N ueva técnica de identificación zyxwvutsrqponm
.
,
crcmesermea
Dr. Fabio
Salamanca
Dr. Ernesto
Barboso
Iné Martínez
cuerpo
finales
las
de la tercera década del
Pb, D. ***
M., M.D.,
últimas
carecen
siglo,
estudios
técnicas
de
Citología en insectos
la
heteropicnosis
na
Cito genétic a
fue
solo
hasta
Barr y Bertran
establecer
este
(1
(2
hallazgo
l
una célula
cromatina
1949
número
pudieron
individuo
del sexo
procedente
posee
primeras
la superficie
de
siempre
Barr;
de tal
igual
con aneuploidías
a
interior de la membrana
X
el
tiene
hombre
del
·INPES·
*** Jefe del Su~Grupo
Trabajo
realizado
de Microbiología
Su~Grupo
de Bioquímica
en el Instituto
(Alteraciones
cromosómico
que
Especiales
de
REV.
MED.
COLOMBIA
FAC.
U.N.
Salud
del
número
haploide
de
cromosomas)
ejemplo
conocidos
XY
en el
simple
los gonosomas
en
los
son
o
que
también
casos
y así
bien
de monosomía del cromo-
soma X (Síndrome de Turner) no hay
cuerpo de Barr, en el Síndrome de
para
·INPES·
VOL.
cuyo
no
múltiplos
por
.INPES.
Nacional
Programas
1,
un
es
JefezyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
del Su~Grupo
de Genética ·INPES·
obedecen a la misma relación
Jefe
al
X menos
gonosómico
comprometen
*
**
célula,
de cuerpo de Barr, y pacientes
número
en
adherida
la
dos cromosomas
carece
las
poseen el cuerpo de croma-
una porción de cromatina
era
complemento
femenino y una
tina (cuerpo de Barr) consistente
en
de cromosomas
cuerpo
de un
del sexo masculino:
de
por lo cual, la mujer que normalmente
en células
procedente
pudieron
presencia
manera que el número de cuerpos de
l.
de mamífero y señalaron la diferencia
entre
la
con el número de cromosomas
presentes
X
por una masa de cromati-
embargo,
cuando
estrecha
en la célula
intranuclear
posteriores
que
de
cuerpos de Barr guardaba una relación
de un cromosoma
o cromocentro
Sin
establecer
habían revelado
X, que se manifestaba
en interfase
investigaciones
de
de
de Barr. Con el progreso
A zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
presente
**
MSC.
P. (Bacteriólogo)
nuclear y las
INTRODUCCION
MSC.zyxwvutsrqponmlkj
*
G., M.D.,
Guzmán U., M.D.,
Dr. Miguel
37 Nº 3
-236-
1971
Klinefeltter
reconocido
(XXY) hay un cuerpo de
cromatina;
en los complementos
XXX
encontrar
no había sido posible
(8).
un método fácil que permi-
ó XXXV hay dos cuerpos de Barr, en
tiera
los casos
ocurría con el procedimiento
XXXX ó XXXXY hay tres
su
identificación
técnica
por
Barr para
para encontrar este dimorfismo sexual
los
cromosomas
Sin
embargo,
cuerpos
de
Barr,
en la especie
La
humana se simplificó
y se generalizó
células
etc.
con la utilización
de la mucosa
bucal
(3),
de
de Caspersson
10
cromosomas
el
reciente
et al
hallazgo
de que los
(9)
toman un patrón especí-
esclarecimiento
con mostaza
de quinacrina,
permitió
avance
La
de anormalidades
en
relación
del
número
de
fluorescencia
un
las
técnicas
que
hizo
cuerpos de Barr con el de cromosomas
identificar
X tuvo un nuevo y valioso soporte en
efecto,
los
estudios
tardía
cromosomas
X en la mujer, utilizando
de
método de timidina
tritio, La explicación
cuerpo
lleva
(5)
su
uno
de
marcada
fué dada
con la hipótesis
nombre,
según
del
con
la
se
inactiva,
al
comportamiento
cuyo lucus
están
cromosoma
X,
no solo
importante
el
sino
un método
cromosoma
autores
en
para
Y.
En
encontraron
por
de algunas
somas
cual
13-14-15)
esta
nes
(6.
renciación
sexual
está
grupo
D
también
(cromosomas
fluorescen
especialmente
inten-
en las regio(10).
se utilizó para estudiar
de quinacrina
Y
( 1 1)
La
celu-
ha
y fueron Pearson et al
George
demostrar
los
(12)
primeros en
que la fluorescencia
del
cromosoma y también se evidenciaba
en
7).
