AAEmpresa

Empresa
Empresa
executora de
P,D&I e
fornecedora de
leveduras
Histórico
A Empresa
A Empresa

Área de Atuação
Minas Gerais
Rio de Jneiro
São Paulo
Paraná
Santa Catarina
Rio Grande do Sul

Localização
Bio4 Soluções Biotecnológicas
Curitiba – PR
www.bio4.com.br
A Levedura
 Um pouco de história

Anthony van Antoine-Laurent Louis Emil Christian

Leeuwenhoek (1680) Lavoisier (1789) Pasteur(1860) Hansen (1883)
Teoria da geração
espontânea?
C6H12O6 2CO2+ 2CH3CH2OH

“Nada se cria, Saccharomyces

nada se perde, carlsbergensis

tudo se
transforma"
 a

Figura 03.(a) Primeiro livro de L. Pasteur

Figura 02. Patente de processo de elaboração de cerveja (b) Diferentes formas de microrganismos 1
 Lager x Ale

Definição Lager Ale

Clássica Saccharomyces pastorianus Saccharomyces cerevisiae
Levedura de baixa fermentação Levedura de alta fermentação
Definição
Moderna Capacidade de fermentar a melibiose -

Limpo Limpo
Neutro Neutro
Aromas
Floral Frutado
Malte Fenólico
Temperatura 9-14 oC 16-26 oC
 Brettanomyces sp.

Definição Brett
Clássica Brettanomyces lambicus
Brettanomyces bruxellensis
Brettanomyces claussenii
Brettanomyces bruxellensis Trois

Morfologia Fungo não formador de esporos e Brettanomyces lambicus

células ovais e alongadas

4-etil fenol – Band-Aid

4-etil guaiacol – Madeira Mofada
Aromas Estábulo
Cavalo
Temperatura 18-26 oC

Brettanomyces bruxellensis
 Microscópio
Ocular

Objetiva
Microscópio
eletrônico
Diafragma
Filtro

Charriot
Micrométrico
Macrométrico

Célula Célula Microscópio

óptico
Viva Morta
 Morfologia

20%

Fermento
Colônia Lisa
Floculação

Grau de Floculação Teste (15 oC) 12 horas

Baixa 20%
Média 50%
Colônia rugosa Alta 80%
Variáveis de Processo

Oxigênio Nutrientes

Inóculo Temperatura

Assepssia
Sistema CIP
Limpeza e Assepssia

Limpeza = Solução NaOH 1-2%

1 a Etapa Sanitização = Solução de Ác. Peracético 0,2-0,3%
Processo de

Limpeza de Superfícies
Assepssia

Enxague
2 a Desinfecção de
Superfícies

Superfície
Porque a superfície externa tem
polimento melhor que a interna?
 Limpeza
pH
Cuidado com:
Cuidado com: Alumínio, resina fenólica.
Mármore, cimento,
Pedra.

Ácido Neutro Alcalino

0 5,5 7 8,5 14
Sujidade inorgânica Sujidade orgânica
 Limpeza
Rugosidade
Groseira

Rugosa

Lisa

Brilhante
 Limpeza
ÁGUA DE PROCESSO

ÁGUA DE PROCESSO
ÁGUA DE PROCESSO

AÇÃO TEMPERA-
QUÍMICA TURA

TEMPO DE AÇÃO
CONTATO MECÂNICA

ÁGUA DE PROCESSO
 Oxigênio
12,5oP ---5 ppm
___9ppm
Variáveis
Temperatura do mosto
Vazão e pressão de O2
Aplicação do O2
Gravidade

1oP

24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)
Cinética de fermentação com diferentes concentrações de oxigênio dissolvido 2
 Solubilidade do Oxigênio
Tabela 01. Solubilidade do oxigênio ( mg O2/L) do ar em água e mosto em diferentes temperaturas e para
oxigênio puro, todos e pressão atmosférica. 3

Tabela 02. Amostras de níveis de oxigênio dissolvido em microcervejarias. 2

Volume de Mosto (L) Vazão de O2 (L/min) Duração (min) Gravidade Oxigênio Disolvido
Inicial (oP) (ppm)
6359,49 (40bbl) 6 40 12,5 5,00
2384,80 (15 bbl) 6 45 13,2 5,42
2384,80 (15 bbl) 12 75-80 25,5 5,50
1589,87 (10 bbl) 6 35 12,3 5,85
6359,49 (40bbl) 7 40 12,3 6,20
2384,80 (15 bbl) 7 40 12,7 6,54
1589,87 (10 bbl) 7 35 12,5 7,20
1589,87 (10 bbl) 6 30 14,4 8,10
1589,87 (10 bbl) 7 30-40 12,0 8,25
 Oxigênio x Ácido Graxo (azeite)
Experimento
19oC
1,5x107cel/mL (91,04%)
pH = 5,34-5,3

les is higher when

0,7 mg/L 0,7 mg/L

5-8 mgO2/L 5-8 mgO2/L
Diferentes na produção de álcool superior e acetato de isoamila em experimentos utilizando
aeração ou açido linoleico. 4
 Nutrientes
Levedura C47H6,3O33N8P1,2S3,5Sais1

