UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL

FACULTAD DE OCEANOGRAFÍA, PESQUERÍA Y

CIENCIAS ALIMENTARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA

ALIMENTARIA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

TEMA: BIOQUÍMICA DE LOS

MICROORGANISMOS

ALUMNOS: Alarcón Abad, Jorge Rolando.

Panez Robles, Roxana Isabel
Ramos Rodas, Eva.
Yon Yong, Alicia Sugen.

DOCENTE: Nilda Quispe.

AÑO DE ESTUDIO: 3ro Año

Miraflores, 03 de Agosto del 2009

Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

I. Objetivos:
 Aprender a identificar a las bacterias de acuerdo a las reacciones
metabólicas que tienen frente a los diferentes reactivos y medios de
cultivo (uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de
microorganismos).
 Entender los principios bioquímicos de las pruebas.

II. Fundamento:
 Metabolismo de los hidratos de carbono : Producción de ácido y/o gas
durante el crecimiento fermentativo con azúcares o alcoholes
azucarados. La utilización de determinados azúcares son la base para la
diferenciación bioquímica de los microorganismos quienes utilizan en
mayor facilidad los carbohidratos de menor peso molecular siendo los
más utilizados los monosacáridos.
 Reacción en el Agar Triple Azúcar Hierro (Producción de Sulfuro de
Hidrógeno – H2S): El H2S por rotura de los aminoácidos azufrados o
reducción del Tiosulfato. El H2S se detecta en un medio rico en hierro a
partir de la formación del sulfito ferroso negro. Es utilizado en
Enterobacterias y ayuda a la identificación de la Salmonella, Arizona,
Edwarsiella y Proteus.
 Prueba de la Oxidasa: Hay bacterias que contiene las enzimas
Citocromo C Oxidasas que reaccionan con el reactivo tetrametil-p-
fenilendiamina oxidándolo (aceptor de electrones artificial).
 Prueba de la Catalasa: Las ensimas de muchas bacterias son capaces de
descomponer el peróxido de hidrógeno (H 2O2 - agente tóxico)
desdoblándolo en H2O y O2.
 Reducción de Nitratos: El nitrato como aceptor de electrones
alternativo, reducido a NO2- o N2.
 Hidrólisis de la Urea: Determinar si la bacteria degrada la Urea a partir
de las enzimas hidrolíticas ureasas. La urea (H2N – CO – NH2) se escinde
en 2 NH3 + CO2. Las sustancia producto de la hidrólisis va alcalinizar el
medio haciendo virar el reactivo indicador Rojo de Fenol a un Rojo
Grosella.
 Prueba del Indol: Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol
(molécula heterocíclica) en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se
debe a la degradación del aminoácido triptófano.
 Prueba del Rojo de Metilo: Las bacterias fermentadoras mixtas de
ácidos producen suficiente ácido para disminuir el pH por debajo de 4.3
 Prueba de Voges-Proskauer: Determinar la capacidad de algunos
microorganismos de producir acetoína a partir de la fermentación de
azúcares. Prueba química para acetoína utilizando α-naftol.

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

 Prueba del Citrato de Simmons: Utilizada para determinar que

microorganismos son capaces de utilizar el citrato como única fuente
de carbono produciendo una alcalinización del medio. La fuente de
nitrógeno la constituye el fosfato de amonio.
 Prueba del ácido Fenil Pirúvico-APP (Prueba de la
Fenilalaníndesaminasa): La desaminación producida por la actividad
metabólica de ciertos microorganismos produce ácido fenílpirúvico que
se detecta en una prueba colorimétrica.
 Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio: Determinar la capacidad
que tiene algunos microorganismos de desarrollarse en un medio que
se ha agregado un veneno enzimático KCN, la que impide el proceso de
respiración.
 Descarboxilación de la Lisina: La descarboxilación de la libera una
amina y CO2. Medio enriquecido de aminoácidos. El púrpura de
bromocresol como indicador de pH vira a púrpura (si actúa una enzima).
 Hidrólisis del Almidón: El almidón es un carbohidrato complejo que es
degradado por microorganismos que contienen amilasas.
 Hidrólisis de la Gelatina: Muchas enzimas hidrolasas hidrolizan la
gelatina y destruyen el gel .

