Royaume Du Maroc Ministère De La Santé Institut Supérieur Des Professions Infirmières Et Techniques De Sante Oujda ‫المملـــــــكة المغربيـــــة‬ ‫وزارة الصحــــــــــــة‬ ‫المعهد العالي للمهن التمريضية وتقنيات الصحة‬ ‫وجـــــــــــــــدة‬ Rapport de stage Effectué par : LACHAL ANOUAR & BOUCHKIMA KHADIJA 23 Septembre − 11 Décembre Techniciens de laboratoire S3, Promotion : 2018-2021S2, Promotion : 2018-2021 REMERCIEMENTS En premier lieu, nous tiendrons à remercier toutes les personnes qui, en tant que maîtres de stage, nous ont beaucoup appris et ont partagés leurs connaissances dans le domaine d’analyse médicale. Nous profitons cette occasion pour adresser nos profonds remerciements aux responsables et au personnels de tous les sites de stage. Nous désirons aussi remercier les professeurs de l‘ISPITSO, qui nous ont fournis les outils nécessaires au bon déroulement de notre stage. 2 SOMMAIRE Liste des abréviations ................................................................................................................. 7 INTRODUCTION ...................................................................................................................... 8 I. Centre Hospitalier Régional AL-FARABI :....................................................................... 9 1. Présentation du site de stage : ...................................................................................... 9 2. Matériel .......................................................................................................................... 9 Accueil et Prélèvement ....................................................................................................... 9 Service de Biochimie ....................................................................................................... 10 Service de l’Hématologie ................................................................................................. 11 3. Notre stage : ................................................................................................................. 12 Service de Biochimie ....................................................................................................... 12 Service d’hématologie ...................................................................................................... 13 Numération Formule Sanguine ou l’Hémogramme .................................................... 13 Vitesse de Sédimentation ............................................................................................... 16 II. Centre Hospitalier Universitaire MED-VI ....................................................................... 17 1. Présentation du site de stage : .................................................................................... 17 2. Matériels ....................................................................................................................... 17 Service de Biochimie ....................................................................................................... 17 Service d’hématologie ...................................................................................................... 19 3. Notre stage : ................................................................................................................. 19 3 Service de Biochimie ....................................................................................................... 19 Service d’hématologie ...................................................................................................... 20 III. Polyclinique CNSS Oujda : ........................................................................................... 21 1. Présentation du site de stage : .................................................................................... 21 2. Matériels : .................................................................................................................... 21 Service de Biochimie ....................................................................................................... 21 Service d’hématologie ...................................................................................................... 22 Service de Sérologie ......................................................................................................... 22 3. Notre stage : ................................................................................................................. 23 Service de Biochimie ....................................................................................................... 23 Biochimie De Routine..................................................................................................... 23 Tests Spéciaux ................................................................................................................. 25 Service d’hématologie ...................................................................................................... 