Magnésio e Zinco
Glicose 1. Requerido para reações de fosforilação oxidativa,
síntese de ATP, síntese de DNA e regulação da
informação genética;
2. Representa 0,3% da massa celular;
Piruvato 3. Importante no metabolismo fermentativo:
Mg+2 Mg+2
CO2 PDC
Mg+2 Mg+2
Vitaminas
1. Requerido como co-fatores das reações enzimáticas;
Acetaldeído

ADH Zn+2
Biotina: reações de carboxilação > síntese de aminoácidos
Zn+2 Ácido pantotênico: forma coenzima A
Etanol Ácido nicotínico: nicotinamida para síntese de ATP
Tiamina (vitamina B): reações de carboxilação
 Floculação
• A adesão celular Floculação de levedura;

20% Ca+
+

Fermento
Floculação
Fatores que influenciam a floculação
• pH,
• temperatura, etanol
• Oxigenação
• disponibilidade de cálcio 5
 Amnoácidos
Tabela 03. Classificação dos aminoácidos do mosto de
acordo com o seu consumo pela levedura.7

Concentração de dicetonas vicinais no final da fermentação 7

Vias da produção de ésteres
Catabolismo Biosentese Catabolismo
aminoácidos leucina fenilalanina
glicólise
ramificados
glicose
Valina alfa-ceto isovalerato Fenilalanina

piruvato
2-oxoisovalerato alfa-isopropil malato Fenilpiruvato

acetaldeído Isoaldeído Alfa -ceto isocaproato

Mg Fenilaldeído
Zn acetato
fermentação
Feniletanol
Acetil-CoA Mg Álcool isoamilico

Zn etanol
Zn
Acetil-CoA
Acetato de isoamila
Malonil-CoA

Acetato de etila
Acetato de feniletanol
Ácidos graxos
cadeia media
Ésteres de ácidos graxos
Produção de ésteres durante a fermentação. 7
 Temperatura
Lager Ale
Temperatura
9-14 oC 16-26 oC

Composto Limite de Temperatura de fermentação

Percepção 19 oC 24 oC Aroma
Etanol 1,4% ABV 4,74% ABV 5,04% ABV Doce
1-Propanol 600 ppm 23,78ppm 22,76 ppm
Acetato de etila 30 ppm 22,51 ppm 33,45 ppm Frutado,
solvente
Álcool isoamílico 70 ppm 108,43 ppm 114,92 ppm Banana
Diacetil Total 150 ppb 7,46 ppb 8,23 ppb Manteiga
2,3 - Pentadiona 900 ppb 5,09 ppb 3,17 ppb
Acetaldeído 10 ppm 7,98 ppm 152,19 ppm Maça Verde

Cromatografia gasosa comparando duas cervejas com mesmo mosto e

levedura ALE, fermentada em duas temperaturas
 Inóculo
Microcervejaria

Cálculo de células viáveis para uma adequada taxa

de inoculação

CUIDADO

!
 Cálculo
Qual a taxa de inóculo mais indicada?
Densidade Inicial
Ale Lager
0,5.106 cel/mL/oP 1.106 cel/mL/oP
Ex.: 12 oP Ex.: 12 oP
C2 = 12*0,5 = 6.106 cel/mL C2 = 12*1 = 12.106 cel/mL

Limpeza
Variáveis Viabilidade e Vitalidade
Tempo de fermentação
Resultado Produção de aromas
 Taxa de inóculo
Ex. Para um volume de brassagem de 10 hL de uma cerveja do tipo ALE
e mosto com 12 oP de concentração.

ALE
Taxa de inóculo (TI) = 0,5 x 106 cel/mL/oP (0,75 x 106 cel/mL/oP (WHITE
, C., 2010))
Densidade da cerveja (OG) = 12oP (1,045 g/mL)
Concentração de fermento (CF) = TI x OG = 0,5 x 106 cel/mL/oP x 12oP
CF = 6x106 cel/mL

Volume da brassagem (VB) = 10 hL = 1.000.000 mL

Concentração de fermento (CF) = 6x106 cel/mL
Quantidade de fermento (QF) = CF x VB = 6x106 cel/mL x 1.000.000 mL
QF = 6.000.000.000.000 = 6 trilhões
 Seleção de leveduras
1 ª Etapa – isolamento e extração de DNA
Amostra in natura

Extração do DNA
dos isolados
Amostra por Amplificação do
plaqueamento DNA por PCR

Avaliação da
morfologia das
colônias

Isolamento das
diferentes colônias
 Seleção de leveduras
2 ª Etapa – amplificação do DNA
Ciclo de aquecimento

T A
G
A
ATCG
G C
TAGC
C

Extração de DNA

G A
Primer
C Enzima Ciclo de resfriamento
 Seleção de leveduras
3 ª Etapa – eletroforese

