Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014

Hal. 42-52

BIOPROSPEKSI RHIZOBAKTERI PENGHASIL IAA (Indole Acetic Acid)

DARI TANAMAN JAGUNG (Zea maysL.) DI AREA PERTANIAN SEMI
ORGANIK DESA BATURKEC. GETASAN KAB. SEMARANG

Khoirul Huda, Anto Budiharjo1, Budi Raharjo 1

1. Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Tembalang,
Semarang50275 Telepon (024)7474754; Fax. (024)76480690
email: suksesirul@yahoo.com

ABSTRACT

Microorganisms in nature have a rich diversity and have an important role in human lives,
especially in agriculture. Some types of bacteria live in the area of plant roots called rhizobacteria. Some
rhizobacteria has the ability to stimulate the growth of crops such as produce IAA (Indole Acetic Acid).
This study aims to find rhizobacteria in maize (Zea mays L.) which has the ability to produce IAA
(Indole Acetic Acid) that can be used as a reference in rhizobacteria resource utilization to increase
agricultural production in a sustainable and environmentally friendly.This study was conducted with
bacterial isolation, characterization of bacterial isolates in colony and cell morphology, The test of
rhizobacteria’s ability to produce IAA (Indole Acetic Acid), the molecular identification of the isolates
were able to produce IAA rhizobacteria and confirmatory tests. The results of isolation obtained
seventeen isolates of rhizobacteria where there is a one of isolate (J.6) is able to produce 20.5 ppm IAA in
TSB (Tryptic Soy Broth) supplemented with 100 ppm of L-tryptophan. The Result of the molecular
identification show that isolate which has the ability to produce IAA has 97% similarity with Bacillus
safensis Strain A-2. Isolate “J.6” have the same characteristic features with Bacillus safensis. They are a
gram-positive, rod-shaped, capable of forming endospores, motile, catalase positive, capable of
fermenting glucose and hydrolyzing a starch.

Key word : Rhizobacteria, Indole Acetic Acid, Bacillus safensis Strain A-2

ABSTRAK

Mikroorganisme di alam memiliki keanekaragaman yang berlimpah dan memiliki peranan yang
penting dalam kehidupan manusia, khususnya dalam bidang pertanian. Beberapa jenis bakteri hidup di
area perakaran tanaman yang disebut dengan rhizobakteri. Beberapa rhizobakteri mempunyai kemampuan
dalam memacu pertumbuhan tanaman seperti menghasilkan IAA (Indole Acetic Acid). Penelitian ini
bertujuan untuk mencari rhizobakteri pada tanaman jagung (Zea mays L.) yang mempunyai kemampuan
dalam menghasilkan IAA (Indole Acetic Acid) sehingga bisa dijadikan sebagai acuan dalam pemanfaatan
sumber daya rhizobakteri untuk meningkatkan produksi pertanian secara berkelanjutan dan ramah
lingkungan. Penelitian ini dilakukan dengan isolasi bakteri, karakterisasi isolat bakteri secara morfologi
koloni dan sel, uji kemampuan rhizobakteri dalam menghasilkan IAA (Indole Acetic Acid), identifikasi
secara molekuler isolat rhizobakteri yang mampu menghasilkan IAA dan uji konfirmasi. Hasil isolasi
diperoleh tujuh belas isolat rhizobakteri dimana terdapat satu isolat rhizobakteri (J.6) yang mampu
menghasilkan 20,5 ppm IAA pada medium TSB (Tryptic Soy Broth) yang disuplementasi dengan 100
ppm L-triptofan. Hasil identifikasi secara molekuler menunjukan isolat yang mampu menghasilkan IAA
tersebut mempunyai kemiripan 97% dengan Bacillus safensis Strain A-2. Isolat J.6 mempunyai ciri
karakteristik yang sama denganBacillus safensis yaitu merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang,
mampu membentuk endospora, bersifat motil, katalase postif, mampu memfermentasi glukosa
sertamenghidrolisis pati.

