Escuela de Tcnicos en Hemoterapia e Inmunohematologa UBA Hospital de Clnicas

INMUNOHEMATOLOGIA. C.- Consideraciones generales. Uso de diferentes medios: salino, albuminoso, soluciones de baja fuerza inica (LISS), enzimtico, polybrene, polietilenglicol, antiglobulnico, etc. Diferentes enfoques de la compatibilidad pretransfusional. Interpretacin de los resultados de las tcnicas de deteccin de anticuerpos y pruebas pretransfusionales.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell

Aglutinacin
La aglutinacin es la agregacin,
mediada por anticuerpos, de las partculas que expresan antgenos de superficie. Tiene dos etapas

1. Sensibilizacin 2. Formacin de puentes entre las clulas sensibilizadas.

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Hemlisis
La hemlisis es la destruccin de los glbulos rojos,

con liberacin de la hemoglobina intracelular La hemlisis no ocurre si los antgenos interactan con los anticuerpos en sueros sin complemento o plasma con anticoagulante La hemlisis constituye un resultado positivo

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Uniones qumicas en la aglutinacin

Uniones polares

Puentes de hidrogeno entre grupos hidroflicos Suelen asociarse a antgenos hidrocarbonados En general involucran a antgenos proteicos

Uniones hidrfobas
London

Uniones o fuerzas de Van der Waals

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Factores a tener en cuenta

El grado de ionizacin de
las molculas
Depende fundamentalmente del pH del medio

Constante de equilibrio
(afinidad de los anticuerpos)
Deriva de las tasas relativas de asociacin y disociacin
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Factores que afectan la aglutinacin (primera fase)

Temperatura PH

Los antgenos hidrocarbonados suelen relacionarse

con anticuerpos reactivos en fro y los proteicos con anticuerpos reactivos en caliente

En la mayora de las pruebas de rutina debe

emplearse un pH de alrededor de 7 La solucin salina almacenada tiene un pH de 5-6 Es mejor usar solucin salina amortiguada

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Factores que afectan la aglutinacin (primera fase)

Tiempo de incubacin
En los sistemas salinos que utilizan suero antiglobulnico para demostrar la fijacin, la incubacin a 37C durante 30-60 minutos permite detectar la mayora de los anticuerpos significativos Lo habitual es usar dos gotas de suero por cada gota de suspensin de glbulos rojos al 2-5% Muy rara vez, el exceso de anticuerpos puede inhibir la aglutinacin y provocar un fenmeno de prozona

Relacin Ag / Ac

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Factores que afectan la aglutinacin (primera fase)

Potencia inica

Cuando se utiliza solucin salina de baja fuerza

inica (LISS) el tiempo de incubacin a 37C se reduce a 10-15 minutos El uso de LISS abrevia la incubacin en la deteccin de anticuerpos de rutina Prolongarla podra deteriorar la sensibilidad de la prueba

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Segundo estado de la aglutinacin

La distancia entre los eritrocitos en un medio inico es proporcional al potencial Z

El agua de hidratacin es la propiedad fsica ms importante que mantiene la distancia entre los glbulos rojos suspendidos en solucin salina
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Proporciones

La inhibicin de la aglutinacin por exceso de anticuerpos es sumamente infrecuente

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Para visualizar la reaccin Ag/Ac:

La centrifugacin promueve el acercamiento
fsico de las clulas La prueba antiglobulnica indirecta emplea suero antiglobulnico Otros mtodos actan:
reduciendo la carga negativa de las molculas superficiales disminuyendo la capa de hidratacin que rodea a las clulas introduciendo macro molculas con carga positiva que las agregan
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Mtodos Potenciadores
Albmina Humana LISS (Low ionic saline solution) PEG (Polietilenglicol) POLYBRENE (BHDM) Tcnicas con enzimas proteolticas

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(Sol de albmina bovina al 30%, 22%, 6%, 3%)

ALBUMINA

Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2

fase de la aglutinacin. En concentraciones de 30% o >favorece la aparicin de rouleaux En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba Por falta de ventajas objetivas est en desuso
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Enzimas Proteolticas
Bromelina, ficina, papana y tripsina
(Las ms usadas)

Desnaturalizan ciertos antgenos eritrocitarios, en

especial M, N, S, Fya y Fyb, XG Disminuyen la carga superficial de los GR por clivaje de las molculas de cido silico de las cadenas polisacridas El tratamiento enzimtico lleva a la formacin de espculas en los GR y aumenta as el nmero potencial de puntos de contacto
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Bromuro de Hexadimetrina, Sulfato de Protamina,

Polilisina B.

Molculas con carga positiva

Ante estos polmeros los GR normales exhiben

agregacin espontnea, que puede dispersarse con sales neutras como el citrato de sodio

El BHDM es un polcatin de amonio cuaternario

que neutraliza las cargas negativas de los GR.

Favorecen la aglutinacin por Ig G

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POLYBRENE
El Polybrene se aade a los GR incubados con
anticuerpos a baja potencia inica y bajo pH Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la carga del GR Si el aglutinado se disocia
prueba negativa

Si el aglutinado persiste Tiene sensibilidad disminuida en la deteccin de

anticuerpos del sistema Kell
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prueba positiva (aglutinacin irreversible a los GR sensibilizados con Acs)

Polietilenglicol (PEG)
El PEG es un polmero lineal hidrosoluble que se

usa como aditivo para incrementar la captacin de anticuerpos Su accin principal es eliminar el agua intercelular favoreciendo el acercamiento de los GR No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR
Se lavan las clulas con solucin salina y luego se efecta la prueba antiglobulnica

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Polietilenglicol (PEG)
El reactivo AGH de eleccin en las pruebas con PEG suele ser el anti-IgG evita las reacciones falsas positivas con
algunos agentes poliespecficos