Gel de eletroforese

- +
DNA amplificado
 Seleção de leveduras
4 ª Etapa – banco genético
 Seleção de leveduras
5 ª Etapa – screening inicial
Controle 40oC 0,5 M NaCl 200 g/L Gli 190 g/L Suc
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
L1
2 dias 2 dias 2 dias 2 dias 2 dias
L2
L3
L4
L5
L6
-1 -1
A. Control B. 40 °C C. 0.5 M NaCl D. 200 g L glucose E. 190 g L sucrose
2 days 2 days 2 days 2 days 2 days

Meio YPD 2% Açucar Total oGl

S.G (A.T.).
pH
Células
Sacarose Vivas
Maltose
Maltotriose
 Seleção de leveduras
6 ª Etapa – Caracterização bioquímica
fermentação em escala piloto (ciclos de fermentação)

Parâmetros microbiológicos:
Viabilidade, brotamento, cel/mL,
Estufa Biomassa úmida e seca

Inóculo da Teor Alcoólico

cepa isolada
HPLC e
GC
Análise do Mosto/Vinho:
ART, Nitrogênio, Teor Alcoólico (alc.
superiores, metanol) e Glicerol
30 OC

Módulo

Monitoramento de variáveis:
Temperatura, pH, CO2 , Brix
 Fermento SuperYeast
Manutenção das Leveduras Cultivo de Leveduras
Ultra Freezer Estufa Shaker

-80 °C

Biorreator

Controle de Qualidade
- +

Câmara

Viabilidade celular Contaminação (UFC/mL) Cariotipagem genética

Concentração celular Teste para melibiose Fingerprinting da levedura
Lamínula Coloração de GRAM Petit mutant Banco genético de leveduras
 Seleção de leveduras
Metabolismo/Genoma X Aplicação no processo

oGl
S.G (A.T.).
pH
Células
Vivas
 Serviço de Análises-ISO17025
Análises Físico-Químicas
Densidade Real (mg/mL) Turbidez (EBC)
Extrato Original (% p/p) Turbidez 0oC (EBC)
Extrato Aparente (% p/p) Teste Forçado (Shelf Life)
Extrato Real (% p/p) Oxigênio Dissolvido (mg/L)
Álcool (% p/p) Polifenóis Totais na Cerveja (mg/L)
Álcool (% v/v) Acidez Total (mg/L)
Cor (EBC) Gluten em Bebidas (ELISA) (ppm)
pH Atenuação Real (%)
Calorias (Kcal/100mL) Açúcar Total (g/L)
Amargor (IBU) Açúcares Redutores Totais (g/L)
Dicetonas Vicinais Totais (mg/L) Cromatografia Gasosa (sob consulta)
Teste de Pasteurização

Análises Microbiológicas
Contagem de Leveduras Câmara de NEUBAUER (Contagem e Viabilidade)
Contagem Total de Bactérias em Anaerobiose de Cerveja (Morfologia + GRAM) (UFC/mL)
Contagem Total de Bactérias em Aerobiose de Cerveja (Morfologia + GRAM) (UFC/mL)
Contagem Total de Bactérias em Anaerobiose de Fermento (Morfologia + GRAM) (UFC/mL)
Contagem Total de Bactérias em Aerobiose de Fermento (Morfologia + GRAM) (UFC/mL)
Plaqueamento leveduras (Morfologia e Contagem)
Petit Mutant Teste
Análise de Floculação
Identificação de Leveduras Selvagens
Análise de Leveduras do Tipo LAGER x ALE
Análise de Leveduras Não Saccharomyces
 Referências Bibliográficas
1) Pasteurs, L. Studies on fermentation. The diseases of beer. Theis causaes and the means of
preventing them. London. Macmillan & Co, 1879.

2) White, C; Zainasheff, J. Yeast - The Practical Guide to Beer Fermentation. Brewers Publication,
2010.

3) Briggs, D. E.; Boulton, C. A.; Brookes, P. A.; Stevens, R. Brewing Science and practice. Woodhead
Publishing Limited and CRC Press LLC, 2004.

4) Bonciu, C. RESEARCH CONCERNING THE INFLUENCE OF LINOLEIC ACID ADDITION IN WORT

COMPARING WITH WORT AERATION. Innovative Romanian Food Biotechnology Vol. 4, Março, 2009.
5) Sim, L.; Groes, M.; Olesen, K.; Henriksen, A. Structural and biochemical characterization of the N-
terminal domain of flocculin Lg-Flo1p from S. pastorianus reveals a unique specificity for
phosphorylated mannose. FEBS Journal, Denmark, 2010

6) Brown, A.K.; Hammond, J.R.M. FLAVOUR CONTROL IN SMALL-SCALE BEER FERMENTATIONS.

Brewing Research International, Surrey, UK, vol 42, 2005.

7) C. Lekkas,1 G. G. Stewart,1 A. Hill,1 B. Taidi,2 and J. Hodgson2

1. The Importance of Free Amino Nitrogen in Wort and Beer. . International Centre of Brewing and
Distilling (ICBD)
Obrigado!