Aula BM 7 Eletroforese

Disciplina:
BIOLOGIA MOLECULAR
Prof. Dr. José Ferreira Marinho Júnior
Paulista – 2017.2
ELETROFORESE
ELETROFORESE
• Conceito e aplicações eletroforese
Técnica de separação de partículas através de corrente elétrica
1-Identificação de substâncias
2-Homogeneidade de sistemas biológicos
3-Determinação de pontos isoelétricos

• Breve Histórico
1909 – Michaelis descreveu o movimento de colóides sob a influência de

um campo elétrico.
1937 – Arne Tiselius, criou o método denominado eletroforese de campo
livre, através da Técnica de separação baseada na migração de moléculas
carregadas. Este trabalho lhe rendeu o Prêmio Nobel em 1948.
ELETROFORESE LIVRE
Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948
Este método de solução livre, era bastante limitado devido á perturbações:
-ondas mecânicas
-movimentos de convecção do líquido pelo aquecimento da solução causado
pela aplicação da diferença de potencial (Voltagem)
Perturbações fazem com que a eletroforese se torne processo muito pouco

reprodutível , com as cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas
sim, dispersas.
Este método era bastante limitado devido:
-Instabilidade do equipamento (manter voltagem adequada);
- Efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os
quais comprometiam a separação dos compostos.
Estes efeitos foram minimizados com a introdução de um suporte (gel
ou papel) que ajudou a conter o movimento livre das moléculas, de
forma que o efeito da difusão fosse reduzido.
• Princípio da técnica e aplicações
Físico-químico: a capacidade de moléculas carregadas migrarem

sob influência de um campo elétrico.
•Lei de Coulomb – onde partículas de carga positiva migram para o

polo negativo (cátodo) e partículas de carga negativa migram para
o polo positivo (anodo).
• A velocidade de migração das moléculas é proporcional ao campo

elétrico e inversamente proporcional ao seu volume molecular.
Desta forma, sob uma mesma voltagem:
- Moléculas com menor volume molecular irão migrar mais
rapidamente e as que possuem maior volume molecular irão migrar
mais lentamente.
Para corrida eletroforética:
1-MATRIZES RÍGIDAS- SUPORTES
papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato
de celulose, gel de agarose, amido ou
poliacrilamida, entre outros.
Dependendo do suporte que utilizamos para a
eletroforese e da natureza das macromoléculas,
podemos separá-las:
1- com base na carga
2- com base em seu tamanho

Os suportes em gel apresentam grande
capacidade de separar as moléculas com base no
tamanho molecular
Eletroforese em suporte de papel é muito

eficiente no que diz respeito a separação de
partículas com grande diferenças de cargas
• Eletroforese
Componentes básicos são necessários:
1-Campo elétrico (obtido através de uma fonte de corrente

contínua)
2- Própria molécula carregada
3 - Corante
Aplicações Eletroforese
1- Análise de DNA – SOUTHERN BLOT
2- Análise de RNA – NORTHERN BLOT
3- Análise de Proteínas – WESTERN BLOT

• Eletroforese
PARA VISUALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS SEPARADAS:
-Corantes específicos para proteínas (ex.: Coomassie Blue);
-Enzimas - Soluções específicas contendo os componentes

necessários (substratos, coenzimas, solucao-tampao e sais) para
revelação das bandas;
-DNA e RNA, diversos sistemas de revelação de bandas são

empregados.
Aplica-se amostras:
Peso Molecular
Controle positivo: C++ (forte) e C+ (fraco)
Controle negativo: Amostra sabidamente negativa ou ausência de amostra
Anota-se a sequência para análise posterior.

• Eletroforese
Corrida eletroforética
- Adicionada uma solução-tampão com “sal”, que conduz eletricidade. -
- O gel e montado entre os dois compartimentos de tal forma que a
única conexão elétrica entre os compartimentos seja através do gel.
-Obs.: LEVAR EM CONSIDERAÇÃO O NÚMERO DE GÉIS USADO
• Eletroforese
VISUALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS SEPARADAS (NA FORMA DE
BANDAS ELETROFORÉTICAS):
• Eletroforese
VISUALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS SEPARADAS (NA FORMA DE
BANDAS ELETROFORÉTICAS):
Tipos de eletroforese
Os principais tipos de eletroforese são:
- Eletroforese capilar
- Eletroforese bidimensional
- ELETROFORESE EM GEL
ELETROFORESE
Dodecil sulfato de sódio e
β-mercaptoetanol
São usados em conjunto para desnaturar as

proteínas, torná-las negativamente
carregadas e reduzir as pontes dissulfeto.
ELETROFORESE
Iodoacetamida
É usada em separações eletroforéticas que

