Cinetica Enzimatica Ejercicios Resueltos

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1-Orden de reaccin. La enzima Glicerol-3 fosfato deshidrogenasa se inactiva irreversiblemente
en presencia de ciclohehanediona con una cintica aparente de primer orden. Sin embargo, cuando
se vara la concentracin del agente inactivante en la cubeta se observa que la cintica se modifica.
Explique este resultado calcule el valor real de la constante de velocidad de la reaccin.
[CHD] (mM) 0.2 1
t (min) + Enzima
activa
remanente
(%)
0 100.0 100.0
10 92.2 77.8
20 93.9 56.8
30 88.4 46.3
40 76.2 36.6
60 72.1 20.4
90 60.8 9.1
120 54.6 4.3
Sugerencias:
a)Demuestre que la cintica de inactivacin es de primer orden aparente y calcular la constante de
primer orden y la vida media (no olvide las unidades).
b)Determine si la constante de primer orden vara con la concentracin del reactante CHD y
escriba una expresin para la velocidad que incluya a todos los reactantes.
c) A partir de esta ecuacin identifique que es lo que vara en cada experimento y lo que se
mantiene constante y diga porque la cintica aparece como si fuese de primer orden.

----------regresar al ndice de la seccin -------------------regresar al ndice general------------

2 Ensayo actividad de una enzima. La enzima mlico deshidrogenasa cataliza la reduccin de
oxaloacetato con NADH, a malato y NAD
+
. En el siguiente experimento se sigui la desaparicin
del NADH, midiendo su absorbencia a 340 nm (c = 6220 M
-1
cm
-1
). Si se emplearon 35 ng de
protena de la preparacin enzimtica, en una cubeta de 3 mL, para este experimento, determine la
actividad de la enzima en unidades internacionales y la actividad especfica de esta preparacin.

tiempo (min) 0.00 0.10 0.20 0.30 0.50 0.85 1.50 2.00
Absorbencia 1.34 1.28 1.26 1.22 1.16 1.10 1.02 0.99

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3 Efecto de la concentracin de enzima. En el siguiente experimento con la enzima fosfatasa
cida de semillas de trigo germinadas se vari la concentracin de la enzima en cubeta a dos
concentraciones de sustrato y se obtuvieron los resultados siguientes:

[enz] (l) [FP] 0.1 mM [FP] 10 mM
Vel
(nmol/min)
Vel
(nmol/min)
5 1.920 6.307
10 4.059 13.169
15 5.956 19.145
20 7.766 25.694
25 9.479 32.282
30 11.844 37.882
a) Como varia la velocidad de la reaccin en funcin de la cantidad de enzima aadida?
b) Qu pasa si dividimos la velocidad registrada por la cantidad de enzima aadida al ensayo?
c) Utilizando la ecuacin de Michelis-Menten explique sus respuestas a las preguntas anteriores?


4-Cintica de una enzima. La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres diferentes
concentraciones de enzima y a diferentes concentraciones de sustrato fu la siguiente:

[Enz] (g de
protena)
0.1 0.2 0.5
[AcetilCoA] (M) + Vel (mol / min)
0.05 0.275 0.546 1.373
0.14 0.482 1.001 2.502
0.23 0.580 1.185 2.891
0.32 0.642 1.385 3.463
0.50 0.755 1.494 3.656
0.59 0.766 1.497 3.810
a) Calcular para cada experimento el valor de Km y el valor de Vmax.
b) Son los valores de Km y Vmax iguales o diferentes?
c) Explique si lo que observ es lo que esperaba obtener
d) Sabiendo que la enzima pesa 220 000 grs/mol, haga una grfica de Vmax vs mol de enzima.
e) Qu represnta la pendiente de esta grfica?
f) En qu se parece el valor anterior a la Actividad especfica = Vmax/mg de protena en mol
min
-1
mg de enzima
-1
?
g) Qu pasa con la medida de actividad especfica cuando la enzima no est pura?


5-Problema sobre un ensayo de actividad enzimtica. Considere a la enzima Invertasa, que
cataliza la hidrlisis de Sacarosa a fructosa y glucosa. Esta enzima posee una Km para sacarosa de
0.5 mM y una constante cataltica de 175 min
-1
. Si se mide su actividad en presencia de 0.25 mM
de sacarosa con 25 pmol de enzima en la cubeta - qu velocidad de catlisis se observar? - qu
fraccin representa esto de la Vmax que se podra calcular en esta reaccin si se variase la
cantidad de sacarosa? - Cunto sustrato habra que aadir para que la velocidad observada
alcanzase 0.95% de la Vmax? - Qu importancia podra tener esto para la posible aplicacin
industrial de la enzima? - Explique sus respuestas.


6-Problema sobre una reaccin con dos sustratos.
La enzima Aspartato transaminasa, que cataliza la reaccin:
Aspartato + Oxoglutarato Glutamato + Oxaloacetato
se realizaron los siguientes tres experimentos el siguiente experimento:
[Asp] = 1 mM [OxG] = 0.02 mM [OxG] = 0.5 mM
[OxG]
(mM)
Vel
(mol/min)
[Asp]
(mM)
Vel
(mol/min)
[Asp]
(mM)
Vel
(mol/min)
0.002 0.444 0.007 0.411 0.007 0.468
0.018 2.031 0.048 1.268 0.048 2.017
0.037 2.781 0.171 1.722 0.171 3.317
0.063 3.336 0.335 1.850 0.335 3.866
0.094 3.756 0.547 1.983 0.547 4.123
0.493 4.324 1.016 2.031 1.016 4.324
a) Calcule Km y Vmax para cada sustrato.
b) Cambian las Vmax? Explique su respuesta
c) Explique que pas en el segundo experimento, con respecto al tercero.
d) Cantos y cules valores de Km debo considerar para describir la afinidad de la enzima por
sus substratos?
e) Qu conclusin se podra sacar de esos datos?


