I n s u l i n R e c e p t o r o f Hu man C e r e b r al Gl i o mas

S t r u c t u r e an d F u n c t i o n
Ge o r ge Gr u n b e r ge r , W i l l i am L . L o we , J r . , Ai dan M c E l du f f , an d R o b e r t a P . Gl i c k
D i ab e t e s B r an c h , N at i o n al I n s t i t u t e o f Ar t h r i t i s , D i ab e t e s , D i ge s t i v e an d K i dn e y D i s e as e s , N at i o n al I n s t i t u t e s o f He al t h ,
B e t h e s da, M ar y l an d 2 0 8 9 2 ; D e p ar t me n t o f N e u r o s u r ge r y , U n i v e r s i t y o f I l l i n o i s , C h i c ago , I l l i n o i s 6 0 6 0 8
Ab s t r ac t
T h e i n s u l i n r e c e p t o r f r o m h u man b r ai n t u mo r s o f gl i al o r i gi n
was e x ami n e d f o r t h e f i r s t t i me u s i n g i n t ac t c e l l s ( f r o m an e s -
t ab l i s h e d c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma c e l l l i n e ) an d p ar t i al l y
p u r i f i e d s o l u b i l i z e d me mb r an e s ( f r o m c u l t u r e d c e l l s an d f r e s h l y
i s o l at e d h u man b r ai n t u mo r s ) . T h e s t r u c t u r e o f t h e gl i al i n s u l i n
r e c e p t o r s u b u n i t s was as s e s s e d b y af f i n i t y c r o s s - l i n k i n g o f 1 2 5 I -
i n s u l i n wi t h t h e a- s u b u n i t o f t h e r e c e p t o r , n e u r ami n i das e t r e at -
me n t o f t h e c r o s s - l i n k e d r e c e p t o r , b e h av i o r o f t h e r e c e p t o r o n
l e c t i n c o l u mn s , an d e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y o f t h e p h o s p h o r y -
l at e d , 8 - s u b u n i t . T h e f u n c t i o n s o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r we r e e x -
ami n e d b y me as u r i n g s p e c i f i c " S I - i n s u l i n b i n di n g ( r e c e p t o r c o n -
c e n t r at i o n , af f i n i t y , s p e c i f i c i t y , p H- , t i me - , an d t e mp e r at u r e de -
p e n de n c e ) , i n s u l i n - i n du c e d do wn - r e gu l at i o n o f t h e r e c e p t o r ,
i n s u l i n - s t i mu l at e d au t o p h o s p h o r y l at i o n o f t h e 1 3 - s u b u n i t , an d
p h o s p h o r y l at i o n o f e x o ge n o u s s u b s t r at e s as we l l as i n s u l i n - s t i m-
u l at e d gl u c o s e u p t ak e i n gl i o b l as t o ma c e l l s . Al l o f t h e s e p r o p -
e r t i e s we r e t y p i c al f o r t h e i n s u l i n r e c e p t o r f r o m t ar ge t t i s s u e s
f o r i n s u l i n ac t i o n . T h e i n s u l i n r e c e p t o r o f t h e n o r mal h u man
b r ai n s h o we d t h e al t e r e d e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y an d l ac k o f
n e u r ami n i das e s e n s i t i v i t y o f i t s a- s u b u n i t p r e v i o u s l y r e p o r t e d
f o r t h e r at b r ai n r e c e p t o r . T h e r e was n o di f f e r e n c e , h o we v e r , i n
t h e f u n c t i o n s o f t h e r e c e p t o r s u b u n i t s ( b i n di n g, p h o s p h o r y l at i o n )
f r o m t h e n o r mal b r ai n t i s s u e an d t h e e i gh t h u man gl i o mal t u mo r s .
S i n c e t h e gl i al e l e me n t s c o mp o s e a maj o r i t y o f t h e b r ai n c e l l s ,
t h e " n o r mal " s t r u c t u r e an d f u n c t i o n o f t h e i r i n s u l i n r e c e p t o r
mi gh t p r o v i de a k e y t o u n de r s t an di n g t h e r o l e o f i n s u l i n i n t h e
c ar b o h y dr at e me t ab o l i s m o f t h e h u man c e n t r al n e r v o u s s y s t e m.
I n t r o du c t i o n
T r adi t i o n al l y , t h e c e n t r al n e r v o u s s y s t e m h as n o t b e e n c o n s i de r e d
a t ar ge t t i s s u e f o r i n s u l i n ac t i o n . A maj o r di f f i c u l t y wi t h mo s t
o f t h e p r e v i o u s s t u di e s h as b e e n t h e u s e o f p r e p ar at i o n s f r o m
b r ai n c o n t ai n i n g h e t e r o ge n e o u s c e l l p o p u l at i o n s . S i n c e t h e v ar -
i o u s c o mp o n e n t s o f t h e wh o l e b r ai n h o mo ge n at e s , b r ai n s l i c e s ,
o r me mb r an e s ( n e u r o n al , gl i al , an d v as c u l ar ) p o s s e s s di f f e r e n t
me t ab o l i c an d f u n c t i o n al p r o p e r t i e s , i t i s di f f i c u l t t o di s s e c t t h e
r o l e o f i n s u l i n i n t h e gl u c o s e me t ab o l i s m o f an y s p e c i f i c c e n t r al
n e r v o u s c o mp o n e n t . A r e gu l at o r y r o l e o f i n s u l i n du r i n g f e t al
b r ai n gr o wt h an d de v e l o p me n t ( 1 , 2 ) as we l l as i t s r o l e i n n e u -
r o t r an s mi s s i o n h as b e e n p o s t u l at e d ( 3 ) . D e s p i t e t h e p r e s e n c e o f
P o r t i o n s o f t h i s wo r k we r e p r e s e n t e d at t h e 6 7 t h An n u al M e e t i n g o f t h e
E n do c r i n e S o c i e t y , B al t i mo r e , M D , 1 9 - 2 1 J u n e 1 9 8 5 .
Addr e s s c o r r e s p o n de n c e t o D r . Gr u n b e r ge r , D i ab e t e s B r an c h ,
N I AD D K , B u i l di n g 1 0 , R o o m 8 - S 2 4 3 , N at i o n al I n s t i t u t e s o f He al t h ,
B e t h e s da, M D 2 0 8 9 2 .
R e c e i v e df o r p u b l i c at i o n 2 3 S e p t e mb e r 1 9 8 5 .
T h e J o u r n al o f C l i n i c al I n v e s t i gat i o n , I n c .
V o l u me 7 7 , M ar c h 1 9 8 6 , 9 9 7 - 1 0 0 5
t h e b l o o d- b r ai n b ar r i e r , i n s u l i n h as b e e n i de n t i f i e d wi t h i n t h e
c e n t r al n e r v o u s s y s t e m ( 4 ) . T h i s f i n di n g, c o u p l e d wi t h t h e p r e s -
e n c e o f s p e c i f i c i n s u l i n r e c e p t o r s i n t h e v ar i o u s c o mp o n e n t s o f
t h e r at , r ab b i t , mo u s e , an d n e o n at al h u man b r ai n ( 1 , 2 , 5 , 6 ) ,
s u gge s t s a f u n c t i o n o f t h i s h o r mo n e i n t h e mammal i an c e n t r al
n e r v o u s s y s t e m.
E x t e n s i v e s t u di e s h av e c o mp ar e d t h e p r o p e r t i e s o f " p e r i p h -
e r al " ( c l as s i c t ar ge t t i s s u e s f o r i n s u l i n ac t i o n ) an d " c e n t r al "
( b r ai n ) i n s u l i n r e c e p t o r s . F u n c t i o n al p r o p e r t i e s o f t h e a- s u b u n i t
o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r , s u c h as t h e b i n di n g k i n e t i c p ar ame t e r s ,
p H o p t i ma, t i me , an d t e mp e r at u r e de p e n de n c e , an d s p e c i f i c i t y
o f i n s u l i n b i n di n g, ar e i n di s t i n gu i s h ab l e f r o m t h e p e r i p h e r al r e -
c e p t o r s ( 1 , 2 , 5 , 7 ) . I n c o n t r as t , o t h e r p r o p e r t i e s o f adu l t r o de n t
b r ai n r e c e p t o r , s u c h as i t s ap p ar e n t i n ab i l i t y t o do wn - r e gu l at e
af t e r e x p o s u r e t o h i gh i n s u l i n c o n c e n t r at i o n ( 7 , 8 ) , di f f e r f r o m
t h o s e o f p e r i p h e r al i n s u l i n r e c e p t o r s . T h e s t r u c t u r e o f t h e r e c e p -
t o r ' s a- s u b u n i t i n r at b r ai n di f f e r s f r o m t h at o f o t h e r t i s s u e s : t h e
e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y o f t h e a- s u b u n i t c o v al e n t l y l ab e l e d wi t h
' 2 5 I - i n s u l i n i s c o n s i s t e n t l y mo r e r ap i d ( M r - 1 1 5 , 0 0 0 v s .
1 3 0 , 0 0 0 - 1 3 5 , 0 0 0 f o r t h e p e r i p h e r al r e c e p t o r ) ( 9 - 1 2 ) . I n addi t i o n ,
n e u r ami n i das e t r e at me n t , r e mo v i n g s i al i c ac i d r e s i du e s , f ai l e d
t o al t e r t h e e l e c t r o p h o r e t i c p r o p e r t i e s o f t h e a- s u b u n i t o f t h e
b r ai n r e c e p t o r wh i l e s i gn i f i c an t l y de c r e as i n g t h e ap p ar e n t mo -
l e c u l ar we i gh t o f t h e a- s u b u n i t o f t h e p e r i p h e r al r e c e p t o r s ( 1 0 ,
1 1 ) , s u gge s t i n g a di f f e r e n c e o f gl y c o s y l at i o n o f t h e t wo t y p e s o f
i n s u l i n r e c e p t o r s . T h e o t h e r , 1 - s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r
h as al s o b e e n s t u di e d i n t h e r at b r ai n an d f o u n d t o p o s s e s s t h e
u s u al f u n c t i o n al ( i n s u l i n - s t i mu l at e d au t o p h o s p h o r y l at i o n an d
t y r o s i n e k i n as e ac t i v i t y ) p r o p e r t i e s ( 9 , 1 3 ) . S t r u c t u r al s t u di e s o f
t h e 1 3 - s u b u n i t o f t h e b r ai n r e c e p t o r r e v e al e d e i t h e r a s l i gh t l y l o we r
( 1 0 , 1 3 ) o r i de n t i c al ( 9 ) ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t ( M r ) wh e n
c o mp ar e d wi t h n o n n e u r al t i s s u e s .
He t e r o ge n e i t y o f t i s s u e s s t u di e d mak e s i t di f f i c u l t t o i de n t i f y
t h e p r e c i s e r o l e o f an y p ar t i c u l ar c o mp o n e n t o f t h e c e n t r al n e r -
v o u s s y s t e m i n i n s u l i n ac t i o n . I n an at t e mp t t o addr e s s t h i s q u e s -
t i o n , C l ar k e e t al . ( 1 4 ) de mo n s t r at e d s p e c i f i c i n s u l i n r e c e p t o r s
an d i n s u l i n - s t i mu l at e d 2 - de o x y - D - gl u c o s e u p t ak e b y c u l t u r e d
n e o n at al gl i al c e l l s f r o m r at b r ai n . S i n c e i n s u l i n di d n o t s t i mu l at e
t h i s u p t ak e i n c u l t u r e s o f n e u r o n al c e l l s , a f u n c t i o n al di f f e r e n c e
b e t we e n t h e gl i al an d n e u r o n al i n s u l i n r e c e p t o r s was s u gge s t e d.
S e v e r al gr o wt h f ac t o r an d h o r mo n e r e c e p t o r s p o s s e s s i n g t y -
r o s i n e - s p e c i f i c p r o t e i n k i n as e ac t i v i t y ar e t h o u gh t t o p l ay a r o l e
i n c e l l t r an s f o r mat i o n o r di f f e r e n t i at i o n . I n de e d, L i b e r man n e t
al . ( 1 5 ) r e p o r t e d t h at i n 2 0 s amp l e s o f h u man b r ai n t u mo r s ,
e x p r e s s i o n o f t h e e p i de r mal gr o wt h f ac t o r ( E GF ) ' was i n c r e as e d
c o mp ar e d wi t h c o n t r o l s p e c i me n s . I n a f o l l o w- u p s t u dy ( 1 6 ) ,
1 . Ab b r e v i at i o n s u s e d i n t h i s p ap e r : D S S , di s u c c i n i mi dy l s u b e r at e ; E GF ,
e p i de r mal gr o wt h f ac t o r ; h GH, h u man gr o wt h h o r mo n e ; I GF - 1 , i n s u l i n -
l i k e gr o wt h f ac t o r - i ; K R P , K r e b s - R i n ge r p h o s p h at e b u f f e r ; P M S F ,
p h e n y l me t h y l - s u l f o n y l f l u o r i de ; S D S - P AGE , s o di u m do de c y l s u l f at e -
p o l y ac r y l ami de ge l e l e c t r o p h o r e s i s .