visem o SEQUENCIAMENTO de proteínas pelo
método de degradação de Edman, com o
objetivo de evitar o bloqueio do N-terminal.
Eletroforese bidimensional
Moléculas separadas em duas dimensões, com moléculas
espalhadas por todo o gel.
As duas propriedades usadas neste tipo de separação
são:
PONTO ISOELÉTRICO
MASSA MOLECULAR.
ELETROFORESE EM GEL
1.Separar partículas por diferença de

carga e massa
2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre

o gel
3.Isolar DNA RNA e proteínas

Eletroforese em gel de agarose
1-Gel gelitificado de agarose
2-Separa fragmentos longos de DNA
3-Corrente elétrica sobre gel
4-Partículas menores tem maior velocidade de

chegar ate o pólo positivo
Eletroforese em gel de
policrilamida
1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra molécula
2-Recupera e purifica amostras
3-Em cubas de vidros
4-Aplicacao de corrente
O gel de policrilamida pode ser:
1-Desnaturante : com presenca de ureia, separa

e purifica fitas simples
2-Não desnaturante : separa e purifica fitas

duplas, sem presenca de ureia
EXERCÍCIOS
• Exercício
Sobre a ELETROFORESE...
• Quando a “corrida”
Nosso genoma eletroforética
é formado é controlada pela corrente
por aproximadamente elétrica(V
30 mil genes. empregada,
ou F?)
devemos levar em consideração o número de géis usados Verdadeiro
• Dodecil sulfato de sódio e β-mercaptoetanol são usados em conjunto para
desnaturar as proteínas, torná-las negativamente carregadas e reduzir as
pontes dissulfeto. Verdadeiro
• A eletroforese in natura é geralmente usada para localizar uma proteína no

gel, com a finalidade de determinar sua massa molecular relativa. Falso
• A focalização isoelétrica é uma etapa fundamental da eletroforese
bidimensional. Verdadeiro
• A iodoacetamida é usada em separações eletroforéticas que visem o
sequenciamento de proteínas pelo método de degradação de Edman, com
o objetivo de evitar o bloqueio do N-terminal. Verdadeiro
• Exercício
• Quando a “corrida”
Nosso genoma eletroforética
é formado é controlada pela corrente
por aproximadamente elétrica(V
30 mil genes. empregada,
ou F?)
devemos levar em consideração o número de géis usados Verdadeiro
• Dodecil sulfato de sódio e β-mercaptoetanol são usados em conjunto para
desnaturar as proteínas, torná-las negativamente carregadas e reduzir as
pontes dissulfeto. Verdadeiro
• A eletroforese in natura é geralmente usada para localizar uma

proteína no gel, com a finalidade de determinar sua massa molecular
relativa. FALSO
• A focalização isoelétrica é uma etapa fundamental da eletroforese
bidimensional. Verdadeiro
• A iodoacetamida é usada em separações eletroforéticas que visem o
sequenciamento de proteínas pelo método de degradação de Edman, com
o objetivo de evitar o bloqueio do N-terminal. Verdadeiro
• Exercício
(C) A eletroforese em gel é uma das principais ferramentas de trabalho no
campo da biologia molecular e tem sido utilizada no estudo de proteínas, DNA e
RNA. Marque a opção que apresente técnicas de biologia molecular que
analisam, respectivamente, proteínas, DNA e RNA.
(A) Northern blot, Southern blot e Western blot.
(B) Southern blot, Northern blot e Western blot.
(C) Southern blot, Western blot e Northern blot.
(D) Western blot, Northern blot e Southern blot.
(E) Western blot, Southern blot e Northern blot.

• Exercício
(C) A eletroforese em gel é uma das principais ferramentas de trabalho no
campo da biologia molecular e tem sido utilizada no estudo de proteínas, DNA e
RNA. Marque a opção que apresente técnicas de biologia molecular que
analisam, respectivamente, proteínas, DNA e RNA.
(A) Northern blot, Southern blot e Western blot.
(B) Southern blot, Northern blot e Western blot.
(C) Southern blot, Western blot e Northern blot.
(D) Western blot, Northern blot e Southern blot.
(E) Western blot, Southern blot e Northern blot.

PRIMER
• Exercício .... relembrando
Sobre os PRIMERS...
Primers universais são aqueles que permitem a amplificação de um fragmento
de DNA presente:
A) em um único gênero.
B) em uma única espécie.
C) em diferentes espécies.
D) em diferentes gêneros.
E) nenhuma das alternativas anteriores.