Kata kunci :Rhizobakteri, Indole Acetic Acid, Bacillus safensisStrain A-2

PENDAHULUAN keanekaragaman hayati, termasuk keanekargaman

Indonesia merupakan negara jenis mikroorganisme. Mikroorganisme di alam
megadiversitas yang sangat kaya akan memiliki keanekaragaman yang berlimpah dan
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

memiliki perananan yang penting dalam (TSA), Tryptic Soybroth(TSB),H2O23 %, larutan

kehidupan manusia, khususnya dalam bidang Hucker’s kristal violet (gram A), larutan mordab
pertanian. lugol’s iodine (gram B), larutan aklkohol aceton
Berbagai spesies bakteri hidup di area (Gram C), larutan cat safrafin (gram D), reagen
perakaran tanaman yang disebut sebagai Salkowski, kaca objek, gelas penutup, minyak
rhizobakteri dan diantaranya mempunyai imersi, DNA marker, etidium bromide (EtBr),
kemampuan dalam memacu pertumbuhan agarosa 0,8 %, alkohol, etanol, L-Triptofan,
tanaman disebut PGPR.PGPR (Plant Growth membran filter 0,45 µm, kapas, kasa, spirtus,
Promoting Rhizobacteria) merupakan mikroba tissue dan alumunium foil.
yang mempunyai peranan menambat N2; Peralatan yang digunakan dalam
menghasilkan hormon tumbuh (seperti: IAA, penelitian ini antara lain: cawan petri, tabung
giberelin, sitokinin, etilen); menekan penyakit reaksi, erlenmeyer, tabung durham, rak tabung,
tanaman asal tanah dengan memproduksi inkubator, autoklaf, laminar air flow, jarum ose,
siderofor, glukanase, kitinase, sianida; dan penangas air, gelas beker, gelas ukur, pipet tetes,
melarutkan hara lainnya (Surtiningsih dan mikro pipet, rotary shaker, vortex, tip, cuvet,
Mariam , 2011). bunsen, mikro pipet, mikroskop, eppendorf,
Aryantha, dkk. (2004) dan Agustian, dkk. polymerase chain
(2010) menyebutkan bahwa IAA (Indole Acetic reaction(PCR),elektroforesis,nampan,
Acid) merupakan hormon kunci berbagai aspek nanospektrofotomete, sentrifuge,mikrosentrifuge,
pertumbuhan dan perkembangan tanaman neraca ohaus, milipore filter, dan uv
sehingga alasan sintesisnya oleh jenis bakteri transluminator.
tertentu merupakan salah satu alasan terjadinya
peningkatan pertumbuhan tanaman. Hormon IAA Cara Kerja
merupakan senyawa yang dalam jumlah sedikit Pengambilan Sampel
tetapi dapat berpengaruh besar terhadap Sampel yang diambil berupa tanah di
pertumbuhan dan produksi tanaman.IAA (Indole sekitar perakaran jagung. Pengambilan sampel
Acetic Acid) berfungsi mendorong pemanjangan dilakukan pada 3 titik dari rhizosfer dengan
sel serta menambah kemampuan sel dalam kedalaman 10-15 cm. Pengukuran temperatur,
menyerap air, sehingga dapat meningkatkan ketinggian lokasi sampel, kelembaban dan pH
potensial air jaringan akibatnya sel akan tanah pada titik pengambilan sampel tanah
mengalami pemanjangan. rhizosfer. Sampel tanah diperoleh dari pertanian
Mengacu pada konsep sistem pertanian organik Dusun Selongisor Desa Batur Kec.
organik, prospek pemanfaatan mikroorganisme Getasan Kabupaten Semarang.
sebagai biostimulants, biofertilizers dan
bioprotectants menjadi penting untuk dikaji. Isolasi Rhizobakteri
Bioprospeksi rhizobakteri yang meliputi Isolasi rhizobakter menggunakan metode
serangkaian kegiatan isolasi, koleksi dan Ammouneh et al. (2010) yang dimodifikasi.
pemanfaatan sumber daya genetik penting untuk Sampel yang berupa 5 g tanah yang melekat
dilakukan guna mendapatkan produk alamiah dipermukaan akar dimasukkan dalam labu
yang mampu membangun pertanian Indonesia. erlemeyer berisi 45 ml aquades steril dishaker
dengan kecepatan 200 rpm selama 4 jam
METODOLOGI kemudian dipanaskan hingga suhu 800C selama
30 menit. Suspensi yang diperoleh diencerkan
Tempat dan Waktu Penelitian kembali hingga didapat pengenceran 10-6.
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret Pengambilan 100 µL dari suspensi pada tingkat
2014 sampai Juni 2014 di Laboratorium 10-4, 10-5, dan 10-6 dalam cawan petri steril berisi
Bakteriologi, Laboratorium Terpadu Universitas medium TSA . Kultur diinkubasikan pada suhu
Diponegoro, Semarang. ruang sampai tampak pertumbuhan koloni–koloni
pada permukaan medium selama 48 jam. Koloni
Bahan dan Alat yang tumbuh kemudian dipisahkan pada cawan
Bahan yang digunakan dalam penelitian petri yang berbeda yang berisi medium TSA
ini antara lain: Sampel tanah pertanian organik, berdasarkan perbedaan morfologi koloni sehingga
akuades, Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Agar didapat kultur murni. Kultur murni yang telah
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