25 Taux de prothrombine : ................................................................................................. 26 Temps de céphaline activée : ......................................................................................... 26 Service d’Immuno-Sérologie ........................................................................................... 27 Venereal Disease Research Laboratory ....................................................................... 27 Latex & Waller Rose ...................................................................................................... 27 IV. Centre Régional de Transfusion Sanguine Oujda : ....................................................... 29 1. Présentation du site de stage : .................................................................................... 29 4 2. Matériels : .................................................................................................................... 29 Service d’immunohématologie ........................................................................................ 29 Service de contrôle qualité ............................................................................................... 30 Service de Sérologie ......................................................................................................... 30 3. Notre stage : ................................................................................................................. 30 Service d’immunohématologie ........................................................................................ 30 Groupage Abo/Rh Et Phénotypage .............................................................................. 30 Processus de groupage Receveur .................................................................................. 32 .......................................................................................................................................... 32 Test De Coombs Direct .................................................................................................. 33 Recherche D’agglutinines Irrégulières .......................................................................... 34 Test De Compatibilité Direct Au Laboratoire ............................................................. 35 Le D Faible Du ................................................................................................................ 35 L’épreuve De L’hémolysine........................................................................................... 36 Service de contrôle qualité ............................................................................................... 36 Service de Sérologie ......................................................................................................... 36 Treponema Pallidum Hémagglutination Assay ........................................................... 37 Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay ...................................................................... 37 Service de Distribution ..................................................................................................... 38 PROCESSUS DE DISTRIBUTION DES PRODUITS SANGUIN LABILES ......... 38 5 Circuit PSL non conforme : .......................................................................................... 39 CONCLUSION ........................................................................................................................ 40 6 Liste des abréviations • CHU : Centre Hospitalier Universitaire MEDVI • CRTSO : Centre Régional de Transfusion Sanguine Oujda • CHR : Centre Hospitalier Régional AL-FARABI • CNSSO : Polyclinique • TDC : Test De Coombs Direct • TDI : Test De Coombs Indirect • RAI : Recherche D’agglutinines Irréguliers • NFS : Numération De La Formule Sanguine • VGM : Volume Globulaire Moyenne • HTE : Hématocrite • Hb • TCMH : Teneur Corpusculaire En Hémoglobine • CCMH : Concentration Corpusculaire En Hémoglobine • VS • EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique • Rh • TCA/TCK : Taux de céphaline activé • TP : Taux De Prothrombine • INR : International Normalized Ratio • TPHA : Treponema Pallidum Hémagglutination Assay • VDRL: Venereal Disease Research Laboratory • MGG: May Grunwald Giemsa • ELISA : Enzyme Linked Immune-Sorbant Assay • FR: Facteur Rhumatoide • VIH: Virus d’immunodeficience Humain • HCV: Virus d’Hépatite C • HBs : Antigène de surface de l’Hépatite B • PSA : Prostate Surface Antigen • PSL : Produit Sanguin Labile : Hémoglobine : Vitesse De Sédimentation : Rhésus CGR : Concentré de Globules Rouges 7 INTRODUCTION Présentation du stage Dès 23 Septembre 2019 au 11 Décembre 2019 (environ 3 mois), nous avons effectué un stage au sein de CHR-ALFARABI, CHU-MEDVI, CRTSO et CNSSO. Au cours de ce stage, nous