7- Problema sobre la energa de activacin.
Para la enzima catalasa se realiz un experimento en el que se determin la velocidad de
descomposicin del perxido de hidrgeno en ausencia en presencia de 10 nM de enzima en el
ensayo.
T vel(sin catalasa) vel(con catalasa)
(C) (mol/s) (mol/s con 10nM Et)
4 0.40E-08 0.0410
10 7.74E-09 0.0464
15 1.31E-08 0.0476
20 2.09E-08 0.0497
25 3.52E-08 0.0530
30 5.74E-08 0.0598
-Suponiendo que la concentracin de perxido de hidrgeno fue suficiente para garantizar la
saturacin de la enzima, calcular la energa de activacin de la reaccin con o sin enzima y discuta
sus resultados. (R=1.987 cal/mol/K)


8-Efecto de temperatura sobre una enzima:
Los valores de Km y Vmax siguientes se determinaron midiendo la hidrlisis de bromuro de
acetilcolina catalizada por la esterasa bovina a diferentes temperaturas:
T (C) K
M
(mM) k
cat
(mol min
-1
pmol_[E]t
-1
)
20 0.403 0.307
25 0.375 0.322
30 0.335 0.340
35 0.305 0.362
45 1.500 0.013
a) Qu intervalo de termperaturas deberan emplearse como datos para calcular la energa de
activacin de la reaccin catalizada por la enzima?.
c) Para ralizar el clculo anterior: debera emplearse los valores de Km o de k
cat
.
b)-Por qu vara K
M
con la temperatura? (sugerencia: vea la deficincin de K
M
).


9- Efecto del pH sobre la Vmax. Los siguientes valores de velcidad inicial de enzimas fueron
obtenidos para la o-Quimotripsina actando sobre un sustrato artificial (ester etlico de acetil-L-
triptofano):
pH Vel (unidades
internacionales)
pH Vel (ui)
5.4 10 6.8 192
5.6 19 7.2 260
5.8 32 7.4 280
6.4 99 7.8 300
6.5 112 8.0 328
6.6 141 8.4 331
sigue en las columna 3 y 4. 9.0 327
a) Determine los valores de pKa(s) del (los) grupo(s) involucrado(s) en este comportamiento.
b) Diga que residuos de aminocido podran responsables de esta respuesta.
c) Si el experimento se extendiera hacia la regin ms alcalina de la escala de pH que cabra
esperar (explique su respuesta).


10-Problemas sobre inhibicin:
Se realizaron estudios de inhibicin para dos enzimas diferentes presentes en el suero bovino. Se
vari la concentracin de sustrato a en ausencia y en presencia de tres concentraciones diferentes
de inhibidores de cada enzima. En cada caso encontrar:

a) El tipo de inhibicin.
b) El valor de Km y Vmax.
c) El valor de Ki para el inhibidor.

Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de Bromolevamisol

[Bromolevamisol]
(M)
0 8 16 40
[Sustrato]
+[FP](mM)
Velocidades iniciales (mol min
-1
mgProt.
-1
)
0.1 0.231 0.210 0.191 0.158
0.3 0.431 0.369 0.309 0.239
0.7 0.607 0.488 0.425 0.277
1.3 0.751 0.599 0.467 0.304
1.8 0.811 0.657 0.530 0.319
2.6 0.912 0.657 0.546 0.328
4.1 0.957 0.688 0.561 0.351
5.8 0.981 0.741 0.558 0.344
Enzima: Transaminasa Glutmico Pirvica.

[2hidroxisuccnico]
(mM)
0.0 1.0 2.0 5.1
[Sustrato]
+[Glu](mM)
Velocidades iniciales (mol / min / mgProt)
0.6 0.59 0.48 0.38 0.24
1.4 1.12 0.91 0.78 0.51
2.9 1.63 1.43 1.19 0.87
5.2 1.94 1.70 1.64 1.19
8.0 2.19 1.94 1.94 1.56
10.3 2.28 2.06 1.99 1.74
16.0 2.32 2.33 2.24 1.89
25.1 2.62 2.53 2.25 2.09


11-Problema sobre inhibicin:
El siguiente experimento fu realizado con la fosfoenolpyruvato:pyruvil tranferasa de
streptococcus sp. Este enzima participa en la sntesis de la pared celular de las bacterias y cataliza
la transferencia de un grupo piruvilo a un precursos del pptidoglicano, liberando fosfato. La
fosfomicina (FSM) es un antibitico sintetizado por ciertas bacterias del grupo streptomyces que
inhibe a esta enzima. Usando el fosfoenolpiruvato (PEP) como sustrato a dos diferentes niveles de
concentracin, se estudi la inhibicin de esta enzima por fosfomicina.

[PEP] (M) 75 200
[FSM] (M) + Velocidad Velocidad
(nmol min
-1

mgProt
-1
)
(nmol min
-1

mgProt
-1
)
0 0.73 2.49
5 0.53 2.29
10 0.42 2.15
25 0.26 1.78
50 0.16 1.4
100 0.09 0.98

a) Identifique el tipo de inhibicin que se presenta
b) Calcule el valor de la I
50
para este inhibidor a la concentraciones ms baja y ms alta de sustrato
empleadas en el experimento.
b) Qu diferencias observa entre este parmetro calculado con diferentes concentraciones de
sustrato?
c) Suponga que encuentra reportados en la literatura otros inhibidores de esta enzima que actan
por un mecanismo semejante a este compuesto, pero descubre que en varios casos los autores
emplearon diferentes concentraciones de PEP para estudiar el efecto del inhibidor. Sera vlido
comparar los valores de K
I
reportados? - explique su razonamiento.