didapatkan dipindahkan ke agar miring sebagai warna dari kuning menjadi menjadi merah.
kultur kerja. Absorbansi diukur dengan menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 530
Karakterisasi Morfologi Koloni dan Sel nm. Jumlah IAA dihitung dengan menggunakan
Karakterisasi morfologi koloni kurva standar.
rhizobakteri dilakukan berdasarkan petunjuk
Cappucino & Sherman (1987) yaitu pengamatan Identifikasi Molekuler
koloni rhizobakteri yang meliputi warna koloni, Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan
ukuran koloni , tepian koloni , bentuk koloni , dan metode Chelex (Walsh et al., 2013). Metode ini
elevasi . dilakukan dengan cara memasukkan 3 ose kultur
Pengamatan morfologi sel dilakukan bakteri ke dalam mikrotube yang telah berisi 100
dengan pewarnaan gram (Cappucino & Sherman, µL ddH2O kemudian ditambah 1 ml saponin 0,5
1987). Pewarnaan gram dilakukan dengan % dalam PBS 1 X kemudian diinkubasi selama 24
membersihkan gelas benda dengan alkohol jam pada suhu 4 0C. Setelah 24 jam, sel bakteri
sehingga bebas lemak, kemudian dipanggang di yang telah direndam dalam saponin kemudian
atas nyala bunsen. Preparat apusan bakteri dibuat disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit.
dengan mengambil secara aseptik 1 ose suspensi Supernatan dibuang kemudian natan ditambah
biakan bakteri lalu diratakan di atas permukaan 100 µL ddH2O dan 50 µL 20% chelex secara
gelas benda kira-kira seluas 1 cm2. Olesan bakteri aseptis. Suspensi dididihkan selama 10 menit dan
diberi 2-3 tetes pewarna Kristal violet (gram A) divorteks setiap 5 menit. Suspensi kemudian
dan dibiarkan selama 1 menit. Zat warna berlebih disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan
dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. 12.000 rpm. Supernatan yang mengandung DNA
Olesan bakteri digenangi dengan 2 tetes larutan diambil dan dipindahkan pada eppendorf bersih.
lugol iodin (gram B), dibiarkan selama 1 menit. Kuantitas DNA hasil ekstraksi diukur dengan
Zat warna berlebih dicuci dengan air mengalir dan menggunakan nanospektrofotometer. Supernatan
dikeringanginkan. Olesan dicuci dengan larutan merupakan DNA yang siap digunakan untuk
alkohol aseton (gram C) selama 30 detik. Zat proses PCR.
pewarna berlebih dibilas dengan air mengalir dan Amplifikasi PCR dengan 16S rRNA
dikeringanginkan. Olesan diberi cat safranin mengggunakan metode Lee et al. (2006). Volume
(gram D) selama 2 menit, dicuci dengan air formula yang diamplifikasi PCR adalah sebesar
mengalir dan dikeringanginkan. Preparat diamati 50 µL yang terdiri dari 3 µL DNA, 1,5 µL primer
dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat 27F, 1,5 µL primer 1492R, 25 µL kit promega dan
(1000x) menggunakan minyak emersi. Bakteri 19 µL ddH2O. Perlakuan temperatur yang
gram negatif akan berwarna merah, sedangkan digunakan pada PCR ini adalah : pradenaturasi
gram positif akan berwarna ungu. yaitu memanaskan DNA supaya untai ganda DNA
terpisah pada 950C selama 3 menit, kemudian 30
Uji Kemampuan Rhizobakteri dalam siklus (denaturasi pada 950C selama 1 menit,
Menghasilkan IAA annealing pada 55 0C selama 1 menit, dan
extension pada 72 0C selama 1 menit), final
Pengukuran kemampuan rhizobakteri extension pada 72 0C selama 7 menit. Primer yang
dalam menghasilkan IAA menggunakan metode digunakan untuk PCR 16S rRNA adalah primer
Gordon dan Weber (Miliute dan Buzaite, 2011) universal 27F (5’-
dengan menggunakan reagen ferri klorida-asam AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan primer
perklorat (FeCl3-HCLO4) 1 ml isolat bakteri 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’).
dinokulasikan pada 20 ml medium TSB yang Visualisasi produk PCR 16S rRNA
diperkaya dengan 100 ppm L-triptofan diinkubasi dilakukan mengguakan analisis elektroforesis
selama 2 hari dalam kondisi dishaker 120 rpm. 1,5 dengan cara memasukkan 5 µl produk PCR
ml kultur bakteri selanjutnya disentrifugasi dengan ditambahkan 1 µl loading dye ke dalam
dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. sumuran gel agarose 0,8 % yang telah direndam
Supernatan diambil dan ditambahkan reagen larutan buffer TAE 0,5 x, gel kemudian
salkowski dengan perbandingan (1:2) dan dielektroforesis dengan voltase sebesar 100 V
diinkubasi selama 25 menit pada suhu kamar. selama 30 menit. Gel kemudian direndam
Supernatan yang mengandung IAA akan berubah ethidium bromida selama 20 menit untuk
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