avons pu s’intéresser aux différentes techniques d’analyses médicales en immunohématologie, sérologie et biochimie. Missions et objectifs Accueil et enregistrement : ✓ Faire le triage des échantillons destinés au laboratoire. ✓ Vérifier la conformité des échantillons reçus au laboratoire. ✓ Enregistrer les échantillons conformes reçus ainsi que leurs résultats après analyses. Examens ✓ Faire fonctionner les différents automates. ✓ Déterminer les causes d’erreurs des différentes méthodes d’analyses biomédicales. ✓ Exprimer et interpréter le résultat de chaque analyse. ✓ Préparer, reconstituer et conserver convenablement les réactifs destinés pour chaque analyse demandée. ✓ Assurer la maintenance des appareils selon les recommandations. 8 I. Centre Hospitalier Régional AL-FARABI : L’Hôpital Al Farabi est un centre hospitalier, géré de manière autonome, offrant des soins et services médicaux à une population estimée à deux millions d’habitants environ, couvrant la préfecture d’Oujda-Angade et toute la région de l’oriental. L'hôpital Al Farabi dispose d'un plateau technique performant de laboratoires d’analyses de biochimie, bactériologie, parasitologie, immunologique, hématologie et d’anatomopathologie. 1. Présentation du site de stage : Le laboratoire régional d’Al Farabi reçoit les échantillons des patients hospitaliers au niveau du CHR Al Farabi durant toute la semaine, ainsi que les échantillons des patients externes du lundi au vendredi. Il est divisé en 4 services : biochimie, immunohématologie, sérologie et bactériologie. Durant ce stage au niveau du CHR AL-FARABI on s’intéressent qu’à la biochimie et l’hématologie. Pendant sa période de travaille (à partir de 8 :30 jusqu’à 16 :30), le laboratoire effectue environ 250 tests chaque jour. 2. Matériel Accueil et Prélèvement 1. GARROT 2. AIGUILLES 3. CORPS DE PRELEVEMENT 4. TUBE DE PRELEVEMENT 9 5. COTON HYDROPHILE 6. PANSEMENET ADHESIF Service de Biochimie L’automate « BIOSYSTEMS A25 » C’est un automate de biochimie, il effectue plusieurs analyses durant un temps bien réduit, le principe de ce dernier est plus simple se base sur le principe de spectrophotomètre, il est composé de quatre compartiments : • Compartiment des liquides : liquide système et déchet. • Compartiment des racks : il y a 3 racks où les échantillons sont posés. 10 • Compartiments des réactifs : une partie consacrée pour les différents réactifs utilisés dans les analyses, elle est réfrigérée pour garder les réactifs dans la température optimale des réactions biochimiques. • Compartiment du rotor : c’est là où le dosage se fait, il est composé de 120 cuvettes pour l’incubation de différentes réactions pour être traverser par un faisceau lumineux pour mesurer l’absorbance qui est proportionnelle à la concentration de l’élément dosé. Cet appareil, est lié à un système informatique permettant de gérer et de contrôler le fonctionnement de l’analyseur tout au long de la réalisation des analyses et d’imprimer les résultats donnés. Service de l’Hématologie L’automate « Sysmex » Elle réalise des numérations formules sanguines par mesure d’impédance. 11 3. Notre stage : Service de Biochimie Le service Biochimie est totalement automatisé, le tableau suivant représente les tests effectués et leurs intérêts cliniques : Examen(s) Intérêt clinique Créatinine, Urée Exploration de la fonction rénale Glycémie Dépistage du diabète Transaminases ASAT et ALAT Evaluation de la fonction hépatique GGT, PAL, Bilirubine Totale et Evaluation des voies hépatobiliaires Conjuguée Triglycérides, Cholestérol Total et HDL Exploration du métabolisme des lipides Tableau 1.Examens réalisés au niveau du service Biochimie du CHR AL-FARABI Processus d’analyse : phase pré-analytique phase analytique Jeter les échantillons de la veille. l'entretien et mise en route de l'appareil. la verification de la conformité et l'identification des échantillons. Lancer les contrôles (normal et pathologie). l'enregistrement des donnés du patient. selectionner les analyses demandes. centrifugation. phase post-analytique validation biologique. remise des resultats. lancer les séries validation technique.. 12 Service d’hématologie Ce service ne réalise que la Numération Formule Sanguine et la Vitesse de Sédimentation. Numération Formule Sanguine ou l’Hémogramme L’hémogramme est un des examens biologiques les plus courants, prescrit dans le cadre d’un Bilan sanguin. Il permet d’évaluer l’état de santé général du patient. Il peut être demandé si le patient souffre de symptômes liés à une maladie du sang (hématomes, fatigue, douleurs osseuses, pâleur…) ou en cas de suspicion d’anémie. Les prélèvements sont mis dans des tubes contenant l’EDTA. Figure 1.Tube à anticoagulant EDTA La NFS est souvent automatisée, La validation technique et éventuellement biologique est réalisée sur frottis sanguins quand il s'agit d'une NFS anormale. (Cas d’une Leucémie…etc.). Principe : Le principe