Na videoaula,

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UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos

é apresentada a técnica de plaqueamento em superfície e uma técnica, mais moderna,

para estimar o NMP de coliformes totais e E.coli.

Outras técnicas de análise de microrganismos que não necessitam de crescimento

do microrganismo podem ser utilizadas, no entanto, requerem reagentes e equipa-
mentos mais específicos.

Análise dos Resultados

Considerando que a distribuição dos microrganismos nos alimentos não é igual,
quanto maior for o número de unidades de um produto submetido à análise, mais
confiável será o resultado. É importante que os resultados sejam confiáveis para evi-
tar erros como reprovar um produto aceitável ou aprovar um produto inadequado.
Para definir os critérios a serem adotados para aprovar ou reprovar um alimento,
é necessário conhecer quais microrganismos devem ser pesquisados, e é a análise
desses microrganismos que vai determinar se o produto está ou não adequado no
que se refere às condições higiênico-sanitárias e de saúde pública.

Para saber quais os microrganismos que deveriam ser estudados num alimento,
o ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Food)
classificou os microrganismos em categorias diferentes, de acordo com os diferentes
graus de risco ao produtor e ao consumidor. Dessa forma, têm-se os microrganismos
que indicam:
• Alterações no alimento sem serem patogênicos que são os microrganismos,
sem risco direto à saúde, como bactérias aeróbias mesófilas e fungos;
• As condições higiênico-sanitárias do produto, que indicam a possível pre-
sença de outros microrganismos prejudiciais à saúde. Esses microrganismos
são os indicadores de contaminação fecal ou da qualidade higiênico-sanitá-
ria dos alimentos;
• Risco direto à saúde do consumidor como os microrganismos patogênicos de
interesse em alimentos.

Assim, a aprovação ou rejeição de qualquer produto está na dependência dos

resultados da análise e dos critérios microbiológicos adotados.

Os critérios microbiológicos são de caráter obrigatório, que são aqueles que não
podem ser desobedecidos. O alimento que não estiver de acordo com esse critério
deve ser reprovado. Assim, o padrão microbiológico é um critério obrigatório, que faz
parte de uma lei ou regulamentação administrativa. O não atendimento ao padrão
microbiológico vigente constitui violação da lei.

Os critérios microbiológicos podem ser internacionais, federais, estaduais e

municipais. Em nível internacional, existe a Comissão do Codex Alimentarius, que
é um órgão formado pela FAO (Food and Agricultural Organization) e pela OMS
(Organização Mundial da Saúde), ambos da Organização das Nações Unidas (ONU)

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e o ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for
Food). Em nível federal, cada país tem os critérios que acha necessário. No Brasil,
os padrões microbiológicos são definidos pelo Ministério da Saúde e da Agricultura.

Os padrões microbiológicos para alimentos, do Ministério da Saúde (ANVISA),

vigentes neste momento, são os da Resolução – RDC nº 331, de 23 de dezembro
de 2019, que dispõe sobre os padrões microbiológicos de alimentos e sua apli-
cação, juntamente da Instrução Normativa nº 60, de 23 de dezembro de 2019,
que estabelece as listas de padrões microbiológicos para alimentos prontos para
oferta ao consumidor. O microrganismo a ser analisado e seu limite aceitável pode
variar conforme o grupo de alimentos. Assim, de acordo com esta RDC, quando
se comparam os resultados obtidos nas amostras de alimentos, com os padrões
estabelecidos, o alimento pode ser considerado satisfatório com qualidade aceitável;
satisfatório com qualidade intermediária; e insatisfatório com qualidade inaceitável.
Em casos de resultados insatisfatórios e os resultados satisfatórios com qualidade
intermediária, devem ser investigadas possíveis causas para esses resultados e ações
corretivas devem ser implementadas.

A RDC nº 331 estabelece um plano de amostragem, definindo o número de uni-

dades amostrais a serem coletadas, aleatoriamente, de um mesmo lote e analisado
individualmente (n), o tamanho da amostra e a indicação do número de unidades
amostrais toleradas com qualidade intermediária (c).

Exemplificando: Na RDC nº 331, os padrões estabelecidos para Frutas e derivados,

preparadas, sanificadas (higienizadas), refrigeradas ou congeladas, são: ausência de
Salmonellla/25g de alimento em 10 unidades amostrais (n); e permite 10 UFC/g de
Escherichia coli, em duas unidades amostrais (c), de um total de 5 unidades amostrais
analisadas (n). Resultados obtidos fora desse padrão indicam que ações corretivas
devem ser realizadas.

Os padrões microbiológicos para água, do Ministério da Saúde, estão na Portaria

nº 2.914, de 12 de dezembro de 2011, que dispõe sobre os procedimentos de
controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão
de potabilidade. De acordo com essa portaria, em água de consumo humano, o
parâmetro Escherichia coli, utilizado como indicador de contaminação fecal, deve
ter valor máximo permitido (VMP) ausência em 100 mL de água. Estipula, ainda,
no Artigo 28 - § 3º, alterações bruscas ou acima do usual na contagem de bacté-
rias heterotróficas (aeróbias mesófilas) devem ser investigadas para identificação
de irregularidade e providências devem ser adotadas para o restabelecimento da
integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede), recomendando-se que
não se ultrapasse o limite de 500 UFC/mL.

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UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos

Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

 Leitura
Análise Microbiológica de Alimentos: Importância do Plano de Amostragem
https://bit.ly/3bti9Px
Resolução – RDC nº 331, de 23 de dezembro de 2019
Dispõe sobre os padrões microbiológicos de alimentos e sua aplicação.
https://bit.ly/3cwxY9n
Instrução Normativa nº 60, de 23 de dezembro de 2019
Estabelece as listas de padrões microbiológicos para alimentos prontos para oferta
ao consumidor.
https://bit.ly/2WuCO1a
Avaliação da Presença de Microrganismos Indicadores Higiênico-Sanitários em Alimentos Servidos em
Escolas Públicas de Porto Alegre, Brasil
https://bit.ly/3dzyaVA
Análise Microbiológica de Esponjas de Uso Doméstico na Cidade de Teresina, PI
https://bit.ly/2WWiUeR

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Referências
SILVA, N. Manual de métodos de análises microbiológicas de alimentos e água.
5. ed. São Paulo: Blucher, 2017. (e-book)

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2017. (e-book)

FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo:

Atheneu, 2008. (e-book)

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