Precipitados podran interpretarse como reacciones positivas

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 Potencia mucho la captacin eritrocitaria de

anticuerpos en la fase I de la aglutinacin
La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al de la SF (0.17M)

Solucin salina de baja fuerza inica (LISS)

En la actualidad la mayora de los

profesionales usa aditivos LISS Contiene macromolculas adems de sales inicas y amortiguadores
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Solucin salina de baja fuerza inica (LISS)

Puede aumentar hasta 1000 veces la

afinidad entre Ags y Acs El aumento del volumen de suero acrecienta la potencia inica del sistema LISS aditivo Se deben respetar estrictamente las instrucciones del fabricante
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LISS
Ventajas:
Aumenta la sensibilidad de la PCI para detectar Acs clnicamente significativos Detecta Acs en baja concentracin y los de baja afinidad que pueden perderse con los lavados Reduce el tiempo de incubacin

Desventajas:
Debe ser sometido a estricto control de osmolaridad para evitar la fijacin inespecfica de C Los GR suspendidos el LISS deben ser procesados dentro de las 24 hs Menor sensibilidad para anti-K. (1 fase de aglutinacin)

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Otros Mtodos para detectar reacciones Ag-Ac

Adherencia
eritrocitaria en fase slida (Microplacas)

Pruebas

Inmunoabsorbentes ligadas a las enzimas (ELISA)

Aglutinacin en

columna, pruebas en gel y separacin por afinidad

Inmovilizacin de

Antgenos Eritrocitarios con Anticuerpos Monoclonales Especficos (IAEAM)

Inmunofluorescencia Radioinmunoensayo
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Gel, microcolumnas
Las reacciones se producen en
microcolumnas que contienen mezclas de cuentas de vidrio o gel, amortiguadores y a veces reactivos Se establecen barreras de densidad permiten separar el suero problema de los eritrocitos Una de sus ventajas es que se evita el lavado con solucin salina
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Micromtodos, Microplacas
Utilizan antgenos o anticuerpos
inmovilizados Existen mtodos manuales, semiautomatizados y automatizados En la prueba indirecta si las clulas indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reaccin es positiva Si sedimentan no se produjo reaccin Ag-Ac
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Hacemos un breve intervalo

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Prueba antiglobulnica, principios

Todas las molculas de anticuerpo son
globulinas

Los dos puntos Fab de la molcula de

AGH forman un puente entre clulas adyacentes recubiertas con anticuerpos y provocan aglutinacin visible

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AGH poliespecfico
La mezcla poliespecfica podra reaccionar
con las cadenas livianas kappa y lambda presentes en todas las clases de inmunoglobulinas Muy pocas veces se reconoce a los anticuerpos por su capacidad de fijacin de complemento La actividad anti-C3d es importante para la PAD
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Reactivos AGH monoespecficos

Anti-IgG, anti-C3b, anti-C3d Anti-IgG
Carecen de actividad anti- complementaria

Pueden ser o no especficos para cadenas

pesadas Pueden ser o no Monoclonales

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Deteccin de anticuerpos antieritrocitarios inesperados. (DAI)

Objetivos:
Detectar la mayor cantidad posible de anticuerpos significativos Detectar la menor cantidad posible de anticuerpos no significativos Completar los procedimientos en un lapso razonable

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Muestras

Se puede utilizar suero o plasma El plasma no es adecuado para apreciar la

activacin del complemento Los GR de donantes mltiples se emplean en la evaluacin de muestras de donantes pero no de receptores

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Deteccin de anticuerpos antieritrocitarios inesperados. (DAI)

La pesquisa de anticuerpos inesperados

requiere:
GR reactivos de donante nico Mtodos que identifiquen a los Acs significativos Que incluyan una prueba antiglobulnica precedida de incubacin a 37C

La magnitud de la aglutinacin o el grado

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de hemlisis debe registrarse de inmediato

Pruebas de compatibilidad
Si se identifican o identificaron anticuerpos
relevantes el paciente debe recibir sangre sin los antgenos correspondientes aunque los GR portadores de esos antgenos sean compatibles in

vitro

La evaluacin pretransfusional no requiere control

autlogo ni PAD La tcnica de compatibilidad ms simple es la centrifugacin inmediata Detecta la incompatibilidad ABO y pueden detectarse anticuerpos anti-M, anti-N y anti-P1
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Compatibilidad informatizada
Fundamento: Si la pesquisa y los antecedentes no revelan anticuerpos significativos, es factible omitir la prueba cruzada en fase antiglobulnica y slo confirmar la compatibilidad ABO Su mayor dificultad radica en la validacin de la metodologa a utilizar

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Tipificacin y deteccin
(Type and Screen)

La metodologa de tipificacin y deteccin

consiste en determinar el tipo ABO y Rh y la presencia de anticuerpos imprevistos en una muestra de sangre del paciente y luego guardarla para una eventual prueba cruzada Su indiscutible ventaja es de tipo logstico

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Seleccin de unidades para transfusin

Despus de identificar los anticuerpos es

preciso definir su significado clnico El grado de relevancia clnica podra variar an en el caso de anticuerpos de igual especificidad Los anticuerpos reactivos a 37C y/o en la PAI, podran ser relevantes y los reactivos a temperatura ambiente o menor, no

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Excepciones a los resultados de las pruebas de rutina

Anti-Ch, anti-Rg y muchos de los Knops y

Cost, ejercen efectos clnicos mnimos o nulos a pesar de la PAI positiva Los anti-Vel, anti-P y anti-Tja podran reaccionar slo a bajas temperaturas y an as causar destruccin celular in vivo

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Gracias por su atencin

medicinatransfusional@hotmail.com
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