de mesure repose sur la variation d’impédance engendrée par le passage de la cellule au travers d’un orifice calibré. L’échantillon est dilué dans un diluant électrolytique (conducteur de courant). La conductivité est très différente de celle des cellules. Quand la cellule traverse l’orifice et passe entre deux électrodes, la résistance électrique augmente de façon proportionnelle au volume de la cellule. D’autres automates utilisent la cytométrie en flux qui permet de mesurer sur une suspension de cellules les caractéristiques individuelles de chaque cellule telles que la taille, la forme et la complexité et n’importe quel composant ou fonction qui puisse être détecté par un composé 13 fluorescent. Les cellules en suspension passent une à une devant un ou plusieurs faisceau(x) laser et des détecteurs photosensibles captent des signaux émis par chaque cellule tels que : ➢ La lumière diffusée aux petits angles (Forward Scatter, FSC) qui renseigne sur la taille des particules ➢ La lumière diffusée à 90 degrés (Side Scatter – SSC) qui renseigne sur la forme, la structure interne et la granularité des particules. Les données ainsi recueillies se présentent sous forme de graphiques ou d’histogrammes auxquels s’ajoutent des statistiques concernant les populations cellulaires et les paramètres étudiés (%, CV, intensité de fluorescence, etc.). Figure 2.Histogramme : cytométrie en flux/NFS Les différents paramètres d'une NFS : L’hématocrite : Hte Est le volume occupé par les globules rouges circulants dans le sang, exprimé en pourcentage, par rapport au volume total du sang. Cette mesure est indispensable pour calculer le VGM et la CCMH. 14 L’hémoglobine : Hb Est une métalloprotéine contenant du fer, qui fixe O2 pour assurer son transport aux différents tissues de l’organisme. Le volume globulaire moyen : VGM Le volume globulaire moyen, est un paramètre sanguin rendant compte de la taille des globules rouges. Il se calcule après la réalisation d'un hémogramme à partir de l'hématocrite et du nombre d'hématies, selon la formule : 𝑉𝐺𝑀 = 𝐻é𝑚𝑎𝑡𝑜𝑐𝑟𝑖𝑡𝑒 × 10 𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝐺𝑅 La teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine : TCMH La teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine, aussi parfois appelée teneur globulaire moyenne en hémoglobine, est un paramètre sanguin donnant la masse moyenne d'hémoglobine contenue dans un globule rouge. Elle est calculée par le rapport entre le taux d'hémoglobine et le nombre d'hématie : 𝑇𝐶𝑀𝐻 = 𝐻𝑏 × 10 𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝐺𝑅 La concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine : CCMH La CCMH est un paramètre sanguin donnant la concentration massique moyenne d'hémoglobine contenue dans un certain volume de globules rouges. 𝐶𝐶𝑀𝐻 = 𝐻𝑏 × 100 𝐻é𝑚𝑎𝑡𝑜𝑐𝑟𝑖𝑡𝑒 15 Vitesse de Sédimentation Le prélèvement se fait dans un tube noir contenant le citrate de sodium comme anticoagulant. La VS mesure le taux de sédimentation des érythrocytes dans le sang dans les conditions standards. Elle est utilisée pour la détection de l’inflammation et les maladies inflammatoires : elle est prolongée dans le cas de l’inflammation aigue et chronique. La vitesse de sédimentation chez une personne normale est inférieure à 10 millimètres par heure. Le seul matériel utilisé est un tube de Westergren. Figure3.Tube citraté pour vitesse de sédimentation Figure 4.Pipette de la vitesse de sédimentation 16 II. Centre Hospitalier Universitaire MED-VI L’établissement, d’une capacité de 653 lits, est bâti sur 10 hectares et comporte entre autres un hôpital des spécialités, un hôpital mère-enfant, un centre des brûlés, un service de médecine légale, un laboratoire central, des services d’urgence, des blocs pédagogiques et un internat. Les structures comportent des services de médecine (cardiologie, dermatologie, endocrinologie, etc.) mais aussi de chirurgie (thoracique, urologie, ophtalmologie, cardiovasculaire…). Les services pour mère-enfant incluent la gynécologie-obstétrique, la pédiatrie, la réanimation pour mères, nouveau-nés et prématurés… 1. Présentation du site de stage : Le laboratoire central au sien du CHU Oujda est composé de 4 services : la bactériologie et la parasitologie, l’hématologie, la biochimie et la génétique. Il traite les échantillons des patients internes durant toute la semaine même que les échantillons des patients externes dès Lundi au Vendredi. Il coopère avec le CRTSO pour faire une 2éme détermination sanguine pour les patients nécessitants une transfusion ou une chirurgie. Le laboratoire reçoit les échantillons à partir d’un système pneumatique ce qui réduit le temps nécessaire au transport d’échantillon et augmente le pourcentage de conformité durant la phase pré-analytique. 