TRABAJO PRCTICO N 7: PROBLEMAS DE CINTICA ENZIMTICA

Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cintica enzimtica, tanto de las clases tericas como de los prcticos de enzimologa 1, 2 e isoenzimas. Asimismo, deben practicar la resolucin de problemas. Los que se incluyen en esta gua son algunos ejemplos resueltos que se discutirn en clase prctica, pero se sugiere la resolucin de los otros problemas propuestos en la gua y la interpretacin de los grficos resultantes de los prcticos anteriores. Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolucin de problemas.
Problema 1: 1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparicin se mide cada 30 seg. durante 3 min. Se prepar en tubos de ensayo una serie de seis tubos con 1.5 g de enzima (peso mol 30,000) aadindose un mismo volumen de disolucin de sustrato a distintas concentraciones. Los resultados estn resumidos en la tabla. Cules son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentracin de sustrato? Tiempo (min)
0

0.5 1 1.5 2.0 2.5 3 Conc. Inicial (moles ml-1)

S 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.0

S 0.49 1.05 1.66 2.23 2.81 3.40 2.32

S 0.71 1.52 2.36 3.18 4.00 4.55

Sustrato transformado (mol) 3 4 S S 1.10 1.36 2.24 2.74 3.48 12.66 38.50

S 1.45 3.00 200.00

Solucin: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolucin testigo (0S) en el tiempo correspondiente.
1

S 0.4 9 0.9 5 1.4 6 1.9 3 2.4 1 2.9

S 0.7 1 1.4 2 2.1 6 2.8 8 3.6 -

1.1 2.1 4 3.2 8 -

S 1.3 6 2.6 4 -

1.45 2.90 -

Paso 2. Representar moles de sustrato transformado para cada concentracin frente al tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos. 1

Sustrato transformado (mol)

S
3

Tiempo (minutos) De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada concentracin de sustrato en el tramo lineal de cada curva. Estos valores sern las pendientes de las porciones lineales y sern tambin las velocidades iniciales. [1S] 2.32 2 [ S] 4.55 3 [ S] 12.66 [4S] 38.50 [5S] 200.00 x x x x x 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M
1

V= 0.95 mol min-1 2 V= 1.44 mol min-1 3 V= 2.31 mol min-1 4 V= 2.64 mol min-1 5 V= 2.90 mol min-1

Estos valores se representan unos frente a otros

Velocidad inicial (mol min-1)

Conc. Sustrato (M x 103)

Problema 2: v0 = Vmx [S] Km + [S] Utilizando la ecuacin de Micaelis-Menten, calcular el cambio en la [S] necesaria para aumentar la velocidad de una reaccin del 10 al 90 % de la velocidad mxima. SOLUCIN Poniendo v0 = 0,1 Vmx Entonces [S] = 0,1 Km + [S] [S] = (Km + [S]) . 0,1 [S] = 0,1 Km + 0,1 [S] [S] - 0,1 [S] = 0,1 Km 0,9 [S] = 0,1 Km 9 [S] = Km Es decir, Poniendo entonces [S] = Km / 9 v0 = 0,9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km, [S]90% = 9 Km = 81 [S]10% Km/9

Es decir, se debe aumentar la [S] 81 veces.

Problema 3:
Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reaccin catalizada por una enzima hipottica son: [S] (moles/l) V (moles/min) 5x10-2 0.25 5x10-3 0.25 -4 5x10 0.25 5x10-5 0.20 -6 5x10 0.071 5x10-7 0.0096 a) Cul es la velocidad mxima para esta reaccin? b) Por qu la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M c) Cul es la concentracin de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M? d) Cul es la Km de la enzima? e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6 3