III. Marco teórico:

Prueba de reducción de nitratos a nitritos: La prueba se basa en basa en la reducción

del nitrato a nitrito o gas nitrógeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un
proceso de oxidación por el cual el nitrato proporciona oxígeno para ser usado como
aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo
de Griess A y Griess B Britania, dando un compuesto diazoico coloreado.
Si se observan burbujas en el medio, éstas son de gas nitrógeno, ya que el nitrito
intermediario inhibe las decarboxilaciones. Esta prueba ayuda en la determinación de
Enterobacterias gran positivas.

Prueba de la Catalasa: La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima

catalasa. La catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrógeno (forma
tóxica del oxigeno) en oxígeno y agua. Esta enzima es similar a la estructura de la
hemoglobina. Debido a que el oxígeno es un oxidante poderoso y un excelente
aceptor de electrones para la respiración, siendo su forma normal conocida como
triplete de oxígeno, sin embargo una forma habitual del oxígeno tóxico se denomina
singlete de oxígeno, esta es una forma de mayor energía en el que la capa más externa
de electrones que rodean al núcleo se hacen altamente reactivos y son capaces de
llevar a cabo una serie de oxidaciones indeseables, dentro de la célula. El singlete de
oxígeno se produce tanto fotoquímicamente como bioquímicamente; esta última
forma es por la reacción de las peroxidasas. Otras formas altamente tóxicas de oxígeno

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

incluyen el anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo

(HO2). Con tantas formas tóxicas del oxígeno no es de extrañar que los
microorganismos hayan desarrollado formas enzimáticas capaces de destruirlos. Entre
estas formas enzimáticas está la catalasa, la peroxidasa y la superóxido dismutasa.
Excluyendo al género Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

Prueba del Indol: Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol (molécula
heterocíclica, con estructura bicíclica que consiste en un anillo de seis miembros
-benceno unido a otro de cinco miembros -pirrol) en un cultivo bacteriano. Dicha
liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima
triptofanasa (desaminación reductiva). Las triptofanasas catalizan la reacción de
desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de
triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco
(NH3) y energía. Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

Para la detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los
siguientes ingredientes:

Ingredientes Cantidad
Alcohol amílico o isoamílico (puede 150 ml.
sustituirse por ácido butílico).
p-dimetilamino-benzaldehído 10 g.
HCl (concentrado) 50 ml.
Constitución del Reactivo de Kovacs (fuente: Brock
“Biología de los Microorganismos, 1998)

Resultados positivos y negativos de la prueba del Indol

(fuente: www.microbology.com)

Prueba de la Oxidasa: El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la

enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la
cadena transportadora de e−. Los citocromos contienen ferroporfirina (grupo hemo),

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

se encuentran en células aeróbicas, algunos en la membrana interna mitocondrial

donde secuencialmente transportan electrones a partir de diferentes deshidrogenasas
hasta el O2. Otros se ubican en el retículo endoplásmico. El Citocromo C oxidasa se
detecta utilizando el tetra-p-fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este
compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es
incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.

Hidrólisis de la Urea: Para esta prueba es necesario el Caldo Urea. El Caldo de urea es
un medio muy pobre y bastante tamponado que permite determinar la presencia de la
actividad de la enzima hidrolítica ureasa, cuya actividad provoca la degradación de la
urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguiente
alcalinización. Este cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul
de bromotimol desde el verde original al azul intenso. También es válido usar el
reactivo indicador Rojo de Fenol el cual vira por la alcalinización del medio a un rojo
grosella.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer: Estas dos pruebas permiten la diferenciación dentro

de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios
facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán
aerobiamente (respiración oxibióntica-oxidativa) consumiendo rápidamente el oxígeno
del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia
(fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:

 Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los
productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y
succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede
detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo
por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

 Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-

Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos
neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como
intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de
Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que
reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico.