mewarnai pita DNA yang terperangkap pada gel. dapat dilihat dalam tabung durham (Pyar & Peh,
Terakhir, pita hasil PCR dilihat menggunakan alat 2014).
Gel Doc. Uji hidrolisis pati dilakukan dengan
Produk PCR yang diperoleh diuji untuk menggunkan medium agar pati. Medium dalam
penentuan sekuens 16S rRNA. Sekuens yang cawan petri yang telah diinokulasikan isolat
diperoleh dianalisis dengan menyejajarkan urutan bakteri dan diinkubasi pada suhu ruang selam 24
nukleotida dengan sekuens yang diduga terdapat jam. Setelah terlihat adanya pertumbuhan, larutan
dalam genbank menggunakan program MEGA 5, iodium/lugol diteteskan disekitar koloni.
kemudian daerah yang memiliki kesamaan urutan Terbentuknya zona bening disekitar koloni
sekuens dianalisis kembali menggunakan menandakan terkadinya hidrolisis pati oleh enzim
penyejajaran yang terdapat dalam fasilitas amilase (Cappuccino & Sherman, 1987).
penyejajaran Basic Local Alignment Search Tool Pengamatan spora menggunakan metode
(BLAST) untuk menentukan persentase kesamaan Klein (Bonang dan Koeswardono, 1982). Iisolat
pasangan basa dengan isolat referensi yang bakteri dibuat suspensi sehingga menyerupai air
terdapat di gen bank. susu. Suspensi kemudian ditambahkan dengan
fushin karbol dalam jumlah yang sama banyaknya
Uji Konfirmasi Karakteristik Isolat Penghasil dengan suspensi. Campuran suspensi dipanaskan
IAA dengan api selama 6 menit kemudian dibuat
Isolat penghasil IAA yang telah sediaan. Sediaan dikeringanginkan dan
diidentifikasi secara molekuler, kemudian diuji direkatkan. Sedian dicelupkan ke dalam larutan
beberapa karakteristik yang dimiliki. Uji yang H2SO4 1% selam 2-3 detik kemudian dicuci
dilakukan meliputi uji motilitas, uji katalase, uji dengan air. Sediaan ditetesi dengan larutan biru
fermentasi karbohidrat, uji hidrolisis pati, dan metilen selama 2-4 menitkemudian dicuci dengan
pewarnaan endospora. air dan dikeringkan.
Uji motilitas dilakukan dengan
diinokulasikanya ujung ose lurus yang HASIL DAN PEMBAHASAN
mengandung isolat bakteri kedalam medium TSB
yang mengandung agar 0,5 % (agar lunak). Diperoleh 17 isolat rhizobakteri dari
Selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang rhizosfer tanaman jagung di area pertanian semi
selama dua hari. Bila pertumbuhan menyebar, organik Desa Batur Kec. Getasan Kab. Semarang.
maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan Isolat yang diperoleh dikarakterisasi berdasarkan
bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya kenampakan morfologi koloni dan sel (Lihat
berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat Tabel 1). Semua isolat yang diperoleh termasuk
tidak bergerak (non motil) (Savitri, 2006). kelompok bakteri gram positif dan berbentuk
Uji katalase diamati dengan mengambil batang. Isolat yang diperoleh kebanyakan
sedikit biakan bakteri yang diletakan pada gelas berwarna putih dengan tingkat kecerahan yang
obyek kemudian diteteskan beberapa tetes larutan berbeda-beda dan berbetuk circuler.
H2O2 3% diatas gelas obyek tersebut. Hasil positif Semua isolat yang diperoleh diuji
pada uji katalase ditunjukkan dengan munculnya kemampuanya dalam menghasilkan IAA (Indole
gelembung udara (O2) di dalam larutan H2O2 Acetic Acid) dengan menginokulasikan 1 ml
berarti bakteri memiliki enzim katalase kultur isolat rhizobakteri pada medium TSB yang
(Cappucino & Sherman, 1987). diperkaya dengan 100 ppm L-triptofan. . Hasil uji
Pengujian fermentasi karbohidrat dapat menunjukan isolat J.6 mampu menghasilkan
diamati menggunakan phenol red indicator. Uji IAA (Lihat Tabel 2). Isolat J.6 terbukti mampu
fermentasi karbohidrat dengan menggunkan menghasilkan IAA terlihat dari adanya perubahan
medium glukosa 0,1 %. 5 ml medium glucose warna dari kuning menjadi merah muda pada
broth ditempatkan dalam tabung reaksi dan sampel yang telah ditambah reagen salkowski
didalamnya terdapat tabung durham. Bakteri yang (Gambar 1).
diuji, diinokulasikan pada medium tersebut, Kemampuan isolat J.6 dalam
kemudian diinkubasi pada temperatur yang sesuai menghasilkan IAA dihitung dengan menggunakan
selama 48 jam. Bakteri yang mampu kurva standar yang sudah dibuat . Isolat J.6
memfermentasi dengan menghasilkan asam mampu menghasilkan 20,1 ppm IAA pada
ditunjukan dengan perubahan warna medium medium TSB yang diperkaya dengan 100 pmm L-
setelah diinkubasi menjadi kuning dan adanya gas
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

