Mezcal

Ao 2012 Volmen 16 Nmero BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 161No.
1 ISSN 0188-4786
COMIT EDITORIAL MESA DIRECTIVA Dr. Alfredo Martnez Jimnez Presidente Dr. Gerardo Saucedo Castaeda Vice-Presidente Dr. Octavio Loera Corral Secretario Dr. Mauricio Trujillo Roldn Tesorero Dra. Romina Rodrguez Sanoja Subsecretaria Dr. Carlos Regalado Gonzlez Vocal Profesional M. en B. Maria Teresa Torres Mancera Vocal Estudiante Dr. Sergio Snchez Esquivel Editor en Jefe Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM Dr. Luis Bernardo Flores Cotera CINVESTAV Dr. Fernando Luis Garca Carreo CIBNOR Dr. Mariano Gutirrez Rojas UAM-I Dra. Romina Rodrguez Sanoja Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM Dra. Sara Sols Pereira Instituto Tecnolgico de Mrida Dra. Elizabeth Langley McCarron Instituto Nacional de Cancerologa DISEO GRAFICO E IMAGEN Lic. Nayeli Quinto (SODIO NET) ADSCRIPCIONES Y PUBLICIDAD FORMACION EDITORIAL Ing. Rubn Castillo Alamilla Ing. Rubn Castillo Alamilla Tel: (55) 5849 5859 Email: smbiotec@yahoo.com.mx
COORDINADOR EDITORIAL Ing. Rubn Castillo Alamilla
ISSN 0188-4786, revista cuatrimestral publicada por la Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera, A.C. incluida en PERIDICA, ndice de Revista Latinoamericanas en Ciencias (CICHUNAM). Certificado de Licitud de Ttulo en trmite y Certificado de Licitud de Contenido en trmite. Reserva de derechos de Ttulo04-1999-082516265000-101. Los Conceptos que en ella aparecen son responsabilidad exclusiva de los autores. Se prohbe la reproduccin total o parcial de su contenido sin previa autorizacin por escrito del Comit editorial. Toda correspondencia deber enviarse a Km. 23.5 Carretera Federal Mxico-Cuernavaca, Av. Cipreses s/n, Col. San Andrs Totoltepec, C.P. 14400, Del. Tlalpan, Mxico, D.F. Tiraje 500 ejemplares.
BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1
Editorial Ventajas del uso de Cocultivos en Biotecnologa

Ma. del Carmen Wacher Rodarte
4 6
Instrucciones para autores ARTCULOS Biologa Sinttica: Diseando Sistemas Biolgicos con Piezas Genticas
Daniel Aguilar-Salvador, Isabel ngeles-Santander, Mauricio A. Trujillo-Roldn, Norma A. Valdez-Cruz
11
Uso de Enzimas en Solventes Orgnicos en la Industria de Bioprocesos

Claudia Maytorena-Verdugo y Fernando Garca-Carreo
21
Potencial de los Marcadores Moleculares para el Rescate de Individuos de Theobroma cacao L. de Alta Calidad
Alfredo Vzquez-Ovando, Francisco Molina-Freaner, Juan Nuez-Farfn, Miguel Salvador-Figueroa
36
Aspectos Qumicos y Moleculares del Proceso de Produccin del Mezcal

Pilar Escalante-Minakata, Ana P, Barba de la Rosa, Leticia Santos y Antonio De Len-Rodriguez
57 71 75
Resea Comisin de Premios XIV Congreso Nacional

Dra. Romina Rodrguez Sanoja
Informe Financiero XIV Congreso Nacional

Dr. Mauricio Trujillo Roldan
EDITORIAL
Ventajas del uso de Cocultivos en Biotecnologa

En biotecnologa la mayora de los productos se obtienen usando una cepa pura, ya que de esta manera se facilita el control del proceso. Se esteriliza el medio de cultivo y se inocula con un cultivo; sin embargo, en la naturaleza la mayora de los microorganismos se encuentran formando parte de comunidades microbianas, en las que se obtienen productos mediante la combinacin de vas metablicas de diferentes microorganismos. Algunos procesos, como los que ocurren en las compostas, en el intestino humano o en los alimentos fermentados tradicionales, actan microbiotas mixtas, las cuales son por lo general complejas. Bader et al. (2010) distinguen estos cultivos mixtos, de los cuales comnmente no se conoce qu microorganismos los componen, de los cocultivos, que se forman mezclando microorganismos conocidos y se llevan a cabo en condiciones aspticas. Dentro de las ventajas del uso de los cocultivos se encuentran: el incremento en el rendimiento del producto con respecto al del cultivo puro, la produccin de diferentes compuestos debida a la sucesin en el crecimiento de diferentes microorganismos, la estabilizacin de alimentos, al tener cepas que produzcan compuestos antimicrobianos. Asmismo, es posible usar en vez de glucosa sustratos ms baratos, como algn residuo lignocelulsico, junto con un cocultivo que incluya microorganismos capaces de degradar el sustrato, junto con los que pr usen los productos de esta degradacin para crecer y producir el compuesto de inters. Esto abaratara considerablemente el proceso. Los efectos de los cocultivos se deben a que existen interacciones entre los microorganismos que forman parte del complejo. En la mayora de los casos se busca una interaccin positiva entre los miembros de un cultivo, es decir, se incluye un miembro cuya accin sera benfica para uno o todos los integrantes de un cocultivo. En este caso una cepa estara sacrificando su propio bien en aras del bien de la comunidad y este es un tema a investigar en ecologa microbiana.