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP

(Red Metil Voges-Proskauer) conocido también como medio de Clark y Lubs.
Medio MR-VP: El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciación de organismos
coliformes en base a las pruebas de Rojo de metilo y Voges-.Proskauer. En 1915 Clark y
Lubs demostraron que las bacterias del colon de la familia aerogenes podían dividirse

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

en dos grupos en base a su acción en un medio con dextrosa y peptona. Cuando se

probaron con el Rojo de Metilo como indicador de pH, el grupo de coliformes producía
una gran cantidad de ácido mientras que el grupo de los aerógenos producía una
reacción menos ácida. La prueba para detectar a los altos productores de ácido es
conocida como Rojo de Metilo (MR). La prueba para detectar a los menos productores
de ácido está basada en el procedimiento que describieron Voges y Proskauer en 1898
donde se presenta una reacción colorida cuando los cultivos se incuban en un medio
conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidróxido de potasio exponiéndolos
al aire. Esta reacción pone de manifiesto la formación de acetilmetilcarbinol y es
conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP).

En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La

dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato actúa como buffer.

Mezcla de Peptonas 7.0

Dextrosa 5.0
Fosfato de potasio 5.0
pH 6.9 ± 0.2

Constitución del Caldo MRVP – Metil Red

Voges Proskauer (fuente: Brock “Biología de
los Microorganismos, 1998)

Prueba del Agar Citrato de Simmons : La utilización de citrato como única fuente de
carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de
citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato
como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio.
Este aumento del pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al
alcalino a pH 7,6.

Resultados positivos y negativos de la

Prueba Agar Citrato de Simmons
(fuente:www.microbiology.org)

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Prueba del Ácido Fenil Pirúvico. La desaminación produce ácido fenilpirúvico que se
detcta a través de una prueba colorimétrica. La fenilalanina es un aminoácido que en
detrminados microorganismos puede transformarse por desaminación oxidativa en
APP (ácido fenil pirúvico), el cual con una reacción de cloruro férrico produce una
coloración verde.

Prueba de la Descarboxilación de la Lisina (Prueba LIA -Lysine Iron Agar ó Agar Lisina
Hierro): Esta prueba se da cuando la descarboxilación de la lisina (aminoácido) da la
formación de la cadaverina que hace virar o cambiar el pH del medio hacia el lado
alcalino, en donde genera CO2. La descarboxilación de los aminoácidos libera CO 2 y una
amina. Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen
descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar además la producción
de SH2 y es más sensible que el TSI (Triple Sugar Iron) para la detección de SH 2. Es muy
utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Resultado positivo de la Prueba de la

Descarboxilación de la Lisina – Prueba
Lia- Lysine Iron Agar
(fuente:www.microbiology.org)

Prueba de la Gelatina: La gelatina tiene la propiedad de precipitar cuando se añaden

metales pesados, los microorganismos que degradan la gelatina es porque segregan
enzimas hidrolíticas transformando esta proteína en peptonas haciendo perder la
capacidad de precipitar los metales pesados.

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 Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Pruebas importantes para el diagnóstico clínico de bacterias y su utilización más

frecuente (fuente: Brock “Biología de los Microorganismos, 1998)

