879 ARTICLE Nature des rhizobia associés à 15 espèces du genre Lotus en Algérie Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. Samir Djouadi, Saïd Amrani, Amina Bouherama, Nazhat-Ezzaman Noureddine et Fatiha Aïd Résumé : Malgré l’importance des représentants du genre Lotus en Algérie, leur statut symbiotique et la nature des rhizobia qui leurs sont associés sont méconnus. Cette étude portant sur 39 plants de Lotus appartenant à 15 espèces nous a permis de vérifier qu’ils sont tous nodulés et fixateurs d’azote et d’isoler à partir de leurs nodules 38 souches de bactéries nodulant les légumineuses qui ont été authentifiées. Le séquençage du gène de l’ARNr 16 S de ces 38 souches de rhizobia montre une prédominance de souches du genre Mesorhizobium représenté par 10 espèces parmi lesquelles M. erdmanii, M. ciceri et M. jarvisii se sont montrées les plus importantes. La nodulation des espèces de Lotus examinées est assurée dans une moindre mesure par des souches des genres Bradyrhizobium et Ensifer, tous deux représentés par deux espèces. Cette étude a permis, d’une part, de révéler la diversité des rhizobia associés aux Lotus d’Algérie, et d’autre part, de mettre en évidence une faible implication dans la nodulation des souches du genre Bradyrhizobium et l’absence de celles de l’espèce Mesorhizobium loti, deux groupes de rhizobia considérés comme les microsymbiotes les plus communs chez les représentants du genre Lotus. Mots-clés : Lotus d’Algérie, nodulation, fixation d’azote, rhizobia, diversité. Abstract: Despite the importance of the genus Lotus representatives in Algeria, their symbiotic status and the nature of associated rhizobia are unknown. This study on 39 Lotus plants belonging to 15 species showed that they are all nodulated and nitrogen-fixing and allowed the isolation of 38 authenticated strains of bacteria nodulating legumes. Analysis of 16 S rRNA gene sequences of these strains indicated a predominance of the strains of the genus Mesorhizobium represented by 10 species among which M. erdmanii, M. ciceri, and M. jarvisii are the most frequent. Nodulation of the examined Lotus species is assured in a lesser extent by strains of the genus Bradyrhizobium and genus Ensifer, both represented by two species. On one hand, this study revealed a part of the diversity of the rhizobia associated with the Lotus of Algeria, and on the other hand, highlighted a low involvement in the nodulation of these strains of the genus Bradyrhizobium as well as the absence of those of the species Mesorhizobium loti, two groups of rhizobia considered as the most common microsymbionts within the representatives of the genus Lotus. Key words: Lotus of Algeria, nodulation, nitrogen-fixation, rhizobia, diversity. Introduction Le genre Lotus tel que défini par Polhill (1981, 1994) est le genre le plus important et le plus représentatif de la tribu des Loteae (DC). Ce genre qui englobe également les représentants de l’ex-tribu des Coronilleae (Polhill 1994) constitue un genre important de la lignée des Hologalegina qui regroupe la majeure partie des légumineuses herbacées épulvinées des zones tempérées (Loteae, Galegeae, Hedysareae, ...) (Wojciechowski et al. 2000). Initialement perçu comme homogène, ce genre a été subdivisé en deux groupes, celui des Lotus de l’ancien monde (genre Lotus) et celui des Lotus du nouveau monde dont les représentants ont été classés dans quatre nouveaux genres (Acmispon, Hosackia, Ottleya et Syrmatium) (Gillett 1958; Allan et Porter 2000; Arambarri 2000a, 2000b; Arambarri et al. 2005). Le genre Lotus est représenté par près de 140 taxons, dominés par des herbacées annuelles ou vivaces qui se rencontrent principalement au niveau du bassin méditerranéen, de la côte ouest des États-Unis d’Amérique, de l’Europe et de l’Océanie (Kramina et Sokoloff 2003, 2004; Degtjareva et al. 2006). Il comporte trois représentants relativement bien connus : Lotus corniculatus L. (Lotier corniculé), L. pedunculatus Cav. (Lotier des marais ou lotier pédon- Reçu le 20 février 2017. Accepté le 6 mai 2017. S. Djouadi, S. Amrani, A. Bouherama, N.