1. 1.- En este problema se nos pide analizar como progresa la inactivacin de una
enzima en el tiempo. Aqu, la ciclohexanodiona (CHD) es un reactivo que modifica
qumicamente con la enzima y el producto de esta reaccin es una protena que
pierde su actividad enzimtica original. Por tanto, en este experimento, la enzima es
un reactante y su actividad enzimtica es el recurso metodolgico que sirve para
evaluar la concentracin remanente de protena no modificada por la CHD, en cada
uno de los tiempos muestreados.
Se puede determinar si la reaccin qumica es de primer orden, o se encuentra en
condiciones tales que progresa como si lo fuese (aunque estrctamente no lo sea); ello
gracias a que la reacciones con cintica de primer orden (o de pseudoprimer orden)
muestran una relacin lineal entre el logaritmo natural de la concentracin de
reactante remanente y el tiempo transcurrido. De modo que, si obtenemos los
logartmos de los valores de concentracin de la enzima remanente (no importa que
se trate de un porcentaje) resultan las siguientes grficas.

La figura superior muestra la grfica logartmica, en la que se puede observar que
ambos conjuntos de puntos describen razonablemente una recta, no as en la grfica
directa de [E] vs. tiempo (panel inferior). Este resultado indica que la inactivacin
observada sigue una cintica de primer orden con respecto a la concentracin de
enzima en la condiciones empleadas. Las pendientes de estas lneas son
numricamente iguales a las constantes de primer orden, o de pseudoprimerorden,
pero con signo negativo, de modo que basta cambiar el signo para determinar el valor
de las constantes buscadas.
Note que ambas rectas presentan pendientes muy distintas, esto significa que la
concentracin de CHD si tiene un efecto sobre la velocidad de la reaccin annque, en
las condiciones experimentales empleadas, este efecto no se manifiesta en los 120
minutos que dura el experimento; posblemente porque este reactivo se encuentra en
gran exceso. Sin embargo, una expresin correcta para la velocidad de la reaccin
debera incluir ambos reactantes y la ley de velocidad indicara que el orden de
reaccin es superior a 1 (uno para la enzima y no sabemos exactamente cuanto para
la CHD).
Finalmente, el recuadro en la figura superior muestra que las constantes aparentes
calculadas varan linealmente con la cantidad de CHD empleada en el experimento y
la lnea cruza el punto x,y (0,0). Esto nos indica que el orden de reaccin para la CHD
es tambin de 1 y la pendiente de esta grfica nos indica el valor de la constante de 2o
orden. y la expresin final para la velocidad sera:
v= k
2
[CHD][E], en donde k
2
= 0.026 mM
-1
min
-1
= 0.43 M
-1
s
-1
.
En condiciones en las que [CHD] es mucho mayor que [E], la enzima se agota sin que
la [CHD] disminuya apreciablemente. Esto es muy frecuente en la inactivacin de
enzimas, ya que la concentracin de protena apenas alcanza los cientos de g/mL, lo
que para una molcula de 10000 gr/mol de PM (si se trata de na protena pequea) o
ms, representa concentraciones inferiores a 10
-5
M. Por su parte el agente qumico
suele agragarse en concentraciones superiores a 10
-4
M, es decir 10 veces por encima
como mnimo. Concencuentemente, el cambio en concentracin de reactante
rramente rebaza el 10% a lo largo de la incubacin.
2.- Para resolver este problema es necesario observar que la absorbencia registrada
representa la desaparicin del NADH, que es el sustrato de la reaccin. En este caso
la estequimetra de la reaccin implica que por cada evento de reaccin, una molcula
de NADH desaparece y, por tanto, lo que necesitamos hacer para calcular la
velocidad es determinar el Cambio de absorbencia del NADH por unidad de tiempo,
para luego convertirlo a cambio de concentracin de NADH mediante la ley de
Lambert-Beer:
A = c c l Ac = AA/(e l)
de donde se sigue que
AA = c Ac l Ac/At = (AA/At)/(c l)
Si graficamos la absorbencia contra el tiempo transcurrido, la pendiente de la curva
descrita por la grfica ser (y
2
-y
1
)/(x
2
-x
1
) = AA/At. La que en este caso ser
numricamente negativa (por tratarse de la desaparicin de un producto). Sin
embargo, podremos notar en la figura inmediata inferior, que la relacin no describe
una recta perfecta, por lo que es necesario considerar tan slo el periodo inicial, en el
que las concentraciones de sustratos y productos no han cambiado apreciablemente y,
por tanto, los punto se aproximan razonablemente a una recta.

As, con una pendiente inicial de -0.3297 Uabs/min y una longitud para el paso de luz
de la celda del espectrofotmetro de 1 cm (l) se obtiene una velocidad de desaparicin
de NADH de 5.310
-5
M min
-1
, lo que en 3 mL del volumen de cubeta representa
(5.310
-5
mol L
-1
min
-1
) (310
-3
L) = (1.5910
-7
mol min
-1
).
Las unidades internacionales (UI) de actividad enzimtica son moles de producto
formado o reactante consumido por minuto, de modo que si 1 mol equivale a 10
6

mol, la velocidad ser (v = 1.5910
-1
mol min
-1
) 0.159 UI.
Finalmente, la actividad especfica es l actividad enzimtica dividida por la
concentracin de protena, es decir a.e. = 0.159 UI/35 ng, pero debido a que la
concentracin de protena suele expresarse en mg: a.e. = 0.159 UI / 3510
-6
mg = 4543
UI/mg de protena.
3.- En este problema se nos pide determinar grficamente la relacin entre la
velocidad de la reaccin catalizada, vs. la cantidad de solucin de protena aadida al
ensayo y luego se nos pide calcular el cociente de la velocidad ( actividad de la
enzima) y la cantidad de solucin deprotena aadida al ensayo. Los resultados de tal
representacin se muentran en la siguiente figura:

