N ueva técnica de identificación zyxwvutsrqponm . , crcmesermea Dr. Fabio Salamanca Dr. Ernesto Barboso Iné Martínez cuerpo finales las de la tercera década del Pb, D. *** M., M.D., últimas carecen siglo, estudios técnicas de Citología en insectos la heteropicnosis na Cito genétic a fue solo hasta Barr y Bertran establecer este (1 (2 hallazgo l una célula cromatina 1949 número pudieron individuo del sexo procedente posee primeras la superficie de siempre Barr; de tal igual con aneuploidías a interior de la membrana X el tiene hombre del ·INPES· *** Jefe del Su~Grupo Trabajo realizado de Microbiología Su~Grupo de Bioquímica en el Instituto (Alteraciones cromosómico que Especiales de REV. MED. COLOMBIA FAC. U.N. Salud del número haploide de cromosomas) ejemplo conocidos XY en el simple los gonosomas en los son o que también casos y así bien de monosomía del cromo- soma X (Síndrome de Turner) no hay cuerpo de Barr, en el Síndrome de para ·INPES· VOL. cuyo no múltiplos por .INPES. Nacional Programas 1, un es JefezyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA del Su~Grupo de Genética ·INPES· obedecen a la misma relación Jefe al X menos gonosómico comprometen * ** célula, de cuerpo de Barr, y pacientes número en adherida la dos cromosomas carece las poseen el cuerpo de croma- una porción de cromatina era complemento femenino y una tina (cuerpo de Barr) consistente en de cromosomas cuerpo de un del sexo masculino: de por lo cual, la mujer que normalmente en células procedente pudieron presencia manera que el número de cuerpos de l. de mamífero y señalaron la diferencia entre la con el número de cromosomas presentes X por una masa de cromati- embargo, cuando estrecha en la célula intranuclear posteriores que de cuerpos de Barr guardaba una relación de un cromosoma o cromocentro Sin establecer habían revelado X, que se manifestaba en interfase investigaciones de de de Barr. Con el progreso A zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA presente ** MSC. P. (Bacteriólogo) nuclear y las INTRODUCCION MSC.zyxwvutsrqponmlkj * G., M.D., Guzmán U., M.D., Dr. Miguel 37 Nº 3 -236- 1971 Klinefeltter reconocido (XXY) hay un cuerpo de cromatina; en los complementos XXX encontrar no había sido posible (8). un método fácil que permi- ó XXXV hay dos cuerpos de Barr, en tiera los casos ocurría con el procedimiento XXXX ó XXXXY hay tres su identificación técnica por Barr para para encontrar este dimorfismo sexual los cromosomas Sin embargo, cuerpos de Barr, en la especie La humana se simplificó y se generalizó células etc. con la utilización de la mucosa bucal (3), de de Caspersson 10 cromosomas el reciente et al hallazgo de que los (9) toman un patrón especí- esclarecimiento con mostaza de quinacrina, permitió avance La de anormalidades en relación del número de fluorescencia un las técnicas que hizo cuerpos de Barr con el de cromosomas identificar X tuvo un nuevo y valioso soporte en efecto, los estudios tardía cromosomas X en la mujer, utilizando de método de timidina tritio, La explicación cuerpo lleva (5) su uno de marcada fué dada con la hipótesis nombre, según del con la se inactiva, al comportamiento cuyo lucus están cromosoma X, no solo importante el sino un método cromosoma autores en para Y. En encontraron por de algunas somas cual 13-14-15) esta nes (6. renciación sexual está grupo D también (cromosomas fluorescen especialmente inten- en las regio(10). se utilizó para estudiar de quinacrina Y ( 1 1) La celu- ha y fueron Pearson et al George demostrar los (12) primeros en que la fluorescencia del cromosoma y también se evidenciaba en 7). A pesar de que en el hombre el cromosoma más las en interfase empleando hidroc Ioruro el las división papel del largos la en el cario-tipo próximas al centrómero técnica en el hipótesis tenido amplia confirmación del samente, enzimas localizados Y muestra Somas como el número 3 y los cromo- esta Siguiendo de los brazos fluorescencia que X en la ocurriendo azar. distal humano, a pesar de que otros cromo- embriona- rio) uno de los cromosomas mujer posible cromosoma intensa tempranamente en la vida embrionaria (12 - 16 días de desarrollo inacti vación tratarlos de citogenética, estos porción los a la función del de cromatina Mary Lyon al (4) sobre GermanzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLK que con el agente mencionado la de replicación el de X supernumerarios. fico sexual. como utilizado la identificación que ha sido de enorme ayuda en el el desarrollo de tal Y en la dife- -237· que no (interfase), están en apareciendo como un pequeño corpúsculofluores- cente muy cerca nuclear. plenamente células Había de la surgido membrana así otro método para masculinas diferenciar células de las femeninas por presencia en las primeras Se estudió clormetacrina la del cro- interfase la acción tanto en de células como en células la en en división. mosomazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Y. La técnica empleada consta de los pasos siguientes: La- técnica con mostaza cloruro en fluorescencia de quinacrina de quinacrina el estudio numéricas de Los 1.