I n s u l i n R e c e p t o r o f Hu man C e r e b r al Gl i o mas 9 9 7
t h e y f o u n d t h at 4 o u t o f 1 0 p r i mar y h u man b r ai n t u mo r s o f
gl i al o r i gi n wi t h i n c r e as e d e x p r e s s i o n o f E GF r e c e p t o r s al s o
s h o we d amp l i f i c at i o n o f t h e E GF r e c e p t o r ge n e .
I n t h e p r e s e n t s t u dy , we an al y z e d f o r t h e f i r s t t i me t h e s t r u c -
t u r al an d f u n c t i o n al c h ar ac t e r i s t i c s o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r s f r o m
c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma c e l l s as we l l as f r o m f r e s h l y i s o l at e d
h u man b r ai n t u mo r s o f gl i al o r i gi n . O u r r e s u l t s s h o w t h at al l
p r o p e r t i e s o f t h e h u man n o n n e u r o n al i n s u l i n r e c e p t o r s mi mi c
t h o s e o f p e r i p h e r al t i s s u e s . Al l gl i o mal t u mo r s al s o e x p r e s s t h e
" p e r i p h e r al " i n s u l i n r e c e p t o r s ; i n t h i s s mal l gr o u p o f p at i e n t s
we c o u l d n o t c o r r e l at e t h e r e c e p t o r ac t i v i t y wi t h t h e t u mo r gr ade .
I n addi t i o n , t h e u n i q u e f e at u r e s o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r f r o m t h e
n o r mal h u man b r ai n , p r e di c t e d f r o m t h e r o de n t mo de l , we r e
i de n t i f i e d.
M e t h o ds
C e l l s
C e l l s o f t h e c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma c e l l l i n e ( S . , e s t ab l i s h e d M ar c h
1 9 8 1 , f r o m a 6 2 - y r - o l d mal e wi t h l e f t p ar ao c c i p i t al gl i o b l as t o ma) we r e
o b t ai n e d f r o m t h e S u r gi c al N e u r o l o gy B r an c h , N at i o n al I n s t i t u t e o f
N e u r o l o gi c al an d C o mmu n i c at i v e D i s o r de r s an d S t r o k e s , N at i o n al I n -
s t i t u t e s o f He al t h . S amp l e s o f f r e s h l y i s o l at e d h u man gl i al c e r e b r al t u mo r s
we r e o b t ai n e d f r o m t h e o p e r at i n g r o o m an d p r o c e s s e d i mme di at e l y . T i s -
s u e was h o mo ge n i z e d i n a 0 . 2 5 M s u c r o s e b u f f e r i n p r e s e n c e o f p r o t e as e
i n h i b i t o r s ( 1 7 ) . T h e 5 5 0 g s u p e r n at an t was c e n t r i f u ge d at 1 9 0 , 0 0 0 g f o r
9 0 mi n . T h e p e l l e t was r e s u s p e n de d i n t h e b i n di n g b u f f e r an d u s e d as
" c r u de me mb r an e s " as de s c r i b e d b e l o w. Al i q u o t s o f t h e p r e p ar at i o n s
we r e s o l u b i l i z e d b y 1 % T r i t o n X - 1 0 0 ( N e w E n gl an d N u c l e ar , B o s t o n ,
M A) an d s p u n at 1 2 0 , 0 0 0 g f o r 4 5 mi n . P o r t i o n s o f t h e s o l u b i l i z e d me m-
b r an e s we r e u s e d f o r s o me s t u di e s , an d t h e r e mai n de r was t h e n p r o c e s s e d
b y wh e at - ge r m aggl u t i n i n c o u p l e d t o agar o s e c h r o mat o gr ap h y ( 1 8 ) . T h e
s o l u b i l i z e d, l e c t i n - p u r i f i e d s amp l e s we r e u s e d f o r b o t h t h e b i n di n g an d
p h o s p h o r y l at i o n e x p e r i me n t s . P r o t e i n c o n t e n t o f t h e p r e p ar at i o n s was
de t e r mi n e d b y t h e B i o - R ad me t h o d ( B i o - R ad L ab o r at o r i e s , R i c h -
mo n d, C A) .
" 2 S I - i n s u l i n b i n di n g s t u di e s
C e l l s o f t h e c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma c e l l l i n e we r e h ar v e s t e d, was h e d
t h r e e t i me s , an d r e s u s p e n de d i n t h e b i n di n g b u f f e r ( N I H M e di a U n i t )
at a c o n c e n t r at i o n o f 1 X 1 0 7 c e l l s / ml . 4 0 0 M l o f t h e s u s p e n s i o n was
i n c u b at e d wi t h 0 . 1 n g/ ml ' 2 5 l - i n s u l i n ( mo n o i o di n at e d, t y r o s i n e A- 1 4 , s p
ac t 3 7 0 mC i / mg; N e w E n gl an d N u c l e ar , B o s t o n , M A) i n t h e ab s e n c e o r
p r e s e n c e o f v ar i o u s c o n c e n t r at i o n s o f u n l ab e l e d i n s u l i n ( E l i L i l l y & C o . ,
I n di an ap o l i s , I N ) at 1 5 C f o r 3 h ( 1 9 ) . N o n s p e c i f i c i n s u l i n b i n di n g, as -
s e s s e d i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s i n s u l i n ( 1 0 0 M g/ ml ) , r e p r e s e n t e d <1 % o f
t h e t o t al t r ac e r b i n di n g. C e l l v i ab i l i t y , as s e s s e d b y e x c l u s i o n o f t r y p an
b l u e dy e , was al way s at l e as t 9 5 % .
' 2 5 1 - i n s u l i n b i n di n g s t u di e s wi t h c r u de me mb r an e s f r o m t h e f r e s h l y
i s o l at e d t u mo r s we r e p e r f o r me d i n an an al o go u s f as h i o n e x c e p t t h at 5 0
M l o f t h e r e s u s p e n de d me mb r an e s ( 1 0 0 - 5 0 0 M g p r o t e i n ) was u s e d. I n s u l i n
b i n di n g was t h e n p e r f o r me d wi t h t h e T r i t o n X - 1 0 0 s o l u b i l i z e d me m-
b r an e s as we l l as s o l u b i l i z e d, l e c t i n - p u r i f i e d p r e p ar at i o n s t o ac c o u n t f o r
t h e i n s u l i n r e c e p t o r s at e ac h s t e p o f p r e p ar at i o n . 2 0 , l o f t h e p r e p ar at i o n s
( - 1 , 8 0 0 , g p r o t e i n / ml ) was u s e d f o r t h e 4 C , 1 6 - h b i n di n g as s ay s ( 1 8 ) .
B r i e f l y , l e c t i n c o l u mn e l u at e s we r e i n c u b at e d wi t h t r ac e r amo u n t o f 1 2 5 I 1
i n s u l i n an d i n c r e as i n g amo u n t s o f u n l ab e l e d i n s u l i n ( 0 - 1 0 M / g/ ml )
i n a
t o t al v o l u me o f 2 0 0 M u l i n 5 0 mM He p e s , 1 0 mM M g2 S O 4 , an d 0 . 1 %
b o v i n e s e r u m al b u mi n , p H 7 . 5 . T h e f i n al c o n c e n t r at i o n o f T r i t o n X -
1 0 0 was 0 . 1 % . R e c e p t o r - b o u n d i n s u l i n was s e p ar at e d f r o m f r e e i n s u l i n
b y p r e c i p i t at i o n wi t h p o l y e t h y l e n e gl y c o l ( f i n al c o n c e n t r at i o n , 1 2 . 5 % ) i n
c ar r i e r h u man y - gl o b u l i n ( f i n al c o n c e n t r at i o n , 0 . 0 5 % ) . O n av e r age , n o n -
s p e c i f i c b i n di n g r e p r e s e n t e d 4 1 % ( r an ge , 3 2 - 4 9 % ) o f t o t al b i n di n g. W h e n
we c o mp ar e d t h e i n s u l i n b i n di n g r e s u l t s wi t h t h e c r u de , s o l u b i l i z e d, an d
wh e at - ge r m aggl u t i n i n - p u r i f i e d p r e p ar at i o n s , we c o u l d ac c o u n t f o r
p r ac t i c al l y al l s p e c i f i c i n s u l i n b i n di n g s i t e s ( r an ge , 6 9 - 1 1 6 % ) . S p e c i f i c
ac t i v i t i e s o f i n s u l i n b i n di n g ( e x p r e s s e d p e r mi c r o gr am p r o t e i n ) o f t h e
v ar i o u s b r ai n t u mo r me mb r an e p r e p ar at i o n s r e v e al e d, o n av e r age , 5 2 -
f o l d p u r i f i c at i o n ( r an ge , 3 8 - 7 7 - f o l d) wh e n t h e l e c t i n - p u r i f i e d an d c r u de
me mb r an e s we r e c o mp ar e d.
' 2 5 I - E GF ( C o l l ab o r at i v e R e s e ar c h , L e x i n gt o n , M A; s p ac t 2 1 2 M C i /
M g) b i n di n g s t u di e s we r e c ar r i e d o u t f o r 3 h at 1 5 C i n t h e ab s e n c e an d
p r e s e n c e o f e x c e s s u n l ab e l e d E GF ( 1 0 - ' M ) . S p e c i f i c ' 2 5 l - l ab e l e d h u man
gr o wt h h o r mo n e ( h GH) ( s p ac t 2 6 GC i / M g; gi f t o f D r . K . As ak awa, D i -
ab e t e s B r an c h , N at i o n al I n s t i t u t e s o f He al t h ) b i n di n g at 3 0 ' C f o r 9 0
mi n was me as u r e d wi t h an d wi t h o u t 1 u g/ ml u n l ab e l e d h GH. D o wn -
r e gu l at i o n s t u di e s we r e c ar r i e d o u t as de s c r i b e d i n ( 2 0 ) . B r i e f l y , c e l l s we r e
p r e i n c u b at e d wi t h u n l ab e l e d i n s u l i n at 3 7 0 C f o r 3 h . Af t e r e x t e n s i v e
was h i n g e mp l o y i n g t h e o p t i mal p r o c e du r e ( 2 1 ) , 1 1 I - i n s u l i n b i n di n g s t u di e s
we r e do n e at 1 5 ' C f o r 3 h .
P h o s p h o r y l at i o n s t u di e s
E n do ge n o u s s u b s t r at e s . T h e l e c t i n - p u r i f i e d, s o l u b i l i z e d e x t r ac t s f r o m e i -
t h e r t h e c u l t u r e d gl i o b l as t o ma c e l l l i n e s o r f r e s h l y i s o l at e d h u man c e r e b r al
gl i o mas we r e p r e i n c u b at e d i n t h e ab s e n c e o r p r e s e n c e o f i n s u l i n f o r 3 0
mi n at 2 2 0 C . P h o s p h o r y l at i o n r e ac t i o n was c ar r i e d o u t f o r 1 0 mi n at
2 2 0 C as p r e v i o u s l y de s c r i b e d ( 1 7 ) . T h e p h o s p h o r y l at e d , - s u b u n i t o f t h e
i n s u l i n r e c e p t o r was i de n t i f i e d b y i mmu n o p r e c i p i t at i o n wi t h h u man an t i -
r e c e p t o r an t i b o dy ( B - 0 , 1 : 1 0 0 ) an d p r o t e i n A ( C al b i o c h e m- B e h r i n g
C o r p . , L a J o l l a, C A) , f o l l o we d b y s o di u m do de c y l s u l f at e - p o l y ac r y l ami de
ge l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P AGE ) ( 1 7 , 2 2 , 2 3 ) an d au t o r adi o gr ap h y ( X -
O mat AR F i l m; E as t man K o dak C o . , R o c h e s t e r , N Y ) .
Ar t i f i c i al s u b s t r at e s . Al i q u o t s o f t h e p ar t i al l y p u r i f i e d i n s u l i n r e c e p t o r
we r e p r e i n c u b at e d wi t h o u t o r wi t h i n s u l i n f o r 3 0 mi n at 2 2 0 C . T h e
p h o s p h o r y l at i o n o f c as e i n o r p o l y ( Gl u N ar 0 T y r " ) ( b o t h f r o m S i gma
C h e mi c al C o . , S t . L o u i s , M O ) i n t h e p r e s e n c e o f M gC l 2 , AT P ( S i gma
C h e mi c al C o . ) , an d ( ' y _ 3 2 p ) AT P ( N e w E n gl an d N u c l e ar ) was c ar r i e d o u t
e x ac t l y as de s c r i b e d i n ( I 1 7 ) . E n do ge n o u s p h o s p h o r y l at i o n ( me as u r e d i n
t h e ab s e n c e o f ar t i f i c i al
s u b s t r at e s ) was al way s <1 0 % an d was s u b t r ac t e d
f r o m t o t al t o as s e s s p h o s p h o r y l at i o n o f t h e e x o ge n o u s s u b s t r at e s . W h e n
e i t h e r t h e c r u de me mb r an e s o r T r i t o n X - 1 0 0 s o l u b i l i z e d me mb r an e s
we r e u s e d f o r t h e p h o s p h o r y l at i o n s t u di e s , i n c o r p o r at i o n o f 3 2 P i n t o t h e
e x o ge n o u s s u b s t r at e s i n t h e b as al s t at e was t o o h i gh t o al l o w r e l i ab l e
q u an t i f i c at i o n o f t h e i n s u l i n e f f e c t .