triptofan yang diinkubasi selama 2 Kemampuan bakteri dalam menghasilkan

hari.Kemampuan isolat J.6 dalam menghasilkan IAA berbeda-beda, hal itu menurut Widyawati
IAA termasuk dalam katagori tinggi. Menurut (2008) disebabkan karena adanya perbedaan jalur
Widyawati (2008) bakteri masuk dalam katagori atau mekanisme dalam menghasilkan
lemah dalam menghasilkan IAA apabila IAA IAA.Menurut Kawaguchi dan Syono (1996) dan
yang dihasilkan kurang 10 ppm. Bakteri yang Speapen dan Vanderleyden (2010) biosinteis IAA
mampu menghasilkan IAA antara 10-20 ppm oleh prokariot bisa terjadi melaui dua jalur yaitu
dikatagorikan sedang dan bakteri masuk dalam Indole-3-Acetamide Pathway (IAM) dan Indole-3-
katagori tinggi kemapuanya dalam menghasilkan Pyruvate Pathway (IPyA).
IAA apabila yang dihasilkan lebih dari 20 ppm.

Tabel 1. Morfologi koloni dan sel rhizobakteri dari tanaman jagung

Isolat Ukuran Warna Bentuk Margin Elevasi Gram Bentuk Sel
j.1 kecil putih-krem circuler entire raised positif basil
j.2 sedang putih circular entire flat positif basil
j.3 besar putih filamentous filiform flat positif basil
j.4 sedang putih circular entire raised positif basil
j.5 sedang putih circular entire raised positif basil
j.6 kecil putih circular entire raised positif basil
j.7 besar putih circular entire raised positif basil
j.8 kecil putih circular entire raised positif basil
j.9 point putih circular entire raised positif basil
j.10 sedang putih circulat undulate raised positif basil
j.11 besar putih rhizoid undulate raised positif basil
j.12 kecil orange circular entire raised positif basil
j.13 besar putih circular entire raised positif basil
j.14 besar putih irregular undulate raised positif basil
j.15 besar putih irregular undulate raised positif basil
j.16 point putih circular entire raised positif basil
j.17 sedang putih circular entire raised positif basil
Biosintesis IAA pada bakteri yang
menguntungkan tanaman seperti Bacillus,
Pseudomonas, Agrobacterium, dan
Enterobacter cloacae melalui jalur Indole-
3-Pyruvate Pathway (IPA). Biosintesis IAA
pada jalur Indole-3-Pyruvate Pathway
(IPA) dipengaruhi oleh ekspresi gen ipdc
sedangkan biosintesis IAA pada jalur
Indole-3-Acetamide Pathway (IAM)
dipengaruhi oleh ekspresi gen iaaM dan
iaaH dimana pada Agrobacterium
tumifaciens gen tersebut berada pada
daerah T-DNA plasmid pTi bersama
dengan gen ipt.
Gambar 1. Hasil Uji Kualitatif IAA (K(-) =
kontrol negatif, J.6 = isolat J.6,
K(+)= kontrol positif).

Menurut Widyawati (2008)

konsentrasi IAA yangdihasilkan oleh
bakteri juga tergantung kepada aktivitas dan
jumlah sel, ketersediaan nutrisi dan substrat
L-triptofan dalam media. Menurut Sofyan
(2013) semakin banyak penambahan
substrat L-triptofan maka IAA yang
dihasilkan bakteri akan meningkat.
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

Isolat J.6 yang mempunyai jumlah siklus diatas 35 siklus tidak

kemampuan dalam menghasilkan IAA memberikan efek yang postif. Produk PCR
(Indole Acetic Acid) disolasi DNA nya kemudian dielektroforesis dan hasilnya
menggunakan larutan chelex 20%. DNA divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc
murni yang diperoleh diuji secara sehingga dapat diketahui bahwa fragmen
kuantitatif menggunakan DNA isolat berukuran sebesar ± 1500 bp
nanospektrofotometer sehingga diketahui yang ditunjukan pada gambar 3.
bahwa DNA isolat J.6 yang diperoleh
adalah 184,7 ngµL-1 dengan nilai kemurnian
1,97 (Lihat Gambar 2).Menurut Fatchiyah,
dkk. (2011) nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1,8-2,0 dimana hal itu bisa diperoleh
dengan menghitung nilai absorbansi 260
nm dibagi nilai absorbansi 280 nm
(Å260/Å280). Kemurnian DNA hasil
ekstraksi sangat penting untuk tahap
selanjutnya yaitu tahap PCR karena
menurut Fatchiyah, dkk. (2011) kontaminan
pada DNA akan menghambat kinerja taq
polymerase.

Gambar 3. Visualisasi hasil amplifikasi

sekuens 16S rRNA isoalat J.6
pada konsentrasi gel agarose 0,8
% (M=marker, J.6=isolat J.6)

Produk DNA hasil PCR selanjutnya

dilakukan sequencing untuk menentukan
Gambar 2. Uji Kuantitatif DNA isolat J.6 urutan nekleotida. Hasil sekuens berupa
dengan Nanospektrofotometer
DNA murni yang diperoleh susunan basa sebanyak 1426 nukleotida.
kemudian di amplifikasi menggunakan Hasil analisis sekuen parsial gen 16 S
PCR (Polymerase Chain Reaction).Sekuens rRNA dengan BLASt-N menunjukan
yang digandakan adalah 16S rRNA dengan bahwa J.6 memiliki similaritas 97 %
menggunakan primer universal 27F dan dengan Bacillus safensisStrain A-2.
1492R. Menurut Pangastuti (2006) daerah Menurut Drancourt et al. (2000) identifikasi
16S rRNA banyak digunakan dalam
pada tingkat spesies ditetapkan dari
filogenetika, klasifikasi, dan identifikasi
untuk bakteri karena sifat keberadaanya similaritas sekuen 16S rRNA ≥ 99% dengan
yang ubikuitas dengan fungsi yang identik sekuen yang ada pada Gen Bank,
pada semua bakteri.Amplifikasi PCR DNA identifikasi pada tingkat genus dengan
isolat J.6 menggunakan 30 siklus yang similaritas ≥ 97% dan identifikasi baru
meliputi proses pradenaturasi, denaturasi, ditetapkan dengan similaritas yang lebih
annealing, ekstensi dan praekstensi. rendah dari 97 %.Setelah sekuens diurutkan
Menurut Fatchiyah, dkk. (2011) dasar
menggunakan program clustalW multiple
siklus PCR ada 30-35 siklus sedangkan
alignment maka dilanjutkan dengan
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

membuat pohon filogeni dengan Kumar et al. (2014) merupakan jenis

menggunakan program MEGA.5 sehingga rhizobakteri yang tahan terhadap salinitas
didapat pohon filogeni sebagaimana tinggi, radiasi sinar UV dan radiasi sinar
Gambar4. gamma. Kothari et al. (2013) menyebutkan
Pohon filogenik menggunakan data bahwa Bacillus safensis merupakan jenis
sekuen GenBank sebagai pembanding bakteri yang kuat dalam menghasilkan
menunjukan bahwa isolat J.6 merupakan hormon tanaman dan merupakan jenis
kelompok Bacillus dan memiliki similaritas PGPR (Plant Growth Promoting
97 % dengan Bacillus safensisstrain A-2. Rhizobacteria) yang mampu meningkatkan
Kothari et al. (2013) mengisolasi Bacillus pertumbuhan tanaman setelah
safensis dari rhizosfer tanaman jinten putih mengkolonisasi akar.
(Cuminum cyminum) di India dan Singh et Karakteristik isolat J.6
al. (2013) mengisolasi Bacillus safensis dikonfirmasikan dengan beberapa
dari umbi akar tanaman Asparagus di kebun karakteristik Bacillus safensis.
botani Universitas Punjabi India. Bacillus Pembandingan katakteristik Bacillus
safensis menurut Kothari et al. (2013) dan safensis dan isolat J.6 dilakuan berdasarkan
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