Prueba Principio Método Utilización más frecuente

Fermentación de Producción de ácido y/o gas Un caldo de cultivo con Diferenciación de
hidratos de carbono durante el crecimiento hidratos de carbono y rojo enterobacterias (también para
fermentativo con azúcares o de fenol como indicador de la separación de otros géneros
alcoholes azucarados pH, tubo invertido para el o especies distintos con
gas algunos azúcares
determinados).
Catalasa La enzima descompone el Añadir una gota de H2O2.a Bacillus (+) de Clostridium
peróxido de hidrógeno, H2O2. un cultivo denso y buscar (-); Streptococcus (-) de
burbujas (O2). Micrococcus-Staphylococcus
(+).
Utilización del citrato. La utilización del citrato como Un medio de citrato con Klebsiella-Enterobacter (+) de
fuente única de carbono produce azul de bromotimol como Escherichia (-), Edwarsiella
la alcalinización del medio. indicador de pH. Buscar un (-) de Salmonella (+)
color azul intenso (pH
alcalino).
Coagulasa La enzima provoca la Mezclar una suspensión Staphylococcus aureus (+) de
aglutinación del plasma líquida densa de bacterias S. epidermis (-)
sanguíneo. con plasma, incubar y
buscar un coágulo de
fibrina.
Descarboxilasas La descarboxilación de los Medio enriquecido con Ayuda a la determinación del
(lisina, ornitina, aminoácidos libera CO2 y aminoácidos. El púrpura de grupo bacteriano entre las
arginina). amina. bromocresol como indicador enterobacterias.
de pH vira a púrpura (pH
alcalino) si actúa la enzima.
Prueba de la β- El ortonitrofenil-β-galactósido Incubar una suspensión Citrobacter y Arizona (+) de
Galactosidasa (ONPG) es un sustrato artificial pesada de un cultivo lisado Salmonella (-). Identificación
(ONPG) para la enzima. Cuando se con ONPG. Buscar un color de algunas especies de
hidroliza, se forma el nitrofenol amarillo. Shigellla y Pseudomonas.
(amarillo)
Licuefacción de la Muchas hidrolasas hidrolizan la Incubar un caldo con 12% Ayudar a la identificación de
gelatina gelatina y destruyen el gel. de gelatina. Enfriar para Serratia, Pseudomonas,
comprobar la formación del Flavobacterium, Clostridium.
gel. Si se hidroliza la
gelatina, el tubo permanece
líquido cuando se refrigera.
Producción de sulfuro La producción de H2S por rotura El H2S se detecta en un En enterobacterias, ayudar a la
de hidrógeno (H2S) de los aminoácidos azufrados o medio rico en hierro a partir identificación de Salmonella,
reducción del tiosulfato. de la formación del sulfit Arizona, Edwarsiella y
ferrosos negro (muchas Proteus.
variantes: agar hierro de
Kligler y agar hierro triple
azúcar, también detectan la
fermentación de los hidratos
de carbono).
Prueba del Indol Conversión del triptófano de las Detección de indol en medio Distinguir Escherichia (+) de
proteínas en indol (molécula de cultivo con dimetil- Klebsiella (-) y Enterobacter
cíclica). aminobenzaldehido (color (-); Edwarsiella (+) de
rojo). Salmonella (-)
Prueba del rojo de Los fermentadores mixtos de Caldo de glucosa. Después Diferenciar Escherichia (+,
metilo ácidos producen suficiente de la incubación, añadir cultivo rojo) de Enterobacter y
ácido para disminuir el pH por indicador rojo de metilo a la Klebsiella (generalmente-,
debajo de 4.3 muestra. cultivo amarillo).
Reducción del nitrato El nitrato como aceptor de Caldo con nitrato. Tras la Ayudar a la identificación de
electrones alternativo, reducido incubación, detectar nitrito enterobacterias (generalmente

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 Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

a NO2- o N2. con ácido α-naftilamina +).