C r o s s - l i n k i n g o f 2 5 1 - i n s u l i n t o i n s u l i n r e c e p t o r s
C r o s s - l i n k i n g was p e r f o r me d u s i n g a mo di f i c at i o n o f t h e me t h o d o f P i l c h
an d C z e c h ( 2 4 ) . Hu man b r ai n an d gl i o b l as t o ma me mb r an e s we r e p r e -
p ar e d as de s c r i b e d ab o v e . M e mb r an e s ( f i n al c o n c e n t r at i o n 2 . 5 mg/ ml )
an d ' 2 5 1 - i n s u l i n ( f i n al c o n c e n t r at i o n 1 0 n g/ ml ) we r e i n c u b at e d o v e r n i gh t
at 4 V C . I n c u b at i o n s we r e t e r mi n at e d b y c e n t r i f u gat i o n at 2 0 , 0 0 0 g at
4 V C . M e mb r an e
p e l l e t s we r e r e s u s p e n de d an d was h e d t wi c e i n b o v i n e
s e r u m al b u mi n - f r e e K r e b s - R i n ge r p h o s p h at e b u f f e r ( K R P ) , p H 7 . 8 .
C r o s s l i n k i n g was p e r f o r me d i n K R P , p H 7 . 8 , i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 mM
di s u c c i n i mi dy l
s u b e r at e
( D S S ) ( P i e r c e C h e mi c al C o . , R o c k f o r d, I L ) f o r
1 6 mi n o n i c e an d was t e r mi n at e d b y 1 0 0 mM T r i s wi t h 1 0 mM E D T A,
p H 7 . 4 . P e l l e t s we r e r e s u s p e n de d i n 5 0 mM He p e s , p H 7 . 6 , an d s o l u b i l i z e d
b y s t i r r i n g
o n i c e f o r 3 h wi t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 wi t h 1 mM p h e n y l n e t h y l -
s u l f o n y l
f l u o r i de
( P M S F ) . S amp l e s we r e u l t r ac e n t r i f u ge d at 1 8 0 , 0 0 0 g
f o r 3 0 mi n at
4 C . An t i - i n s u l i n r e c e p t o r an t i b o dy ( B - 1 0 ; 1 : 1 0 0 ) was
u s e d f o r
i mmu n o p r e c i p i t at i o n as de s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 7 ) . T h e c r o s s -
l i n k e d r e c e p t o r s we r e s u b j e c t e d t o S D S - P AGE u n de r r e du c i n g c o n di t i o n s
ac c o r di n g
t o L ae mml i
( 2 3 ) . T h e ac r y l ami de c o n c e n t r at i o n o f t h e r e s o l v i n g
ge l
was
7 . 5 % , wh i l e t h at o f t h e s t ac k i n g ge l was 5 % .
N e u r ami n i das e di ge s t i o n o f c r o s s - l i n k e d r e c e p t o r s
R e c e p t o r s f r o m n o r mal h u man b r ai n , gl i o b l as t o ma, an d h u man e r y t h -
r o c y t e s we r e c r o s s - l i n k e d t o ' 2 5 I - i n s u l i n as de s c r i b e d ab o v e . N e u r ami n -
i das e
di ge s t i o n was p e r f o r me d u s i n g a mo di f i c at i o n o f t h e me t h o d o f
He n dr i c k s e t al . ( 1 1 ) . B e f o r e s o l u b i l i z at i o n , t h e p e l l e t s we r e r e s u s p e n de d
i n I ml 5 mM
2 ( N - mo r p h o l i n o ) e t h an e s u l f o n i c ac i d an d I mM C aC l 2
i n t h e p r e s e n c e o r ab s e n c e o f 2 . 5 u n i t s o f n e u r ami n i das e ( t y p e V I I ) f r o m
C l o s t r i di u m
p e r f r i n ge n s ( S i gma C h e mi c al C o . ) . D i ge s t i o n was c ar r i e d
o u t at 3 7 0 C f o r 3 0 mi n i n t h e ab s e n c e o f p r o t e as e i n h i b i t o r s f o r t h e b r ai n
9 9 8 G. Gr u n b e r ge r , W . L . L o we , J r . , A. M c E l du f f ; an d R . P . Gl i c k
p r e p ar at i o n b u t i n t h e p r e s e n c e o f 2 mM P M S F , 1 0
j i g/ ml
l e u p e p t i n ,
0 . 5 U / ml a2 - mac r o gl o b u l i n , 1 0
j i g/ ml
p e p s t at i n A, an d I mM N - e t h y l -
mal e i mi de ( S i gma C h e mi c al C o . ) f o r t h e e r y t h r o c y t e an d gl i o b l as t o ma
p r e p ar at i o n s . T h e p e l l e t s we r e was h e d o n c e i n K R P , p H 7 . 8 , an d s o l u -
b i l i z e d, i mmu n o p r e c i p i t at e d, an d s u b j e c t e d t o S D S - P AGE .
C r o s s - l i n k i n g o f 1 2 S I - i n s u l i n t o t h e p ar t i al l y
p u r i f i e d
i n s u l i n r e c e p t o r
S o l u b i l i z e d, wh e at - ge r m aggl u t i n i n - p u r i f i e d me mb r an e s we r e p r e p ar e d
as ab o v e . Ab o u t 1 0 0 M g o f p r o t e i n was u s e d i n e ac h t u b e . S amp l e s we r e
p r e i n c u b at e d wi t h ' 2 5 l - i n s u l i n i n t h e ab s e n c e o r p r e s e n c e o f e x c e s s u n -
l ab e l e d i n s u l i n ( 1 0 0 M u g/ ml ) at 4 V C f o r 1 6 h . T o s e p ar at e t h e b o u n d f r o m
f r e e i n s u l i n , s amp l e s we r e r u n o n G- 2 5 M S e p h ade x c o l u mn s ( P h ar mac i a
F i n e C h e mi c al s , U p p s al a, S we de n ) an d 1 - ml f r ac t i o n s c o l l e c t e d. F r ac t i o n s
wi t h t h e h i gh e s t r adi o ac t i v i t y ( u s u al l y N o . 5 ) we r e u s e d f o r t h e c r o s s -
l i n k i n g s t u di e s i n p r e s e n c e o f 0 . 1 mM D S S as de s c r i b e d ab o v e . Af t e r
i mmu n o p r e c i p i t at i o n wi t h an t i - r e c e p t o r an t i b o dy , S D S - P AGE an d au -
t o r adi o gr ap h y we r e u s e d t o e s t i mat e t h e ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t o f
t h e c r o s s - l i n k e d a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r .
D e gr adat i o n o f ' 2 5 I - i n s u l i n b y t h e h u man gl i o b l as t o ma c e l l s
D e gr adat i o n o f ' " I - i n s u l i n b y t h e c u l t u r e d gl i o b l as t o ma c e l l s was as s e s s e d
as de s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 9 ) . B r i e f l y , t r ac e r de gr adat i o n b y b o t h t h e i n -
c u b at i o n me di u m an d b y t h e c e l l s was me as u r e d b y T C A p r e c i p i t ab i l i t y
af t e r a 3 - h i n c u b at i o n at
1
5 C . L e s s t h an 5 % o f' 2 5 I - i n s u l i n was de gr ade d
b y t h e me di u m af t e r t h e 3 - h i n c u b at i o n . Ab o u t 7 % o f t h e t r ac e r was
de gr ade d b y t h e c e l l s af t e r t h e 3 - h i n c u b at i o n at 1 5 C .
I n s u l i n - s t i mu l at e d gl u c o s e u p t ak e
T h e u p t ak e o f D - gl u c o s e was s t u di e d u s i n g c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma
c e l l s ( c e l ll i n e S . ) . C e l l s , at 2 X 1 0 5 / we l l , we r e s u s p e n de d i n D u l b e c c o ' s
mi n i mal e s s e n t i al me di u m c o n t ai n i n g1 0 % f e t al b o v i n e s e r u m an d gl u -
t ami n e , p l at e d, an d gr o wn f o r 5 d at 3 7 C i n h u mi di f i e d at mo s p h e r e
( 5 % C 0 2 ) . T h e c e l l s we r e was h e d t wi c e wi t h E agl e ' s mi n i mal e s s e n t i al
me di u m an d i n c u b at e d wi t h i t f o r
I
h at 3 7 C . T h i s was f o l l o we d b y
t wo was h e s wi t h p h o s p h at e b u f f e r e d s al i n e ( P B S ) , p H 7 . 4 , at 3 7 C , an d
i n c u b at i o n wi t h o r wi t h o u t i n s u l i n f o r 1 5 mi n . 0 . 5 mM D - gl u c o s e an d
I M C i o f D - [ 4 C ( U ) ] - gl u c o s e ( N e w E n gl an d N u c l e ar - , s p ac t 3 4 1 . 2 mC i /
mmo l ) we r e adde d f o r 5 mi n at 3 7 C . T h e r e ac t i o n was t e r mi n at e d b y
2 ml o f i c e c o l d P B S , p H 7 . 4 . C e l l s we r e was h e d t h r e e mo r e t i me s wi t h
P B S an d di ge s t e d wi t h 0 . 5 ml o f 0 . 1 % S D S . T h e di ge s t was al i q u o t e d f o r
p r o t e i n de t e r mi n at i o n an d l i q u i d s c i n t i l l at i o n c o u n t i n g. Al l as s ay s we r e
do n e i n q u adr u p l i c at e s .
R e s u l t s
C h ar ac t e r i z at i o n o f t h e s t r u c t u r e an d f u n c t i o n o f t h e i n s u l i n
r e c e p t o r f r o m t h e h u man gl i al t u mo r s was c ar r i e d o u t u s i n g t wo
ap p r o ac h e s : f i r s t , c e l l s o f e s t ab l i s h e d h i gh - gr ade c u l t u r e d gl i o -
b l as t o ma l i n e s we r e u s e d; an d s e c o n d, t i s s u e f r o mf r e s h l y r e s e c t e d
h u man c e r e b r al gl i al t u mo r s was u t i l i z e d.
S p e c i f i cI 2 5 I - i n s u l i n b i n di n g. S t u di e s o f 1 2 5 1 I - i n s u l i n b i n di n g
t o i n t ac t c e l l s o f t h e c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma l i n e r e v e al e d
c h ar ac t e r i s t i c s t y p i c al o f t h o s e o b t ai n e d wi t h c l as s i c t ar ge t t i s s u e s
wi t h r e gar d t o t i me - , t e mp e r at u r e - , an d p H- de p e n de n c e . R e s u l t s
o f t h e i n s u l i n b i n di n g s t u di e s ar e s h o wn i n F i g.1 wh e r e c o m-
p e t i t i o n - i n h i b i t i o n s t u di e s we r e c ar r i e d o u t f o r 3 h at 1
5 W C
wi t h
v ar i o u s c o n c e n t r at i o n s o f u n l ab e l e d i n s u l i n i n t h e p r e s e n c e o f
0 . 1 n g/ m l 2 5 1 - i n s u l i n . 2 . 3 n g/ ml o f i n s u l i n i n h i b i t e d' 2 5 I - i n s u l i n
b i n di n g b y 5 0 % ( I D s c ) . S c at c h ar d an al y s i s ( 2 5 ) o f t h e b i n di n g
dat a r e v e al e d a c u r v i l i n e ar p l o t , t y p i c al o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r
f r o m o t h e r t i s s u e s ( F i g. 1 ) . S p e c i f i c i t y o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r
b i n di n g t o i n t ac t c e l l s o r c r u de me mb r an e s f r o m t h e c u l t u r e d
gl i o b l as t o ma c e l l s was as s e s s e d me as u r i n g i n h i b i t i o n o f
' n s - i n -
s u l i n b i n di n g b y v ar i o u s r e l at e d o r u n r e l at e d p e p t i de s . Ho r mo n e s
j m
0 . 9
0
a:
&
0 . 7
. ' 0 . 5
. _
1 . 0 i
c
2
c: 0
0
c o
0 . 5
0 . 3
0 . 1
3
I n s u l i n b o u n d
( n g/ mi l )
1 0 1 0 0 1 , 6 0 0 0
I n s u l i n ( n g/ ml )
F i gu r e 1 . S p e c i f i c 1 2 5 I - i n s u l i n b i n di n g t o c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma
c e l l s . C e l l s o f an e s t ab l i s h e d h u man gl i o b l as t o ma- de r i v e d l i n e we r e
h ar v e s t e d an d s p e c i f i c 1 2 5 1 I - i n s u l i n b i n di n g s t u di e s do n e as o u t l i n e d i n
M e t h o ds . S h o wn i s a c o mp e t i t i o n - i n h i b i t i o n c u r v e f o r 1 2 5 1 I - i n s u l i n
b i n di n g at 1 5 C f o r 1 8 0 mi n ( s t e ady s t at e ) . I D S o ( 2 . 3 n g/ ml ) r e f e r s t o
c o n c e n t r at i o n o f u n l ab e l e d i n s u l i n i n h i b i t i n g 1 2 5 1 I - i n s u l i n
b i n di n g b y
5 0 % . S c at c h ar d an al y s i s o f t h e b i n di n g dat a i s s h o wn i n t h e i n s e r t .