y [S]=1x10-1 f) Calcular la concentracin de producto formado en los cinco primeros minutos de reaccin utilizando 10 ml de una disolucin de sustrato 2x10-3 M. SOLUCIN a) Vmax = 0.25 mol/min, ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta. b) Porque todos los enzimas est ocupados transformando un sustrato. c) Cero, todos los enzimas ocupados, a esa [S] se da la Vmax. d) Empleando la ecuacin de Michaelis, utilizando la velocidad 0.20, 0.070 0.0096 y sus correspondientes [S], como sabemos la Vmax, obtenemos una Km 0 1,25 x 10-5 moles/l. e) Sabiendo la Km y Vmax, aplicamos Michaelis utilizando esas [S], y obtenemos: V = 0,018 mol/min y V = 0,25 mol/min. f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0,25 mol/min. En 5 min 0,25 x 5 = 1,25 mol. Tenemos 10 ml de sustrato, luego 1,25 mol / 10-2 l = 1,25 x 102 mol/l

Problema 4:
Se estudi la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la reaccin: CO(NH2)2+H2O <=> CO2+2NH2 en funcin de la concentracin de urea, con los resultados siguientes: Concentracin de urea (mmoles dm-3) 30 -1 -1 V inicial (mmoles urea consumidos min mg enzima ) 3,37 Cules son los valores de Km y Vmx para esta reaccin? SOLUCIN Los datos se ordenan en la forma adecuada para una grfica lineal (por ejemplo, 1/V inicial frente a 1/[S], aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro estudio). La grfica de la doble inversa se indica en la Figura. De la grfica se puede calcular que Km es 105 mmoles dm-3 y la Vmx es 15,2 mmoles urea consumidos mg-1 min-1. Observar la distribucin de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la concentracin de sustrato al planificar un experimento. 60 5,53 100 7,42 150 8,94 250 10,70 400 12,04

0.30

1/Vinicial (mg min mmoles )

-1

0.24

0.18

0.12

0.06

0.00 0.00

0.01

0.02
3

0.03
-1

0.04

1/[urea] (dm mmoles )

Ejemplo resuelto de acuerdo con el mtodo de doble inversa o de Lineweaver-Burk.

Problema 5:
4

Se investig el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente sobre un solo sustrato, obtenindose los siguientes resultados Concentracin de sustrato (mmol L -1) Concentracin del inhibidor (mmol L -1) 0 0.5 1.0 Velocidad de reaccin 0 (mol L -1 min-1) 0.33 0.50 0.67 0.80 0.83 0.20 0.33 0.50 0.67 0.71 0.14 0.25 0.40 0.57 0.63

0.05 0.10 0.20 0.40 0.50

A) De que manera acta el inhibidor? B) Obtngase los valores para Vmx, y Km. SOLUCIN A) La manera ms sencilla de deducir cmo acta un inhibidor es graficar 1/0 en funcin de 1/[S]0 para cada concentracin del inhibidor.
8 7

1/ 0 ( mol L -1 min-1 )

6 5 4 3 2 1 0

0.5 1/Vmx

[I ] 0 (mmol L-1) [I ] 0,5 (mmol L-1) [I ] 1,0 (mmol L-1)

-15

-10

-5

10
-1 -1

15

20

25

-1/Km

1/[S] 0 [(mmol L ) ]

Grfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor A partir de la grfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los cambios en la concentracin del inhibidor pero no la interseccin en el eje 1/ 0 (1/Vmax). Por ello los datos anteriores indican que el inhibidor I est actuando como un inhibidor competitivo. B) De la interseccin en el eje 1/0 se puede estimar Vmax= 1(mol L -1 min-1) y de la interseccin con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0,1 (mmol L -1) sin ihnhibidor, Km=0,2(mmol L -1) con 0.5(mmol L -1) de inhibidor y Km=0,3 (mmol L -1) con 1(mmol L-1) 5

Problema 6:

A partir de los siguientes datos de una reaccin enzimtica, determinar de que manera est actuando el inhibidor. Determinar la Km y la velocidad mxima. [S] mM g producto/h g producto/h (sin inhibidor) (6 mM inhibidor) 2 139 88 3 179 121 4 213 149 10 313 257 15 370 313 SOLUCIN Se calculan los inversos de [S] y de v, producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se representa. Sin inhibidor: Vmax = 0,5x103 g/h y Km = 5 mM. Con inhibidor: Vmax es la misma y Km=9 mM. PROBLEMAS PARA RESOLVER
Problema 7: Calcular qu velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la velocidad mxima es igual a 100 y la concentracin de sustrato es a) 10 Km b) Km/3. Sol.: a) 91 %; b) 25% Problema 8: Una enzima cuya Km es 2,4 10 -4 M se ensaya con una concentracin de sustrato de 210 -7 M. Si la velocidad media para esta reaccin con una concentracin de sustrato de 510 -2 M fue 0.128 mmoles/min, calcular la velocidad inicial en el caso anterior. Sol.: 0.107 mol/min Problema 9: Se detect actividad de una determinada enzima en extractos de hgado y cerebro. Para dilucidar si la actividad detectada era atribuible a la misma enzima presente en ambos rganos, o a especies distintas de la enzima propias de cada rgano, se llevaron a cabo estudios cinticos con distintos sustratos. Uno de los sustratos, ensayado siempre bajo idnticas condiciones en 1 ml de volumen total incluyendo 0,1 ml de extractos de cada rgano, result ser transformado a las siguientes velocidades iniciales: Concentracin de sustrato Velocidad (moles/min) (moles/ml) Hgado Cerebro 1 0,14 0,085 2 0,23 0,14 5 0,39 0,23 10 0,50 0,30 Den las caractersticas de la enzima que puedan ser determinadas a partir de estos datos, y mustrese cules de ellas son de inters en relacin con la cuestin de la identidad de las dos enzimas. Sol.: los valores de Km son los mismos Problema 10: La fructosa difosfatasa (que cataliza la hidrlisis de la fructosa difosfato a fructosa-6-fosfato y fosfato) es inhibida por AMP. Los siguientes datos se obtuvieron a partir de un estudio de la enzima del hgado de rata: FDP (moles ml-1) 4 6 10 20 40

AMP (moles ml-1)

Velocidad inicial (moles ml-1 min-1)

0 0,059 0,076 0,101 0,125 0,150 8 0,034 0,043 0,056 0,071 0,083 Comentar estos resultados en relacin a las constantes cinticas en cada caso. Sol.: Km 8 moles ml-1; Vmx sin inhibidor 0.185 moles ml-1 min-1; Vmx con inhibidor 0.102 moles ml-1 min-1 Problema 11: Una determinada enzima cataliza la reaccin A B. Se ha observado previamente que la Vmx de esta reaccin no vara dentro de un rango de pH entre 5 y 9: Vmx= 100 moles/min/g de enzima. Por otra parte, la Km vara segn se muestra en esta figura: El ensayo fue realizado en presencia de 0,01 M sustrato, y 1 g de enzima, en cada uno de los bufferes. Qu velocidad inicial se esperara para pH 5.5 y 8? Explique. Sol.: Para pH 5.5: 50 moles/min/ g de enzima Para pH 8: 100 moles/min/ g de enzima Problema 12:

0,010 0,008

Km (M)

0,006 0,004 0,002 0,000 5 6 7 8 9

pH

Habindose conseguido aislar de Salmonella typhimurium una enzima (E) que cataliza la reaccin AP, se decidi hacer un estudio estructural y cintico de dicha enzima: [A] mM 1,00 0,55 0,25 0,20 V(mmol P/ min) 1,00 0,71 0,50 0,41 V (nmol P/min) con J 0,66 0,41 0,25 0,20 donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar. [J] = 0,25mM. a) Calcular la Km de la enzima estudiada para A, y Vmax para la transformacin A--P en presencia de E. b) Que tipo de inhibidor es J? c) Cul sera el efecto sobre la Vmax de la enzima, un aumento de la concentracin de J? Solucin: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = Vmax = 1.66 mmol P/min b) KM = 0.5 mM c) KM = 1.25 mM (con inhibidor) (Inhibicin Competitiva)
Problema 13