-E. Noureddine* et F. Aïd. Laboratoire de biologie et de physiologie des organismes, Faculté des Sciences Biologiques, Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediène, BP 32, El-Alia, Bab Ezzouar, 16111, Alger, Algérie. Auteur correspondant : Samir Djouadi (courriel : sdjouadi1@yahoo.fr). *Décédé. Les droits d’auteur demeurent la propriété des auteurs ou de leur établissement. Il est possible d’obtenir (gratuitement dans la plupart des cas) l’autorisation de réutiliser du contenu en passant par RightsLink. Botany 95: 879–888 (2017) dx.doi.org/10.1139/cjb-2017-0020 Publié à www.nrcresearchpress.com/cjb le 31 mai 2017. Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. 880 culé) et L. japonicus L. Les deux premières espèces sont cultivées (Hannaway et Myers 2004; Sato et Tabata 2011) tandis que la troisième a été retenue comme plante modèle pour les légumineuses du clade des Robinioides (Handberg et Stougaard 1992), clade qui regroupe les Loteae (sensu lato) et les représentants du genre Sesbania (Wojciechowski et al. 2004). En Algérie, le genre Lotus est représenté par 26 taxons qui se rencontrent en majorité et fréquemment au niveau de la frange littorale et les hauts-plateaux du pays sous des régimes climatiques allant du semi-aride à l’humide en allant d’ouest en est (Quezel et Santa 1962; Ozenda 1983, 2004). Cependant, certains taxons se retrouvent au niveau des secteurs arides et hyperarides du pays comme c’est le cas de Lotus arabicus L. et de Lotus jolyi Batt. qui sont des espèces sahariennes (Quezel et Santa 1962; Ozenda 1983). En raison de leur capacité à former une symbiose fixatrice d’azote avec les rhizobia, les représentants du genre Lotus sont des plantes pionnières et une source de biomasse riche en protéines, ce qui leur confère un intérêt écologique et agropastoral (Abdelguerfi et Abdelguerfi-Laouar 2004). L’étude des rhizobia associés aux espèces du genre Lotus est relativement ancienne; elle remonte au moins à 1914, année durant laquelle Klimmer, Krüger et Simon ont étudié des souches de rhizobia isolées à partir de nodules de Lotus uliginosus Schkuhr., L. corniculatus et L. purpureus Webb. (Klimmer et Krüger (1914) et Simon (1914) dans Fred et al. (1932)). En 1982, Jarvis et al. ont décrit à partir de nodules de L. corniculatus une nouvelle espèce de rhizobia, Rhizobium loti. Cette espèce a été retenue plus tard comme espèce type du genre Mesorhizobium, un nouveau genre de rhizobia phylogénétiquement intermédiaire entre le genre Rhizobium et Bradyrhizobium, dans lequel ont été aussi transférées les espèces R. huakuii, R. ciceri, R. mediterraneum et R. tianshanense (Jarvis et al. 1997). Depuis, de nombreux travaux concernant différentes régions du monde et espèces de Lotus ont permis d’établir que ces légumineuses sont nodulées par divers groupes de rhizobia: Mesorhizobium spp., Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Ensifer spp., et Phyllobacterium spp. (Jarvis et al. 1982; Jordan 1982; Kaneko et al. 2000; Estrella et al. 2009; Lorite et al. 2010, 2012; Sánchez et al. 2014). Malgré l’importance des Lotus en Algérie et plus généralement en Afrique du Nord, peu d’intérêt a été accordé jusqu’ici à leur statut symbiotique et aux souches de rhizobia qui leur sont associés. Nous avons donc jugé pertinent d’évaluer la prévalence et l’efficience de la symbiose chez le genre Lotus et de caractériser leurs microsymbiotes. Matériel et méthodes Matériel végétal Cette étude a été réalisée sur 39 plants nodulés représentant 15 espèces de Lotus d’Algérie provenant de 33 localités situées pour la plupart dans la zone littorale Botany vol. 95, 2017 Fig. 1. Localisation géographique des sites de prélèvement des plants de Lotus examinés. Pour chaque site le nombre en noir indique le nombre de plants prélevés et celui en blanc indique le nombre d’espèces de Lotus concernées (La carte a été générée et élaborée en utilisant le logiciel Xara Xtreme pro. version 4,0). du pays où se rencontre la majorité des espèces (fig. 1; tableau 1) (Quezel et Santa 1962). L’identification des plants a été réalisée au stade phénologique de floraison – fructification à l’aide des flores de Quézel et Santa (1962), d’Ozenda (1983) et accessoirement de celles de la Tunisie (Pottier-Alapetite 1979) et de la France (Guinochet et de Vilmorin 1984). Détermination du statut symbiotique des plants Les plants ont été excavés en évitant d’endommager leur système racinaire et ont été placés dans des sachets en polyéthylène