R e s u l t s p l o t t e d ar e me an s o f t h r e e s e p ar at e s t u di e s .
r e l at e d t o i n s u l i n ( e . g. , p r o i n s u l i n o r i n s u l i n - l i k e gr o wt h f ac t o r -
1
[ I GF - I ] )
di d c o mp e t e wi t h 2 5 1 I - i n s u l i n b i n di n g, wh i l e u n r e l at e d
p e p t i de s ( e . g. , h GH o r E GF ) we r e i n e f f e c t i v e .
I n s u l i n b i n di n g s t u di e s we r e al s o do n e wi t h c r u de me mb r an e s
an d s o l u b i l i z e d, wh e at - ge r m aggl u t i n i n - p u r i f i e d me mb r an e s
f r o m t h e gl i o b l as t o ma c e l l s ( F i g. 2 ) . I n c o n t r as t wi t h t h e r e p o r t
o f He i de n r e i c h e t al . ( 1 0 ) , al l s p e c i f i c i n s u l i n b i n di n g ac t i v i t y
was r e c o v e r e d i n t h e l e c t i n - c o l u mn e l u at e ; n o s i gn i f i c an t i n s u l i n
b i n di n g was me as u r e d i n t h e f l o w- t h r o u gh o f t h e wh e at ge r m
aggl u t i n i n c o l u mn . M e an i n s u l i n c o n c e n t r at i o n r e q u i r e d t o i n -
h i b i t 5 0 % S o f' 2 5 I - i n s u l i n b i n di n g was 3 . 7 n g/ ml f o r t h e
s o l u b i l i z e d,
l e c t i n - p u r i f i e d p r e p ar at i o n s f r o m t h e c u l t u r e d gl i o b l as t o ma c e l l s .
W e n e x t e x ami n e d i n s u l i n b i n di n g t o t h e i n s u l i n r e c e p t o r
f r o m f r e s h l y o b t ai n e d c e r e b r al gl i o mas f r o m e i gh t mal e p at i e n t s .
0 . 5
0 ) c
C
r D
C X
0 . 3 -
-
0 . 1 _
0 . 1 1 I D 1 0 1 0 0 1 , 0 0 0
I n s u l i n ( n g/ ml )
F i gu r e 2 . S p e c i f i c ' 2 5 1 I - i n s u l i n b i n di n g t o s o l u b i l i z e d, l e c t i n - p u r i f i e d
me mb r an e s o f t h e c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma c e l l l i n e . R e s u l t s ar e
e x p r e s s e d as s p e c i f i c 2 5 1 I - i n s u l i n b i n di n g p e r 2 5 0 M u g p r o t e i n as a f u n c -
t i o n o f i n s u l i n c o n c e n t r at i o n . B i n di n g s t u di e s we r e c ar r i e d o u t at
4 C
f o r 1 6 h . N o n s p e c i f i c b i n di n g, as as s e s s e d i n t h e p r e s e n c e o f I M g/ ml
i n s u l i n , r e p r e s e n t e d 2 0 % o f t h e t o t al i n s u l i n b i n di n g. R e s u l t s s h o wn
ar e me an s o f t h r e e s e p ar at e s t u di e s .
I n s u l i n R e c e p t o r o f Hu man C e r e b r al Gl i o mas 9 9 9
C l i n i c al p ar ame t e r s o f t h e s u b j e c t s ar e s h o wn i n T ab l e I . O n e
o f t h e p at i e n t s ( N o . 4 ) u n de r we n t a f r o n t al l o b e c t o my du r i n g
t h e b r ai n s u r ge r y ; t h e h i s t o l o gi c al l y n o r mal t i s s u e s e r v e d as a
s o u r c e o f " n o r mal b r ai n . " C r u de me mb r an e s we r e p r e p ar e d f r o m
t h e gl i o mal t i s s u e s ; n o at t e mp t was made t o s e p ar at e mi c r o v e s s e l s
f r o m t h e gl i a. S p e c i f i c ' 2 5 I - i n s u l i n b i n di n g s t u di e s we r e c ar r i e d
o u t wi t h t h e s e me mb r an e s . N o c l e ar c o r r e l at i o n c o u l d b e e s t ab -
l i s h e d b e t we e n t h e amo u n t o f i n s u l i n b o u n d p e r mi l l i gr am o f
t h e me mb r an e p r o t e i n an d t h e t u mo r gr ade , l o c at i o n , o r p at i e n t ' s
age . C o n c e n t r at i o n o f i n s u l i n r e q u i r e d f o r t h e 5 0 % i n h i b i t i o n o f
' 2 5 I - i n s u l i n b i n di n g r an ge d f r o m 1 . 2 t o 9 n g/ ml . R e s u l t s o b t ai n e d
wi t h t h e n o r mal b r ai n f e l l wi t h i n t h e r an ge o b t ai n e d wi t h t h e
t u mo r t i s s u e .
T h e mal i gn an t an d n o r mal b r ai n t i s s u e was f u r t h e r p r o c e s s e d.
S p e c i f i c ' 2 5 I - i n s u l i n b i n di n g was de mo n s t r at e d wi t h T r i t o n X -
1 0 0 ( 1 % ) s o l u b i l i z e d me mb r an e s an d p ar t i al l y p u r i f i e d ( b y wh e at
ge r m aggl u t i n i n c o u p l e d t o agar o s e c h r o mat o gr ap h y ) r e c e p t o r
p r e p ar at i o n s ( n o t s h o wn ) . As i n t h e c as e o f t h e c u l t u r e d gl i o -
b l as t o ma c e l l s , al l s p e c i f i c i n s u l i n b i n di n g ac t i v i t y was r e c o v e r e d
i n t h e l e c t i n c o l u mn e l u at e s . W h e n e x p r e s s e d p e r s t an dar d
amo u n t o f p r o t e i n , t h e s p e c i f i c I 2 5 1 - i n s u l i n b i n di n g t o t h e p ar t i al l y
p u r i f i e d i n s u l i n r e c e p t o r s f r o m t h e v ar i o u s t u mo r s was r e mar k -
ab l y s i mi l ar an d di d n o t di f f e r f r o m t h e n o r mal b r ai n . I D 5 0 r an ge
( 1 . 7 t o 5 . 5 n g/ ml o f i n s u l i n ) o b t ai n e d i n t h e 1 2 5 1 - i n s u l i n b i n di n g
e x p e r i me n t s wi t h t h e p ar t i al l y p u r i f i e d r e c e p t o r s di d n o t di f f e r
f r o m t h e r e s u l t s o b t ai n e d wi t h t h e c r u de me mb r an e s .
' 2 5 1 - E GF an d ' 2 5 s I h GH b i n di n g. S p e c i f i c b i n di n g o f o t h e r
p e p t i de gr o wt h f ac t o r s t o t h e c r u de me mb r an e s f r o m t h e gl i o mal
t u mo r s - was as s e s s e d. ' 2 5 I - E GF b i n di n g was me as u r e d i n f i v e
t u mo r s an d t h e n o r mal b r ai n . E x c e p t f o r p at i e n t n o . 5 , wh o s e
t u mo r h ad n o s i gn i f i c an t E GF b i n di n g, al l t i s s u e s s h o we d h i gh e r
l e v e l s o f E GF t h an i n s u l i n b i n di n g. Ho we v e r , t h e r e was n o c o r -
r e l at i o n b e t we e n s p e c i f i c ' 2 5 I - E GF b i n di n g c ap ac i t y an d t h e t u -
mo r gr ade . N o s p e c i f i c b i n di n g o f ' 2 5 1 - h GH was de t e c t e d i n an y
o f t h e c r u de me mb r an e s .
R e gu l at i o n o f c e r e b r al gl i al i n s u l i n r e c e p t o r s . S t u di e s i n t h e
p as t s h o we d f ai l u r e o f i n s u l i n t o do wn - r e gu l at e i t s r e c e p t o r s i n
r at n e u r o n - e n r i c h e d c u l t u r e d b r ai n t i s s u e ( 7 , 8 ) . W h e n c e l l s o f
t h e c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma l i n e we r e p r e i n c u b at e d wi t h
v ar i o u s c o n c e n t r at i o n s o f i n s u l i n at 3 7 0 C , an d 2 5 1 I - i n s u l i n b i n d-
i n g was c ar r i e d o u t af t e r e x t e n s i v e was h i n g o f t h e c e l l s , t h e gl i al
i n s u l i n r e c e p t o r s we r e do wn - r e gu l at e d b y t h e amb i e n t i n s u l i n
c o n c e n t r at i o n s ( F i g. 3 ) . I n c r e as i n g i n s u l i n l e v e l s du r i n g p r e i n -
c u b at i o n i n h i b i t e d s u b s e q u e n t s p e c i f i c ' 2 5 i - i n s u l i n b i n di n g. 5 0 %
do wn - r e gu l at i o n o c c u r r e d af t e r p r e i n c u b at i o n wi t h - 4 6 n g/ ml
i n s u l i n . I n c o mp ar i s o n , t h e c e l l s o f t h e h u man U - 9 3 7 l i n e , wh i c h
i s k n o wn f o r t h e r ap i d an d s e n s i t i v e r e gu l at i o n o f t h e i n s u l i n
T ab l e I . C l i n i c al C h ar ac t e r i s t i c s o f P at i e n t s wi t h B r ai n Gl i o mas
P at i e n t Age T u mo r t y p e L o c at i o n
1 3 5 Gl i o s ar c o ma L F r o n t al
2 5 0 Gl i o ma R T e mp o r al
3 6 0 Gl i o ma L F r o n t al
4 7 5 Gl i o b l as t o ma R F r o n t al
5 5 J u v e n i l e as t r o c y t o ma Hy p o t h al amu s
6 6 1 Gl i o b l as t o ma R F r o n t al
7 1 5 Gl i o b l as t o ma L F r o n t o p ar i e t al
8 3 7 Gl i o b l as t o ma L T e mp o r al
2 F i gu r e 3 . D o wn - r e gu l at i o n
E b y "
o f t h e i n s u l i n
r e c e p t o r s
o f
t h e c u l t u r e d h u man gl i o -
b l as t o ma c e l l l i n e . T h e c e l l s
8 .
e AQ U
gl i o b l as t o ma o f t h e gl i o b l as t o ma an d h u -
- 6 0 Ad / man mo n o c y t e - l i k e c e l l l i n e
n 0
< " s t ( U - 9 3 7 ) we r e p r e i n c u b at e d
C
\ " I i n t h e p r e s e n c e o f v ar i o u s
4 0
-
b
c o n c e n t r at i o n s o f p o r c i n e
7 5
C :
i n s u l i n at 3 7 1 C f o r 3 h . Af -
N o / \t e r e x t e n s i v e was h i n g ( 2 1 ) , ' !
2 0
U 0 - 9 3 7 ' 2 5 I - i n s u l i n
b i n di n g s t u di e s
we r e do n e at
1 5 C
f o r 3 h .
e n J o t
T h e r e s u l t s ar e
p l o t t e d
as
0 1 1 0 1 0 0
p e r c e n t age o f ' 2 5 I - i n s u l i n
I n s u l i n
( n g/ ml ) b i n di n g t o c e l l s p r e i n c u -
b at e d wi t h t h e c u l t u r e me -
di u m al o n e . T h e
gl i o b l as t o ma i n s u l i n
r e c e p t o r i s do wn - r e gu l at e d
b y
t h e
p r e v i o u s e x p o s u r e
t o
i n s u l i n , wi t h 5 0 % i n h i b i t i o n o f b i n di n g b y
- 4 6
n g/ ml i n s u l i n ; I D 5 0
f o r t h e U - 9 3 7 c e l l l i n e was
-
1 0 n g/ ml . D at a
s h o wn ar e
av e r age s
o f t wo
e x p e r i me n t s .
r e c e p t o r ( 2 0 ) ,
was ab o u t f i v e f o l d mo r e s e n s i t i v e t o i n s u l i n
r e g-
u l at i o n
( I D O
-
1 0
n g/ ml ) .
a- S u b u n i t s t n wt u r e . I n s u l i n
b i n di n g
i s t h e
p r e s u me d
f u n c t i o n
o f t h e a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n
r e c e p t o r .
T h e r at b r ai n
a- s u b u n i t ,
wh i c h was i de n t i f i e d e i t h e r
b y p h o t o - l ab e l i n g o r c o v al e n t c r o s s -
l i n k i n g
wi t h
' 2 5 I - i n s u l i n ,
was s h o wn t o
mi gr at e
wi t h an
ap p ar e n t l y
l o we r mo l e c u l ar
we i gh t b y e l e c t r o p h o r e t i c c r i t e r i a t h an t h e a-
s u b u n i t s o f
p e r i p h e r al
i n s u l i n
r e c e p t o r s ( 9 - 1 2 ) .
W h e n we c o -
v al e n t l y c r o s s - l i n k e d, i n
p r e s e n c e o f 0 . 1 mM D S S , ' 2 5 1 - i n s u l i n
t o t h e
r e c e p t o r
f r o m t h e c u l t u r e d h u man gl i o b l as t o ma c e l l s o r
c r u de me mb r an e s de r i v e d f r o m t h e s e c e l l s , t h e a- s u b u n i t o f t h e
gl i o b l as t o ma r e c e p t o r
h ad an M r o f 1 3 5 , 0 0 0 - 1 3 8 , 0 0 0 i n o u r
s t u di e s . E x c e s s c o n c e n t r at i o n o f u n l ab e l e d i n s u l i n
c o mp l e t e l y
ab o l i s h e d
l ab e l i n g
o f t h e i n s u l i n
r e c e p t o r
o n t h e
au t o r adi o gr ap h s
( r e s u l t s
n o t
s h o wn ) .
