Tecnica de Colesterol

Colestat
enzimático
Método enzimático para la determinación de colesterol
en suero o plasma
SIGNIFICACION CLINICA porciones establecidas. Es importante además, respetar el

La determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad orden de agregado de los reactivos y asegurar una perfecta
diagnóstica limitada. Se ha visto que el colesterol es uno de homogeneización de los mismos, a fin de que el Reactivo
los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado Fenol no deteriore el Reactivo de Trabajo.
que las complicaciones arterioscleróticas prevalecen en indi-
viduos hipercolesterolémicos. PRECAUCIONES
Estudios epidemiológicos demuestran que el riesgo de con- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". El fenol es
traer enfermedad cardíaca coronaria para individuos de más tóxico e irritante.
de 40 años con colesterolemia menor a 2,10 g/l es 3 veces
menor que entre individuos con más de 2,30 g/l y 6 veces ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE
menor que entre individuos con más de 2,60 g/l. ALMACENAMIENTO
Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC)
FUNDAMENTOS DEL METODO hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No mante-
El esquema reaccional es el siguiente: ner a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados.
lipasa Reactivo de Trabajo: en refrigerador y en frasco de vidrio
ésteres de colesterol > colesterol + ácidos grasos color caramelo es estable 1 mes a partir del momento de su
CHOD preparación.
colesterol + O2 > colesten-3-ona + H2O2
POD INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS
H2O2 + 4-AF + fenol > quinona coloreada + H2O REACTIVOS
Durante el uso, el Reactivo de Trabajo puede desarrollar un
REACTIVOS PROVISTOS ligero color rosado que no afecta los resultados siempre que
Standard: solución de colesterol 2 g/l. se procese un Blanco con cada lote de determinaciones y un
Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal 300 U/ml, co- Standard periódicamente. Desechar cuando las lecturas del
lesterol oxidasa (CHOD) 3 U/ml y peroxidasa (POD) 20 U/ml. Blanco sean superiores a 0,160 D.O. o las lecturas del Stan-
Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona 25 mmol/l. dard sean anormalmente bajas.
Reactivo Fenol: solución de fenol 55 mmol/l.
Concentraciones finales MUESTRA
Lipasa .................................................................. ≥ 6000 U/l Suero o plasma
CHOD ...................................................................... ≥ 60 U/l a) Recolección: se debe obtener suero o plasma de la ma-
POD ..................................................................... ≥ 400 U/l nera usual.
4-AF .................................................................. 1,25 mmol/l b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plas-
Fenol ................................................................. 2,75 mmol/l ma, se recomienda únicamente el uso de heparina como an-
pH ......................................................... 7,4 ± 0,1 (a to amb.) ticoagulante para su obtención.
c) Sustancias interferentes conocidas:
REACTIVOS NO PROVISTOS - Excepto la heparina, los anticoagulantes comunes interfie-
Agua destilada. Ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. ren en la determinación.
- Los sueros con hemólisis visible o intensa producen valores
INSTRUCCIONES PARA SU USO falsamente aumentados por lo que no deben ser usados.
Standard: mezclar por inversión antes de usar. - En sueros fuertemente hiperlipémicos puede observarse tur-
Enzimas: homogeneizar por inversión antes de usar, evitan- biedad: en tal caso, diluir el volumen final de reacción a 1/2
do la formación de espuma. ó 1/3 con Blanco de reactivos, repetir la lectura y multiplicar
Reactivo 4-AF: listo para usar. el resultado por el factor de dilución.
Reactivo Fenol: listo para usar. Ver PRECAUCIONES. - No interfieren: bilirrubina hasta 200 mg/l, ácido ascórbico hasta
Reactivo de Trabajo: según el volumen de trabajo colocar en 75 mg/l, ácido úrico hasta 200 mg/l, ni hemólisis ligera.
una probeta 50 partes de agua destilada, 5 partes de Reactivo Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las
4-AF, 5 partes de Reactivo Fenol y llevar a 100 partes con agua drogas en el presente método.
destilada. Agregar 2 partes de Enzimas previamente homoge- d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el
neizadas. Mezclar por inversión, sin agitar. Rotular y fechar. colesterol en suero es estable 1 semana en refrigerador (2-
Pueden prepararse distintas cantidades respetando las pro- 10oC) y 2 meses congelado, sin agregado de conservadores.
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MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Otras causas de resultados erróneos son:
- Espectrofotómetro o fotocolorímetro. - Los reductores disminuyen la respuesta de color mientras
- Micropipetas, pipetas y material volumétrico adecuados. que los oxidantes colorean el Reactivo aumentando los Blan-
- Frasco de vidrio color caramelo. cos. Dichos agentes son frecuentemente encontrados en el
- Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas de agua destilada empleada para preparar el Reactivo de Traba-
caras paralelas. jo, por lo que se recomienda controlar la calidad de la misma.
- Baño de agua a 37°C (opcional). - Los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibido-
- Reloj o timer. res enzimáticos.
- Incubación incorrecta. El nivel del agua en el baño no debe
CONDICIONES DE REACCION ser inferior al de los reactivos en los tubos.
- Longitud de onda: 505 nm en espectrofotómetro o en fotoco- - Uso del Standard de un equipo con los reactivos de otro. Los
lorímetro con filtro verde (490-530 nm). reactivos y el Standard de cada equipo forman un conjunto
- Temperatura de reacción: 37°C perfectamente controlado y estandarizado.
- Tiempo de reacción: 15 minutos
- Volumen de muestra: 20 ul PERFORMANCE
- Volumen de Reactivo de Trabajo: 2 ml a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas
- Volumen final de reacción: 2,02 ml muestras en 10 días diferentes, se obtuvo:
Los volúmenes de Muestra y Reactivo pueden aumentarse o Nivel D.S. C.V.
disminuirse proporcionalmente (Ej.: 10 ul de Muestra + 1 ml 1,57 g/l ± 0,033 g/l 2,32 %
de Reactivo de Trabajo o 50 ul + 5 ml). 2,90 g/l ± 0,065 g/l 2,23 %
4,71 g/l ± 0,102 g/l 2,13 %
PROCEDIMIENTO b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de co-
En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofoto- lesterol a distintos sueros, se obtuvo una recuperación entre
métricas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D (Desco- 98 y 101%, para todo nivel de colesterol entre 1,90 y 4,79 g/l.
nocido), colocar: c) Límite de detección: depende del fotómetro empleado y
de la longitud de onda. De acuerdo con la sensibilidad re-
B S D querida, el cambio mínimo de concentración detectable para
Standard - 20 ul - 0,001 D.O. será aproximadamente de 0,007 g/l.
d) Linealidad: la reacción es lineal hasta 5 g/l. Para valores
Muestra - - 20 ul superiores, diluir 1/2 con el Blanco y repetir la lectura multipli-
Reactivo de Trabajo 2 ml 2 ml 2 ml cando el resultado final por 2.
Incubar 15 minutos en baño de agua a 37oC o 30 minutos
a temperatura ambiente (25oC). Leer en fotocolorímetro con PRESENTACION
filtro verde (490-530 nm) o en espectrofotómetro a 505 nm, Equipo para 250 ml de Reactivo de Trabajo (Cód. 1220101).
llevando el aparato a cero con el Blanco. Equipo para 1000 ml de Reactivo de Trabajo (Cód. 1220102).
Empleando los reactivos de Colestat enzimático junto con
HDL-Colesterol Reactivo Precipitante o HDL-Colesterol
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL FT y LDL-Colesterol Reactivo Precipitante (provistos se-
El color de reacción final es estable dos horas, por lo que la paradamente por Wiener lab.) es posible determinar el coles-
absorbancia debe ser leída dentro de este lapso. terol ligado a las lipoproteínas de alta densidad (HDL-coleste-
rol) y a las lipoproteínas de baja densidad (LDL-colesterol).
CALCULO DE LOS RESULTADOS
2,00 g/l BIBLIOGRAFIA
colesterol (g/l) = D x f donde f = - Allain, C.C. et al. - Clin. Chem. 20:470 (1974).
S - American Health Foundation - Position statement on diet
and coronary heart disease - pág. 255 (1972).
METODO DE CONTROL DE CALIDAD - Castelli, W.P. - Current Prescribing 6/77:39 (1977).
Standatrol S-E 2 niveles. - Flegg, A.S. - Ann. Clin. Biochem. 10:79 (1973).
- I.F.C.C. - Clin. Chim. Acta 87/3:459 F (1978).
VALORES DE REFERENCIA - Trinder, P. - Ann. Clin. Biochem. 6/24 (1969).
El panel de expertos del National Cholesterol Education Pro- - Coniglio R.I. - Acta Bioq. Clin. Latinoam. XXIII/2:201, 1989.
gram (NCEP) provee los siguientes valores de colesterol: - Expert Panel of National Cholesterol Education Program -
Deseable: < 2,00 g/l JAMA 285/19:2486 (2001).
Moderadamente alto: 2,00 - 2,39 g/l - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",
Elevado: ≥ 2,40 g/l AACC Press, 4th ed., 2001.
No obstante, se recomienda que cada laboratorio establezca Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
sus propios intervalos o valores de referencia. Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Wiener lab.
Producto Inscripto M.S.
Disp. Nº: 5983/83 - 5660/99 2000 Rosario - Argentina
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