en prenant soin d’entourer leurs racines avec du papier absorbant imbibé d’eau. Les nodosités ont été observées à l’œil nu et à la loupe binoculaire. Pour chaque plant, le nombre de nodules présents sur le système racinaire, leur localisation, morphologie, taille et détails de surface, en particulier la présence de lenticelles ont été notés. Un nodule a été choisi sur chaque plant comme représentatif du cortège nodulaire; il a été excisé avec un fragment de racine pour faciliter sa manipulation et mis de côté dans un tube contenant de l’eau physiologique stérile (KCl 8,5 ‰) pour l’extraction de la souche de rhizobia associée. L’efficience des nodules (capacité à réduire l’azote moléculaire) a été vérifiée en réalisant une coupe transversale sur trois nodules par plant afin de rechercher la présence d’une coloration rose ou rouge au niveau de leur zone centrale, qui est indicative de la présence de leghémoglobine, une hémoPublié par NRC Research Press Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. Djouadi et al. 881 protéine qui n’est produite que par les nodules fixateurs d’azote (Downie 2005; Prévost et Antoun 2006). leurs nodosités ont révélé la présence de leghémoglobine (Downie 2005; Prévost et Antoun 2006). Isolement des souches bactériennes Séquençage du gène de l’ARN 16 S Le nodule préalablement excisé a été abondamment lavé à l’eau physiologique stérile sous une hotte stérile; sa surface a été alors désinfectée par immersion dans un bain d’éthanol à 95° pendant 30 s, suivie d’un bain d’hypochlorite de sodium (NaClO 5,25 %) pendant 2 min. Le nodule a été ensuite rincé trois fois consécutives avec de l’eau physiologique stérile, puis mis dans une boîte de Pétri et écrasé à l’aide d’une baguette en verre dans quelques gouttes d’eau physiologique stérile. Le broyat obtenu a été ensemencé par stries sur trois boîtes de Pétri contenant du milieu « yeast mannitol agar » (« YMA ») additionné de rouge Congo (0,025 g·L−1) (Vincent 1970). Après quatre à huit jours d’incubation à 25 °C, nous avons procédé, à partir d’une colonie unique représentative du type colonial prédominant au niveau des cultures, à des repiquages successifs sur milieu YMA jusqu’à purification de la souche. La pureté de cette dernière a été évaluée par des observations macroscopiques des colonies et microscopiques des cellules à l’état frais et sur des frottis colorés selon la technique de Gram modifiée (Vincent 1970). Authentification des isolats Les tests de nodulation nécessaires à l’authentification des isolats ont été réalisés par inoculation des plantules de L. corniculatus cv. ‘Bravo’, dont les semences ont été stérilisées superficiellement sous une hotte stérile, par immersions successives dans des bains d’éthanol à 75° durant 30 s, d’hypochlorite de calcium (CaCl2O2) à 5,25 % durant 5 min suivies de trois rinçages dans de l’eau physiologique stérile. La production des plants a été assurée au laboratoire dans des pots en plastique de 300 mL renfermant 250 g d’un mélange de sable et de tourbe (2 : 1 v/v) préalablement stérilisé (Chao et Alexander 1984). La germination des graines a été effectuée en boîtes de Pétri, sur gélose à l’eau (7,5 g·L−1 d’agar agar), pendant 48 h dans une étuve réglée à 25 °C. Les germinations ont été transférées en pots sur le substrat de culture porté à 80 % de sa capacité de rétention en eau à l’aide d’eau distillée stérile. Une semaine après la mise en pots, les plantules ont été inoculées avec 3 mL d’une culture bactérienne obtenue en milieu « tryptone – yeast extract » (« TY ») renfermant environ 108 cellules·mL–1. Les pots ont été placés à 25 °C en chambre de culture réglée à une photopériode de 16 h de jour et de 8 h de nuit. Les pertes en eau résultant de l’évaporation et de l’évapotranspiration ont été déterminées toutes les 48 h, par pesée des pots, et compensées par l’addition d’un poids équivalent d’eau distillée stérile. Six semaines après l’inoculation, les plantules ont été déterrées, leur système racinaire a été lavé à l’eau du robinet et examiné pour la recherche de nodules. Les plants obtenus au laboratoire ont été considérés comme efficients si les coupes transversales de L’étude génotypique des souches a été réalisée en adoptant les protocoles d’extraction d’ADN et d’amplification du gène de l’ARN 