T h e a- s u b u n i t o f t h e I M - 9 i n s u l i n
r e c e p t o r ,
r e p r e s e n t at i v e
o f
p e r i p h e r al t i s s u e s , s h o we d i de n t i c al e l e c t r o -
p h o r e t i c mo b i l i t y
o n t h e s ame
ge l s .
Al l o f t h e i n s u l i n
r e c e p t o r s f r o m t h e
f r e s h l y i s o l at e d
gl i o ma
t u mo r s
y i e l de d
a- s u b u n i t wi t h M r 1 3 5 , 0 0 0 - 1 4 0 , 0 0 0 ( F i g. 4 ) .
S i gn i f i c an t l y ,
wh e n me mb r an e s f r o m n o r mal b r ai n t i s s u e an d
f r o m t h e
gl i o b l as t o ma
de r i v e d f r o m t h e b r ai n o f t h e s ame i n -
di v i du al we r e
s t u di e d,
t h e r e was a mar k e d di f f e r e n c e i n t h e mo -
b i l i t y
o f t h e a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n
r e c e p t o r . T h e a- s u b u n i t o f
t h e
gl i o b l as t o ma r e c e p t o r
mo v e d wi t h an M
- ~ 1 4 0 , 0 0 0 , wh i l e
t h at o f t h e n o r mal b r ai n h ad an M r
-
1 8 , 0 0 0 ( F i g. 4 ) , s i mi l ar
t o t h at
p r e v i o u s l y r e p o r t e d
wi t h t h e wh o l e r at b r ai n as we l l as
s e v e r al
r e gi o n s
f r o m t h e r at b r ai n
( 9 - 1 2 ) . I n
addi t i o n , t h e e l e c -
t r o p h o r e t i c mo b i l i t y
o f t h e r at b r ai n i n s u l i n
r e c e p t o r s u b u n i t s
was n o t
c h an ge d b y
n e u r ami n i das e t r e at me n t
( 1 0 , 1 1 ) . T h e r e f o r e ,
we n e x t as s e s s e d t h e
r e s p o n s e o f n o r mal h u man b r ai n as we l l
as h u man
gl i o b l as t o ma r e c e p t o r
t o n e u r ami n i das e di ge s t i o n . As
s h o wn i n
F i g. 5 , n e u r ami n i das e
( 2 . 5 U / mI ) t r e at me n t r e s u l t e d
i n a s mal l
( f r o m
an M r 1 3 6 , 0 0 0
t o
1 3 2 , 0 0 0 ) b u t
s i gn i f i c an t de -
c r e as e i n t h e M r o f t h e a- s u b u n i t o f t h e
gl i o b l as t o ma r e c e p t o r .
T h e i n s u l i n
r e c e p t o r
o f a
p e r i p h e r al c e l l , t h e
e r y t h r o c y t e , s h o we d
i de n t i c al r e s p o n s e t o n e u r ami n i das e ( F i g. 5 , C an d D ) . I n c o n t r as t ,
t h e c r o s s - l i n k e d i n s u l i n
r e c e p t o r o f t h e n o r mal h u man b r ai n
mi gr at e d mo r e
r ap i dl y an d di d n o t r e s p o n d t o n e u r ami n i das e
( F i g. 5 ,
E an d
F ) .
1 0 0 0 G. Gr u n b e r ge r , W L . L o we , J r . , A.
M c E l du f f
an d R . P . Gl i c k
ab
. . . . . l
2 0 0 K D -
1 1 6 K D -
9 2 K D
6 6 K D -
4 5 K D -
F i gu r e 4 . E l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y o f t h e a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e -
c e p t o r o f t h e n o r mal h u man b r ai n an d gl i o b l as t o ma. C r u de me m-
b r an e s f r o m f r e s h l y r e s e c t e d gl i o b l as t o ma ( c as e n o . 4 , l an e a) an d n o r -
mal b r ai n t i s s u e ( c as e n o . 4 , l an e b ) , b o t h at 3 . 7 5 mg/ ml p r o t e i n , we r e
p r e i n c u b at e d wi t h ' 2 5 I - i n s u l i n at 4 C f o r 1 6 h . C o v al e n t c r o s s - l i n k i n g
o f t h e l i gan d t o t h e r e c e p t o r was do n e i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 mM D S S .
T h e c r o s s - l i n k e d a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r was i de n t i f i e d af t e r
i mmu n o p r e c i p i t at i o n wi t h an t i - r e c e p t o r an t i b o dy ( B - 1 0 , 1 : 1 0 0 ) , S D S -
P AGE , an d au t o r adi o gr ap h y . T h e ar r o w p o i n t s t o t h e r e gi o n o f t h e a-
s u b u n i t mi gr at i o n ;
M ,
o f t h e gl i o b l as t o ma r e c e p t o r was 1 4 0 , 0 0 0 , wh i l e
t h at o f t h e n o r mal b r ai n was
-
1 1 8 , 0 0 0 . P r e i n c u b at i o n o f t h e me m-
b r an e s wi t h e x c e s s o f u n l ab e l e d i n s u l i n ab o l i s h e d t h e l ab e l i n g o f t h e a-
s u b u n i t . I mmu n o p r e c i p i t at i o n o f t h e s amp l e s wi t h n o r mal h u man
s e r u m di d n o t r e s u l t i n l ab e l i n g o f an y b an ds i n t h e r e gi o n o f t h e r e -
c e p t o r ' s a- s u b u n i t ( n o t s h o wn ) .
S t r u c t u r e an df u n c t i o n o f t h e , 3 - s u b u n i t . 1 3 - s u b u n i t o f t h e i n -
s u l i n r e c e p t o r s f r o m n u me r o u s t i s s u e s c o n t ai n s t y r o s i n e k i n as e
ac t i v i t y wh i c h c an b e s t i mu l at e d b y i n s u l i n ( 2 6 , 2 7 ) . I n o u r s t u dy
i n s u l i n s i gn i f i c an t l y s t i mu l at e d au t o p h o s p h o r y l at i o n o f t h e c u l -
t u r e d gl i o b l as t o ma 1 - s u b u n i t ( F i g. 6 ) . T h e t i me - , t e mp e r at u r e - ,
an d i n s u l i n c o n c e n t r at i o n - de p e n de n c e as we l l as i o n i c r e q u i r e -
me n t s f o r t h e o p t i mal ac t i v i t y o f t h e r e c e p t o r k i n as e we r e i de n -
t i c al f o r t h e gl i o b l as t o ma p r e p ar at i o n t o t h o s e p r e v i o u s l y r e p o r t e d
wi t h o t h e r t i s s u e s ( 1 7 , 2 2 , 2 8 ) . T h e ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t
o f t h e 1 3 - s u b u n i t o f t h e gl i o b l as t o ma i n s u l i n r e c e p t o r , at
- 9 5 , 0 0 0 , was t y p i c al o f t h e r e c e p t o r s o f p e r i p h e r al c e l l s . I n s u l i n -
ac t i v at e d r e c e p t o r k i n as e i s c ap ab l e o f p h o s p h o r y l at i n g e x o ge -
n o u s s u b s t r at e s ( 2 7 - 2 9 ) . T h e p ar t i al l y p u r i f i e d gl i o b l as t o ma r e -
c e p t o r al s o c o n t ai n e d i n s u l i n - s e n s i t i v e k i n as e ac t i v i t y t o war d
ar t i f i c i al s u b s t r at e s . I n s u l i n at 1 0 - 8 M s t i mu l at e d p h o s p h o r y l at i o n
o f c as e i n - 2 . 5 - f o l d b y t h i s p r e p ar at i o n ( F i g. 7 ) . I n addi t i o n ,
i n s u l i n ( 1 0 - 8 M ) al s o s t i mu l at e d p h o s p h o r y l at i o n o f a s u b s t r at e
c o n t ai n i n g t y r o s i n e as t h e o n l y p h o s p h o r y l at ab l e ami n o ac i d
r e s i du e , p o l y ( Gl u N a8 0 T y r 2 0 ) , - 3 . 7 5 - f o l d i n t h e p r e s e n c e o f ( y -
3 2 P ) AT P an d 2 0 mM M g2 + ( F i g. 7 ) . T h u s , t h e h u man gl i o b l as -
t o ma i n s u l i n r e c e p t o r c o n t ai n e d f u n c t i o n al l y an d s t r u c t u r al l y
n o r mal 1 3 - s u b u n i t .
An al o go u s r e s u l t s we r e o b t ai n e d wi t h t h e p ar t i al l y p u r i f i e d
i n s u l i n r e c e p t o r f r o m t h e c e r e b r al gl i o mas an d n o r mal h u man
b r ai n . I n s u l i n s i gn i f i c an t l y i n c r e as e d au t o p h o s p h o r y l at i o n o f t h e
r e c e p t o r ' s 1 - s u b u n i t as i de n t i f i e d b y i mmu n o p r e c i p i t at i o n wi t h
an t i - r e c e p t o r an t i b o dy , S D S - P AGE , an d au t o r adi o gr ap h y ( F i g.
8 ) . T h e o p t i mal i n s u l i n e f f e c t o c c u r r e d at a c o n c e n t r at i o n o f 1
p g/ ml
f o r al l f r e s h l y i s o l at e d t i s s u e s e x ami n e d an d was ap p r o x -
i mat e l y e q u al i n magn i t u de wi t h al l r e c e p t o r p r e p ar at i o n s . T h e
e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y o f t h e r e c e p t o r ' s 1 3 - s u b u n i t f r o m al l t u -
mo r o r n o r mal b r ai n t i s s u e s was i de n t i c al ( M r 9 5 , 0 0 0 ) . I n s u l i n -
s t i mu l at e d p h o s p h o r y l at i o n o f e x o ge n o u s s u b s t r at e s b y t h e p ar -
t i al l y p u r i f i e d h u man b r ai n r e c e p t o r p r e p ar at i o n s was n e x t as -
s e s s e d. T h e i n s u l i n do s e - r e s p o n s e was s i mi l ar t o t h at s e e n i n t h e
au t o p h o s p h o r y l at i o n e x p e r i me n t s ; t h e o p t i mal s t i mu l at i o n o f
t h e r e c e p t o r k i n as e ac t i v i t y o c c u r r e d wi t h 1 , u g/ ml i n s u l i n ( F i g.
9 ) . T h e r e c e p t o r k i n as e s f r o m t h e n o r mal b r ai n an d t h e t u mo r s
s h o we d t h e s ame i n s u l i n s e n s i t i v i t y . N o i n s u l i n - s t i mu l at e d k i n as e
ac t i v i t y was de t e c t e d i n t h e l e c t i n c o l u mn f l o w- t h r o u gh c o l l e c -
t i o n .
T h e i n s u l i n - s t i mu l at e d t y r o s i n e k i n as e ac t i v i t i e s o f t h e p ar -
t i al l y p u r i f i e d i n s u l i n r e c e p t o r s f r o m t h e n o r mal b r ai n an d t h e
p at i e n t s ' gl i o mas we r e c o mp ar e d. As we p r e v i o u s l y di s c u s s e d
( 1 7 ) , t h e o p t i mal e x p r e s s i o n o f t h e i n s u l i n - s t i mu l at e d r e c e p t o r
k i n as e ac t i v i t y i n v o l v e s t h e i n s u l i n - s t i mu l at e d i n c r e me n t i n t h e
e n z y me ac t i v i t y e x p r e s s e d p e r u n i t o f t h e r e c e p t o r b i n di n g. N o
s i gn i f i c an t di f f e r e n c e i n t h e r e c e p t o r t y r o s i n e k i n as e ac t i v i t y was
de t e c t e d b e t we e n t h e n o r mal b r ai n , h i gh - o r l o w- gr ade t u mo r s
f r o m t h e s mal l n u mb e r o f p at i e n t s e x ami n e d [ r an ge , 4 . 4 - 2 6 . 1
i n s u l i n - s t i mu l at e d k i n as e ac t i v i t y ( = p i c o mo l e s AT P p e r mi l l i -
gr am s u b s t r at e p e r 1 0 mi n ) p e r B / F ] .
I n s u l i n - s t i mu l at e d gl u c o s e u p t ak e . P r e i n c u b at i o n o f c u l t u r e d
h u man gl i o b l as t o ma c e l l s wi t h i n s u l i n r e s u l t e d i n an i n c r e as e i n
[ ' 4 C ] gl u c o s e u p t ak e . I n s u l i n at l 0 - 7 M s t i mu l at e d gl u c o s e u p t ak e
max i mal l y b y 4 5 . 7 8 . 2 % o v e r t h e c o n t r o l v al u e af t e r a 1 5 - mi n
p r e i n c u b at i o n p e r i o d.