La cintica de una enzima viene determinada como funcin de la concentracin de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor I. [S], Mx10-5 0.3 0.5 1.0 V(mol/min) sin inhibidor 10.4 14.5 22.5 V(mol/min) con inhibidor 10-4 M 2.1 2.9 4.5 a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor b) Que tipo de inhibidor es? 3.0 33.8 6.8 9.0 40.5 8.1

Solucin: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = 50 mol/min b) Vmax = 9.5 mol/min c) KM = 1.1x10-5 M 7

d) Inh. No Competitiva
Problema 14

Qu relacin numrica existe entre Km y [S] cuando una reaccin enzimtica alcanza el 87 % de la Vmax?
Problema 15

100 ug de una enzima a 25 C descomponen en 10 min el 1% de un sustrato 0,1 M. La misma cantidad de enzima descompone en 1 min el 10% de un sustrato 10 -3 M. Calular Vmax y ctividad especfica de la enzima.
Problema 16

Una enzima se ensayo con una [S] inicial de 2.10 -5 M. en 6 min la mitad del sustrato haba reaccionado. Si la Km para el sustrato es 5x10 -3 M, calcular la Vmax y la cantidad de producto formado en 10 min de reaccin.
Problema 17

Una enzima cataliza una reaccin con una velocidad mxima de 5 moles por minuto, siendo su Km para el sustrato de 0.5 mM. Si la ponemos en presencia de una concentracin 500 mM de sustrato. Qu cantidad de sustrato se lograr transformar en 10 min?
Problema 18

La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10 -2 M. Si la concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de 59.8 g/ml, Qu proporcin de enzima estar libre y que proporcin estar combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol).
Problema 19

Calcular que velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la velocidad mxima es igual a 100 y la concentracin de sustrato es igual a) 10 Km y b) Km/3.
Problema 20

Una enzima cataliza una reaccin a una velocidad de 35moles/min cuando la concentracin de sustrato es 0.01M. La KM para el sustrato es 2x10 -5 M. Cul ser la velocidad inicial a las concentraciones de sustrato: a) 3.5x10-3 M, b)4x10-4 M, c) 2x10-4 M, d) 2x10-6 M y e) 1.2x10-6 M?
Problema 21

Calcular Km y Vmax de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representacin de Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1, y que la pendiente de dicha recta es 120 min/L.
Problema 22

Una reaccin enzimtica se lleva a cabo a diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y presencia de dos inhibidores diferentes: [Ia] = [Ib] = 1.5 mM. La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: [S] (mM) v (mol/min) v (Ia) (mol/min) v(Ib) (mol/min) 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 1.67 2.86 4.44 6.15 7.62 0.63 1.18 2.1 3.48 5.16 0.83 1.43 2.22 3.08 3.81 8

a) determinar todos los parmetros cinticos de la enzima. b) Qu tipo de inhibidor es Ia e Ib?

25 L de una preparacin de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reaccin estndar de 1 mL y a temperatura y pH ptimos, pero con distintas concentraciones iniciales de sustrato obtenindose las velocidades iniciales que se indican [S] x10-3 (mM) v (nmol/min) 303 120 149 98 128 92.6 100 83.3 80 74.6

Determine la Km y Vmax y exprese tambin la cantidad de enzima en UI/mL.

La descarboxilacin enzimtica de -cetocido procede con las velocidades iniciales para las concentraciones que se citan: [cetocido] (mM) 2.500 v (mol CO2/2 min) 0.588 Determine la Km y Vmax.
Problema 25

1.000 0.500

0.714 0.417

0.526 0.370

0.250 0.252

Qu informacin puede obtenerse a partir de una representacin grfica del mtodo de Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida, convenientemente extrapolada, corta el eje de las abscisas en -40 Litros/mol?
Problema 26

La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10 -2 M. Si la concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de 59.8 g/ml, Qu proporcin de enzima estar libre y que proporcin estar combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol)