Aula P2 - Métodos de Estudo de Proteínas

05/09/2024
Biologia Molecular e Celular
Aulas Práticas 2024-2025

Prática 2: Métodos de estudo de proteínas
Porquê estudar proteínas?
Moléculas essenciais em todos os processos biológicos
As proteínas estão envolvidas na saúde e na doença
Estudo das proteínas permite estudar a patofisiologia e abordagens terapêuticas
Necessário separar ou identificar proteínas de interesse de/numa mistura
1
05/09/2024
Como separar proteínas numa mistura?

Cromatografia
Separação de componentes a partir de uma mistura com base na interação diferencial
que estes estabelecem com uma fase móvel e uma fase estacionária.
Dependendo do tipo de parâmetro que é usado, temos diferentes tipos de cromatografia.
Troca iónica Exclusão de tamanho Afinidade
Electroforese (migração de moléculas sob influência de um campo elétrico)
SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
Poliacrilamida - polimero de acrilamida

e bisacrilamida que forma uma malha
porosa que afeta a migração das
proteínas, atrasando as maiores –
separação pelo tamanho
SDS- Detergente fortemente aniónico usado

para:
- a desnaturação das proteínas, reduzindo-as
à sua estrutura primária, linearizada
- conferir às proteínas carga negativa
2
05/09/2024
SDS-PAGE
Marcador de pesos
moleculares
Como identificar proteínas específicas numa mistura?

Imunoensaios ou técnicas baseadas na reação anticorpo-antigénio
Proteínas específicas podem ser detetadas com base em

reações antigénio-Anticorpo, devido à capacidade de um
anticorpo reconhecer especificamente uma determinada
proteína (que funciona como seu antigénio)
3
05/09/2024
Como se obtém Anticorpos monoclonais?
ü O ratinho é estimulado a produzir

anticorpos para um determinado antigénio
(proteína de interesse)
ü Isolam-se do baço as células produtoras
de anticorpos (plasmócitos)
ü Hibridam-se células de mieloma com
plasmócitos dando origem aos hibridomas
ü Selecionam-se os clones com
especificidades para diferentes epítopos
ü Cada clone produz anticorpos com uma
única especificidade - anticorpo monoclonal
Métodos de identificação de proteínas (antigénios) com anticorpos monoclonais
Método direto: Método indireto:

O anticorpo primário que O anticorpo primário que reconhece o antigénio
reconhece o antigénio tem não tem associada nenhuma marcação, mas é
associada uma marcação reconhecido por um anticorpo secundário. Este
(por ex: fluorescência, enzima...) último tem associado uma marcação (por ex.
fluorescência, enzima...).
4
05/09/2024
Método indireto:
O Anticorpo secundário tem que ser produzido numa espécie animal diferente do primário.
Para identificar uma proteína específica num extrato proteico obtido de células ou
tecidos - Western Blot
10
5
05/09/2024
Western Blot (continuação)
11
Para identificar uma proteína específica numa solução (ex. no soro, na urina, na
saliva...) - ELISA (“Enzyme Lynked immunosorbent assay”)
Ex: vírus, anticorpos, marcadores

de inflamação, hormona da gravidez
A deteção da reação anticorpo-

antigénio é dependente de uma reação
enzimática, isto é, uma enzima
conjugada a um anticorpo reage com
um substrato incolor dando origem a
um produto colorido.
12
6
05/09/2024
ELISA (continuação)
ELISA indireto
ELISA sandwich
Método quantitativo
13
Para identificar/localizar uma proteína específica em células (cito) ou tecido (histo)

imobilizados numa lâmina de microscópio - Imunocito(histo)química ou Imunofluorescência
Ø A Imunofluorescência ou imunocitoquímica/Imunohistoquímica permite a deteção e localização de proteínas em células e
tecidos, utilizando anticorpos monoclonais específicos, marcados com fluorocromos (ou enzima) de modo a que a
localização dessas proteínas se torne visível ao microscópio (fluorescência ou luz branca).
Imunohistoquímica Imunofluorescência
Complexo
Avidina-
biotina-
Peroxidase
TECIDO
14
7
05/09/2024
Para identificar proteínas específicas em células intactas numa suspensão – Citometria de fluxo
Técnica baseada em anticorpos monoclonais fluorescentes