2. Matériels Service de Biochimie L’automate « ARCHITECT ci 8200 » Automate de biochimie capable de réaliser les différentes analyses .il est composé de deux compartiments : • Compartiment de biochimie C8000 : il est réservé pour le dosage des analyses biochimiques, où il y a deux centres de réactifs R1 et R2 et autour de compartiment des réactifs, on trouve le lieu d’incubation qui est fixé. 17 • Compartiment de sérologie et immunologie i200 : il est réservé pour le dosage des analyses sérologiques et immunologiques, où il y a deux centres de réactifs R1 et R2 et les réactions se font dans des cupules réactionnelles jetables. L’automate « Cobas e 411 » C’est un automate permet la réalisation des analyses d’immunologie, les résultats données sont plus précis. 18 Service d’hématologie L’automate « Sysmex » Elle réalise des numérations formule sanguine par cytométrie en flux. 3. Notre stage : Service de Biochimie Durant la période de notre stage au niveau du CHU Oujda, nous avons pu contrôler l’automate ARCHITECT, la calibrer en plusieurs occasions, ainsi que passer plusieurs échantillons. La plupart des analyses sont de type biochimie de routine sauf quelques cas où il y a des tests spécifiques comme la CA-125 ou PSA par exemple. 19 Service d’hématologie Ce service est doté de l’automate Sysmex pour la réalisation des NFS. Lorsqu’il y a une anomalie sur l’hémogramme, le personnel du laboratoire réalise des frottis pour une étude morphologique qui permet de détecter l’origine de l’anomalie (ex. Thrombopénie par amas de plaquettes) Exemple d’un cas clinique en hématologie Patient présentant une hyperéosinophilie. Patient présentant une Leucémie Aiguë le plus probable Lymphoïde, avec une anémie macrocytaire normochrome. 20 III. Polyclinique CNSS Oujda : 1. Présentation du site de stage : Le polyclinique CNSS Oujda, crée en 1983, parmi 13 autres polycliniques au Maroc, est un organisme multidisciplinaire offrant un plateau technique permettant de couvrir une large activité médico-chirurgicale aussi bien dans le cadre de l’hospitalisation que pour des consultations et explorations en ambulatoire. Il dispose d’un laboratoire d’analyses médical, service de réanimation, maternité, salles d’opération et un service d’imagerie. Les urgences et la permanence des soins y sont assurés 24/24H. 2. Matériels : Service de Biochimie L’automate « Vitros 350 » 21 Principe repose sur la chimie sèche : réactif lyophilisé Service d’hématologie L’automate « ABX Pentra 60c » Réalise des NFS par mesure d’impédance. Service de Sérologie L’automate « SIEMENS » 22 Automate utilisée souvent pour des tests de sérologie. 3. Notre stage : Service de Biochimie Biochimie De Routine La biochimie donne des informations primordiales sur le fonctionnement du métabolisme (ensemble des réactions chimiques qui se déroulent au sein d’un être vivant). Elle dose des molécules fabriquées au cours de la digestion, de l’effort musculaire ou cardiaque, de la fonction rénale ou impliquées dans le transport de substances entre cellules à partir d’un prélèvement sanguin, urinaire, ou d’un prélèvement spécial comme le Liquide CéphaloRachidien. Certaines de ces réactions chimiques sont facilitées par des enzymes que la biochimie étudie aussi. Les paramètres dosés sont donc le reflet du bon fonctionnement du métabolisme ou de l’efficacité d’un traitement. 23 Les tubes utilisés au cours d’une analyse biochimique : Tableau 2.Tubes en biochimie Tube à bouchon GRIS VERT VIOLET JAUNE ROUGE Test(s) adéquat(s) Glycémie, Lactate Bilan VitB12 complet, Créatinine, Urée, Ionogramme complet, Acide urique, Protéines totaux, Albumine, Bilirubine Total et Directe, Transaminases, Gamma GT, Phosphatase Alcaline, Lactate Déshydrogénase, Lipase, Amylase, Créatine Phosphokinase, Cholestérol Total, HDL/LDL… HbA1C Folate Sérique, Vit B12 Presque toutes les analyses précédentes Méthodes de dosage en biochimie : Basé spécifiquement sur la spectroscopie d’absorption moléculaire SAM qui dose différentes molécules dans une solution (sérum…), par mesure d’absorption d’un rayonnement lumineux monochromatique (UV-visible) par ces molécules. La spectrophotométrie d’absorption moléculaire est l’appareil de base du laboratoire de biochimie clinique. ❖ Dosage par colorimétrie directe : Le substrat réagit avec le réactif pour former un complexe coloré, ce complexe a une longueur d’onde déterminée (correspond à celle de la couleur complémentaire). Il faut noter que certaines réactions nécessitent une incubation à 37°C pour être réaliser. Exemple : le dosage des protéines sériques s’effectue à l’aide de la réaction de biuret, les ions cuivriques Ca2+ du biuret réagissent avec les protéines sériques pour former un complexe coloré bleu qui absorbe a 545nm, dans cette méthode de colorimétrie directe la réaction est totale, cela veut dire que la concentration finale en complexe = concentration initiale en substrat à un facteur de dilution prêt. 24 Donc en mesurant la densité optique sur solution du complexe coloré, il est possible de déterminer facilement la concentration de substrat d’après la loi de Beer Lambert 𝐴 = 𝜉. 