16 S utilisés par Amrani et al. (2010) et Noureddine et al. (2010). Les amorces d’amplification et le protocole d’amplification par réaction de polymérase en chaîne (PCR) retenus ont permis l’amplification de l’ARNr 16 S de l’ensemble des souches et l’obtention d’amplifiats dont la taille, évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %, est comprise entre 1153 et 1474 paires de bases. Le séquençage des produits d’amplification a été effectué par la firme New Biotechnic (NBT) – Séville – Espagne avec un séquenceur ABI 310 (Applied Biosystems), en utilisant les amorces : 16R1488, 16F27, 16R343, 16F530 (MWG Biotech). Analyse des séquences de l’ARN 16 S Les séquences obtenues ont été assemblées en utilisant l’outil Auto-Assembler du logiciel ChromasPro (Technelysium Pty. Ltd.) et alignées selon la méthode Clustal-W (Thompson et al. 1994) à l’aide du logiciel MEGA6 (Tamura et al. 2013) qui a été également utilisé pour la reconstruction phylogénétique en utilisant l’algorithme « neighbour joining » en fixant le bootstrap à 1000 répétitions. Les séquences ont été soumises à un Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pour l’identification préliminaire des souches en utilisant la base de données EzTaxon (Kim et al. 2012). Les séquences du gène de l’ARN 16 S des souches types nécessaires à la détermination de la position phylogénétique de nos souches ont été également obtenues à partir d’EzTaxon, exceptions faites de celles des souches types de Mesorhizobium erdmanii et de M. jarvisii qui ont été obtenues à partir de NCBI– GENBANK. Les séquences des 38 souches analysées dans le cadre de cette étude ont été déposées auprès de NCBI– GENBANK sous les numéros d’accession qui figurent au tableau 1. Résultats Nodulation des 15 espèces de Lotus et authentification de leurs isolats bactériens nodulaires Les 39 plants des 15 espèces de Lotus examinés dans le cadre de cette étude, soit près de 57 % de la biodiversité du genre en Algérie, sont nodulés et efficients (tableau 1). En effet, tous les plants ont présenté sur leur système racinaires, plus particulièrement au niveau du collet, des nodosités de type déterminé c’est-à-dire de forme sphérique/globuleuse qualifiés de nodules desmodoïdes par Corby (1981, 1988). Les nodules de certaines des espèces examinées ont montré à leur surface des bandes horizontales de lenticelles, hypertrophies du cortex nodulaire, favorisant l’oxygénation des nodules lorsque le sol est gorgé d’eau (Pankhurst et Sprent 1975; Walsh 1995; Takanashi et al. 2011). Des coupes transversales réalisées sur les nodules des plants examinés ont toutes révélées Publié par NRC Research Press 882 Botany vol. 95, 2017 Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. Tableau 1. Origine, caractéristiques symbiotiques et identité des souches de rhizobia (Mycorhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer) No. Plante hôte Souche Localité Étage bioclimatique Nodulation Localisation des nodules 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 L. biflorus L. biflorus L. corniculatus L. conimbricensis L. ornithopodioides L. pedunculatus L. edulis L. biflorus L. biflorus L. corniculatus L. roudarei L. purpureus L. glinoides L. parviflorus L. hispidus L. corniculatus L. corniculatus L. ornithopodioides L. purpureus L. purpureus L. ornithopodioides L. hispidus L. edulis L. edulis L. ornithopodioides L. parviflorus L. edulis L. creticus ssp. maritimus L. roudarei L. jolyi L. arabicus L. arabicus L. creticus ssp. maritimus L. pedunculatus L. creticus ssp. maritimus L. purpureus L. creticus ssp. maritimus L. palustris L. bif2 L. bif1 Lot-cor1 Lot-con1 Lot-orn1 Lot-ped2 Lot-edu3 Lot-bif3 Lot-bif4 Lot-cor4 Lot-rou2 Lot-pur4 Lot-gli Lot-par1 Lot-his1 Lot-cor2 Lot-cor3 Lot-orn3 Lot-pur1 Lot-pur3 Lot-orn4 Lot-his2 Lot-edu1 Lot-edu2 Lot-orn2 Lot-par2 Lot-edu4 Lot-cre4 Lot-rou1 Lot-jol Lot-ara1 Lot-ara2 Lot-cre3 Lot-ped1 Lot-cre1 Lot-pur2 Lot-cre2 Lot-pal Baba Hassan (Alger) Beni Douala (Tizi Ouzou) Ben Aknoun (Alger) Chettia (Chlef) El Bouni (Annaba) Boukadir (Chlef) Beni Douala (Tizi Ouzou) Ouadhias (Tizi Ouzou) Ouled Fayet (Alger) Bordj el Bahri (Alger) Messaad (Djelfa) Hassi Bounif (Oran) El Idrissia (Djelfa) Chetaibi (Annaba) Oued Sly (Chlef) Beni Douala (Tizi Ouzou) Baïnem (Alger) Ain Merane (Chlef) Cheurfa (Annaba) Gdyel (Oran) Hassi Bounif (Oran) Treat (Annaba) Misserghine (Oran) Sidi Amar (Annaba) Ouadhias (Tizi Ouzou) Frenda (Tiaret) Oued el Aneb (Annaba) Tenes (Chlef) Gdyel (Oran) Ideles (Tamanrasset) Herafok (Tamanrasset) Essendilene (Tamanrasset) Seraïdi (Annaba) Ain el Bia (Oran) Kaddous (Alger) El Kerma (Oran) Tenes (Chlef) Oued Fodda (Chlef) SH SH SH SH SH SH SH SH SH SH SA SH SA SH SH SH SH SH SH SH SH SH SH SH SH SA SH SH SH A A A SH SH SH SH SH SH + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C RII C C C C RII C RII C RII C Nota : Les numéros d’accession NCBI de nos souches sont notés au niveau de l’avant dernière colonne. SH, sub-humide; SA, semi-aride; A, aride; Efficience (déterminée par la présence de léghémoglobine sur des coupes de trois nodules) : +, présence d’une coloration rose ou rouge au a une coloration rosâtre ou rougeâtre de leur zone centrale, ce qui indique qu’ils sont efficients. Les tests de nodulation réalisés au laboratoire ont permis de montrer que 38 des 39 isolats provenant des nodules des plants pris en considération sont capables de renoduler au laboratoire des plants de L. corniculatus ‘Bravo’ (tableau 1) et peuvent donc être considérés comme des souches de rhizobia. Ces nodules se sont tous révélés efficients et ont présenté dans l’ensemble une forme et une localisation similaires à celles observées pour les plants recueillis en milieu naturel. Caractérisation génotypique des souches de rhizobia associées aux représentants du genre Lotus L’arbre phylogénétique obtenu avec les séquences du gène de l’ARN 16 S des 38 souches de rhizobia associées aux plants des 15 espèces de Lotus examinées (tableau 1) indique qu’elles appartiennent à trois genres différents de rhizobia : Ensifer (Rhizobiaceae), Bradyrhizobium (Bradyrhizobiaceae) et Mesorhizobium (Phyllobacteriaceae). La branche des Ensifer (fig. 2) porte deux souches (Lot-ara1 et Lot-ara2) isolées de nodules de Lotus arabicus L., une espèce herbacée annuelle qui ne se rencontre en Algérie qu’au niveau du Sahara. La position de ces deux souches Publié par NRC Research Press Djouadi et al. 883 associées aux plants des 15 espèces de Lotus d’Algérie étudiées. Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. Renodulation de Lotus corniculatus L. cv ‘Bravo’ Lenticelles Efficiencea Nodulation Localisation des nodules Efficience No. d’accession NCBI + + – – – – – + + – – + – – – – – – + + – – – – – – – – – – – – – – – + – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + KU740033 KX660740 KX638449 KX638447 KX639616 KX639692 KX639615 KX636094 KX636097 KX636091 KX660738 KX636163 KX636156 KX636162 KX660739 KX639150 KX639151 KX639138 KX639149 KX638491 KX638492 KX660736 KU740032 KX638402 KX638426 KX638448 KX638506 KX638450 KX660737 KX639152 KU991830 KU991831 KU836855 KU991826 KU991829 KU991827 KU991828 KU992938 Assignation sur la base des séquences du gène de l’ARN 16 Sf M. tamadayense M. tamadayense M. tamadayense M. jarvisii M. jarvisii M. jarvisii M. jarvisii M. erdmanii M. erdmanii M. erdmanii M. erdmanii M. erdmanii M. erdmanii M. erdmanii M. ciceri M. ciceri M. ciceri M. ciceri M. ciceri M. qingshengii M. qingshengii M. qingshengii M. opportunistum M. opportunistum M. hawassense M. hawassense M. mediterraneum M. mediterraneum M. temperatum M. alhagi E. fredii E. numidicus B. japonicum B. japonicum B. lupini B. lupini B. lupini B. lupini , présence de nodules/lenticelles; –, absence de nodules/lenticelles; C, collet; RII, racines secondaires. niveau de la zone centrale du nodule; –, absence de la coloration rose ou rouge. + sur l’arbre phylogénétique indique que la souche Lotara1 est apparentée à Ensifer fredii tandis que la souche Lot-ara2 l’est à E. numidicus. La branche des Bradyrhizobium (fig. 3) porte six des 38 souches de rhizobia associées aux espèces de Lotus étudiées. La position de quatre de ces souches (Lot-cre2, Lot-pal1, Lot-cre1, Lot-pur2) suggère qu’elles sont apparentées à Bradyrhizobium lupini, une espèce rarement rapportée comme microsymbiote des Lotus. Les deux autres souches de la branche des Bradyrhizobium : Lot-cre3 et Lot-ped1, sont apparentées quant à elles à Bradyrhizobium japonicum. La branche la plus importante, celle des Mesorhizobium (fig. 4), porte quant à elle 30 des 38 souches (79 %) de rhizobia