• Exercício .... relembrando
Sobre os PRIMERS...
Primers universais são aqueles que permitem a amplificação de um fragmento
de DNA presente:
A) em um único gênero.
B) em uma única espécie.
C) em diferentes espécies.
D) em diferentes gêneros.
E) nenhuma das alternativas anteriores.

PCR
• Exercício
Sobre os PCR...
A técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) em tempo real revolucionou
o processo de quantificação de fragmentos de DNA. Ela realiza a quantificação
desses ácidos nucleicos de maneira precisa e com maior reprodutividade.
Assinale o fator que permite essa quantificação:
a) O sequenciamento do DNA.
b) A eletroforese.
c) A carga elétrica do DNA.
d) Os marcadores STRs
e) A fluorescência.
• Exercício
Sobre os PCR...
A técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) em tempo real revolucionou
o processo de quantificação de fragmentos de DNA. Ela realiza a quantificação
desses ácidos nucleicos de maneira precisa e com maior reprodutividade.
Assinale o fator que permite essa quantificação:
a) O sequenciamento do DNA.
b) A eletroforese.
c) A carga elétrica do DNA.
d) Os marcadores STRs
e) A fluorescência.
• Exercício
Sobre os PCR...
Qual sequência de etapas constituem a reação em cadeia da polimerase (PCR):
I. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 30s).
II. Anelamento dos iniciadores no DNA genômico (30-60ºC, 30s).
III. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 5min).
IV. Síntese do DNA pela polimerase (72ºC, 2-5 min).

• Exercício
Sobre os PCR...
Qual sequência de etapas constituem a reação em cadeia da polimerase (PCR):
I. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 30s).
II. Anelamento dos iniciadores no DNA genômico (30-60ºC, 30s).
III. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 5min).
IV. Síntese do DNA pela polimerase (72ºC, 2-5 min).
III ; II; IV; I; II, IV... I; II; IV I; II; IV....

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2-Homogeneidade de sistemas biológicos

3-Determinação de pontos isoelétricos

1909 – Michaelis descreveu o movimento de colóides sob a influência de

Este método de solução livre, era bastante limitado devido á perturbações:

Perturbações fazem com que a eletroforese se torne processo muito pouco

Físico-químico: a capacidade de moléculas carregadas migrarem

•Lei de Coulomb – onde partículas de carga positiva migram para o

• A velocidade de migração das moléculas é proporcional ao campo

1- com base na carga

2- com base em seu tamanho

Eletroforese em suporte de papel é muito

1-Campo elétrico (obtido através de uma fonte de corrente

2- Própria molécula carregada

1- Análise de DNA – SOUTHERN BLOT

2- Análise de RNA – NORTHERN BLOT

3- Análise de Proteínas – WESTERN BLOT

-Enzimas - Soluções específicas contendo os componentes

-DNA e RNA, diversos sistemas de revelação de bandas são

Anota-se a sequência para análise posterior.

São usados em conjunto para desnaturar as

É usada em separações eletroforéticas que

1.Separar partículas por diferença de

2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre

3.Isolar DNA RNA e proteínas

2-Separa fragmentos longos de DNA

3-Corrente elétrica sobre gel

4-Partículas menores tem maior velocidade de

2-Recupera e purifica amostras

3-Em cubas de vidros

1-Desnaturante : com presenca de ureia, separa

2-Não desnaturante : separa e purifica fitas

• A eletroforese in natura é geralmente usada para localizar uma proteína no

• A eletroforese in natura é geralmente usada para localizar uma

(A) Northern blot, Southern blot e Western blot.

(B) Southern blot, Northern blot e Western blot.

(C) Southern blot, Western blot e Northern blot.

(D) Western blot, Northern blot e Southern blot.

(E) Western blot, Southern blot e Northern blot.

(A) Northern blot, Southern blot e Western blot.

(B) Southern blot, Northern blot e Western blot.

(C) Southern blot, Western blot e Northern blot.

(D) Western blot, Northern blot e Southern blot.

(E) Western blot, Southern blot e Northern blot.

B) em uma única espécie.

E) nenhuma das alternativas anteriores.

B) em uma única espécie.

E) nenhuma das alternativas anteriores.

c) A carga elétrica do DNA.

c) A carga elétrica do DNA.

I. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 30s).

II. Anelamento dos iniciadores no DNA genômico (30-60ºC, 30s).

III. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 5min).

IV. Síntese do DNA pela polimerase (72ºC, 2-5 min).

I. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 30s).

II. Anelamento dos iniciadores no DNA genômico (30-60ºC, 30s).

III. Desnaturação do DNA genômico (94ºC, 5min).

IV. Síntese do DNA pela polimerase (72ºC, 2-5 min).