𝐿. 𝐶 ❖ Dosage par voie enzymatique : La réaction chimique est réalisée à l’aide d’une enzyme biologique, le produit peut être dosé soit directement (Cinétique enzymatique), soit transformé par un second réactif en un complexe coloré qui absorbera à une longueur d’onde déterminée. Cependant la plupart des dosages effectués au niveau d’un laboratoire de biochimie sont automatisés. Tests Spéciaux Tableau 3.Exemple d’analyses spécifiques en biochimie Catégorie Marqueurs Cardiaques Tests Troponine, CK-MB, LDH-1… Protéines Spécifiques Ferritine, Transferrine, Haptoglobine, CRP… Hormonologie Beta HCG, T3, T4, TSH, FSH, LH, Cortisol… Toxico/Pharmacologie Éthanolémie, Paracétamol… Marqueurs de cancers tumoraux CA19-9 : Protéine observée sur la plupart des cellules cancéreuses de l’ovaire ; CA 125 : marqueur tumoral pour certains types de cancer du pancréas ; PSA : marqueur du cancer de la prostate… Service d’hématologie Durant nos premiers jours au niveau de ce service nous avons effectués des NFS et VS, ainsi que plusieurs tests d’hémostase à l’aide de l’automate « Sysmex CA50 » 25 Taux de prothrombine : Temps de coagulation d’un plasma pauvre en plaquettes à 37°C, en présence de la thromboplastine tissulaire et le calcium (CaCl2). Ce test explore la voie extrinsèque (VII) et la voie commune. Valeur normale : TP ≥ 70% Temps de céphaline activée : Temps de coagulation d’un plasma pauvre en plaquettes à 37°C, en présence de phospholipides (céphaline), un activateur (kaolin) et le calcium (CaCl2). Ce test explore la voie endogène et la voie commune. Valeur normale : 𝑇𝐶𝐴 𝑃𝑎𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡 𝑇𝐶𝐴 𝑇𝑒𝑚𝑜𝑖𝑛 ≤ 1.2 26 Service d’Immuno-Sérologie Venereal Disease Research Laboratory C’est un test biologique utile au diagnostic de la syphilis. Cet examen de laboratoire détecte des anticorps dirigés contre des antigènes non tréponèmiques appelés cardiolipines, ce qui en fait donc un test non spécifique, contrairement au TPHA. Les causes de faux positif sont : la grossesse, des maladies auto-immunes (lupus, polyarthrite rhumatoïde), certains médicaments, certaines infections bactériennes (lèpre…) ou virales (mononucléose...) ou d'autres tréponématoses. Latex & Waller Rose La réaction au latex utilise des particules synthétiques recouvertes d’immunoglobulines pour chercher le facteur rhumatoïde, présent dans plusieurs maladies avec auto-anticorps. Ce qu’il faut savoir : La technique : de petites billes de polystyrène sont recouvertes d’immunoglobulines humaines. Ce sont des anticorps particuliers. En présence du plasma à étudier, les billes vont s’agglutiner si ce plasma contient du facteur rhumatoïde. Le test est sensible à partir d’une dilution au 1/80è. 27 La réaction de Waaler-Rose est une très ancienne méthode de dosage du facteur rhumatoïde. Ce qu’il faut savoir : Il détecte le facteur rhumatoïde, et n’est pas spécifique d’une maladie particulière : on trouve le facteur rhumatoïde plus souvent dans la polyarthrite rhumatoïde, mais aussi dans d’autres maladies auto-immunes, et chez des personnes non malades. Il utilise des globules rouges sensibilisés par des anticorps, qui vont s’agglutiner en présence du facteur rhumatoïde. Il est positif à partir d’une dilution à 1/64è, il est un peu moins sensible que la réaction au latex. 28 IV. Centre Régional de Transfusion Sanguine Oujda : Parmi 17 centre régional de transfusion sanguine au Maroc, le CRTSO est l’un responsable de la région d’Oriental, il a pour mission l’acquisition du sang au personnes ayant besoins tout en respectant les règles de la sécurité transfusionnelle et l’hémovigilance, depuis la collecte jusqu’à l’acte transfusionnelle. Ainsi que le suivi des receveurs du sang pour but d’évaluer leurs profils immunitaires après chaque transfusion 1. Présentation du site de stage : Le CRTSO est doté d’un laboratoire d’immunohématologie, un laboratoire de sérologie et un de contrôle qualité. Chaque laboratoire effectue ses propres analyses pour s’assurer de la conformité du don et la sécurité du receveur. 2. Matériels : Service d’immunohématologie L’automate « QWALYS III » 29 Service de contrôle qualité Une balance pour mesurer le poids de chaque PSL. Service de Sérologie L’automate « SIEMENS » 3. Notre stage : Service d’immunohématologie Receveur : Groupage Abo/Rh Et Phénotypage Le système ABO est défini par : • La présence ou l’absence à la surface des GR des Ag A et/ ou des Ag B, • La présence dans le sérum de l’anti- A et/ou l’anti-B correspond à l’Ag absent à la surface des GR. 30 Tableau 4.Systéme ABO GROUPE A GROUPE B GROUPE AB GROUPE O AG A B A et B -------- AC Anti-B Anti-A --------Anti-A et Anti-B Les GR sont classés en Rh+ ou en Rh neg selon la présence ou l’absence de l’Ag D. Dans le système Rhésus, en plus de l’antigène D qui est le plus immunogène, il existe d’autres antigènes : C, c, E, e, K Une détermination fait appel à une : 1/ Mise en évidence des Ag par des sérums tests : C’est une épreuve globulaire appelé test de Beth-Vincent. 