- o hidro- ha sido tan dos células de nosotros un caso del con con en u ai. Uno (F.S.G.) ha de anormalidad la substancias la identificación fijan durante descrito el cual del análisis fluorescentes se esclarecimiento por tienen selectivas técnica de contribuír del mecanismos) en para facilitar los de los clormetacrina al con la cual se mejores resultados) 4.- Se lava s.- cubren Se buffer con agua las corriente láminas con pH . S. 3 fosfato y se montan en Buffer fosfato pH 7.4. cual estas 6.- Se y de esta en observa utilizando nuestro al microscopio lámpara de luz ultravioleta. el primer estudio de empleo modifican- Para fluorescencia mediante el substancia la CLORMETACRINA. (Ba estudiar clormetacrina de una nueva la acción en células utilizamos cultivo sangre periférica al Y METODOS Los realizados -238- ( 15) con algunas cultivos se de la en división de linfocitos yer).zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA la conocida técnica MATERIAL con durante 6 minutos. al cromosomas, Cito genética técnica las incorporaciones aparecido en la Literatura, la cubren 0.4% (concentración mecanismo el la realización medio, presentamos do láminas Se de este cromosoma Con el objeto substancias 10 minutos en una 3.- obtuvieron para las láminas se y acético 1: 1. solución (14). (o mujeres y solución de etanol-ácido estructural en Y utilidad hombres 2.- Se hacen frotis dos fluorescentes en interfase cromosoma demuestra de de mucosa del cromo- hombres cuerpos toman muestras mediante raspado con escobillón. cromosomas y (síndrome YY) presenlas Se bucal útil anormalidades estructurales y Y. soma de de mediante de Moorhead et modificaciones. cosecharon a 19; 72 horas de preparadas la siembra. las cultivos se Una vez láminas siguen los de los pasos CUADRO Ng 1 CELULAS EN INTERFASE CON CLOR Y METAFASE ANALIZADAS - METACRINA desCULTIVO critos anteriormente. MUCOSA Ni Las preparaciones utilizando Y filtros barrera de preparaciones las microfotografías las procesaron el por 380 METAFASE Nl! DE CELULAS , - '" 717 283 300 - lOO zyxwvutsrqponmlkjihg 500 500 Mujeres BG 12 Todas 530 K. De algunas se INTERFASE Ng DE CELULAS - 620 Hombres lámpara de luz ultravioleta HBO 200, con filtro excitador DE , Fluorescencia Leitz Orthoplan, DE SANGRE PE.PIFERICA CELULAS se observaron en un fotomicroscopio BUCAL analizadas tomaron cuales las metafases de se un revelaron de usual. los en la la brazos presencia Y con intensa cromosoma fluorescenci a procedimiento masculinas porción largos distal según se observa en las Figuras Nºs. 6, 7 y 8. RESUL TADOSzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFE y DISCUSION No se observó fluorescencia similar en los cariotipos Los Cuadro el resultados aparecen Nº 1. Puede 62% de las mostró células las células lizadas en estas células y en las células masculinas también presentan masculinas positi va en femeninas ninguna fluorescente. positivas mostraron llante dos, a pesar de que otros cromosomas fluorescencia de mucosa bucal mientras que de 500 células mostró terístico, ana- avance de la técnica (cromosomas distintos aquellas células que somas bri- objeto cuerpo o muy cerca de la membrana nuclear con una fluorescencia muy intensa lo cual constituye de como pequeño tal como se muestra sexuales periférica el masculinas fluorescencia nuevamente de sangre 71.7% de las células cultivos en interfase generalmente es menos la del positiva, las no mostraron esta células mientras con Figura normal que habitual femeninas se -239- esta Y (Figuras nueva muestra según la masculino técnica de Glemsa, en el cual diferenciar los técnica en la con coloración pueden La intensa comparar Nº 9 un cariotipo procedimiento fluorescencia. Para se obtenido y será ón. autosomas cromosoma 6, 7, 8,). fluorescen te, mostró y Y), publícací los resultados los autosomas de Nºs. un gran a los cromo- X otra de carac- al permitir la los fluorescencia que en las Figuras Nºs. 1, 2, 3, 4 y 5. En un patrón identificación tomaron un con cuerpo Se adosado analiza- que apreciarse