EDITORIAL
Existe un gran potencial en el uso de cocultivos o de cultivos mixtos para mejorar los procesos biotecnolgicos. Es necesario entonces conocer ms sobre los cultivos mixtos naturales y sus interacciones, para aprovechar no solamente lo que un cultivo puro puede proporcionar, sino tambin lo que es capaz de hacer en equipo. En este nmero se incluyen contribuciones tanto del estudio de un alimento fermentado por un cultivo mixto, como otro en el cual se propone el diseo de sistemas biolgicos.
Ma. del Carmen Wacher Rodarte Departamento de Alimentos y Biotecnologa Facultad de Qumica Universidad Nacional Autnoma de Mxico E-mail: wacher@unam.mx
Gua de Autores
La revista puede recibir trabajos de investigacin original as como de revisin en los campos de la biotecnologa y bioingeniera. Todos los manuscritos sern sujetos a revisin por al menos dos miembros del Comit Editorial y debern contar con una recomendacin de aceptacin para ser publicados. Los idiomas de la revista son el Espaol y el Ingls. Los trabajos se escribirn en hoja tamao carta (21.6 cm x 27.6 cm). Los mrgenes aplicados a todo el manuscrito sern de 2.5 cm para los extremos superior e inferior, as como 3 cm de cada lado. Las pginas debern estar numeradas en la parte inferior y central de cada hoja. Se recomienda que los trabajos completos tengan un mximo de 25 pginas, escritas con un interlineado de 1.5 renglones, incluyendo las tablas y figuras. Las publicaciones de trabajos originales y revisiones en la revista Biotecnologa estn exentas de costo para los autores. Cuando corresponda, se recomienda el uso de abreviaturas para referirse a unidades de tiempo (h, min, s), de volumen (l, ml, l), de peso (kg, g, mg, g), DNA, RNA y otras comnmente aceptadas en la literatura cientfica. Los trabajos de investigacin original pueden tocar cualquiera de los diversos campos que cultivan la biotecnologa y la bioingeniera, desde sus aspectos fundamentales hasta las aplicaciones de los mismos, incluyendo: microbiologa, bioqumica y biologa molecular, procesos y proyectos, as como biotecnologa marina y biotecnologa aplicada a la salud, alimentos, agricultura, veterinaria, enzimas y ambiente. Los trabajos de investigacin original sern divididos en las siguientes secciones: Introduccin, Materiales y mtodos, Resultados, Discusin, Referencias y Agradecimientos. Las secciones de Resultados y Discusin pueden presentarse combinadas. Los trabajos de revisin incluirn el tema y subtemas que a juicio de los autores sean necesarios para la mejor presentacin de la informacin. Estos trabajos pueden cubrir los siguientes contenidos: 1. Qu es y para qu sirve la Biotecnologa?. Es decir: descripciones que ilustren y divulguen los distintos campos de la biotecnologa, sus alcances y limitaciones, su historia y sus perspectivas. 2. Las fronteras de la biotecnologa: revisiones de nuevos campos o nuevas aplicaciones de la biotecnologa. Por ejemplo: las perspectivas del uso de los genomas para el desarrollo de nuevas drogas o para el tratamiento de enfermedades metablicas. Las perspectivas de la genmica (estudio sistemtico de los genes y sus aplicaciones), la protemica (prediccin de la expresin de los genes en protenas funcionales) y la fenmica (prediccin de fenotipos o conductas de los organismos, en base a sus genes y a sus protenas). El uso de la ingeniera gentica para hacer ingeniera metablica. Los nuevos tipos de reactores biolgicos y los fenmenos de transporte implicados. Los nuevos esquemas de reaccin, separacin y control en procesos biotecnolgicos.
3. Aplicaciones de la Biotecnologa para resolver problemas o atender necesidades de la sociedad, con especial atencin a sus aplicaciones ya vigentes en Mxico. Esta seccin ser dedicada a una empresa o institucin (pblica o privada) que desee difundir los logros obtenidos en algn campo de la biotecnologa. Por ejemplo: empresas productoras de antibiticos o productos biolgicos, empresas de ingeniera ambiental que usen procesos biotecnolgicos, empresas agropecuarias, forestales o de acuacultura que usen tecnologas biolgicas avanzadas, o empresas de transformacin de alimentos que utilicen enzimas, cultivos de microorganismos, etc. Esta lista es indicativa pero no exhaustiva. 4. Problemas de bioseguridad, biotica y biodiversidad relacionados con las aplicaciones de la biotecnologa a la sociedad. Por ejemplo: anlisis y comentarios sobre los debates acerca del uso de semillas transgnicas, los problemas de conservacin y explotacin de la biodiversidad mediante la biotecnologa, los riesgos del uso de organismos transgnicos en diversos campos de la industria, los problemas de bioseguridad del uso de antibiticos y otros productos biotecnolgicos. 5. La educacin, la cultura y la difusin tecnolgica en relacin con la biotecnologa. Por ejemplo: comentarios de planes y programas, de estilos y necesidades de la enseanza, del enfoque interdisciplinario, en carreras o planes de estudio directamente ligados con la biotecnologa. Tambin necesidades y modalidades sobre programas de extensin educativa para la industria, para el pblico consumidor o para grupos selectos de personas interesadas en la biotecnologa (polticos, funcionarios de empresas, lderes de opinin). El uso de la informtica en la difusin de la biotecnologa, y en general, el anlisis de necesidades, mtodos y alternativas para difundir los conocimientos de la biotecnologa. 6. Oportunidades y propuestas para mejorar la cooperacin y el desarrollo biotecnolgicos. Por ejemplo: Anlisis de las oportunidades vigentes de intercambio acadmico o comercial en biotecnologa. Propuestas de nuevas formas de cooperacin entre los sectores de investigacin y la industria biotecnolgica. Anlisis y propuestas del uso ptimo de recursos humanos, financieros o materiales para mejorar la cooperacin o el desarrollo de la biotecnologa. En esta seccin se dar espacio a los anlisis, crticas o propuestas de los aspectos legales y fiscales que afecten e incluso puedan mejorar el desarrollo de la biotecnologa en Mxico. Tales como: la propiedad industrial, el rgimen fiscal de las empresas, el costo del desarrollo biotecnolgico y los subsidios o estmulos econmicos para el desarrollo de la biotecnologa. Tanto los trabajos de investigacin original como las revisiones debern apegarse al siguiente formato: 1. El ttulo del manuscrito ser puesto en negritas con letra Arial o equivalente tamao 14. El ttulo deber estar centrado. 2. El nombre de los autores ocupar los siguientes renglones escribiendo el nombre y primer apellido de cada participante. Se usar letra Arial o equivalente tamao 12. Los nombres de los
participantes debern estar centrados, sealando con un asterisco el autor responsable de la publicacin. En el siguiente rengln con letra itlica Arial del mismo tamao, se incluir la direccin postal de la institucin de adscripcin de los autores, as como el e-mail del autor corresponsal. 3. Se deber aadir un Resumen de no ms de 250 palabras en Espaol y un Abstract en Ingls de tamao similar. 4. Se incluirn entre 3 a 6 Palabras clave: que permitan clasificar el artculo en una base de datos. Estas palabras debern de incluirse en Espaol y en Ingls (Key words:). 5. Si el texto inicia con el nombre de algn subtema, ste de pondr como primera lnea en cursivas con letra Arial o equivalente tamao 10. Despus en el siguiente rengln se iniciar el texto descriptivo usando letra Arial o equivalente tamao 10. El texto deber ser escrito con un interlineado de 1.5 renglones. Se deber dejar un espacio de un rengln al inicio de una seccin o subtema nuevo. Los gneros y especies debern escribirse en letras itlicas. 