isolées à partir des plants de Lotus étudiés. Sept d’entre elles, Lot-bif3, Lot-bif4, Lot-cor4, Lot-rou2, Lot-pur4, Lot-gli et Lot-par1 sont apparentées à M. erdmanii. Cinq autres souches de cette lignée (Lot-his1, Lotcor3, Lot-cor2, Lot-orn3 et Lot-pur1) sont apparentées à M. ciceri. Alors que les souches Lot-con1, Lot-orn1, Lotped2 et Lot-edu3 sont apparentées à M. jarvisii, les 14 souches de Mesorhizobium restantes se rapprochent de sept autres espèces de Mesorhizobium : M. tamadayense et M. qingshengii (trois souches chacune), M. opportunistum, Publié par NRC Research Press 884 Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. Fig. 2. Arbre phylogénétique construit par la méthode du neighbour-joining sur la base des séquences du gène de l’ARN 16 S et montrant la position relative des souches du genre Ensifer associées à quelques espèces de Lotus d’Algérie (noms précédés d’un triangle). La séquence de la souche de Rhizobium tropici ATCC 49672T a été retenue comme « outgroup » et les valeurs de bootstrap ont été calculées en considérant 1000 pseudo-réplicats (seules les valeurs supérieures à 50 % sont figurées). Botany vol. 95, 2017 Fig. 3. Arbre phylogénétique construit par la méthode du neighbour-joining sur la base des séquences du gène de l’ARN 16 S et montrant la position relative des souches du genre Bradyrhizobium associées à quelques espèces de Lotus d’Algérie (noms précédés d’un triangle). La séquence de la souche de Rhizobium tropici ATCC 49672T a été retenue comme outgroup et les valeurs de bootstrap ont été calculées en considérant 1000 pseudo-réplicats (seules les valeurs supérieures à 50 % sont figurées). M. hawassense et M. temperatum (deux souches chacune), et M. mediterraneum et M. alhagi représentées chacune par une seule souche. Discussion La prévalence élevée de la nodulation et de la fixation d’azote chez les 15 espèces de Lotus d’Algérie indique que les sols qui les supportent renferment une microflore rhizobienne compétente, suffisamment abondante pour assurer leur nodulation et leur efficience symbiotique. Ce groupe de plantes, qui est une composante fondamentale de nombreux écosystèmes en Algérie, joue vraisemblablement un rôle écologique important en raison de son pouvoir fertilisant et représente, par ailleurs, un potentiel agropastoral non négligeable en raison de la richesse de sa biomasse en protéines (Garcia de los Santos et al. 2001; Stenglein et al. 2003; Abdelguerfi et Abdelguerfi-Laouar 2004; Escaray et al. 2012). Les nodules des 15 espèces de Lotus examinées sont de type déterminé, forme exclusive des nodules chez les Lotus (Allen et Allen 1981; Sprent 2001, 2009). Considéré comme primitif, ce type nodulaire se rencontre chez les légumineuses tropicales ou subtropicales du groupe des Phaséolidées (Loureiro et al. 1998; Sprent 2001, 2008). Bien qu’il soit similaire au niveau morphologique à celui des Phaséolidées, le nodule des représentants du genre Lotus s’en distingue cependant au niveau métabolique. En effet, dans le cas des nodules des Lotus, l’azote fixé est exporté sous forme d’amides comme c’est la règle chez les Galegoidées et non pas sous forme d’uréides comme c’est le cas pour les Phaséolidées (James et Sprent 1999). Le type de nodules que forment les légumineuses est déterminé par la plante hôte et est considéré comme un caractère botanique important (Corby 1981, 1988; Sprent 2001). Sur les 39 souches isolées de plants de Lotus prélevés en milieux naturels, 38 se sont montrées capables de noduler au laboratoire en conditions bactériologiques contrôlées Publié par NRC Research Press Djouadi et al. Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. Fig. 4. Arbre phylogénétique construit par la méthode du neighbour-joining sur la base des séquences du gène de l’ARN 16 S et montrant la position relative des souches du genre Mesorhizobium associées à quelques espèces de Lotus d’Algérie (noms précédés d’un triangle). La séquence de la souche de Rhizobium tropici ATCC 49672T a été retenue comme outgroup et les valeurs de bootstrap ont été calculées en considérant 1000 pseudo-réplicats (seules les valeurs supérieures à 50 % sont figurées). 