fluorescencia femeninos en el solamente los distintos FIGURAS N!s, 1 y 2 Se aprecia interfase el cuerpo de la mucosa fluorescente bucal que evidencia de un individuo -240- el cromosoma normal de sexo Y. en células en zyxwvutsrqponmlk masculino. FIGURAS NOs. 3, 4 y 5 Fluorescencia cultivo de sangre del cromosomazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVU y en linfocitos (interfase) procedentes dezyxwvu periférica ·241· en un individuo normal de sexo masculino. FIGU.RA NO 6 Metaf~se derecha cencia de la metafase FIGURA Nº 7 de una célula Fluorescencia metafase de un sujeto de la porción distal de los un núcleo en interfase. de la de una célula porción de varón distal n orm al de sexo brazos de normal. · 242· los largos masculino. del brazos A la izquierda Se muestra crom os om a Y. largos se del aprecia la fluores- Se aprecia a la zyxwvutsrqponm y en unazyxwvutsr cromosoma un núcleo en interfase " I 3 2 5 4 10 11 9zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPO 12 8 7 zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA ·6 '1 14 13 II II zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZ 19 N9 9 l. técnica Se aprecia Xy y cariotipo citogenética el complemento mas (cromosomas 22 .21zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUT 20 Metafase distintos 18 17 16 ,15 11/11 FIGURA o zyxwvutsrqponmlkjihgfedcba sexual correspondiente habitual los XY del varón a los cromosomas a un individuo cromosomas normal. sexuales -243- Los solo normal se números X y Y), de sexo diferencian del masculino. Con la por su morfología 1 al 22 indican ... los a ut os o- cromosomas fluorescentes? . por sus características morfológicas. Caspersson En el hom1:ireel papel determinante masculino está plenameate La regulación del cromosoma Y a interacción heterocromatinas de de los se debe a una de los pares Citosina- (8). Guanina en los sepentos de la diferenciación la et al han postulado afinidad prevalencia aceptado sexual en la vida embrionaria se ha atribuído que dicha las. crottW- tes fluorescen- de la molécula del DNA (ácido desoxiribonuléico), pensando que el grupo alquilante de la moleeula de mostaza de quinacrin a fuera el (16). X y YzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTS responsable de ésta afinidad y se autores han presentado uniera a los segmentos del DNA de que en el hombre los ricos en Guanina (Figura Nº 10). determinantes lDMCulin06 somas heterocromáticos Algunos evidencia factores están localizados cortos del croaaosoma Y tros en en un reeiente señalado zados brazos porción factores brazos mero del (14). más tamaño se refiere aparentemente expensas en en cuanto CI se variaciones hace a en la de los brazos largos. porción es la intensamente que con Esta fluoresce las utilizadas substancia más substancias (mostaza en el presente algunos la gran / N embargo fluorescencia et al (I n hidrocloruro N° 10 hallazgo el similar Y George por (I2) de quinacrina del de por las Pearson utilizando molécula en la cadena lateral (Figura N!l 11), e b ) Hidrocloruro zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPON de Quinacrina. pH NHCH-(CH2)3N(CH2CH} Por ~ qué 2 OCH:1 2HCI los brazos CI / cromosoma Y muestran afinidad una empleado estudio. distal de que ha perdido el grupo alquilan te cromosomas y especialmente porción largos hemos 2HCI FIGURA también con ésta nueva que -, Sin hiároc1oruro de quinacrina, proflavina) y lo hace OCH3 al , en indi viduos normales de hoy H3 «ortos del longitud hasta r locali- próxima al centro Y, de Quinacrina. NH CH-(CH )3N(CH CH CIl 2 2 2 La variación morfológica cromosoma de Hidrocloruro Noso- (17). cromosoma Y, no están situados la a) Mostaza trabajo hemos que estos sobre los los N substancias FIGURA N° 1 l FIGURA Nº 8 Intensa metafase FIGURA Nº 13 Cuerpo zoides fluorescencia de-la de una célula fluorescente porción distal de un individuo en un espermatozoide que portan cromosoma X na presentan -245- de los normal brazos de sexo que porta este zyxwvutsrqpon y en una largos del cromo s oma masculino. el cromosoma corpúsculo Y. Los fluorescente. espermato- zyxwvutsrqp está en contra sugerida de posibilidad siguiendo y su grupo. timidina la por Caspersson Nuestro hallazgo utilizando erina, molécula una que modificación lateral clormeta- también en la sufre cadena (Figura Nº 12) habla en favor la triatida fluorescente más exacta de tipo está que por la cadena el Cl or-Met acrin a, por estructura- ejemplo de la en la cual se intercamde distintos cromoso- mas. Por este método se ha establecido lateral. cromosomas les