6. Las figuras debern numerarse con arbigos, correlativamente en orden de aparicin en el texto. No se integrarn al texto, sino al final del manuscrito. No obstante, para facilitar el trabajo de edicin, se recomienda indicar la ubicacin de las mismas en el momento en que son mencionadas por primera vez en el texto. Las figuras deben incluir un breve ttulo explicativo en la parte inferior de la misma. Si es necesario incluir fotos, stas se debern designar como figuras. La impresin de las figuras e imgenes se har en blanco y negro, por lo que se recomienda que muestren un buen contraste, en especial las figuras con varias lneas. Segn el orden de aparicin en el texto, las tablas tambin se numerarn con arbigos ubicados en la parte superior de las mismas e incluirn un breve ttulo explicativo. Las notas en las tablas debern ser indicadas con letras minsculas en superndice. La ubicacin de las tablas ser sealada en el texto pero se anexarn en hojas separadas despus de las Referencias. 7. La informacin dada como referencias bibliogrficas deber permitir a los lectores llegar con facilidad a tal fuente de informacin original, si ello fuera necesario. En el texto del trabajo, las referencias se citan por autor y ao entre parntesis red ondos. Por ejemplo: Martnez & Garca (1999) han demostrado que..., o bien, Datos recientes (Martnez & Garca, 1999) han demostrado que.... Si la cita posee varios autores se escribira como sigue: Gutirrez et al. (2003), han demostrado. O bien: Datos recientes (Gutirrez et al., 2003) han mostrado Si la cita es es una pgina de Internet, sta deber ponerse completa entre parntesis directamente en el texto donde se mencione. La lista de Referencias se deber escribir con el mismo tipo de letra del texto principal (Arial tamao 10) de acuerdo al siguiente formato:
Para revistas: Garca-Carreo F, Cota K & Navarrete del Toro MA (2008) Phenoloxidase activity of hemocyanin in whiteleg shrimp, Penaeus vannamei: conversion, characterization of catalytic properties, and role in postmortem melanosis. J. Agric. Food Chem. 56: 6454-6459. Para libros y captulos de libros: (Libro) Ullrich M (2009) Bacterial Polysaccharides: Current Innovations and Future Trends. Horizon Scientific Press, Norwich. (Captulo de libro) Snchez S & Demain AL (2009) Metabolic regulation and overproduction of primary metabolites. In: Encyclopedia of Industrial Biotechnology. Bioprocess, Bioseparation, and (EIB). Flickinger MC (ed). John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. pp. 396-458. Para patentes: Fenical WH, Jensen PR & Kwon HC (2009) Polyol macrolide antitumor-antibiotics from the marine actinomycete strain CNQ140. US patent 7,521,414. Para congresos y reuniones: Se aceptarn un mximo de dos citas de este tipo. Reyes N, Domnguez RM, Islas I & Solis S (2007) Induccin diferencial por pH y temperatura del Complejo pectinoltico producido por clulas inmovilizadas de Aspergillus HL. XII Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera. Morelia Mich. Mxico. OIII-12. Para citas provenientes de internet: Se aceptar un mximo de dos citas de este tipo. Van Deuren J, Wang Z & Ledbetter J (1997) Remediation Technologies Screening Matrix and Reference Guide. 3 Ed. Technology Innovation Office, EPA. Disponible en: http://www.epa.gov/tio/ remed.htm. Revistas electrnicas: Sun J, Lu X, Rinas U, & Zeng AP (2007) Metabolic peculiarities of Aspergillus niger disclosed by comparative metabolic genomics. Genome Biol. 8: R182. Cell Technology
Para tesis de pre y posgrado: Crdenas C (2009) Evaluacin del uso biotecnolgico de la semilla de Ditaxis heterantha para la Produccin de safranal. Tesis de Maestra en Ciencias Bioqumicas. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico D.F. pp. 1-78.