2/ Mise en évidence des Ac par des hématies tests : C’est une épreuve sérique nommée le test de Simonin. Méthode carte à gel : 1) Dilution des GR patient 8‰ dans le LISS. 2) 50 µL depuis la dilution dans chaque cupule est destinée à l’épreuve globulaire (antiA, anti-B, anti-AB, anti-D) 3) 50 µL des hématies tests A et B dans les deux cupules destinées à l’épreuve sérique en plus de 25 µL du sérum su patient 4) Centrifugation 1030tr/min pendant 10 min et Lecture Méthode Microplaque : 1) Dilution des GR patient 8‰ dans le LISS (5% dans l’eau physiologique). 2) Ajouter une goutte de l’anti-A dans le puit 1, l’anti-B dans le puit2, l’anti-AB dans le puit3 et l’anti-D dans le puit 4 (Epreuve globulaire = Beth Vincent) 3) Dans le puit 5 ajouter les hématies test A et dans le puit 6 ajouter les hématies test B (Epreuve Sérique=Simonin) 4) Ajouter une goutte de l’anti-C, anti-c, anti-E, anti-e et l’anti-K dans les puits 8 à 12 5) Ajouter 25µL du sérum du patient dans les puits 5 et 6 6) Ajouter 50µL du sang du patient dans chaque puits de 1 à 4 et de 8 à 12 7) Centrifugation 1000tr/min pendant 1min 8) Agitation et lecture d’agglutination 31 Processus de groupage Receveur 32 Test De Coombs Direct Ce test est utilisé pour la mise en évidence de la fixation in vivo d’immunoglobulines ou de complément sur les hématies. Le test de Coombs direct n'est pas spécifique, c'est à dire qu'un résultat positif affirme la présence d’agglutinines irrégulières (anticorps dirigés contre GR, présents à l'état naturel ou plus souvent à la suite de l'introduction d'un antigène étranger) à la surface des hématies, mais ne donne aucune indication sur leur origine. Figure 5. Principe du TDC et Carte gel pour TDC Le TDC est demandé lors : ✓ ✓ ✓ ✓ 1) 2) 3) 4) 5) La recherche d’une incompatibilité fœto-maternelle D’un bilan d’anémie hémolytique auto immune AHAI Diagnostic de la maladie hémolytique du nouveau-né MHNN Après une réaction transfusionnelle… ➢ Procédure Lavage des globules rouges du patient pour se débarrasser des immunoglobulines plasmatiques. (Au moins 3 fois) Dilution des hématies : 8‰ dans le LISS Prendre 50µl de la dilution et la mettre dans la carte gel Centrifugation 1030tr/min pendant 10 min Lecture d’agglutinations 33 Recherche D’agglutinines Irrégulières La mise en présence d'un sérum ou d'un plasma inconnu et d'érythrocytes portant des antigènes connus permet la fixation des anticorps recherchés sur ces érythrocytes et de les sensibiliser. Dans un second temps, l'action de l'anti globuline permettra la mise en évidence de cette éventuelle sensibilisation. Si la réaction est positive, c'est que des anticorps ont été fixés sur ces érythrocytes, et étaient donc présents dans le sérum ou plasma objet de la recherche d'agglutinine irrégulière. La RAI est systématiquement réalisée : ✓ Chez toute personne susceptible d’être transfusée ✓ Après toutes transfusion dans le cadre du suivi d’hémovigilance ✓ Chez toute femme enceinte ➢ Procédure 1) Déposer 50µl des Hématies tests H1, H2, H3 diluées à 8‰ dans le LISS dans chaque cupule de la carte gel après lavage au moins 3 fois. 2) Ajouter 25µl du sérum du patient 3) Incuber pendant 15min à 37°C 4) Centrifugation 1030tr/min pendant 10min 5) Lecture d’agglutinations Figure 6. Recherche d'agglutinines irréguliers RAI 34 Test De Compatibilité Direct Au Laboratoire Le Cross Matching consiste à tester le sérum ou plasma du malade avec un échantillon des érythrocytes du CGR que l'on envisage de transfuser. Si la réaction est positive, c'est qu'il existe un anticorps vis à vis des globules du donneur, et que la transfusion envisagée est incompatible, sans que l'on sache quel système de groupe sanguin est en cause. Une autre unité de sang devra donc être choisie, et, bien sûr, testée C’est une RAI personnalisée avec le sérum du Receveur et les GR du Donneur. Donneur : Chaque donneur du sang va subir un groupage ABO/Rh et un Phénotypage Rh/KELL, ainsi qu’un test à l’Hémolysine. Pour les poches des Donneurs Rh neg, elles vont être testées par le D faible Du. Le D Faible Du Les hématies D faible ne sont pas agglutinées par les réactifs anti-D en test de routine, par contre elles sont mieux détectées par le test indirect du Coombs. Le D faible n’est pas qualitativement différent de l’antigène D, il s’agit d’un affaiblissement de la réactivité du D transmis de façon héréditaire. Les hématies D faible sont considérées comme des hématies Rh neg. ➢ Procédure 1) Lavage des hématies à Rh neg au moins 3x et mis en suspension à 5% à l’eau physiologique (NaCl 9‰) 2) Mettre 50µL d’hématies dans un tube à essais avec l’addition d’une goutte de l’anti-D 3) Incubation à 37°C pendant 45min. 4) Lavage 3x par l’eau physiologique 5) Addition d’une goutte de l’AGH (réactif de Coombs) 6) Centrifugation 1000tr/min pendant 1min et Lecture (agglutination= Rh +). 