885 des plantules de L. corniculatus ‘Bravo’ et peuvent être considérées, de ce fait, comme étant des rhizobia. Les nodules obtenus sur les racines au laboratoire ont tous montré la présence de leghémoglobine au niveau de leur zone centrale ce qui indique que le souchier de rhizobia obtenu à partir des 15 espèces de Lotus échantillonnées est très compétent et peut par conséquent servir de base pour la sélection de souches élites pour la production d’inoculants rhizobiens destinés à la bactérisation des cultures de L. corniculatus L. ‘Bravo’. L’analyse des séquences du gène de l’ARN 16 S nous a permis d’établir que les 38 souches de rhizobia associées aux plants des 15 espèces de Lotus examinées appartiennent à 14 espèces représentant trois genres de rhizobia : Ensifer, Bradyrhizobium et Mesorhizobium. La diversité générique des rhizobia nodulant les Lotus est bien établie puisqu’il est couramment isolé de leurs nodosités, en plus des trois genres que nous avons mis en évidence, des souches appartenant au genre Rhizobium et, plus exceptionnellement, au genre Phyllobacterium (Phyllobacteriaceae) (Bonish et al. 1991; Estrella et al. 2009; Rejili et al. 2009; Gossmann et al. 2012; Lorite et al. 2012; Sánchez et al. 2014; Marcos-García et al. 2015). Parmi les souches associées aux espèces de Lotus examinées, deux (Lot-ara1 et Lot-ara2) appartiennent au genre Ensifer (Sinorhizobium). La souche Lot-ara1 est apparentée à Ensifer fredii et la souche Lot-ara2 à E. numidicus. La nodulation des représentants du genre Lotus par ces deux espèces et d’autres espèces du genre Ensifer (E. meliloti, E. kummerowiae, E. medicae) a déjà été rapportée par certains auteurs parmi lesquels León-Barrios et al. (2009), Rejili et al. (2009), Merabet et al. (2010) et De Meyer (2011). Le genre Bradyrhizobium est quant à lui représenté par six souches parmi les 38 souches associées aux espèces de Lotus étudiées (Lot-cre2, Lot-pal, Lot-cre1, Lot-pur2, Lot-cre3 et Lotped1); elles sont apparentées à B. lupini et B. japonicum. La première n’a été rapportée que par Jensen (1967) et Caradus et Silvester (1979) comme espèces nodulant le genre Lotus et la deuxième est une espèce dont les représentants sont fréquemment associés aux Lotus dans de nombreuses régions du monde (Baraibar et al. 1999; Estrella et al. 2009; Lorite et al. 2012; Dubey et Maheshwari 2013). Le troisième genre mis en évidence, le genre Mesorhizobium s’est révélé le mieux représenté puisqu’il renferme 30 souches des 38 souches de rhizobia associées aux Lotus et 10 espèces parmi les 14 espèces mises en évidence. Sept des souches de ce genre (Lot-bif3, Lot-bif4, Lot-cor4, Lot-rou2, Lot-pur4, Lotgli et Lot-pur1) sont apparentées à M. erdmanii, une espèce décrite récemment par Martínez-Hidalgo et al. (2015) à partir d’une souche (Mesorhizobium loti, USDA 3471) originellement isolée de nodules de L. corniculatus par Jarvis et al. (1982) et qui a été considérée à tort comme une copie de la souche type ayant servi à la définition de l’espèce R. loti (Jarvis et al. 1982) et plus tard du genre Mesorhizobium (Jarvis et al. 1982, 1997). Cinq autres Publié par NRC Research Press Botany Downloaded from www.nrcresearchpress.com by Monsieur Samir DJOUADI on 09/06/17 For personal use only. 886 souches (Lot-his1, Lot-cor3, Lot-cor2, Lot-orn3 et Lot-pur1) sont apparentées à M. ciceri, microsymbiote commun du pois-chiche (Cicer arietinum L.), espèce de rhizobia dont nous sommes les premiers, à notre connaissance, à rapporter l’implication dans la nodulation de plants de Lotus. Quatre souches (Lot-con1, Lot-orn1, Lot-ped2 et Lotedu3) se sont révélées quant à elles apparentées à M. jarvisii, une espèce décrite, elle aussi, récemment par Martínez-Hidalgo et al. (2015) à partir de la souche ATCC 33669 jusque-là considérée comme une souche type de Mesorhizobium loti (Jarvis et al. 1982, 1997). Le genre Mesorhizobium se révèle ainsi comme le groupe de rhizobia le plus fréquemment associé aux Lotus d’Algérie mais également le plus diversifié puisqu’il est représenté dans notre cas par au moins 10 espèces différentes. La nodulation des espèces du genre Lotus par les espèces du genre Mesorhizobium est fréquente et ce groupe de rhizobia est considéré par certains auteurs comme celui qui leur est le plus typique (Lorite et al. 2010; Dubey et Maheshwari 2013). Pour d’autres auteurs, ce serait les représentants du genre Bradyrhizobium, en particulier ceux de