Cada autor es responsable de la precisin de las citas que emplea. Las citas de internet, congresos y reuniones, debern evitarse al mximo. Una vez que ha sido revisado y aceptado su trabajo, los autores debern enviar una carta de cesin de los Derechos de Autor, de manera que la Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera pueda hacer uso del artculo aceptado, o parte de l, con fines de divulgacin y difusin de la actividad cientfica y tecnolgica. En ningn caso, dichos derechos afectan la propiedad intelectual que es propia de los autores, para usar la totalidad o parte de ese artculo con fines no lucrativos. Los trabajos solamente se reciben va correo electrnico en la direccin smbiotec@yahoo.com.mx Al momento de recibirlo, se enviar un acuse de recibo al autor corresponsal, por lo que se pide incluir una direccin de correo electrnico para este fin, as como para mantener comunicacin con el editor sobre la evolucin de la revisin y sobre la aceptacin del mismo. Una vez aceptados, los trabajos son editados y enviados a los autores para su correccin. En esta condicin no se permitirn cambios sustanciales en el contenido de los mismos sin la aprobacin del editor en jefe. Una vez aprobada la prueba, el trabajo se publicar en lnea y podr ser consultado en la pgina de la Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera AC http://www.smbb.com.mx/ La publicacin en lnea preceder a la publicacin impresa.
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Biologa Sinttica: Diseando Sistemas Biolgicos con Piezas Genticas

Daniel Aguilar-Salvador, Isabel Angeles-Santander, Mauricio A. Trujillo-Roldn, Norma A. Valdez-Cruz * Departamento de Biologa Molecular y Biotecnologa, Instituto de Investigaciones Biomdicas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, A.P. 70228, Mxico D.F., C.P. 04510, Mxico * Correspondencia: adrivaldez1@gmail.com
RESUMEN La biologa sinttica es una nueva rea de la biologa y la tecnologa que fusiona la biologa molecular, la ingeniera gentica y herramientas computacionales, para crear sistemas biolgicos con funciones novedosas. Los sistemas creados sintticamente son ya una realidad, y cada vez se acumulan ms trabajos alrededor del mundo que muestran su factibilidad. En este campo no slo se hacen pequeas modificaciones en la informacin gentica, sino que tambin se disean, manipulan, simulan e introducen circuitos genticos a los organismos. Con este nuevo enfoque cientfico, se estn abordando distintos problemas tecnolgicos, como nuevas formas de sntesis y produccin de biocombustibles, biofrmacos, nanoestructuras, entre otras, permitiendo la innovacin y desarrollos en la generacin de energa, biomedicina y biologa celular, as como en las ciencias de materiales. En este artculo se presenta una breve resea de interesantes logros de la biologa sinttica. Entre ellos, la manipulacin de E. coli para producir protenas estables mediante recombinacin homloga simulando la biosntesis de anticuerpos variables, basadas estructuralmente en las molculas DARPinas derivadas de ankirinas, las cuales presentarn afinidad por diferentes sustratos. Palabras clave: Biologa sinttica, Ingeniera gentica, Biopartes, Anticuerpos, DARPinas.
ABSTRACT Synthetic biology is a new area of biology and technology that fuses molecular biology, genetic engineering and computational tools, to create biological systems with novel functions. Systems synthetically created are now a reality, and the accumulation of more works around the world, shows their feasibility. In this field, not only minor modifications to genetic information in organisms are made, genetic circuits are designed, manipulated, simulated, built and introduced to whole organisms. With this new scientific approach, various technological problems are being addressed, such as new forms of synthesis and production of biofuels, biopharmaceuticals, nanostructures, among others, allowing innovation and developments in power generation, biomedical and cell biology as well as in the materials science. This article provides a brief overview of interesting
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achievements of synthetic biology. Among them, the manipulation of E. coli to produce stable proteins by homologous recombination (mimicking the biosynthesis of antibodies variability), based on the structure of DARPinas derived from ankyrins, which will have affinity for different substrates. Keywords: Synthetic biology, Genetic engineering, Biobricks, Antibodies, DARPins.