En el panel inferior, apreciamos que la velocidad aumenta linealmente con la
concentracin de protena, esto es lo que cabra esperar, debido a que, si tomamos
como referencia la ecuacin de Michaelis-Menten, notaremos que la velocidad es
proporcional a la Velocidad mxima y a su vez la Vmax es proporcional a la
concentracin total de enzima aadida, i.e.:

Dado que en cada una de las dos series de determinaciones la concentracin de
sustrato se mantuvo constante, el factor k
CAT
S / (K
M
+ S) se mantiene constante y, por
tanto, podemos decir que mientras se emple la misma concentracin de sustrato en
todas las medidas, v = constante E
T
. Consecuentemente, cuando se grafica el
cociente v/[E] el resultado es una constante (vease panel superior de la figura
anterior), mientras la concentracin de sustrato no sea modificada.
Lo anterior significa que la velocidad de una reaccin enzimtica es proporcional a la
concentracin de enzima, lo que constituye la base terica de las mediciones de
actividad enzimtica como una estimacin de la cantidad de esta enzima presente en
un fludo biolgico. Este principio tiene, por ejemplo, mucha importancia en la
prctica clnica, ya que nos permite determinar alteraciones en los niveles de diversas
enzimas, que pueden relacionarse a diversos estados patolgicos. Tambin es
importante en aplicaciones en la industria de alimentos, ya que permite evaluar la
cantidad de ciertas enzimas presentes en los alimentos, cuya actividad puede ser
indeseable, o bien, puede ser aadida ex professo para modificar las propiedades de
los preparados alimenticios. Todo ello, mediante un ensayo enzimtico, generalmente
sencillo, que tan slo requiere como condicin que la concentracin de sustrato
empleada, as como otras condiciones (pH, temperatura, etc.), sean estandarizadas
adecuadamente.
4.- En este problema se nos d el valor de la velocidad como funcin de la cantidad de
sustrato aadido a tres diferentes niveles de concentracin de enzima. El valor de
Vmax y Km puede calcularse a partir de estos datos de diversas maneras. La manera
directa, aunque no muy precisa, consiste en graficar los datos y estimar el valor de
Vmax a partir del valor al que tiende la velocidad cuando la concentracin de
sustrato es muy elevada. Como en realidad este valor es el lmite superir de la curva,
pero esta se aproxima indefinidamente a l sin llegar a tocarlo, estimar este techo
resulta un poco impresiso. Con el valor obtenido, es posible calcular el valor de la
Km, ya que este representa la concentracin de sustrato a la que 50% de los sitios
activos de la enzima estn ocupados con sustrato y 50% estn vacos. En estas
condiciones, la velocidad observada deber ser igual a la Vmax/2. (vase panel A de la
figura que sigue a este prrafo). Como se describi en el problema anterior,
aumentar la concentracin de enzima resulta en un incremento en la Vmax, ya que v
= V
MAX
E
T
. Por tanto, las tres curva son semejantes en su forma, pero a mayor
cantidad de enzima tenemos curvas ms elevadas. Como es de esperar, cuando
dividimos la velocidad por la concentracin de protena empleada, la tres curvas se
superponen (ver panel B de la figura), dado que aqu la velocidad ya slo depender
de la concentracin de sustrato. Esta es una manera comn de representar las curvas
de saturacin por su sustrato de las reaccines enzimticas, ya que no su forma es la
misma sin importar cuanta enzima se emple en el experimento.

Los pneles de la derecha en la figura anterior (C,D) son representaciones de
Linewaver-Burk, en esta representacin se grafica 1/velocidad vs. 1/[sustrato], por lo
que tambin se le conoce como la grfica de dobles recprocos. Los valores de 1/v
frente a la 1/S describen una lnea recta, cuya pendiente es numricamente igual a
K
M
/V
MAX
y que intesecta al eje "Y" en un valor numrico igual a 1/V
MAX
y si la recta
se prolonga a travs del cuarto cuadrante intersecta al eje "X" en un valor numrico
igual a -1/K
M
. En la figura, el panel derecho inferior (C) muestra que la K
M
es
independiente de la concentracin de enzima aadida. Esto puede deducirse del
hecho de que la concentracin de enzima es casi siempre mucho menor que la de l
sustrato (vease problema 1), por lo que la cantidad de sustrato requerida para ocupar
el 50% de los sitios activos slo depende de la afinidad relativa entre la enzima y el
sustrato, propiedad que no cambia con la concentracin total de enzima. Esto mismo
puede deducirse de la ecuacin de Michaelis-Menten, ya que en ella, la concentracin
de E
T
y la de sustrato no son interdependientes. El panel superior dereho (D) reitera
que al dividir la velocidad por la concentracin de enzima empleada las tres lneas se
superponen.
Si ahora graficamos velocidad mxima obtenida contra la cantidad de enzima
aadida en mol, asumiendo que cada molcula de enzima posee un slo sitio activo,
la pendiente de la grfica ser:

Este valor nos dice que una molcula de enzima es capz de convertir 33300
molculas de sustrato a poducto por segundo y es equivalente a la actividad especfica
de una enzima pura (V
MAX
/[Protena]), excepto por la unidades empleadas. Dado que
para determinar este ltimo nmero no necesitamos una estimacin exacta del peso
molecular de la enzima, no del nmero de sitios activos por molcula de protena, este
valor es el ms frecuentemente reportado en diversas tablas de parmentros cinticos
y propiedades de enzimas. Sin embargo, cuando la preparacin no es pura el
denominador de este conciente ser mayor, debido a la contribucin de los
contaminantes a la cantidad total de protena, en consecuencia, la actividad especfica
disminuir. De este modo, la actividad especfica es un buen indicador del grado de
pureza de una preparacin enzimtica.
5.- En este problema se nos pide determinar la actividad como fraccin de la V
MAX

para la enzima invertasa, la manera ms simple de proceder es reordenar la ecuacin
de Michalis y Menten como sigue:

Lo que nos indica que se alcanza el 33% de la V
MAX
, como V
MAX
= k
CAT
E
T
, se tiene
vel = 175 min
-1
2.5 10
-6
mol 0.33 = una actividad de 0.00146 mol min
-1
. Ahora,
segn lo abtenido arriba, para obtener un 95 % de la V
MAX
bastar con que S/(K
M
+
S) = 0.95, de donde al despejar S tendremos S= K
M
0.95/(1-0.95) = 19 K
M
. Lo que
significa que habr que aadir 19 x 0.5 mM = 9.5 mM de sacarosa para que la
actividad alcance este valor.
Este problema sugiere que la cantidad de sustrato es uno de los factores importantes
a considerar cuando se desea emplear una enzima para aplicaciones inductriales. En
otras palabras, si el producto a tratar, que en este caso podra ser un almibar hecho a
base de sacarosa, posee un cancentracin de sustrato muy baja, o sea que nuestro
jarabe est muy diludo, deberemos aadr mucha ms enzima, puesto que sta estara
trabajando muy por debajo de su capacidad mxima. Por otro lado, una alternativa
para ahorrar enzima, sera tratar el jarabe concentrado y luego aadir el agua y los
otros componentes de su almibar, para tener el producto final.
6.- En este problema se pide calcular K
M
y V
MAX
para una enzima que posee dos
sustratos. En este caso, podemos variar la cancentracin de oxoglutarato y mantener
la concentracin de aspartato constante y viceversa. El problema consiste en saber
que concentracin de aspartato debo emplear cuando varo el oxoglutatato y que
concentracin de oxoglutaroto es recomendable mantener, al variar el osoglutarato.
Aqu, existen dos valores para la K
M
, dado que este valor representa la cocentracin
de sustrato que ocupa 50% de los sitios activos de la enzima en el estado estacionario,
sin embargo, se pueden ocupar estos sitios activos con ambos sustratos y, por tanto,
habr una K
M
(oxoglutarato ) y otra K
M
(aspartato).
La figura sigiente muestra la grfica de velocidad contra concentracin de sustrato
(panel izquierdo, para los 3 experimentos) y la de 1/v vs 1/s (panel derecho).

Puede observarse que las curvas y las rectas correspondientes a los experimentos 1 y
3 extrapolan a la misma V
MAX
, este es el primer diagnstico. La V
MAX
es la velocidad
de catlisis cuado la enzima se encuentra saturada con sus sustrato, pero dado que
aqu hay dos sustratos, habr que saturar con ambos. Esto significa que cuando
variamos la concentracin de aspartato, la concentracin de oxoglutarato debe estar
saturante desde el primero hasta el ltimo tubo medido y viceversa. Si esto no se
asegura, entonces el resultado ser como el mostrado en el experimento 2, en el que la
V
MAX
determinada es considerablemente inferior al valor real, decimos que se trata
de un valor aparente. Ahora -cmo sabemos que la concentracin de un sustrato es o
no saturante?- bueno, como se vi en el problema anterior, nosotros nos
aproximamos al 95% de la V
MAX
cuando la concentracin de sustrato es 19 veces K
M
.
En este caso, habr que elegir una concentracin de oxoglutarato igual a
19*K
M
(oxoglutarato ) cuando se vara el aspartato y viceversa.
El problema es que de entrada, no sabemos cual es el valor de la K
M
para ninguno de
los sustratos y, por tanto, no es posible determinar a priori que concentracin ser
saturante. Para resolver este dilema se realiza un primer experimento y se determina
el valor de KM para un sustrato (el que se vari). En nuestro caso, se trata del
experimento con oxoglutarato variable. Con este resultado, se calcula el valor de
K
M
(oxoglutarato ) aparente y se realiza entonces otro variando la concentracin de
aspartato con una concentracin de osoglutarato de al menos 20*K
M
(oxoglutarato ).
De este nuevo experimento se determina ahora la K
M
(aspartato), con lo que podemos
saber si la concentracin de aspartato empleada anteriormente fue realmente
saturante. Si la respuesta es afirmativa, ambos valores de V
MAX
deben ser muy
cercanos. De lo contrario, es necesario repetir el primer experimento con una
concentracin de sustrato mayor a la empleada inicialmente.
En nuestro caso, la K
M
(oxoglutarato) determinada en el primer experimento es 0.022
mM y la V
MAX
4.54 mol min
-1
. En el segundo experimento, realizado con 0.02 mM de
oxoglutarato, la concentracin no fue realmente saturante y no es sorprendente ver
que el valor de Vmax es inferior al anterior (2.06 mol min
-1
) y la K
M
(aspartato)
obtenida no es necesariamente el valor real tampoco (0.03 mM). Sin embargo, en el
tercer experimento, la concentracin de oxoglutarato fue de 0.5 mM, es decir, 22
veces la K
M
(oxoglutarato) del primer experimento (que por cierto, an no sabemos si
es cercana al valor real), por consiguiente la V
MAX
es ahora mayor (4.58 mol min
-1
,
de hecho ms cercana a la obtenida en el primer experimento) y el valor de
K
M
(aspartato) es ahora 0.062 mM.
Es decir, ahora podemos determinar que la concentracin de aspartato empleada en
el primer experimento fue 16 veces K
M
(aspartato), cercano a la saturacin, pero se
deseamos resultados an ms limpios, habra que repetir este experimento con una
concentracin an mayor (digamos 2 mM).
7.- En este problema se nos pide calcular la energa de activacin de Arhenius, para
ello, el procedimiento ms sencillo es el obtener una grafca de Log(k) vs. 1/T
(absoluta) y la pendiente de esta grafica ser igual a -Ea/R (siendo R la constante
universal de los gases). En este caso no tenemos el valor de k, sino tan slo el valor de
la velocidad de reaccin. Sin embargo, la pendiente de una grfica de Arhenius es:

Ello gracias a que la velocidad es proporcional a la concentracin de reactante (v = k
R) y asumiendo que sta no se modific durante el experimento. Lo que significa que
para efectos del clculo de la pendiente y de la energa de Activacin, es equivalente
graficar la k o la velocidad directamente, siempre que las mediciones se hallan
realizado con un cantidad constante de reactante.

La fugura anterior muestra la grfica directa de velocidad vs. Temperatura, la que
muestra que la velocidad de la reaccin crece exponencialmente con la temperatura.
Tambin es claro, que en el caso de la reaccin catalizada, no se observa una cada en
el rango de temperatura empleado, lo que nos dice que no se presenta
desnaturalizacin trmica de la protena y, por ello, es posible emplear todos los
puntos para construir el grafico de Arhenius, mismo que se muestra a la derecha de
la figura anterior. Note que para realizar esta igura las temperaturas fueron primero
convertidas a temperaturas absolutas en
o
K.
De la pendiente de la grfica y sabiendo que R=1.987 cal mol
-1

o
K
-1
se obtienen los
valores para la energa de Activacin de la reaccin catalizada por la enzima y en
ausencia de catalizador, ya que E
A
= pendiente -1 R. Aqu se puede ver que la
energa de activacin de la reaccin catalizada por la enzima es cerca de 8 veces
menor que la de la reaccin en ausencia de enzima. Lo que confirma que las enzimas
actan reduciendo el tamao de esta barrera enegtica.
8.- Este es un problema en el que lo que tenemos que hacer es muy semejante a lo que
hicimos en el problema anterior. Aqu sin embargo hay que determinar que datos
debemos usar. Dado que la grfica de Arhenius implica la relacin entre Log(k) vs
1/T absoluta, y k es una constante de velocidad, debemos identificar aqu la constante
de velocidad relacionada con el proceso de catlisis, esta el la k
CAT
. La KM como
puede verse, tambin puede ser modificada por la temperatura, debido a que su valor
es una relacin de varias constantes de velocidad (vease la definicin de K
M
en la
deduccin de la ecuacin de Michaelis y Menten), por tanto, al cambiar la
temperatura las constantes de velocidad cambin y esto afecta el valor de K
M
. Esto es
lgico, ya que la temperatura tambin puede afectar la unin del sustrato a la
protena y este proceso se refleja en el valor de K
M
.
Ahora, en adicin a lo anterior, se puede identificar en la siguiente figura que a las
temperaturas ms altas se observa un claro efecto de desnaturacin de la protena y
por tanto una caida en la catlisis. Dado que la energa de activacin que deseamos
medir es la del proceso cataltico, debemos considerar slamente los puntos que
reflejan el efecto de la temperatura sobre la reaccin catalizada y no acusan an
efectos sobre la reaccin qumica paralela de desnaturalizacin de la protena:

En la grfica de la derecha, se puede ver la recta que se obtiene en el grfico Ln(k) vs
1/T, del que se deduce una energa de activacin de 1.96 Kcal/mol. Ntese como
clramente el punto que corresponde a la mayor temperatura no cae sobre la recta.
Esto debido a que este punto presenta una mezcla de los efectos de la temperatura
sobre la velocidad de catlisis y sobre la velocidad de desnaturalizacin de la
protena.
9.- En este problema se nos pide determinar el valor del pKa del grupo involucrado
en la respuesta de la enzima frente al pH. As, haciendo una grfica de la actividad
frente al pH, se obtiene la curva siguiente (lnea contnua):

