Estructura y expresión diferencial de una posible porina de Bradyrhizobium sp. (Lupinus) en vida libre y en simbiosis inducida por glifosato

Trabajo presentado en la X Reunión Nacional de Fijación de Nitrógeno, celebrada en Granada (España), del 15 al 18 de junio de 2004El glifosato es uno de los herbicidas más empleados actualmente en cultivos agrícolas, por su inmovilidad, rápida inactivación y degradación en el suelo (2). En trabajos anteriores (1), hemos comprobado que este herbicida produce un rápido descenso de la actividad fijadora de nitrógeno así como ligeras alteraciones en el patrón polipeptídico de hojas y nódulos de plantas de Lupinus albus cv. Multolupa, inoculadas con Bradyrhizobium sp. (Lupinus) cepa ISLU-16. Sin embargo, la mayor alteración encontrada fue la presencia de un polipéptido de 44 kDa (44K) en el citosol bacteroidal, que no se detectaba en el citosol de bacteroides de plantas control. Se ha llevado a cabo la identificación de esta proteína mediante la secuenciación de su región N-terminal, la caracterización de sus genes codificadores, el análisis del patrón de expresión de su mRNA y el análisis de su estructura. El análisis de la secuencia nucleotídica de su gen codificador y de las secuencias aminoacídicas deducidas, mostraron que el polipéptido 44K posee una elevada homología de secuencia con porinas de la membrana externa de otras bacterias Gram negativas. Los ensayos de Southern del DNA genómico de la cepa ISLU-16 son indicativos de que esta proteína está codificada por un único gen en el genoma bacteriano. El patrón de expresión del gen mediante Northern de los RNA aislados de nódulos tratados con distintas dosis de herbicida, reveló una expresión constitutiva basal que se incrementa en los tratamientos con altas dosis de herbicida (5 y 10 mM), indicando que la expresión del polipéptido 44K está regulada transcripcionalmente. En la bacteria en vida libre se detectó sólo acumulación de RNA, cuando fue crecida en ausencia de glifosato, indicando diferencias en su patrón de expresión en vida libre y en simbiosis. Finalmente, hemos analizado la estructura de la proteína 44K. Se han identificado dos motivos: uno de asociación a membrana, próximo a la región C-t y otro característico de la subfamilia de porinas, situado a 30 aa de la región N-t. La estructura secundaria contiene esencialmente lámina β y un posible dominio transmembrana β-barrel correspondiente a la cadena P de una porina específica de sacarosa, presente en proteínas de membrana externa de enterobacterias. Actualmente se están estudiando la(s) posible(s) función(es) de esta proteína en la respuesta del microsimbionte frente al tratamiento con herbicidas