D i s c u s s i o n
R at b r ai n i n s u l i n r e c e p t o r s h av e b e e n f o u n d t o p o s s e s s u n i q u e
f e at u r e s ( 9 - 1 2 ) . T h e c o v al e n t l y l ab e l e d a- s u b u n i t - i n s u l i n c o m-
I n s u l i n R e c e p t o r o f Hu man C e r e b r al Gl i o mas 1 0 0 1
a b
I
2 0 0 k D
1 1 6 k D
c
mu R
9 2 k D -
d
A. . z
- - 2 0 0 k D
- - 1 1 6 k D
-
9 2 k D
6 6 k D -
-
6 6 k D
4 5 k D
- 4 5 k D
N e u r ami n i das e - + +
-
F i gu r e 5 . E f f e c t o f n e u r ami n i das e o n t h e e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y o f
t h e i n s u l i n r e c e p t o r o f n o r mal h u man b r ai n , gl i o b l as t o ma, an d e r y t h -
r o c y t e s . C r u de me mb r an e s ( 3 . 5 mg/ ml p r o t e i n ) we r e p r e i n c u b at e d
wi t h ' 1 ' I - i n s u l i n an d c o v al e n t c r o s s - l i n k i n g do n e i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1
mM D S S . N e u r ami n i das e ( 2 . 5 U / ml ) t r e at me n t was do n e i n t h e p r e s -
e n c e o f p r o t e as e i n h i b i t o r s ( s e e M e t h o ds ) . Af t e r s o l u b i l i z at i o n , i mmu -
n o p r e c i p i t at i o n wi t h an t i - r e c e p t o r an t i b o dy ( B - l 0 , 1 : 1 0 0 ) was c ar r i e d
o u t , f o l l o we d b y S D S - P AGE an d au t o r adi o gr ap h y . Ar r o ws p o i n t t o
p l e x p o s s e s s e d a mo r e r ap i d e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y ; e x p o s u r e
t o n e u r ami n i das e f ai l e d t o al t e r t h e e l e c t r o p h o r e t i c p r o p e r t i e s
o f t h e a- s u b u n i t o f t h e b r ai n r e c e p t o r s , an d wh o l e b r ai n an d
n e u r o n al i n s u l i n r e c e p t o r s di d n o t do wn - r e gu l at e af t e r a c h r o n i c
e x p o s u r e t o i n s u l i n . W e t e s t e d, wi t h h u man t i s s u e , t h e p r e di c t i o n s
f r o m t h e r at b r ai n mo de l an d e x t e n de d t h e s t u di e s t o t h e i n s u l i n
r e c e p t o r s f r o m n o r mal h u man b r ai n an d c e r e b r al gl i o mas . T o
av o i d t h e p r o b l e ms i n h e r e n t i n de al i n g wi t h mi x e d c e l l p o p u -
l at i o n s , we f i r s t s t u di e d p r o p e r t i e s o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r s f r o m
c u l t u r e d h u man c e l l s o f p u r e l y gl i al o r i gi n . T h e gl i al e l e me n t s
c o mp o s e u p t o 8 5 % o f t h e b r ai n c e l l s ( 1 4 ) . W e f o u n d t h at al l
p r o p e r t i e s o f t h e h u man gl i o b l as t o ma i n s u l i n r e c e p t o r s we r e i n -
di s t i n gu i s h ab l e f r o m t h o s e o f p e r i p h e r al t ar ge t t i s s u e s . W e i de n -
t i f i e d s p e c i f i c i n s u l i n r e c e p t o r s wi t h b i n di n g p ar ame t e r s ( r e c e p t o r
af f i n i t y c o n s t an t s , s h ap e o f t h e S c at c h ar d p l o t , p H- , t i me - , an d
t e mp e r at u r e - de p e n de n c e , as we l l as s p e c i f i c i t y ) t y p i c al o f p e -
r i p h e r al t ar ge t t i s s u e s f o r i n s u l i n . T h e a- s u b u n i t o f t h e gl i o b l as -
t o ma i n s u l i n r e c e p t o r ( f r o m i n t ac t c e l l s , c r u de me mb r an e s , an d
p ar t i al l y p u r i f i e d r e c e p t o r ) c r o s s - l i n k e d wi t h ' 2 5 I - i n s u l i n s h o we d
e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y i de n t i c al t o t h at o f p e r i p h e r al t i s s u e s .
I n addi t i o n , t h e i n s u l i n r e c e p t o r o f t h e gl i o b l as t o ma c l e ar l y do wn -
r e gu l at e d af t e r a 3 - h e x p o s u r e t o as l i t t l e as 1 0 n g/ ml i n s u l i n .
-
+
t h e p o s i t i o n o f a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r . L an e s A an d B , h u -
man gl i o b l as t o ma; C an d D , h u man e r y t h r o c y t e s ; E an d F , n o r mal
h u man b r ai n . Ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t s we r e r e du c e d b y t h e n e u r -
ami n i das e t r e at me n t o f t h e gl i o b l as t o ma ( f r o m an M r o f 1 3 7 , 0 0 0 t o
1 3 2 , 0 0 0 ) an d e r y t h r o c y t e ( f r o m an M r o f 1 3 6 , 0 0 0 t o 1 3 2 , 0 0 0 ) r e c e p -
t o r , b u t n o t wh o l e b r ai n ( u n c h an ge d at an M r o f 1 1 8 , 0 0 0 ) i n s u l i n
r e c e p t o r .
T h e , 3 - s u b u n i t o f t h e c u l t u r e d gl i o b l as t o ma i n s u l i n r e c e p t o r
s h o we d t h e s ame ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t , i n s u l i n - s t i mu l at e d
au t o p h o s p h o r y l at i o n , an d t y r o s i n e k i n as e ac t i v i t y t o war ds e x -
o ge n o u s s u b s t r at e s as t h at o f p e r i p h e r al r e c e p t o r s .
F u r t h e r , we c h ar ac t e r i z e d f o r t h e f i r s t t i me i n s u l i n r e c e p t o r s
f r o m h u man b r ai n gl i al t u mo r s i mme di at e l y u p o n t h e i r r e mo v al
t o r u l e o u t an y e f f e c t s o f t h e c e l l c u l t u r i n g p e r s e . E v e n t h o u gh
n o s p e c i f i c me t h o d was u s e d t o r e mo v e t h e v as c u l ar e l e me n t s
f r o m t h e gl i al t u mo r t i s s u e , i t i s u n l i k e l y t h at t h e p r e s e n c e o f
mi c r o v e s s e l i n s u l i n r e c e p t o r s ( 3 0 , 3 1 ) wo u l d af f e c t o u r c o n c l u -
s i o n s s i n c e t h e r e s u l t s wi t h t h e c u l t u r e d an d f r e s h l y i s o l at e d gl i al
t i s s u e s we r e an al o go u s .
W e f o u n d t h at al l t h e h u man gl i al t u mo r s p o s s e s s e d s p e c i f i c
i n s u l i n r e c e p t o r s wi t h t h e t y p i c al b i n di n g ac t i v i t i e s an d c h ar -
ac t e r i s t i c s o f t h e p e r i p h e r al r e c e p t o r s . T h e c r o s s - l i n k e d a- s u b u n i t
mi gr at e d i de n t i c al l y wi t h a p e r i p h e r al r e c e p t o r o n S D S - P AGE .
C ar b o h y dr at e mo i e t i e s o f t h e gl i al an d o t h e r p e r i p h e r al r e c e p t o r s
ar e i de n t i c al o r c l o s e l y r e l at e d s i n c e al l t h e gl i al p r e p ar at i o n s
b o u n d t o t h e wh e at ge r m aggl u t i n i n c o l u mn s an d we r e s p e c i f i -
c al l y e l u t e d wi t h N - ac e t y l - D - gl u c o s ami n e . T h e e l u at e s c o n t ai n e d
t h e f u l l b i n di n g an d i n s u l i n - s t i mu l at e d k i n as e ac t i v i t i e s . N e u r -
ami n i das e t r e at me n t de c r e as e d t h e ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t
1 0 0 2 G. Gr u n b e r ge r , W L . L o we , J r . , A. M c E l du f f an d R . P . Gl i c k
gi l o
2 0 0 k D
1 1 6 k D -
9 2 k D -
6 6 k D
4 5 k D -
I n s u l i n +
F i gu r e 6 . I n s u l i n - s t i mu l at e d p h o s p h o r y l at i o n o f t h e c u l t u r e d gl i o b l as -
t o ma ( gl i o ) i n s u l i n r e c e p t o r . P ar t i al l y p u r i f i e d i n s u l i n r e c e p t o r f r o m
t h e c u l t u r e d gl i o b l as t o ma c e l l l i n e was p r e i n c u b at e d i n t h e ab s e n c e
an d p r e s e n c e o f I s g/ ml i n s u l i n at 2 2 0 C f o r 3 0 mi n . Au t o p h o s p h o r y -
l at i o n e x p e r i me n t s we r e do n e i n t h e p r e s e n c e o f ( y - 3 2 P ) AT P an d M n 2 +
at 2 2 0 C f o r 1 0 mi n . T h e p h o s p h o p r o t e i n s we r e i de n t i f i e d b y i mmu n o -
p r e c i p i t at i o n wi t h an t i - r e c e p t o r an t i b o dy ( B - 0 , 1 : 1 0 0 ) , S D S - P AGE ,
an d au t o r adi o gr ap h y .
o f t h e gl i al r e c e p t o r ' s a- s u b u n i t i n t h e s ame f as h i o n as t h at o f a
p e r i p h e r al r e c e p t o r .
S i gn i f i c an t l y , wh e n p r e p ar at i o n s o f t h e mal i gn an t an d n o r mal
p o r t i o n s o f t h e s ame l o b e f r o m t h e b r ai n o f t h e s ame p at i e n t
we r e e x ami n e d, we s h o we d maj o r di f f e r e n c e s b e t we e n t h e t wo
t y p e s o f t i s s u e i n t h e ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t o f t h e a- s u b u n i t s
an d t h e i r r e s p o n s e t o n e u r ami n i das e . T h e " wh o l e b r ai n " p r e p -
ar at i o n b e h av e d as p r e di c t e d b y t h e r at b r ai n mo de l ( 1 0 , 1 1 ) :
mar k e dl y f as t e r e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y an d f ai l u r e t o r e s p o n d
t o n e u r ami n i das e . I n c o n t r as t , t h e r e we r e n o di f f e r e n c e s s e e n
b e t we e n t h e n o r mal h u man b r ai n an d gl i al t u mo r t i s s u e i n t h e
* E F i gu r e 7 . I n s u l i n - s t i mu l at e d
o C p h o s p h o r y l at i o n
o f
e x o ge -
-
2 n o u s s u b s t r at e s b y t h e c u l -
t u r e d h u man gl i o b l as t o ma
E
1 . 5
- > I
i n s u l i n r e c e p t o r . T h e p ar -
t i al l y p u r i f i e d gl i o b l as t o ma
Hi i n s u l i n r e c e p t o r was p r e i n -
0 1 ~
a @ c u b at e d wi t h o u t o r wi t h i n -
s u l i n at 2 2 0 C f o r 3 0 mi n .
0 -
-
0 . 5 _ a ^ 2
P h o s p h o r y l at i o n o f e x o ge -
n o u s s u b s t r at e s
[ c as e i n
o r
p o l y
( Gl u N a8 1 T y r l )
= p o l y
X I N S U L I N : e 1 - M e 1 0 M 1 0 7 M ( Gl u , T y r ) ,
4 : 1 ] was c ar r i e d
o u t i n t h e p r e s e n c e o f ( ' y -
C AS E I N p o l y ( Gl u T y r ) , 4 : 1
3 2 P )
AT P an d
M g'
( s e e
M e t h o ds ) at 2 2 0 C . R e s u l t s ar e s h o wn as me an o f t h r e e s e p ar at e e x p e r -
i me n t s + 1 S D ; f o u r i n di v i du al v al u e s o f t h e k i n as e ac t i v i t y we r e de t e r -
mi n e d f o r e ac h c o n di t i o n i n e v e r y e x p e r i me n t .
l e v e l o f s p e c i f i c i n s u l i n b i n di n g, r e c e p t o r af f i n i t y , s t r u c t u r e o f
t h e ( 3 - s u b u n i t , o r i t s i n s u l i n - s t i mu l at e d k i n as e ac t i v i t y .
T h e f i n di n g o f i de n t i c al i n s u l i n b i n di n g ac t i v i t y p e r u n i t o f
p r o t e i n o f t h e n o r mal an d mal i gn an t b r ai n t i s s u e de s p i t e t h e
mar k e d di f f e r e n c e i n b o t h t h e s t r u c t u r e o f t h e b i n di n g ( a) s u b u n i t
o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r de s e r v e s a c o mme n t . I t h as b e e n as s u me d
t h at t h e l o we r ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t o f t h e b r ai n r e c e p t o r ' s
a- s u b u n i t i s du e t o i t s de c r e as e d o r ab s e n t n e u r ami n i das e - s e n -
s i t i v e s i al i c ac i d c o n t e n t ( 1 0 - 1 2 ) . I n r at adi p o c y t e s r e mo v al o f
s i al i c ac i d p r e s e r v e s i n s u l i n b i n di n g b u t i mp ai r s i n s u l i n ac t i o n
( 3 2 , 3 3 ) . W e h av e r e p o r t e d t h at i n t h e c u l t u r e d h u man mo n o c y t e -
l i k e c e l l ( U - 9 3 7 ) an d f r e s h l y i s o l at e d h u man mo n o c y t e s t h e al -
t e r e d ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t o f t h e a- s u b u n i t di d n o t c h an ge
i n s u l i n b i n di n g ( 3 4 ) . I f t h e s t r u c t u r al di f f e r e n c e s ar e du e t o al t e r e d
p o s t t r an s l at i o n al gl y c o s y l at i o n o f t h e b r ai n an d p e r i p h e r al r e -
c e p t o r s , t h e s e c h an ge s mi gh t n o t t ak e p l ac e i n t h e b i n di n g do mai n
o f t h e a- s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r . Al t e r n at i v e l y , o u r me t h -
o ds o f as s ay i n g t h e s p e c i f i c i n s u l i n b i n di n g mi gh t n o t b e s e n s i t i v e
e n o u gh t o de t e c t s u b t l e c h an ge s i n b i n di n g.