Esta curva es equivalente a una curva de titulacin como las que se ven cuando se
aade base a un cido debil en solucin y se siguen los cambio de pH, slo que aqu,
en lugar de equivalentes de base aadida, lo que estamos modificando el el pH y
observando los equivalentes de enzima activa presentes. Dado que el intervalo de pH
empleado no es muy extremo, es de esperarse que la cada en la actividad hacia el pH
de 6, se reflejo de que la mayora de la enzima no est en su forma inica
catalticamente competente, por lo que no manifiesta su actividad, pero es
improbable que est irreversiblemente desnaturalizada. En cualquier caso, para estar
completamente seguros de este hecho, habra que hacer un experimento distinto, en el
que la enzima se incubara a los diferentes pH durante un cierto intervalo de tiempo y
luego se regresara al pH de 8.5-9 (en donde tiene su mxima actividad de acuerdo
con la curva anterior) y se medira cuanta de la enzima puede recuperarse despus
del tratmiento. Este experimento nos dara la misma actividada a todos los pH's en
los que la enzima es estable y reportara bajas de la actividad en las regiones en las
que el pH desnaturaliza a una fraccin de la protena en forma irreversible.
a) A partir de la curva dibujada, se puede ver que el punto de inflexin de la curva es
paroximadamente de 6.7, lo que se da a un valor de activida de aproximadamente la
mitad del mximo observado a un pH entre 8.5 y 9.
b) Lo anterior nos indica que podra tratarse de algn aminocido como la histidina.
Menos probables, pero no se pueden descartar, seran los carboxilatos de Asp y Glu o
el grupo SH de una cistena libre (es decir que no est formando puente de disulfuro.
Aunque los pKa de los grupos R de estos ltimos 3 aminocidos en su forma libre se
encuentran relativamente alejados de 7 (4.7 para los carboxilatos y 8 para el tiol), en
el interior de las protenas y especialmente en el sitio activo de las enzimas, se pueden
observar desviaciones impertantes de los pKa, causadas por las caractersticas de
polaridad del sitio activo, que son casi seimpre muy diferentes a las del medio acuoso
puro.
c) Fnalmente, la lnea punteada de la figura anteror indica de manera aproximada lo
que se espera observar a valores de pH mucho ms alcalinos. En esas condiciones, la
desprotonacin masiva de muchos aminocidos, es decir casi todas las histidinas, los
tioles y la gran mayora de lisinas, as como muchas argininas, perdern su carga
positiva provocando la desestabilizacin de numerosos puentes de sal en la protena,
con lo que la estructura se ver severamente afectada. Consicuentemente, se espera a
que un pH superior a 10 u 11, la actividad comenzar a desiminuir abruptamente y
para un pH de 12 o 13 la enzima presentar una actividad nula. Esto es casi siempre
cierto, pero cabe aclarar que algunas protenas de bacterias alcaloflicas y que se
encuentran en medios extremos pueden soportar pH cercanos a 14 sin perdida de la
actividad.
10.- parte a. En este problema, podemos graficar los valores de velocidad frente a la
concentracin de sustrato para las series obtenidas sin y con las distintas
concentraciones del inhibidor. Esto se muestra en la figura que sigue, en el panel
inferior izquierdo. Aunque es posible estimar los valores de Km y Vmax (en ausencia
del inhibidor) y los valores de las constantes aparentes en presencia del inhbibidor en
esta figura, el estimado ser difcil de hacer, debido a que la Vmax es una valor lmite
que debe extrapolarse y el valor de Km debe estimarse una vez que se conoce la
Vmax, lo que significa que un mal estimado de Vmax dar un mal estimado de Km.
Una manera sencilla de resolver este problema es realizar la grfica que se presenta
en el lado izquierdo de la figura, la representacin de 1/v vs. 1/s propuesta por
Linewaver & Burk permite, unindo los puntos con una recta, determinar los valores
de 1/Vmax a partir de la intercepcin con el eje ordenado y -1/Km a partir de la
intercepcin de la recta extrapolada al eje de las abscisas. Aunque existen otras
formas de graficar estos datos que pueden ser ms convenientes desde el punto de
vista del estimado numrico obtenido, esta es la ms extendida en la literatura.
a) A partir de la representacin mostrada en el panel derecho de la figura, puede
tambin determinarse el tipo de inhibidor que se tiene, que en este caso es
acompetitivo (tambin llamado incompetitivo), dado que las rectas que unen cada
una de las series de puntos son paralelas. Note que aqu de poco sirve emplear un
anlisis de regresin lineal, dado que los errores experimentales provocan que las
rectas obtenidas por regresin no presenten la misma pendiente. En estos casos, una
vez que se ha decidido que los puntos realmente representan rectas paralelas, lo
mejor es tomar una regla y trazar todas las recta paralelas buscando que el conjunto
de lneas realmente describan, tan cercnamente como sea posible, el conjunto de
puntos experimentales.
b) Aqu, el nico valor de Vmax para la enzima es el determinado en ausencia del
inhibidor (O). Es decir 1/Vmax = 0.965 (mol
-1
min mg prot) Vmax = 1.04 (mol

min
-1
mg prot
-1
). Los valores obtenidos con las otras rectas representan tan slo
parmetros cinticos aparentes cuyo valor refleja las alteraciones impuestas sobre la
actividad enzimtica por la presencia del inhibidor. Km se determina por
consiguiente del valor de la intercepcin con las absisas de esta misma recta i.e. -
1/Km = -2.4 mM
-1
Km = -1/-2.4 mM = 0.417 mM de p-nitrofenilfosfato. Esto
significa que cuando la concentracin de p-nitrofenilfosfato en el medio de reaccin
(al pH y temperatura empleados en este experimentos) alcanzan 0.417 mM, el 50% de
los sitios activos de la enzima se encontrarn saturados y por tanto la actividad der
igual a la mitad de la mxima que puede observarse en dichas condiciones.

c) Finalmente, dado que los inhibidores acompetitivos afectan al valor de la
intercepcin con la ordenada de la grfica de (1/v,1/s), los valores de este parmetro
pueden emplearse para calcular grficamente el valor de Ki sin recurrir al lgebra.
Para ello, basta graficar estos valores frente a la concentracin de inhibidor
empleada en cada serie de determinaciones, lo que se muestra en el panel izquierdo
superior. Aqu, se unen los puntos con una recta y se extrapolan al eje de las absisas,
el punto de crte es numricamente igual a -Ki = -20.47 M Ki = 20.47 M de
bromolevamisol. Note que el primer punto de la grfica representa el valor de la
intercepcin cuando la concentracin de inhibidor el cero, es decir, este punto es
numricamente igual a 1/Vmax.
parte b. a) La solucin de este problema es muy semejante a la descrita para el
problema anterior, de manera que no abundaremos en los detalles. Aqu, el patrn
del grfico de Lineweaver-Burk es claramente no paralelo, sin embargo, habr que
dterminar si las rectas se cortan en un punto sobre el eje de las ordenadas, o sobre un
punto en el segundo o tercer cuadrante. La distincin entre ambos casos debe hacerse
nuevamente al observar todo el conjunto de puntos y el empleo de la regresin lineal
aporta poco para una eleccin adecuada del conjunto de rectas y del punto de corte
entre ellas. En el caso presente es claro que el mejor patrn es un abanico de rectas
que se cortan en el eje de las ordenadas, por lo que puede decirse con facilida que el
inhibidor es competitivo. Note que a pesar de tener la misma Vmax, las curva de la
grfica directa no dan la apariencia de tener la misma asntatota. Esto se debe a que
en cada una de las series de experimentos, al estar una concentracin de inhibidor
distinta presente, se alcanza un grado de saturacin distinta de la enzima y por ello es
muy difcil decidir si todas las rectas, dada una concentracion de sustrato
suficientemente alta, alacanzarn el mismo techo. Esto recalca la dificultad de
emplear la representacin directa para el clculo grafico de los valores de Vmax y
Km. Sin embargo, con la ayuda de un programa de regresin no lineal, es posible
determinar un estimad de Km y Vmax a partir de esta representacin, cuyo valor
constituye un mejor estimado que el obtenido por cualquiera de los mtodos grficos
descritos en la literatura, salvo quiz una excepcin (ref).
b) los valores de Vmax y Km se obtiene de la serie realizada en ausencia de inhibidor
(O); aqu, Vmax = 1/0.38 (mol

min
-1
mg prot
-1
) = 2.63 (mol

min
-1
mg prot
-1
) y -1/Km
= -0.51 mM
-1
Km = -1/-0.51 mM = 1.95 mM de glutamato.

c) Finalmente, el valor de Ki puede obtenerse ahora del efecto que el inhibidor
produce sobre la pendiente de la grfica de Linewaver-Burk (que en ausencia de
inhibidor es numricamente igual a Km/Vmax). De nuevo, si se grafica el valor de
estas pendientes frente a la concentracin de inhibidor empleada (panel superior
izquierdo). El valor obtenido para Ki es ahora 2.38 mM de 2-hidroxisuccinato. Es
importante recalcar que cuando las rectas no se cortan en el eje "Y" como en este
caso, esto significar que el inhibidor ( no competitivo) producir alteraciones en los
valores de la pendiente y de los interceptos con la ordenada del grfico (1/v, 1/s), por
tanto aqu se podrn obtener dos valores de Ki (usualmente llamados Kiu y Kic,
respectivamente). Lo que representa una medida inversa de la fuerza con la que el
inhibidor se une a la enzima cuando esta tiene su sitio activo vaco (Kic) o de la fuerza
de unin a la enzima con el sitio activo ocupado (Kiu), por ello es que se obtienen dos
valores de Ki. Si todas las rectas se cortasen en un punto sobre el eje "X", esto
significara que Kiu y Kic son numricmente idnticos, pero esta coincidencia no es el
caso ms comn.
11.- En este problema se presenta un caso comn en la investigacin farmacolgica.
Se trata de buscar un inhibidor que sea efectivo contra una enzima que resulta vital
para un microorganimo y, por tanto, nos puede servir para defendernos de l. Lo
primero que observamos, es que en lugar de hacer medidas a diferentes
concentraciones de sustrato en presencia y ausencia del activador, aqu se realizaron
determinaciones de la actividad a una u otra concentracin fija de sustrato y con
cantidades crecientes del inhibidor.
a) Para identificar el tipo de inhibidor que acta, se pueden emplear diversas
estrategias, por ejemplo, se pueden ordenar los datos de manera que se tienen dos
valores de velocidad y dos concentraciones de sustrato para diferentes
concentraciones de inhibidor. Esto es lo que se hizo en la figura inferior (panel B).
Ntese que si trazaraos rectas estas cruzaran hacia el lado negativo del eje. Dado que
las medidas de actividad se realizan sin aadir producto, una velocidad negativa
carece de sentido, porque tendra que generarse sustrato en lugar de desaparecer y si
no hay producto - de dnde puede aparecer sustrato?
El resultado anterior nos indica que la cintica de esta enzima no es michaelina
(hiperblica), por lo que no podemos trazar rectas, sino que debera mos trazar
curvas en esta figura. Por lo que lo nico que podemos decir del tipo de inhibicin
con estos datos es que podra ser complejo y que se necesita ms informacin para
determinarlo.

b) Respecto al valor de I50, las curvas y los valores correspondiente se muestran en la
figura inmediata superior, panel A. Como puede observarse el valor de I50 decrese
cuando hay menor cantidad de sustrato. El valor de I50 nos indica cuanto inhibidor
requerimos para inhibir la actividad de la enzima a la mitad en una cierta condicin.
Es evidente que el resultado nos dice que si hay ms sustrato disponible el inhibidor
ser menos efectivo y refleja la existencia de un componente competitivo en la
inhibicin, lo que no significa que la inhibicin sea realmente competitiva.
c) Como puede verse, si otros inhibidores se quisieran comparar con este, primero
habra que asumir que el mecanismo de inhibicin es el mismo. Esto suele hacerse en
la investigacin farmacolgica, ya que a menudo los compuestos a ensayar son iguales
en su estructura qumica, excepto por uno o dos substituyentes. En segundo trmino,
los valores de I50 tendrn que haber sido determinados con la enzima ensayada en
condiciones idnticas, excepto por la adicin del inhibidor en estudio. Por ello, la
respuesta a la pregunta que se plantea en el problema es NO - no es posible compara
los valores puesto que no fueron medidos bajo las mismas condiciones.

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