sulfanílico (color rojo). Si es
negativo, confirmar que el
NO3- está aún presente
añadiendo polvo de zinc
para reducir el NO3- a
NO2-. Si tras la adición del
zinc no hay color, entonces
NO3-→NO2- .
Prueba de la oxidasa El citocromo C oxida al aceptor Caldo o agar. Las colonias Separar Neisseria y Moraxella
de electrones artificial: oxidasa positivas en agar (+) de Acinetobacter (-).
tetrametail (o dimetil)-p- pueden detectarse Separar enterobacterias
fenilendiamina. sumergiendo la placa en un (todas-). De pseudomonas (+).
reactivo y buscando Ayudar a la identificación de
colonias azuladas o Aeromonas (+).
marrones.
Prueba de la Algunos organismos producen Producción de ácido en la Diferenciar Micrococcus
oxidación- ácido solamente cuando crecen parte alta del tubo de cultivo (producción de ácido
fermentación (O/F). en aerobiosis. que contiene azúcar; el agar solamente en aerobiosis) de
blando se utiliza para Staphylococcus (producción
disminuir la mezcla durante anaeróbica de ácido).
la incubación Caracterizar Pseudomonas
(producción aeróbica de ácido)
de enterobacterias (producción
anaeróbica de ácido).
Prueba de la La desaminación produce ácido Medio enriquecido en Caracterizar el género Proteus
fenilalaníndesaminasa fenilpirúvico que se detecta en fenilalanina. Después del y el grupo Providencia.
una prueba colorimétrica. crecimiento, añadir cloruro
férrico y buscar el color
verde
Hidrólisis del almidón El yodo-ioduro da un color azul Crecimiento de un Identificar los hidrolizadores
con el almidón. organismo en una placa que típicos de almidón como
contiene almidón. Sumergir Bacillus spp.
la placa en ioduro de Gram
y buscar las zonas claras
alrededor de las colonias.
Prueba de la ureasa La urea (H2N – CO – NH2) se Medio con un 2% de urea y Dsitinguir Klebsiella (+) de
escinde en 2 NH3 + CO2 rojo de fenol como Escherichia (-). Distinguir
indicador. La liberación de Proteus (+) de Providencia (-)
amonio eleva el pH, intenso
de color rojo rosado
Prueba del Voges- La acetoína es producida a Prueba química para Separar Klebsiella y
Proskauer partir de la fermentación de acetoína utilizando α-naftol. Enterobacter (+) de
azúcares. Escherichia (-). Caracterizar
los miembros del género
Bacillus.

Pruebas importantes para el diagnóstico clínico de

bacterias y su utilización más frecuente (fuente: Brock
“Biología de los Microorganismos, 1998)

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Zona de viraje pH Cambio de color

Azul de timol 1,2 – 2,8 rojo amarillo
Púrpura de m-cresol 1,2 – 2,8 rojo a amarillo
4- Dimetilaminoazobenzol 2,9 – 4,0 rojo a anaranjado amarillento
Azul de bromofenol 3,0 – 4,6 amarillo a violado rojizo
Rojo de Congo 3,0 – 5,2 violeta azulado a naranja rojizo
Naranja de metilo 3,1 – 4,4 rojo a anaranjado amarillento
Verde de bromocresol 3,8 – 5,4 amarillo a azul
Indicador mixto 4,4 – 5,8 violado rojizo a verde
Rojo de metilo 4,4 – 6,2 rojo a anaranjado amarillento
Tornasol 5,0 – 8,0 rojo a azul
Púrpura de bromocresol 5,2 – 6,8 amarillo a púrpura
Rojo de bromofenol 5,2 - 6,8 amarillo anaranjado a púrpura
Azul de bromotimol 6,0 – 7,6 amarillo a azul
Rojo de fenol 6,4 – 8,2 amarillo a rojo
Rojo neutro 6,8 – 8,0 rojo azulado a amarillo anaranjado
Rojo de cresol 7,0 – 8,8 amarillo a púrpura
Púrpura de m-cresol 7,4 – 9,0 amarillo a púrpura
Azul de timol 8,0 – 9,6 amarillo a azul
Fenolftaleína 8,2 – 9,8 incoloro a violado rojizo
Timolftaleína 9,3 – 10,5 incoloro a azul
Amarillo de alizarina GG 10,0 – 12,1 amarillo claro a amarillo pardusco
Azul de épsilón 11,6 – 13,0 anaranjado a violeta

Indicadores de ácidos y bases más utilizados en las

pruebas de Diagnóstico Clínco (fuente: Brock “Biología
de los Microorganismos, 1998)

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

Materiales, Equipos y Reactivos:

 Tubos de prueba
 Placa petri
 Mechero
 Papel de filtro whatman
 Caldo nutritivo
 Ácido sulfanílico
 Caldo úrea
 Caldo rojo de metilo
 Cloruro férrico
 Agar LIA
 Caldo lactosa
 Agar gelatina
 Solución clorhídrica
 Col. De dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina
 Aguja y asa de kolle
 Gradilla
 Algodón
 Estufa a 35ºC
 Solución de peróxido de hidrógeno
 Agar nutritivo
 Ácido tartárico
 Reactivo de Kovac`s
 Agar citrato de Simmons
 Agar TSI
 Caldo glucosado
 Agar almidón
 Lugol

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Procedimiento:

Reducción de Nitratos a Nitrititos:

Se realiza la siembra en caldo de nitrato, luego de la incubación a 37ºC por un tiempo de 24 a

48h, se adiciona el reactivo de Griebs al cultivo.