O n e p u z z l i n g as p e c t o f t h e s t r u c t u r al s t u di e s o f t h e a- s u b u n i t
r e mai n s t o b e s o l v e d. S i n c e t h e gl i al e l e me n t s o f t h e b r ai n c o m-
p r i s e t h e maj o r i t y o f t h e c e l l s i n t h e wh o l e b r ai n , wh y do we
de t e c t o n l y o n e , t h e " c e n t r al , " ' 2 5 1 - i n s u l i n - l ab e l e d s p e c i e s o n
t h e au t o r adi o gr ap h s o f t h e c r o s s - l i n k i n g s t u di e s o f t h e r e c e p t o r
f r o m t h e n o r mal b r ai n ? I s i t p o s s i b l e t h at t h i s r e f l e c t s an i n h i b -
i t o r y i n f l u e n c e o f t h e n e u r o n al e l e me n t s o n t h e gl i al r e c e p t o r s
i n t h e i n v i v o s e t t i n g o r du r i n g t h e p r e p ar at i o n o f t h e s amp l e s ?
I t i s u n l i k e l y , f r o m o u r r e s u l t s , t h at a maj o r di s c r e p an c y i n t h e
af f i n i t y o f t h e n e u r o n al an d gl i al r e c e p t o r s f o r i n s u l i n c o u l d e x -
p l ai n t h e p r e do mi n an c e o f t h e " c e n t r al " t y p e o f t h e r e c e p t o r ' s
a- s u b u n i t .
T o i n v e s t i gat e me t ab o l i c c o n s e q u e n c e s o f t h e p r e s e n c e o f
t h e t y p i c al i n s u l i n r e c e p t o r s o n t h e h u man gl i al c e l l s , we me a-
s u r e d t h e e f f e c t o f i n s u l i n o n gl u c o s e u p t ak e . As de mo n s t r at e d
wi t h t h e r at n e o n at al c u l t u r e d gl i al c e l l s b y C l ar k e e t al . ( 1 4 ) , we
s h o w h e r e t h at i n s u l i n s t i mu l at e d gl u c o s e u p t ak e b y c u l t u r e d
h u man gl i o b l as t o ma c e l l s .
W e c an t h u s e x t e n d t h e r e s u l t s p r e v i o u s l y o b t ai n e d wi t h t h e
r o de n t i n s u l i n r e c e p t o r s t o h u man b r ai n r e c e p t o r s . T h e p r e do m-
i n an t c e l l u l ar c o mp o n e n t o f t h e b r ai n , t h e gl i a, p o s s e s s e s s p e c i f i c
i n s u l i n r e c e p t o r s wi t h s t r u c t u r al an d f u n c t i o n al p r o p e r t i e s t y p i c al
o f t h e t ar ge t t i s s u e s f o r i n s u l i n . I mp o r t an t l y , a me t ab o l i c e f f e c t
I n s u l i n R e c e p t o r o f Hu man C e r e b r al Gl i o mas 1 0 0 3
A B C D E F G H I I
- 2 0 0
k D
- 1 1 6 k D
- 9 2 k D
- 6 6
k D
- 4 5 k D
F i gu r e
8 . I n s u l i n - s t i mu l at e d
p h o s p h o r y l at i o n
o f t h e i n s u l i n r e -
c e p t o r
f r o m n o r mal h u man b r ai n
an d c e r e b r al
gl i o b l as t o ma.
P ar -
t i al l y p u r i f i e d
i n s u l i n
r e c e p t o r s
f r o m n o r mal h u man b r ai n
( 2 7 . 4
u g p r o t e i n )
an d
f r e s h l y
r e s e c t e d
gl i o b l as t o ma ( 2 5 u g p r o t e i n )
f r o m t h e s ame
p at i e n t ( c as e
n o .
4 )
we r e
p r e i n c u b at e d wi t h o u t
( l an e s
A an d
F )
o r wi t h i n s u l i n
( l an e s
B an d
G, 1 0 n g/ ml ;
C an d
H,
1 0 0
n g/ ml ;
D an d I , 1 u g/ ml ;
E an d
J , 1 0 u g/ ml )
at
2 2 0 C
f o r
3 0 mi n .
P h o s p h o r y l at i o n
r e ac -
t i o n was do n e i n t h e
p r e s e n c e
o f
( ' y _ 3 2 P )
AT P an d M n 2 +
( S e e
M e t h o ds )
f o r 1 0 mi n . I mmu n o -
p r e c i p i t at i o n ( B - 0 , 1 : 1 0 0 ) ,
S D S -
P AGE an d
au t o r adi o gr ap h y
we r e
t h e n c ar r i e d o u t .
O p t i mal s t i mu -
l at i o n o f
au t o p h o s p h o r y l at i o n o f
t h e
# - s u b u n i t o f t h e i n s u l i n r e -
c e p t o r o c c u r r e d at 1 t g/ ml
i n s u -
l i n f o r b o t h
p r e p ar at i o n s . T h e r e
was n o di f f e r e n c e i n t h e e l e c t r o -
p h o r e t i c mo b i l i t y
o f t h e
p h o s -
p h o r y l at e d
, 8 - s u b u n i t o f n o r mal
b r ai n o r t u mo r i n s u l i n
r e c e p t o r .
H
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2
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X
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1 0 0
8 0
6 0 L
4 0
2 0
0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 , 0 0 0
I N S U L I N I n g/ ml )
F i gu r e 9 . I n s u l i n - s t i mu l at e d t y r o s i n e k i n as e ac t i v i t y o f t h e i n s u l i n r e -
c e p t o r f r o m n o r mal h u man b r ai n an d c e r e b r al gl i o b l as t o ma. P ar t i al l y
p u r i f i e d i n s u l i n r e c e p t o r p r e p ar at i o n s o f n o r mal b r ai n t i s s u e an d gl i o -
b l as t o ma f r o m t h e s ame s u b j e c t ( c as e n o . 4 ) we r e p r e i n c u b at e d wi t h -
o u t o r wi t h i n s u l i n at 2 2 C f o r 3 0 mi n ( s e e M e t h o ds ) . P h o s p h o r y l a-
t i o n o f p o l y ( Gl u N ar 0 T y r 0 ) i n t h e p r e s e n c e o f ( 7 - 3 2 P ) AT P an d
M g2 e
( 2 0 mM ) was c ar r i e d o u t f o r v ar i o u s l e n gt h s o f t i me u p t o 2 0 mi n at
2 2 C ( r e ac t i o n r e mai n s l i n e ar f o r t h e i n i t i al 3 0 mi n ) . T h e t y r o s i n e k i -
n as e ac t i v i t y i n p i c o mo l e s AT P i n c o r p o r at e d p e r mi l l i gr am s u b s t r at e
p e r 1 0 mi n was p l o t t e d as p e r c e n t o f t h e max i mal v al u e s ( ac h i e v e d
wi t h 1 s g/ ml i n s u l i n ) f o r e ac h p r e p ar at i o n . T h e r e was n o s i gn i f i c an t
di f f e r e n c e i n t h e s h ap e s o f t h e i n s u l i n do s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r r e c e p -
t o r p r e p ar at i o n s f r o m t h e b r ai n t u mo r s o f o t h e r p at i e n t s . S i mi l ar q u al -
i t at i v e r e s u l t s we r e o b t ai n e d wi t h o t h e r e x o ge n o u s s u b s t r at e s , s u c h as
c as e i n ( n o t s h o wn ) .
o f i n s u l i n b i n di n g t o t h e s e r e c e p t o r s c an b e me as u r e d i n t h e
gl i o b l as t o ma c e l l s .
C r u de me mb r an e p r e p ar at i o n s f r o m gl i al t u mo r s o f o u r p a-
t i e n t s c o n t ai n e d h i gh s p e c i f i c E GF b i n di n g ac t i v i t y , as al s o r e -
p o r t e d b y L i b e r man n e t al . ( 1 5 ) . I t i s p o s s i b l e t h at e x p r e s s i o n o f
t y r o s i n e - k i n as e - c o n t ai n i n g gr o wt h f ac t o r r e c e p t o r s i s r e l at e d t o
t h e t r an s f o r mat i o n o f b r ai n gl i al c e l l s . Ho we v e r , we di d n o t f i n d
an y c o r r e l at i o n b e t we e n t h e i n s u l i n b i n di n g ( a- s u b u n i t f u n c t i o n )
o r t y r o s i n e - k i n as e ac t i v i t i e s ( , 8 - s u b u n i t f u n c t i o n ) an d gr ade o f
mal i gn an c y o f t h e b r ai n t u mo r s i n o u r s mal l gr o u p o f p at i e n t s .
N o s p e c i f i c h GH b i n di n g t o t h e t u mo r me mb r an e s c o u l d b e
me as u r e d. h GH, u n l i k e i n s u l i n an d E GF , do e s n o t s t i mu l at e
au t o p h o s p h o r y l at i o n o f i t s r e c e p t o r o r t y r o s i n e k i n as e ac t i v i t y
( 3 5 ) t o war ds e x o ge n o u s s u b s t r at e s .
I n s u mmar y , t h e i n s u l i n r e c e p t o r s o f t h e c u l t u r e d h u man
gl i o b l as t o ma c e l l l i n e an d f r e s h l y i s o l at e d h u man b r ai n t u mo r s
o f gl i al o r i gi n ar e i n di s t i n gu i s h ab l e f r o m t h e t y p i c al p e r i p h e r al
r e c e p t o r s o f t ar ge t t i s s u e s f o r i n s u l i n . T h e i n s u l i n r e c e p t o r o f t h e
n o r mal h u man b r ai n di f f e r s f r o m t h e p e r i p h e r al r e c e p t o r i n t h e
e l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y o f i t s a- s u b u n i t as we l l as i t s f ai l u r e t o
r e s p o n d t o n e u r ami n i das e t r e at me n t , as was p r e di c t e d b y t h e
r o de n t b r ai n mo de l .
Ac k n o wl e dgme n t s
W e ar e gr at e f u l f o r t h e s k i l l f u l t e c h n i c al as s i s t an c e o f M ar i a T e r r y , an d
c o n t i n u e d e n c o u r age me n t b y D r . P h i l l i p Go r de n . W e de e p l y ap p r e c i at e
1 0 0 4 G. Gr u n b e r ge r , W . L . L o we , J r . , A. M c E l du f f J an d R . P . Gl i c k
_ _ 4
o q P 4 E .
n o r mal b r ai n
gl i o b l as t o ma
I
. i -
t h e c o l l ab o r at i o n o f D r s . J . B r e s s l e r , ' E . H. O l df i e l d, an d A. Hi r s c h f e l d
i n s u p p l y i n g t h e c u l t u r e d c e l l s an d f r e s h l y i s o l at e d b r ai n t u mo r s .
R e f e r e n c e s
1 . V an S c h r av e n di j k , C . F . H. , E . L . Ho o gh e - P e t e r s , P . D e M e y t s ,
an d D . G. P i p e l e e r s . 1 9 8 4 . I de n t i f i c at i o n an d c h ar ac t e r i z at i o n o f i n s u l i n
r e c e p t o r s o n f o e t al - mo u s e b r ai n - c o r t i c al c e l l s . B i o c h e m. J . 2 2 0 : 1 6 5 - 1 7 2 .
2 . P o t au , N . , E . R i u do r , an d A. B al l ab r i ga. 1 9 8 1 . I n s u l i n r e c e p t o r s
i n h u man b r ai n i n r e l at i o n t o ge s t at i o n al age . I n C u r r e n t V i e ws o n I n s u l i n
R e c e p t o r s . D . An dr e an i , R . D e P i r r o , R . L au r o , J . O l e f s k y , an d J . R o t h .
Ac ade mi c P r e s s . L o n do n / N e w Y o r k . 4 2 2 - 4 2 7 .
3 . R h o ads , D . E . , R . J . D i R o c c o , L . D . O s b u r n , N . A. P e t e r s o n , an d
E . R agh u p at h y . 1 9 8 4 . S t i mu l at i o n o f s y n ap t o s o mal u p t ak e o f n e u r o -
t r an s mi t t e r ami n o ac i ds b y i n s u l i n : p o s s i b l e r o l e o f i n s u l i n as a n e u r o -
mo du l at o r . B i o c h e m. B i o p h y s . R e s . C o mmu n . 1 1 9 : 1 1 9 8 - 1 2 0 4 .
4 . Hav r an k o v a, J . , J . R o t h , an d M . J . B r o wn s t e i n . 1 9 7 9 . C o n c e n t r a-
t i o n s o f i n s u l i n an d o f i n s u l i n r e c e p t o r s i n t h e b r ai n ar e i n de p e n de n t o f
p e r i p h e r al i n s u l i n l e v e l s . S t u di e s o f o b e s e an d s t r e p t o z o t o c i n - t r e at e d r o -
de n t s . J . C l i n . I n v e s t . 6 4 : 6 3 6 - 6 4 2 .
5 . Hav r an k o v a, J . , J . R o t h , an d M . B r o wn s t e i n . 1 9 7 8 . I n s u l i n r e c e p -
t o r s ar e wi de l y di s t r i b u t e d i n t h e c e n t r al n e r v o u s s y s t e m o f t h e r at . N at u r e
( L o n d. ) . 2 7 2 : 8 2 7 - 8 2 9 .
6 . D e v as k ar , S . U . , an d N . Ho l e k amp . 1 9 8 4 . I n s u l i n do wn r e gu l at e s
n e o n at al b r ai n i n s u l i n r e c e p t o r s . B i o c h e m. B i o p h y s . R e s . C o mmu n . 1 2 0 :
3 5 9 - 3 6 7 .
7 . Zah n i s e r , N . R . , M . B . Go e n s , P . J . Han away , an d J . V . V i n y c h .
1 9 8 4 . C h ar ac t e r i z at i o n an d r e gu l at i o n o f i n s u l i n r e c e p t o r s i n r at b r ai n .
J . N e u r o c h e m. 4 2 : 1 3 5 4 - 1 3 6 2 .
8 . B o y d, F . T . , J r . , an d M . K . R ai z ada. 1 9 8 3 . E f f e c t s o f i n s u l i n an d
t u n i c amy c i n o n n e u r o n al i n s u l i n r e c e p t o r s i n c u l t u r e . Am. J . P h y s i o l .
2 4 5 : C 2 8 3 - C 2 8 7 .
9 . Gamme l t o f t , S . , A. K o wal s k i , M . F e h l man n , an d E . V an O b -
b e r gh e n . 1 9 8 4 . I n s u l i n r e c e p t o r s i n r at b r ai n : i n s u l i n s t i mu l at e s p h o s -
p h o r y l at i o n o f i t s r e c e p t o r , 8 - s u b u n i t . F E B S ( F e d. E u r . B i o c h e m. S o c . )
L e t t . 1 7 2 : 8 7 - 9 0 .
1 0 . He i de n r e i c h , K . A. , N . R . Zah n i s e r , P . B e r h an u , D . B r an de n b u r g,
an d J . M . O l e f s k y . 1 9 8 3 . S t r u c t u r al di f f e r e n c e s b e t we e n i n s u l i n r e c e p t o r s
i n t h e b r ai n an d p e r i p h e r al t ar ge t t i s s u e s . J . B i o l . C h e m. 2 5 8 : 8 5 2 7 - 8 5 3 0 .
1 1 . He n dr i c k s , S . A. , C . - D . Agar dh , S . I . T ay l o r , an d J . R o t h . 1 9 8 4 .
U n i q u e f e at u r e s o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r i n r at b r ai n . J . N e u r o c h e m. 4 3 :
1 3 0 2 - 1 3 0 9 .
1 2 . Y i p , C . C . , M . L . M o u l e , an d C . W . T . Y e u n g. 1 9 8 0 . C h ar ac t e r -
i z at i o n o f i n s u l i n r e c e p t o r s u b u n i t s i n b r ai n an d o t h e r t i s s u e s b y p h o -
t o af f i n i t y l ab e l i n g. B i o c h e m. B i o p h y s . R e s . C o mmu n . 9 6 : 1 6 7 1 - 1 6 7 8 .
1 3 . R e e s - J o n e s , R . W . , S . A. He n dr i c k s , M . Q u ar u m, an d J . R o t h .
1 9 8 4 . T h e i n s u l i n r e c e p t o r o f r at b r ai n i s c o u p l e d t o t y r o s i n e k i n as e
ac t i v i t y . J . B i o l . C h e m. 2 5 9 : 3 4 7 0 - 3 4 7 4 .
1 4 . C l ar k e , D . W . , F . T . B o y d, J r . , M . S . K ap p y , an d M . K . R ai z ada.
1 9 8 4 . I n s u l i n b i n ds t o s p e c i f i c r e c e p t o r s an d s t i mu l at e s 2 - de o x y - D - gl u c o s e
u p t ak e i n c u l t u r e d gl i al c e l l s f r o m r at b r ai n . J . B i o l . C h e m. 2 5 9 : 1 1 6 7 2 -
1 1 6 7 5 .
1 5 . L i b e r man n , T . A. , N . R az o n , A. D . B ar t al , Y . Y ar de n , J . S c h l e s -
s i n ge r , an d H. S o r e q . 1 9 8 4 . E x p r e s s i o n o f e p i de r mal gr o wt h f ac t o r r e -
c e p t o r s i n h u man b r ai n t u mo r s . C an c e r R e s . 4 4 : 7 5 3 - 7 6 0 .
1 6 . L i b e r man n , T . A. , H. R . N u s b au m, N . R az o n , R . K r i s , I . L ax ,
H. S o r e q , N . W h i t t l e , M . D . W at e r f i e l d, A. U l l r i c h , an d J . S c h l e s s i n ge r .
1 9 8 5 . Amp l i f i c at i o n , e n h an c e d e x p r e s s i o n an d p o s s i b l e r e ar r an ge me n t
o f E GF r e c e p t o r ge n e i n p r i mar y h u man b r ai n t u mo r s o f gl i al o r i gi n .
N at u r e ( L o n d. ) . 3 1 3 : 1 4 4 - 1 4 7 .
1 7 . Gr u n b e r ge r , G. , R . J . C o mi , S . I . T ay l o r , an d P . Go r de n . 1 9 8 4 .
T y r o s i n e k i n as e ac t i v i t y o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r o f p at i e n t s wi t h T y p e A
e x t r e me i n s u l i n r e s i s t an c e : s t u di e s wi t h c i r c u l at i n g mo n o n u c l e ar c e l l s
an d c u l t u r e d l y mp h o c y t e s . J . C l i n . E n do c r i n o l . M e t ab . 5 9 : 1 1 5 2 - 1 1 5 8 .
1 8 . He do , J . A. , L . C . Har r i s o n , an d J . R o t h . 1 9 8 1 . B i n di n g o f i n s u l i n
r e c e p t o r s t o l e c t i n s : e v i de n c e f o r c o mmo n c ar b o h y dr at e de t e r mi n an t s
o n s e v e r al me mb r an e r e c e p t o r s . B i o c h e mi s t r y . 2 0 : 3 3 8 5 - 3 3 9 3 .
1 9 . Gr u n b e r ge r , G. , an d P . Go r de n . 1 9 8 2 . Af f i n i t y al t e r at i o n o f i n s u l i n
r e c e p t o r i n du c e d b y a p h o r b o l e s t e r . Am. J . P h y s i o l . 2 4 3 : E 3 1 9 - E 3 2 4 .
2 0 . R o b e r t , A. , G. Gr u n b e r ge r , J . - L . C ar p e n t i e r , J . - M . D ay e r , L .
O r c i , an d P . Go r de n . 1 9 8 4 . T h e i n s u l i n r e c e p t o r o f a h u man mo n o c y t e -
l i k e c e l l l i n e : c h ar ac t e r i z at i o n an d f u n c t i o n . E n do c r i n o l o gy . 1 1 4 : 2 4 7 -
2 5 3 .
2 1 . K o s mak o s , F . , an d J . R o t h . 1 9 8 0 . I n s u l i n - i n du c e d l o s s o f t h e
i n s u l i n r e c e p t o r i n I M - 9 l y mp h o c y t e s . J . B i o l . C h e m. 2 5 5 : 9 8 6 0 - 9 8 6 9 .
2 2 . Zi c k , Y . , M . K as u ga, C . R . K ah n , an d J . R o t h . 1 9 8 3 . C h ar ac -
t e r i z at i o n o f i n s u l i n - me di at e d p h o s p h o r y l at i o n o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r
i n a c e l l - f r e e s y s t e m. J . B i o l . C h e m. 2 5 8 : 7 5 - 8 0 .
2 3 . L ae mml i , U . K . 1 9 7 0 . C l e av age o f s t r u c t u r al p r o t e i n s du r i n g t h e
as s e mb l y o f t h e h e ad o f b ac t e r i o p h age T 4 . N at u r e ( L o n d. ) . 2 2 7 : 6 8 0 - 6 8 5 .
2 4 . P i l c h , P . F . , an d M . P . C z e c h . 1 9 8 0 . T h e s u b u n i t s t r u c t u r e o f t h e
h i gh af f i n i t y i n s u l i n r e c e p t o r : e v i de n c e f o r a di s u l f i de - l i n k e d r e c e p t o r
c o mp l e x i n f at c e l l an d l i v e r p l as ma me mb r an e s . J . B i o l . C h e m. 2 5 5 :
1 7 2 2 - 1 7 3 1 .
2 5 . S c at c h ar d, G. 1 9 4 9 . T h e at t r ac t i o n o f p r o t e i n s f o r s mal l mo l e c u l e s
an d i o n s . An n . N Y Ac ad. S c i . 5 1 : 6 6 0 - 6 7 2 .
2 6 . K ah n , C . R . 1 9 8 3 . T h e i n s u l i n r e c e p t o r an d i n s u l i n : t h e l o c k an d
k e y t o di ab e t e s . C l i n . R e s . 3 1 : 3 2 6 - 3 3 5 .
2 7 . R o s e n , 0 . M . , R . He r r e r a, Y . O l o we , L . M . P e t r u z z e l l i , an d
M . H. C o b b . 1 9 8 3 . P h o s p h o r y l at i o n ac t i v at e s t h e i n s u l i n r e c e p t o r t y r o s i n e
p r o t e i n k i n as e . P r o c . N at l . Ac ad. S c i . U S A. 8 0 : 3 2 3 7 - 3 2 4 0 .
2 8 . Gr u n b e r ge r , G. , Y . Zi c k , J . R o t h , an d P . Go r de n . 1 9 8 3 . P r o t e i n
k i n as e ac t i v i t y o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r i n h u man c i r c u l at i n g an d c u l t u r e d
mo n o n u c l e ar c e l l s . B i o c h e m. B i o p h y s . R e s . C o mmu n . 1 1 5 : 5 6 0 - 5 6 6 .
2 9 . Gr u n b e r ge r , G. , Y . Zi c k , an d P . Go r de n . 1 9 8 4 . D e f e c t i n p h o s -
p h o r y l at i o n o f i n s u l i n r e c e p t o r s i n c e l l s f r o m an i n s u l i n - r e s i s t an t p at i e n t
wi t h n o r mal i n s u l i n b i n di n g. S c i e n c e ( W as h . D C ) . 2 2 3 : 9 3 2 - 9 3 4 .
3 0 . P i l l i o n , D . J . , J . F . Has k e l l , an d E . M e e z an . 1 9 8 2 . C e r e b r al c o r t i c al
mi c r o v e s s e l s : an i n s u l i n - s e n s i t i v e t i s s u e . B i o c h e m. B i o p h y s . R e s . C o m-
mu n . 1 0 4 : 6 8 6 - 6 9 2 .
3 1 . Has k e l l , J . F . , E . M e e z an , an d D . J . P i l l i o n . 1 9 8 5 . I de n t i f i c at i o n
o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r o f c e r e b r al mi c r o v e s s e l s . Am. J . P h y s i o l . 2 4 8 :
E 1 1 5 - E 1 2 5 .
3 2 . C h e r q u i , G. , M . C ar o n , J . C ap e au , an d J . P i c ar d. 1 9 8 2 . C ar b o -
h y dr at e de t e r mi n an t s i n v o l v e d i n b o t h t h e b i n di n g an d ac t i o n o f i n s u l i n
i n r at adi p o c y t e s . M o l . C e l l E n do c r . 2 8 : 6 2 7 - 6 4 3 .
3 3 . C u at r e c as as , P . , an d G. I l l i an o . 1 9 7 1 . M e mb r an e s i al i c ac i d an d
t h e me c h an i s ms o f i n s u l i n ac t i o n i n adi p o s e t i s s u e c e l l s . J . B i o l . C h e m.
2 4 6 : 4 9 3 8 - 4 9 4 6 .
3 4 . M c E l du f f , A. , G. Gr u n b e r ge r , an d P . Go r de n . 1 9 8 5 . An al t e r at i o n
i n ap p ar e n t mo l e c u l ar we i gh t o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r f r o m t h e h u man
mo n o c y t e c e l l l i n e ( U - 9 3 7 ) . D i ab e t e s . 3 4 : 6 8 6 - 6 9 0 .
3 5 . As ak awa, K . , G. Gr u n b e r ge r , A. M c E l du f f , an d P . Go r de n . 1 9 8 5 .
P o l y p e p t i de h o r mo n e r e c e p t o r p h o s p h o r y l at i o n : i s t h e r e a r o l e i n r e c e p t o r -
me di at e d e n do c y t o s i s o f h u man gr o wt h h o r mo n e ? E n do c r i n o l o gy . 1 1 7 :
6 3 1 - 6 3 7 .
I n s u l i n R e c e p t o r o f Hu man C e r e b r al Gl i o mas 1 0 0 5