l’espèce B. japonicum, qui constitueraient les microsymbiotes les plus fréquemment associés aux Lotus (Baraibar et al. 1999; James et Sprent 1999). L’analyse de nos résultats indique que le niveau de spécificité des espèces de Lotus prises en considération vis-à-vis de leur microsymbiote est très variable (tableau 1). Certaines comme Lotus jolyi, L. arabicus, L. edulis et L. biflorus sont vraisemblablement spécifiques et ne sont nodulées que par des souches d’un seul genre (Mesorhizobium ou Ensifer), voire d’une espèce unique de rhizobia (M. alhagi dans le cas de L. jolyi). D’autres espèces, comme L. purpureus, L. pedunculatus et L. creticus, semblent moins spécifiques et sont, pour leur part, nodulées par des souches appartenant à au moins deux genres de rhizobia. Ce comportement devrait cependant faire l’objet d’une confirmation par l’examen d’un nombre plus important de plants de ces espèces. Les résultats de cette étude mettent en évidence deux points relativement atypiques. Le premier est la faible proportion de souches de Bradyrhizobium associées aux représentants du genre Lotus en Algérie. En effet, seules six des 38 souches examinées (16 %) appartiennent au genre Bradyrhizobium dont les représentants sont considérés comme des microsymbiotes très courants, voire prédominants, chez les Lotus tout au moins dans certaines régions du monde (Estrella et al. 2009; Lorite et al. 2012; Dubey et Maheshwari 2013). Le second est l’absence parmi les 38 souches de rhizobia isolées des espèces de Lotus d’Algérie de Mesorhizobium loti, espèce considérée par certains auteurs comme le microsymbiote le plus commun et préférentiel des Lotus (Lorite et al. 2010). Conclusions Cette étude nous a permis de montrer que les plants de 15 espèces de Lotus parmi les 26 que compte la flore Botany vol. 95, 2017 d’Algérie sont nodulés et fixateurs d’azote. L’analyse des séquences du gène de l’ARN 16 S de 38 souches de rhizobia qui leur sont associées indique que celles-ci sont très diversifiées puisqu’elles appartiennent à au moins 14 espèces réparties sur trois genres : Mesorhizobium, Bradyrhizobium et Ensifer. Les représentants du genre Mesorhizobium sont les plus fréquents et les plus diversifiés puisqu’ils sont impliqués dans la nodulation de près de 75 % des plants examinés et représentés par 10 espèces parmi lesquelles M. erdmanii, M. ciceri et M. jarvisii prédominent. En plus d’appréhender la prévalence de la nodulation et de la fixation d’azote et de dévoiler un pan de la biodiversité des rhizobia associés aux Lotus d’Algérie, cette étude a mis en évidence, la faible proportion, parmi les souches associées aux plants des espèces de Lotus examinées, de souches de Bradyrhizobium et de l’absence de celles de l’espèce Mesorhizobium loti, des rhizobia considérés comme des microsymbiotes très courants des représentants du genre Lotus. Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude devraient être complétés par l’exploration d’un plus grand nombre d’espèces de Lotus d’Algérie pour une meilleure appréhension de la prévalence de la symbiose, de la fixation d’azote et de la diversité des souches de rhizobia qui leurs sont associées. Remerciements Ce travail a bénéficié du soutien financier de l’Union Européenne dans le cadre du projet Euro-Méditerranéen AQUARHIZ (INCO-CT-2004-509115). Les auteurs tiennent à remercier le Pr. Carmen Vargas de l’Université de Séville pour l’aide apportée à la caractérisation génotypique des souches en accueillant l’un des auteurs de cet article dans son laboratoire. Nous tenons également à remercier le comité de rédaction de la revue Botanique et les deux relecteurs de cet article, leurs critiques et suggestions ont été très utiles à l’amélioration de cette contribution. Hommage Notre collègue et amie Noureddine NazhatEzzaman, qui a grandement participé à la réalisation de cette étude, nous a malheureusement quittés pour toujours avant la finalisation de cette contribution que nous dédions à sa mémoire. Bibliographie Abdelguerfi, A. et Abdelguerfi-Laouar, M. 2004. Les ressources génétiques d’intérêt fourrager et/ou pastoral: Diversité, collecte et valorisation au niveau méditerranéen. Cahiers Options Méditerranéennes, 62: 29–41. Allan, G.J. et Porter, M.J. 2000. 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