Reactivo de Griebs

Caldo de nitrato

Prueba de Indol:

Se realiza la siembra en caldo de triptona, luego de la incubación a 37ºC por 24h se adiciona el
reactivo de KOVAC´S de 2 a 3 gotas.

Reactivo de Kovac`s

Caldo de triptona

Asimilación de Citrato:

Se realiza la siembra en Agar de Citrato de Simmons, luego se incuba a 37ºC por 24h

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Tolerancia al Cianuro de Potasio:

Se realiza la siembra en un caldo nutritivo de 2ml que contiene 0.1ml de KCN, luego se realiza
la siembra y se procede ala incubación a 37ºC por 24h.

Descarboxilación de la lisina:

Se realiza la siembra por picadura profunda en Agar Lía, se procede a la incubación a 37ºC por
24h

Formación de ácido fenil pirúvico:

Se realiza la siembra en agar nutritivo, luego se procede a incubar a 37ºC por 24-48h, para
realizar la lectura se agrega Cl3Fe de 2 a 3 gotas Cl3Fe

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Oxidación fermentativa de la glucosa:

Se realiza la siembra por picadura profunda en dos tubos, luego uno de ellos se agrega cera
líquida, incubación de 37ºC por 24-48h.

Hidrólisis de la Urea:

Se realiza la siembra en el caldo de la urea, incubación de 37ºC por 24h.

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Prueba de la Oxidasa:

Se obtiene papel de filtro watman impregnado con solución de Dihidrocloruro de tetrametil

parafenilendiamina, luego con una asa de koller, se realiza una estria sobre el papel y se
observa la reacción.

Prueba de la catalasa:

En un porta objeto se coloca la cepa, luego se agrega 2 a 3 gotas de peroxido de hidrogeno y se

observa el desprendimiento de oxigeno.

Hidrólisis de la gelatina:

Se realiza la siembra por estrías del microorganismo en la placa petri que contiene agar,
incubar a 37ºC por 24horas luego de esto se agrega gotas de solución clorhídrica y se expone
por un minuto, luego enjuagar con agua corriente.

Cl3Mg

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Hidrólisis del almidón:

Se realiza la siembra por estrías por un agar de almidón al 1% en placa petri, incubar a 37ºC
por 24horas, se adiciona gotas de lugol sobre la placa.

lugol

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

V. RESULTADOS:

Salmonella typhi
PRUEBA RESULTADO COLORACIÓN
Reducción de nitritos a nitratos Positivo con formación de Rojo ladrillo
nitritos
Prueba de Indol Negativo Amarillo
Prueba de citrato de Simmons Positivo, se produce una Azul
(P. de asimilación de citrato) alcalinización por el
amoniaco

Descarboxilación de la lisina Positivo , se produce una Amarillo en la superficie y

alcalinización en el pH morado en la parte de abajo
siendo este más intenso

Formación de APP (acido fenil Negativo,no hay cambios Coloración amarilla, no

piruvico) concuerda con el coloración
verde propia de las
desaminación oxidativa

 Reducción de nitritos a nitratos (Rojo ladrillo)

 Prueba de Indol (Amarillo)

 Prueba de citrato de Simmons (P. de asimilación de citrato) (Azul)

17
Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

 Formación de APP (acido fenil piruvico)

VI. DISCUSIONES:

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

 Según BROCK MICHAEL T. MADIGAN, JOHN M. MARTINKS & JACK PARKER

(1998) los microorganismos que al reducir los nitratos a través de la enzima
nitrato reductasa, liberan gas nitrógeno, producen un resultado falso negativo
con la metodología detallada previamente. Por eso, ante un resultado negativo,
agregar unas granallas de Zinc y observar el color desarrollado. Esto permitirá
dar el resultado definitivo de la prueba de reducción de los nitratos. Este
enunciado fue comprobado en la experiencia de laboratorio.