Gambar 4. Pohon filogenetik berdasarkan perbandingan sekuens16S rRNA menggunakan

analisis Neighbor-joining dengan bootstrap 100

hasil penelitian Satomi, et al. (2006) dan katalase postif. Bacillus safensis mampu
Kothari, et al. (2013). Isolat J.6 mempunyai menghasilkan asam dari medium glucose
karakteristik yang sama dengan Bacillus broth tapi tidak mampu menghasilkan gas
safensis(Tabel 2).Satomi et al. (2006) pada medium yang sama. Menurut Kothari
menyebutkan bahwa Bacillus safensis et al. (2013) Bacillus safensis merupakan
merupakan berbentuk batang dan termasuk kelompok bakteri yang berpotensi sebagai
dalam kelompok bakteri gram positif. PGPR dan kuat dalam menghasilkan
Bacillus safensis bersifat motil dan mampu fitohormon.
membentmampu membentuk endospora.
Bacillus safensis mampu menghidrolisis
pati dan termasuk dalam kelompok bakteri
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

Tabel 2. Karakteristik isolat J.6 dibandingkan dengan Bacillus safensis

Karakteristik yang diamati Sifat J.6 Bacillus safensis (Satomi et al., 2006
dan Kothari et al., 2013)
Pewarnaan Gram + +
Bentuk Batang Batang
Motiltas + +
Membentuk Endospora + +
Fermentasi glukosa
 Terbentuk Asam + +
 Terbentuk Gas (-) (-)
Hidrolsis Pati + +
Katalase + +
Kemampuan Menghasilkan + +
Fitohormon
Keterangan: tanda + berarti postif
tanda (-) berarti negatif

KESIMPULAN Aryantha, N.P., Dian, P.L. dan

Nurmi,P.D.P. 2004. Potensi Isolat
Sebanyak 17 isolat bakteri telah Penghasil IAA dalam Peningkatan
berhasil diisolasi dari rhizosfer tanaman Pertumbuhan Kecambah Kacang Hijau
jagung (Zea mays L) pada area pertanian pada Kondisi Hidroponik. Jurnal
semi organik Desa Batur Kec. Getasan Kab. Mikrobiologi Indonesia 9(2): 43-46.
Semarang dan terdapat satu isolat bakteri Bonang, G dan E.S. Koeswardono. 1982.
(J.6) yang mempunyai kemampuan Mikrobiologi Kedokteran Untuk
menghasilkan IAA (Indole Acetic Acid). Laboratorium dan Klinik. PT.
Hasil identifikasi molekuler menunjukan Gramedia. Jakarta.
bahwa isolat yang mampu menghasilkan Breed, R.S.,E.G.D. Murray and Nathan,
IAA tersebut merupakan Bacillus safensis R.S. 1957. Bergey's Manual of
Strain A-2. Isolat J.6 mempunyai Determinative Bacteriology Seventh
karakteristik yang sama denganBacillus Edition. Baltimore, Williams &
safensis. Wilkins Co.USA.
Cappucino, J. G and Sherman, N. 1987.
DAFTAR PUSTAKA Microbiology a Laboratory Manual.
Agustian, Nuriyani, Lusi, M dan Oktanis, The Benyamin/cumming Publishing
E. 2010. Rhizobakteria Penghasil Company Inc. California.
Fitohormon IAApada Rhizosfer Drancourt, M., Claude, B., Antoine, C.,
Tumbuhan Semak Karamunting, Rolland, M., Jean,P.G., and Didier,
Titonia, Dan Tanaman Pangan . J. R.2011. 16 S Ribosomal DNA
Solum. 8 (1): 49-60. Sequence Analysis of a Large
Ammouneh, H., Muhanad, H.,Emad ,I., and Collection Of Environmental and
Hayat, M. 2010. Isolation and Clinical Unidentifiable Bacterial
Characterization of Native Bacillus Isolates. Journal of Clinical
Thuringiensis Isoalats From Syrian Microbiology 30 (10): 3623-2630.
Soil and Testing of Their Insecticidal Fatchiyah, Arumningtyas, E.L., Widyarti,
Activities Against Some Insect Pests. S., dan Rahayu, S., 2011. Biologi
Turk J Agric For. 35 (2011) 421-431 Molekular Prinsip Dasar dan Analisis.
Erlangga. Jakarta.
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

Gordon, S.A and Robert, P.W.1950. Assembly-Facility Surfaces.

Colorimetric Estimation of Indole International Journal of Systematic
Acetic Acid. Plant Physiol. 30(1): 192- and Evolutionary Microbiology 56:
195. 1735–1740.
Kawaguchi, M and K. Syono. 1996. Savitri, S.D. 2006. Isolasi Dan
TheExcessiveProductionofIndole-3- Karakterisasibakteri Halotoleran Pada
ceticAcidandItsSignificance Peda Ikan Kembung (Rastrelliger sp.).
inStudiesoft Skripsi. Program Studi Teknologi
heBiosynthesisofThisRegulatorofPlant Hasil Perikanan Fakultas Perikanan
Growth andDevelopment. Plant Cell Dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Physiol. 37(8):1043-1048. Bogor, Bogor.
Kothari, V.V., R. K. Kothari, C. R. Kothari, Singh, R.S., and Singh, R.P. 2014.
V. D. Bhatt, N. M. Nathani, P. G. Response Surface Optimization of
Koringa, C. G. Joshi, B. R. M.,And Endoinulinase Roduction From a Cost
Vyas. 2013.Genome Sequence of Salt- Effective Substrate Bybacillus
Tolerant Bacillus safensis Strain VK, Safensisas-08 for Hydrolysis of Inulin.
Isolated from Saline Desert Area of Biocatalysis and Agricultural
Gujarat, India. Journal Genome Biotechnology.1(1): 1-8.
Announcements. 1 (5): 1-1. Sofyan, F.L. 2013. Kemampuan Isolat
Kumar, D., Rajinder, P.,and Vijay, K.G. Bakteri Penghasil Indole Acetic Acid
2014. Application of a statistically (IAA) daru Tanah Gambut Kabupaten
enhanced, novel, organic solvent stable Sampit Kalimantan Tengah. Skripsi.
lipase from Bacillus safensis DVL-43. Jurusan Biologi Fakultas Sains dan
International Journal of Biological Matematika Undip, Semarang.
Lee, Y.K., Hyun, J.J., end Hong, K.L. 2006. Spaepen, S and J. Vanderlaeyden. 2011.
Marine Bacteria Associated with the Auxin and Plant-Microbe
Korean Brown Alga,Undaria Interactions.Cold Spring Harb
pinnatifida. The Journal of Perspect Biology. 3(4): 1-13.
Microbiology 44(6): 694-698. Surtiningsih,T dan Mariam, S. 2011.
Miliute,I., and Odeta, B. 2011.IAA Efektifitas Campuran Pupuk Hayati
Production and Other Plant Growth Dengan Pupuk Kimia Pada
Promoting Traits of Endophytic Pertumbuhan Dan Produksi Tanaman
Bacteria From Apple Tree. Selada Bokor (Lactuca sativa,
Biologija.57(2): 98–102. L.var.Crisp). Jurnal Matematika dan
Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Ilmu pengetahuan Alam. 14(2): 4-8.
Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Walsh, P.S., David, A.M., end Russel, H.
Gen Penyandi 16s rRNA dan Gen 2013. Chelex 100 as a Medium for
Penyandi Protein.Jurnal Biodiversitas Simple Extraction of DNA for PCR-
(7) 3: 292-296 Based Typing from Forensic Material.
Pyar, P and K.K. Peh. Biotechniques 55(3): 134-139.
2014.Characterization and Widiarta, A. 2011. Analisis Keberlanjutan
Identification of Lactobacillus Praktik Pertanian Organik Di Kalangan
acidophilus Using Biolog Rapid Petani (Kasus: Desa Ketapang,
Identification System. International Kecamatan Susukan, Kabupaten
Journal of Pharmacy and Semarang, Propinsi Jawa Tengah).
Pharmaceutical Sciences 6(1):189- Skripsi.Departemen Sains Komunikasi
193. Dan Pengembangan Masyarakat
Satomi, M., Myron, T.D., and Kasthuri, V. Fakultas Ekologi Manusia Institut
2006. Bacillus safensis sp. nov., Pertanian Bogor, Bogor.
Isolated From Spacecraft and
Jurnal Biologi, Volume 3 No 3, Juli 2014
Hal. 42-52

Widiarta, A., Soeryo, A., dan Widodo. Widyawati, A. 2008. Bacillus sp. Asal
2011. Analisis Keberlanjutan Praktik Rhizosfer Kedelai Yang Berpotensi
Pertanian Organik Di Kalangan Petani. Sebagai Pemacu Pertumbuhan
Jurnal Transdisiplin Sosiologi, Tanaman Dan Biokontrol Fungi
Komunikasi, dan Ekologi Manusia Patogen Akar. Thesis. Program Studi
5(1): 71-89. Biologi Sekolah Pascasarjana IPB,
Bogor.