35 L’épreuve De L’hémolysine Le principe de l’hémolysine consiste à détecter l’hémolyse éventuelle des hématies A et B connues par le sérum à examiner censé contenir une hémolysine anti-A et/ou anti-B, ceci en mettant en contact les hématies A et B avec le sérum du Donneur et les mettre en incubation. Les Ac anti-A et anti-B sont des Ac naturels réguliers de nature IgM, agglutinants et ayant un optimum thermique à 4°C. Il existe cependant une situation à risque d’accident hémolytique lorsque on transfuse du sang provenant d’un Donneur présentant une IgG anti-A et/ou anti-B (optimum thermique à 37°C). Ce type d’hémolysine rare se retrouve surtout chez les sujets de groupe O « le O dangereux » et apparait par commutation à partir d’une IgM anti-A ou anti-B. ➢ Procédure 1) Dans 2 tubes à essais, un contenant HA et l’autre HB ajouter 100µL du sérum du Donneur dans chaque tube. 2) Incubation à 37°C pendant 1h30min 3) Observation d’hémolyse (réaction positive si le sang est hémolysé) Service de contrôle qualité Détection des anomalies au cours du processus des analyses effectuées au sein du centre en plus du contrôle de la conformité du matériel et réactifs, pour au cas où il y a une anomalie une enquête sera lancer pour déterminer sa source et prendre les initiations nécessaires pour l’éviter éventuellement. Service de Sérologie Au niveau du CRTSO la Sérologie concerne seulement les Donneurs du sang. Ce service doté de l’automate « SIEMENS » qui passe environ 120 échantillons durant une heure. Le service est semi-automatisé, le personnel ne réalise que la distribution des réactifs dans les microplaques et la maintenance de l’automate. Le seul test effectué manuellement est le TPHA, les autres tests VIH, HBs et HCV sont réalisés par l’automate. 36 Treponema Pallidum Hémagglutination Assay C’est un test d’hémagglutination indirecte pour la détermination qualitative at quantitative des Ac anti-Treponema Pallidum. Il est indiqué lors du dépistage de la Syphilis qui est une MST causée par la bactérie Treponema Pallidum. ➢ Principe : Des érythrocytes aviaires sont sensibilisés avec des composants antigéniques de T. Pallidum. En présence d’Ac spécifiques anti-Treponema Pallidum, les érythrocytes sensibilisés (cellules tests) s’agglutinent et présentent un aspect caractéristique (présence d’un voile) dans le fond des puits de la plaque de micro-titration. En absence d’Ac spécifiques, ils sédiments et forment un anneau trop serré ou un bouton compact dans le fond des puits. Les éventuelles réactions non spécifiques sont détectées par l’utilisation des cellules de contrôle, qui sont des érythrocytes aviaires non sensibilisés. Les tests VIH, HBs et HCV sont réalisés par l’automate qui utilise la méthode ELISA Sandwich. Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immunoenzymatique de détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps. Avantages de la technique : • L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique. • Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle. • L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible. • Technique accessible à tous les biologistes. • La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisé. • La validité des trousses est d'environ 1 an. 37 Inconvénients de la technique : • La limite de détection est moins bonne que d’autres techniques. • La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement. Service de Distribution PROCESSUS DE DISTRIBUTION DES PRODUITS SANGUIN LABILES Contrôle des documents Donneurs/Produits demandés Controle de la Controle de la carte du Donneur demande du sang Disponibilité des PSL Controle dans le registre des poches à probleme PSL livré Demande de sang Contrôle des Produits Controle date de péremption Traçabilité de la distribution Registre demande du sang Registre fiche de livraison et traçabilité Registre de sortie de sang 38 Circuit PSL non conforme : 39 CONCLUSION Pour conclure, Durant cette aventure, on a vraiment apprécié le stage pour son apport très fructueux en qualité humaine, en savoir -faire et en savoir devenir, ainsi que Les bonnes conditions de travail et l’ambiance agréable régnant dans le Laboratoire ont facilité notre intégration et notre apprentissage. Il nous a appris à développer aussi bien l’esprit d’équipe que l’autonomie. En plus il nous a donné de l’ambition, l’envie de découvrir plus et de creuser pour comprendre chaque principe. Les explications nécessaires nous ont été données pour qu’on puisse ensuite nous débrouiller seul dans la réalisation de nos manipulations. Cela nous a permis de prendre plus confiance en soi. Il nous a permis de consolider nos connaissances par une pratique quotidienne, en faisant face aux multiples difficultés et imprévus. Enfin, on tient à exprimer notre grande satisfaction, on a presque tout apprécié et tout aimé, nous avons atteint énormément d’acquis. 40