 Según LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) en la prueba del indol “ciertos

microorganismos forman Indol por descomposición del aminoácido triptófano
(indol-alanina) presente en la triptona. Después del periodo de incubación, la
presencia del Indol se reconoce con el reactivo de Kovacs, integrado por p-
dimetil-amino-benzaldehido, alcohol amílico y HCl concentrado, con el cual
forma un estrato superficial de color rojo en el tubo de reacción”; en la práctica
al realizar esta prueba con la salmonella tiphy nos dio una coloración roja al
adicionar el reactivo de Kovacs lo que nos indica que la salmonella puede
degradar al triptófano.

 Según LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) en la prueba de Voges-Proskauser el

periodo de incubación es de 24-48 horas utilizando el medio M.R.-V.P. (caldo
glucosado-sal peptona), esta reacción consiste en establecer la formación de
acetilmetil- carbinol o acetoína, producida por ciertos microorganismos a partir
de la glucosa, con el reactivo de Barrit, constituido por alfa-naftol y KOH ; sin
embargo en la guía de práctica se especifica que el periodo de incubación es de
3 días y los reactivos a usar son la creatina y el KOH .

 La UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) nos menciona que para la prueba del rojo
de metilo se debe incubar el medio M.R.-V.P. (caldo glucosado-sal peptona)
por 5 días (a 35ºC) para luego adicionar las gotas del indicador para observar la
reacción del medio; no obstante en la guía de práctica se nos indica que el
periodo de incubación debe ser 24 horas.

 En la Prueba de asimilación del citrato se debe sembrar en el agar citrato de

simmons con una aguja de Kohl poco cargada e incubar a 35ºC durante 72-96
horas y luego observar si ha habido desarrollo del cultivo o cambio del color
verde al azul ,UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) ; en la práctica el periodo de
incubación del agar citrato de Simons fue 48 horas

VII. Conclusiones

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

 Los microorganismos mueren con la presencia de los nitratos al ser esta una
sustancia toxica.
 La salmonella typhi descompone al nitrato en nitrito aprovechando el oxigeno
que es liberado para su proceso de respiración
 Las granallas de zinc sirven para confirmar que la reacción es negativa y que
hay presencia de nitratos en la muestra además de descartar la posibilidad que
el microorganismo haiga degradado o reducido el nitrato a nitrógeno
 Si en la prueba de reducción de nitrato a nitrito al confirmar con las granallas
de zinc no hay cambio de color es porque el microorganismo ha degradado
hasta el final el nitrato y es muy ávido de oxigeno por lo que se podría decir que
el microorganismo es un aerobio estricto.
 La reducción total del nitrato es nitrógeno o nitrógeno celular.
 La salmonella tiphy nos dio negativo en la prueba del indol debido a que no
puede degradar el triptófano del caldo triptona.
 El reactivo de griess reacciona con los nitritos y debido a esto para saber si el
nitrato fue degradado por el microorganismo se le debe agregar este reactivo
dándonos un color rojo ladrillo como prueba positiva.
 La alfanaftilamina es la que detecta el nitrito pero en las condiciones que le da
el acido sulfanílico y el acido tartárico.
 En la prueba de la catalasa la enzima descompone el peróxido de hidrogeno en
agua y O2 ,debido a esto se producen las burbujas formadas.

VII.- BIBLIOGRAFÍA:

 BROCK MICHAEL T. MADIGAN, JOHN M. MARTINKS & JACK PARKER (1998), “Biología
de los Microorganismos” 8va Edición, Editorial Grafilles (Group Fuproin) Impreso en
España.
 PDF: S. ROUSSOS & I. PERRAUD-GAIME (1986) “Fisiologia y Bioquimica de
microorganismos utilizados en procesos de fermentación en medio sólido” Laboratorie
de Biotechnologie PMC, Centre ORSTOM.
 LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) “Microbiología De La Leche II” Maracaibo-
Venezuela
 QUEVEDO, F (1967) “Microbiología General: Prácticas De Laboratorio” UNFV Lima-
Perú

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