A pesar de que en el hombre el
cromosoma
más
las en interfase empleando hidroc Ioruro
el
las
división
papel del
largos
la
en el cario-tipo
próximas al centrómero
técnica
en el
hipótesis
tenido amplia confirmación
del
samente,
enzimas
localizados
Y muestra
Somas como el número 3 y los cromo-
esta
Siguiendo
de los brazos
fluorescencia
que
X en la
ocurriendo
azar.
distal
humano, a pesar de que otros cromo-
embriona-
rio) uno de los cromosomas
mujer
posible
cromosoma
intensa
tempranamente en la vida embrionaria
(12 - 16 días de desarrollo
inacti vación
tratarlos
de citogenética,
estos
porción
los
a la función del
de cromatina
Mary Lyon
al
(4)
sobre
GermanzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLK
que con el agente mencionado la
de
replicación
el
de
X supernumerarios.
fico
sexual.
como
utilizado
la identificación
que ha sido de enorme ayuda en el
el desarrollo
de
tal
Y en la dife-
-237·
que
no
(interfase),
están
en
apareciendo
como
un pequeño corpúsculofluores-
cente
muy cerca
nuclear.
plenamente
células
Había
de
la
surgido
membrana
así
otro
método
para
masculinas
diferenciar
células
de las femeninas por
presencia
en las
primeras
Se
estudió
clormetacrina
la
del cro-
interfase
la
acción
tanto
en
de
células
como en células
la
en
en división.
mosomazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Y.
La técnica empleada consta de los
pasos siguientes:
La-
técnica
con mostaza
cloruro
en
fluorescencia
de quinacrina
de quinacrina
el
estudio
numéricas
de
Los
1.-
o hidro-
ha sido
tan
dos
células
de
nosotros
un caso
del
con
con
en
u ai.
Uno
(F.S.G.)
ha
de anormalidad
la
substancias
la identificación
fijan durante
descrito
el
cual
del
análisis
fluorescentes
se
esclarecimiento
por
tienen
selectivas
técnica
de contribuír
del
mecanismos)
en
para facilitar
los
de
los
clormetacrina
al
con la cual se
mejores
resultados)
4.- Se
lava
s.-
cubren
Se
buffer
con
agua
las
corriente
láminas
con
pH . S. 3
fosfato
y
se
montan en Buffer fosfato pH 7.4.
cual estas
6.- Se
y
de esta
en
observa
utilizando
nuestro
al
microscopio
lámpara
de
luz
ultravioleta.
el primer estudio
de
empleo
modifican-
Para
fluorescencia
mediante
el
substancia
la CLORMETACRINA. (Ba
estudiar
clormetacrina
de una nueva
la acción
en células
utilizamos cultivo
sangre periférica
al
Y METODOS
Los
realizados
-238-
( 15) con algunas
cultivos
se
de la
en división
de linfocitos
yer).zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
la conocida técnica
MATERIAL
con
durante 6 minutos.
al
cromosomas,
Cito genética
técnica
las
incorporaciones
aparecido en la Literatura,
la
cubren
0.4% (concentración
mecanismo
el
la realización
medio, presentamos
do
láminas
Se
de este cromosoma
Con el objeto
substancias
10 minutos en una
3.-
obtuvieron
para
las láminas se
y
acético 1: 1.
solución
(14).
(o
mujeres
y
solución de etanol-ácido
estructural
en
Y
utilidad
hombres
2.- Se hacen frotis
dos
fluorescentes
en interfase
cromosoma
demuestra
de
de mucosa
del cromo-
hombres
cuerpos
toman muestras
mediante raspado con escobillón.
cromosomas y (síndrome YY) presenlas
Se
bucal
útil
anormalidades
estructurales
y
Y.
soma
de
de
mediante
de Moorhead et
modificaciones.
cosecharon
a
19;
72
horas
de
preparadas
la
siembra.
las
cultivos
se
Una vez
láminas
siguen
los
de
los
pasos
CUADRO
Ng 1 CELULAS
EN INTERFASE
CON CLOR
Y METAFASE
ANALIZADAS
- METACRINA
desCULTIVO
critos anteriormente.
MUCOSA
Ni
Las preparaciones
utilizando
Y filtros
barrera
de
preparaciones
las
microfotografías
las
procesaron
el
por
380
METAFASE
Nl! DE CELULAS
,
-
'"
717
283
300
-
lOO
zyxwvutsrqponmlkjihg
500
500
Mujeres
BG 12
Todas
530 K. De algunas
se
INTERFASE
Ng DE CELULAS
-
620
Hombres
lámpara de luz ultravioleta
HBO 200, con filtro excitador
DE
,
Fluorescencia
Leitz Orthoplan,
DE SANGRE
PE.PIFERICA
CELULAS
se observaron
en un fotomicroscopio
BUCAL
analizadas
tomaron
cuales
las metafases
de
se
un
revelaron
de
usual.
los
en
la
la
brazos
presencia
Y con intensa
cromosoma
fluorescenci a
procedimiento
masculinas
porción
largos
distal
según
se
observa en las Figuras Nºs. 6, 7 y 8.
RESUL TADOSzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFE
y DISCUSION
No se observó fluorescencia similar
en los cariotipos
Los
Cuadro
el
resultados
aparecen
Nº 1. Puede
62% de las
mostró
células
las células
lizadas
en estas células y en las células
masculinas
también
presentan
masculinas
positi va
en
femeninas
ninguna
fluorescente.
positivas
mostraron
llante
dos, a pesar de que otros cromosomas
fluorescencia
de mucosa bucal mientras
que de 500 células
mostró
terístico,
ana-
avance
de la técnica
(cromosomas
distintos
aquellas
células
que
somas
bri-
objeto
cuerpo
o muy cerca
de la
membrana nuclear con una fluorescencia muy intensa
lo cual constituye
de
como
pequeño
tal como se muestra
sexuales
periférica
el
masculinas
fluorescencia
nuevamente
de
sangre
71.7% de las
células
cultivos
en
interfase
generalmente
es
menos
la
del
positiva,
las
no mostraron esta
células
mientras
con
Figura
normal
que
habitual
femeninas
se
-239-
esta
Y (Figuras
nueva
muestra
según
la
masculino
técnica
de Glemsa,
en el cual
diferenciar
los
técnica
en
la
con coloración
pueden
La
intensa
comparar
Nº 9 un cariotipo
procedimiento
fluorescencia.
Para
se
obtenido
y será
ón.
autosomas
cromosoma
6, 7, 8,).
fluorescen te,
mostró
y Y),
publícací
los
resultados
los
autosomas
de
Nºs.
un gran
a los cromo-
X
otra
de
carac-
al permitir la
los
fluorescencia
que
en las Figuras Nºs. 1, 2, 3, 4 y 5.
En
un patrón
identificación
tomaron
un
con
cuerpo
Se
adosado
analiza-
que
apreciarse
fluorescencia
femeninos
en el
solamente
los distintos
FIGURAS
N!s,
1 y 2 Se
aprecia
interfase
el cuerpo
de la mucosa
fluorescente
bucal
que evidencia
de un individuo
-240-
el cromosoma
normal
de sexo
Y. en células
en
zyxwvutsrqponmlk
masculino.
FIGURAS NOs. 3, 4 y 5
Fluorescencia
cultivo
de sangre
del cromosomazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVU
y en linfocitos
(interfase)
procedentes
dezyxwvu
periférica
·241·
en un individuo
normal
de sexo
masculino.
FIGU.RA
NO 6 Metaf~se
derecha
cencia
de la metafase
FIGURA
Nº 7
de una célula
Fluorescencia
metafase
de un sujeto
de la porción
distal
de los
un núcleo en interfase.
de
la
de una célula
porción
de varón
distal
n orm al de sexo
brazos
de
normal.
· 242·
los
largos
masculino.
del
brazos
A la izquierda
Se muestra
crom os om a Y.
largos
se
del
aprecia
la fluores-
Se aprecia
a la
zyxwvutsrqponm
y en unazyxwvutsr
cromosoma
un núcleo
en interfase
"
I
3
2
5
4
10
11
9zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPO
12
8
7 zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
·6
'1
14
13
II
II
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZ
19
N9 9
l.
técnica
Se aprecia
Xy
y cariotipo
citogenética
el complemento
mas (cromosomas
22
.21zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUT
20
Metafase
distintos
18
17
16
,15
11/11
FIGURA
o
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcba
sexual
correspondiente
habitual
los
XY del varón
a los cromosomas
a un individuo
cromosomas
normal.
sexuales
-243-
Los
solo
normal
se
números
X y Y),
de sexo
diferencian
del
masculino.
Con la
por su morfología
1 al 22 indican
...
los a ut os o-
cromosomas
fluorescentes? .
por sus características
morfológicas.
Caspersson
En el hom1:ireel papel determinante
masculino
está
plenameate
La
regulación
del
cromosoma Y
a
interacción
heterocromatinas
de
de
los
se debe a una
de los pares
Citosina-
(8).
Guanina en los sepentos
de la diferenciación
la
et al han postulado
afinidad
prevalencia
aceptado
sexual en la vida embrionaria se ha
atribuído
que dicha
las.
crottW-
tes
fluorescen-
de la molécula del DNA (ácido
desoxiribonuléico),
pensando que el
grupo alquilante
de la moleeula de
mostaza
de quinacrin a fuera el
(16).
X y YzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTS
responsable de ésta afinidad y se
autores
han presentado
uniera a los segmentos del DNA
de que en el hombre los
ricos en Guanina (Figura Nº 10).
determinantes
lDMCulin06
somas heterocromáticos
Algunos
evidencia
factores
están
localizados
cortos
del croaaosoma Y
tros
en
en un reeiente
señalado
zados
brazos
porción
factores
brazos
mero
del
(14).
más
tamaño
se
refiere
aparentemente
expensas
en
en cuanto
CI
se
variaciones
hace
a
en
la
de los brazos largos.
porción
es
la
intensamente
que
con
Esta
fluoresce
las
utilizadas
substancia
más
substancias
(mostaza
en
el
presente
algunos
la
gran
/
N
embargo
fluorescencia
et al
(I
n
hidrocloruro
N° 10
hallazgo
el
similar
Y George
por
(I2)
de quinacrina
del
de
por las
Pearson
utilizando
molécula
en la cadena lateral (Figura N!l 11),
e
b ) Hidrocloruro
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPON
de Quinacrina.
pH
NHCH-(CH2)3N(CH2CH}
Por
~
qué
2
OCH:1
2HCI
los
brazos
CI
/
cromosoma Y muestran
afinidad
una
empleado
estudio.
distal
de
que ha perdido el grupo alquilan te
cromosomas y especialmente
porción
largos
hemos
2HCI
FIGURA
también con ésta nueva
que
-,
Sin
hiároc1oruro de quinacrina, proflavina)
y lo hace
OCH3
al
, en indi viduos
normales
de
hoy
H3
«ortos del
longitud
hasta
r
locali-
próxima al centro
Y,
de Quinacrina.
NH CH-(CH )3N(CH CH CIl
2
2 2
La variación morfológica
cromosoma
de Hidrocloruro
Noso-
(17).
cromosoma Y, no están situados
la
a) Mostaza
trabajo hemos
que estos
sobre los
los
N
substancias
FIGURA
N° 1 l
FIGURA
Nº 8
Intensa
metafase
FIGURA
Nº 13 Cuerpo
zoides
fluorescencia
de-la
de una célula
fluorescente
porción
distal
de un individuo
en un espermatozoide
que portan cromosoma
X na presentan
-245-
de los
normal
brazos
de sexo
que porta
este
zyxwvutsrqpon
y en una
largos
del cromo s oma
masculino.
el cromosoma
corpúsculo
Y. Los
fluorescente.
espermato-
zyxwvutsrqp
está
en
contra
sugerida
de
posibilidad
siguiendo
y su grupo.
timidina
la
por Caspersson
Nuestro hallazgo utilizando
erina,
molécula
una
que
modificación
lateral
clormeta-
también
en
la
sufre
cadena
(Figura Nº 12) habla en favor
la
triatida
fluorescente
más
exacta
de
tipo
está
que
por la cadena
el Cl or-Met acrin a,
por
estructura-
ejemplo
de
la
en la cual se intercamde distintos
cromoso-
mas. Por este método se ha establecido
lateral.
cromosomas
les
bia segmentos
central
los
en alteraciones
translocación,
núcleo
Con el método
(18).
envueltos
del
con
se logra la identificación
de que la afinidad química específica
dada más bien por el anillo o
incorporación
igualmente
que
el
cromosoma
extra en el síndrome de la Trisomía
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
O H zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQP
G1 (mongolismo) no es el mismo que
I
N HC H 2"eH-eJl2 N(C 2 H S )2
se encuentra en la leucemia mieloidecrónica
y que tiene
amputación
en
una delesión
sus
brazos
(cromosoma Philadelphia
o
largos
o Ph 1)
(19),
como se venía afirmando hasta ahora.
el
El método ha sido úti 1 también en el
estudio
FIGURA
La
Nº 12
técnica
fluorescente
nuevo
con
substancia
ha permitido no solo un
método
evidenciar
des
el
cito genético
dimorfismo
para
sexual en
el hombre, tal como lo demuestra el
presente
trabajo, sino que además ha
revolucionado
ticas,
las técnicas
citogené-
al permitir una identificación
más precisa del cariotipo humano ya
que
la substancia
manera
se incorpora
específica
de
en los distintos
cromosomas (Figuras
N2s. 6, 7 y 8).
De ésta manera se pueden diferenciar
los cromosomas que pertenecen
a los
grupos C, F y G, los cuales
no se
diferenciaban
por
estudios
de
modo concluyente
de
autorradiografía
de la relación de anormalida-
cromosómicas
habiéndose
trabajos
con
encontrado
el
cáncer,
en
algunos
una mayor frecuencia
esperado de translocaciones
Otro empleo de la
nes cromosómicas,
técnica
es
de lo
y delesio-
el
averiguar
el
sexo
genético del feto durante el embarazo,
investigación
varios
en
adelantada
desde hace
años por muchos laboratorios
el
mundo.
Gracias
método
es
identificación
más adecuada y segura
del sexo genético
de estos estudios
posible
al
fluorescente
hacer
una
del feto. Algunos
se están adelantan-
do en nuestro laboratorio.
Una
empresa
ambiciosa
en el
campo de la Genética ha sido la de
separar
los
espermatozoides
que
portan cromosoma Y de los que portan
cromosoma X, con el objeto de hacer
estudios
cito genéticos
en nuestro
medio, ya que la clormetacrina es de
fecundaciones
más
selectivas
en cuanto
fácil
obtención
que
otras
al sexo se refiere. La técnica descri-
substancias
fluorescentes
que
se
ta en este trabajo permite identificar
incorporan
sel ecti vamen te
en
los
los
cromosomas,
espermatozoides
que
portan
el
sino
que
además
permite estudios de gran importancia
cromosomazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHG
y tal como se muestra en
en el campo de la Biología y particula figura Nº 13 en donde se aprecia
un
espermatozoide
corpúsculo
que
fluorescente
porta
larmente
el
parte
correspon-
cias
técnica
presente
reportada
trabajo
Genética.
a
mecanismo
diente al cromosoma Y.
La
de la
contribuye
no
solo
en
el
por el cual las substan-
fluorescentes
nes específicas
el
Por otra
precisar
se unen a porcio-
del Genoma Humano.
facilitazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFED
SUM M ARY
RESUM EN
This
Se
presenta
informe
literatura
sobre
el
aparecido
en
una nueva
técnica
Cromosómica
primer
la
de Identificación
el
empleo
la
Clor-Metacrina.
Se
señalan
algunos
usos de esta
técnica
campo
de la Biología
de
mente
mediante
de
la
y
como Identificación
Anomalías
de Desarrollo
y
del
del
Sexo
Embarazo.
mecanismos
de esta
Feto
Se discuten
substancia
in detecting
foetus
cells
the genetic sex
during
pregnancy,
sex oí patients
and
in
in
with sex
detecting
(Zpermatozoa)
chromosome
this
male
germ
bearing
Y-
other
branches
of Biology are discussed.
Sexual
durante
In the other hand, this study ís
el
one approach to clarify the chernical
los posibles
de la acción
a
Utility
malformations,
del Sexo Genético
en
Cytogenetic
of
detecting
tales
first
Clor-Metacrine.
of
en el
the
compound
technique
particular-
Citogenética
is
Study using the fluorescent
Mechanism
específica
of
sobre el genoma
responsable
fluorescent
for binding
compounds
to
the
specífic portions of human Karyotype.
Humano.zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
AGRADECIMIENTOS:
Los autores ."preson
sus agradecimientos
Villomizor H., Hemondo Graot L, Augusto
(oci lidodes otorgocJos pora
'A
a los doctores Pablo Morillo C., Luis J.
Corredor A. y Alfredo Lleras P., por las
realización
de éste trabajo
-247-
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