bia segmentos central los en alteraciones translocación, núcleo Con el método (18). envueltos del con se logra la identificación de que la afinidad química específica dada más bien por el anillo o incorporación igualmente que el cromosoma extra en el síndrome de la Trisomía zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA O H zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQP G1 (mongolismo) no es el mismo que I N HC H 2"eH-eJl2 N(C 2 H S )2 se encuentra en la leucemia mieloidecrónica y que tiene amputación en una delesión sus brazos (cromosoma Philadelphia o largos o Ph 1) (19), como se venía afirmando hasta ahora. el El método ha sido úti 1 también en el estudio FIGURA La Nº 12 técnica fluorescente nuevo con substancia ha permitido no solo un método evidenciar des el cito genético dimorfismo para sexual en el hombre, tal como lo demuestra el presente trabajo, sino que además ha revolucionado ticas, las técnicas citogené- al permitir una identificación más precisa del cariotipo humano ya que la substancia manera se incorpora específica de en los distintos cromosomas (Figuras N2s. 6, 7 y 8). De ésta manera se pueden diferenciar los cromosomas que pertenecen a los grupos C, F y G, los cuales no se diferenciaban por estudios de modo concluyente de autorradiografía de la relación de anormalida- cromosómicas habiéndose trabajos con encontrado el cáncer, en algunos una mayor frecuencia esperado de translocaciones Otro empleo de la nes cromosómicas, técnica es de lo y delesio- el averiguar el sexo genético del feto durante el embarazo, investigación varios en adelantada desde hace años por muchos laboratorios el mundo. Gracias método es identificación más adecuada y segura del sexo genético de estos estudios posible al fluorescente hacer una del feto. Algunos se están adelantan- do en nuestro laboratorio. Una empresa ambiciosa en el campo de la Genética ha sido la de separar los espermatozoides que portan cromosoma Y de los que portan cromosoma X, con el objeto de hacer estudios cito genéticos en nuestro medio, ya que la clormetacrina es de fecundaciones más selectivas en cuanto fácil obtención que otras al sexo se refiere. La técnica descri- substancias fluorescentes que se ta en este trabajo permite identificar incorporan sel ecti vamen te en los los cromosomas, espermatozoides que portan el sino que además permite estudios de gran importancia cromosomazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHG y tal como se muestra en en el campo de la Biología y particula figura Nº 13 en donde se aprecia un espermatozoide corpúsculo que fluorescente porta larmente el parte correspon- cias técnica presente reportada trabajo Genética. a mecanismo diente al cromosoma Y. La de la contribuye no solo en el por el cual las substan- fluorescentes nes específicas el Por otra precisar se unen a porcio- del Genoma Humano. facilitazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFED SUM M ARY RESUM EN This Se presenta informe literatura sobre el aparecido en una nueva técnica Cromosómica primer la de Identificación el empleo la Clor-Metacrina. Se señalan algunos usos de esta técnica campo de la Biología de mente mediante de la y como Identificación Anomalías de Desarrollo y del del Sexo Embarazo. mecanismos de esta Feto Se discuten substancia in detecting foetus cells the genetic sex during pregnancy, sex oí patients and in in with sex detecting (Zpermatozoa) chromosome this male germ bearing Y- other branches of Biology are discussed. Sexual durante In the other hand, this study ís el one approach to clarify the chernical los posibles de la acción a Utility malformations, del Sexo Genético en Cytogenetic of detecting tales first Clor-Metacrine. of en el the compound technique particular- Citogenética is Study using the fluorescent Mechanism específica of sobre el genoma responsable fluorescent for binding compounds to the specífic portions of human Karyotype. Humano.zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA AGRADECIMIENTOS: Los autores ."preson sus agradecimientos Villomizor H., Hemondo Graot L, Augusto (oci lidodes otorgocJos pora 'A a los doctores Pablo Morillo C., Luis J. Corredor A. y Alfredo Lleras P., por las realización de éste trabajo -247- REFERENCIASzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJ 1. Geltler, L., Z. Zelllorsch. Mlcroslcop. Exptl. Ce" Res. 60: 315, 1970. Anat., 26: 641, 1937. 11. Pearson, 2. Sorr, y M.L. Beltran, E. G., P.L., Sobrow, M. y Vosa, C.G., Nature. 226: 78, 1970. 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