(método direto) usada para identificar proteínas em células
intactas. Usa um equipamento designado por Citometro de fluxo.
As proteínas servem de marcadores que podem ajudar a
caracterizar certas células/populações celulares.
Características físicas das células:

-tamanho relativo (FSC)
-granularidade/complexidade interna (SSC)
-intensidade de fluorescência (dependente da
quantidade de ligações do anticorpo à respetiva proteína)
15
Ex: Identificação de células do sangue (LEUCÓCITOS) com base no seu tamanho e granularidade
O FSC (dispersão da luz frontal) correlaciona-se com o tamanho da célula e o SSC (dispersão da luz lateral) correlaciona-se
com a complexidade interna da célula.
16
8
05/09/2024
Ex: Identificação de células alguns LEUCÓCITOS especificos com base em marcadores particulares
Este método utiliza também as reações dos anticorpos com as proteínas para determinar os tipos celulares específicos numa amostra de
células. Anticorpos (com fluorescência) reativos contra proteínas específicos das células (CDs de “Cluster of Differentiation”) são incubados com
as células que se querem caraterizar ou IMUNOFENOTIPAR.
17
Análise de dados
18
9
05/09/2024
Ex: Identificação subpopulações de linfócitos usando anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 conjugados com fluorócromos que
se vão ligar especificamente a moléculas (proteínas) na superfície destas células.
19
Para separar células suspensas e intactas com base nas proteínas que as caracterizam –
“Fluorescence-activated cell sorting” (FACS)
Alguns citómetros de fluxo para além de analisar as células também permitem a sua separação com base nas proteínas de
superfície das células que são reconhecidas pelos anticorpos fluorescentes
20
10
05/09/2024
Como estudar o conjunto de todas as proteínas de um organismo ou tecido (Proteoma) –

Proteómica
1. Separação por geis 3. Identificação por

bidimensionais (2-D) Espectrometria de massa
2. Análise Bioinformática
4. Bases de Dados
21
Bibliografia
Ø Alberts, Bruce et al.; Molecular Biology of the Cell; 6ª ou 7ª edição; Garland Garland Science,
Taylor & Francis group. (7.ª Edição 2022, W. W. Norton & Company)
Capítulo 3, 8
Ø Lodish, Harvey et al.; Molecular Cell Biology; 6º ou 7º Edição; W. H. Freeman and Company.
Capítulo 3
22
11

Aula P2 - Métodos de Estudo de Proteínas

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Aula P2 - Métodos de Estudo de Proteínas

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Aula P2 - Métodos de Estudo de Proteínas

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

05/09/2024

Biologia Molecular e Celular

Aulas Práticas 2024-2025

Porquê estudar proteínas?

Moléculas essenciais em todos os processos biológicos

As proteínas estão envolvidas na saúde e na doença

Estudo das proteínas permite estudar a patofisiologia e abordagens terapêuticas

Necessário separar ou identificar proteínas de interesse de/numa mistura

Como separar proteínas numa mistura?

Electroforese (migração de moléculas sob influência de um campo elétrico)

SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

Poliacrilamida - polimero de acrilamida

SDS- Detergente fortemente aniónico usado

Como identificar proteínas específicas numa mistura?

Proteínas específicas podem ser detetadas com base em

Como se obtém Anticorpos monoclonais?

ü O ratinho é estimulado a produzir

Métodos de identificação de proteínas (antigénios) com anticorpos monoclonais

Método direto: Método indireto:

Western Blot (continuação)

Ex: vírus, anticorpos, marcadores

A deteção da reação anticorpo-

Para identificar/localizar uma proteína específica em células (cito) ou tecido (histo)

Técnica baseada em anticorpos monoclonais fluorescentes

Características físicas das células:

Como estudar o conjunto de todas as proteínas de um organismo ou tecido (Proteoma) –

1. Separação por geis 3. Identificação por

Você também pode gostar