LA BIOLOGA SINTTICA La promesa de la biologa sinttica es disear y construir diferentes sistemas
convencional se extrae de la planta Artemisia annua. La E. coli fue modificada
genticamente introducindole informacin gentica involucradas codificante en la va para enzimas del
biolgicos de forma racional conjuntando piezas de informacin gentica, lo que permitir la modificacin de la vida existente. Los sistemas que se disean en biologa sinttica comparten el hecho de no
metablica
mevalonato de la levadura S. cerevisiae y el gen codificante para la enzima amorfadieno sintasa de Artemisia annua (Martin et al., 2003). De esta manera, se logr producir (un compuesto a partir
encontrarse en la naturaleza y de que algunos de ellos ni siquiera podran sobrevivir fuera del laboratorio. Probablemente, en un futuro cercano, un cientfico de cualquier parte del mundo podr sentarse ante la pantalla de su computadora y disear seres vivos en cuestin de das, o incluso de horas. Ya sea que desee fabricar frmacos
amorfa-4,11-dieno
del cual se puede sintetizar la artemisinina) en E. coli,. Posteriormente, en 2006 el
mismo grupo report la produccin de cido artemisnico en S. cerevisiae, otro precursor de la artemisinina, cuya molcula necesita menos pasos de modificacin qumica
complejos o combustible para aviones, podr descargar de una base de datos la
comparado con el amorfa-4,11-dieno, para obtener artemisinina (Ro et al., 2006). Esto
informacin gentica necesaria para hacer un organismo a la carte. Como toda promesa, puede no cumplirse, aunque no parece tan lejana, pues ya se han construido circuitos genticos que producen frmacos complejos y biocombustibles. Por ejemplo, el Doctor
se logr mediante la modificacin de la regulacin de la va del mevalonato y la introduccin de dos genes de Artemisia annua en la levadura. Por otro lado, la
empresa LS9, con base en San Francisco, California report la modificacin de E. coli mediante la incorporacin de un circuito gentico para producir alcanos y alquenos, principales combustibles constituyentes fsiles (gasolina, de diesel los y
Jay Keasling de la Universidad de California, en 2003 dise e introdujo un circuito gentico para producir en la bacteria
Escherichia coli un precursor qumico de la artemisinina (Martin et al., 2003). Este es un compuesto que se usa como tratamiento contra la malaria y que de forma
turbosina), mediante la insercin de la ruta biosnttica de la cianobacteria
Synechococcus elongatus (Schirmer et al.,
12
2010).
La ruta biosntetica incluye dos
cholerae.
La previa inoculacin de la
enzimas, una reductasa acarreadora de grupos acilo y una aldehdo decarbonilasa, las cuales convierten los intermediarios del metabolismo de cidos grasos en alcanos y alquenos. El hallazgo de dicha ruta, as como la posibilidad de ser transferida entre
bacteria modificada en ratones disminuy la colonizacin de V. cholerae y aument 85% la sobrevivencia de los ratones infectados (Duan y March 2010). Algunas de las ideas ms ambiciosas buscan crear construcciones genticas que puedan detectar enfermedades y restauren las funciones saludables de las propias clulas del cuerpo. Un ejemplo de esto es el trabajo de Kemmer y colaboradores (2010), quienes disearon y probaron en ratones con expresin deficiente de la ureato-oxidasa (enzima que degrada el cido rico), un circuito gentico codificante para producir una protena que sensa el cido rico y, cuando hay un exceso, se produce la enzima ureato-oxidasa. Sin embargo, estos trabajos con aplicaciones directas en mamferos an son escasos, debido a que la mayora de las herramientas para hacer biologa sinttica se han probado en bacterias y levaduras. Por lo que, se requiere que la biologa sinttica tenga un mayor desarrollo en clulas de mamfero, tejidos y en organismos
organismos, permitir la conversin biolgica de carbohidratos o azcares en combustibles de bajo costo (Schirmer et al., 2010). En el 2011, todos los genes involucrados en dicha ruta biosinttica fueron construidos en
formato de bioparte para su posterior uso en otros circuitos genticos
(http://2011.igem.org/Team:Washington). La Biologa Sinttica, tambin ha
generado alternativas para la biomedicina, mediante diferentes el diseo y construccin para de
microorganismos
atacar
distintas infecciones virales y microbianas. Por ejemplo, para enfrentar el problema de las bacterias patgenas resistentes a
antibiticos y que forman biopelculas, se han modificado virus que infectan a bacterias, para que eliminen a distintas poblaciones bacterianas (Lu y Collins 2007, 2009). Por ejemplo, fago ltico para que T7 fue modificado la la enzima matriz
(Constante et al., 2011).
genticamente dispersina B,
producir degrada
HERRAMIENTAS
DE
LA
BIOLOGA
SINTTICA PARA ENSAMBLAR VIDA La biologa sinttica adems de la biologa molecular requiere de la informacin gentica y las diferentes tcnicas de
extracelular que mantiene agragadas a las clulas, mientras el fago infecta y lisa las clulas (Lu y Collins 2007). En otro estudio, se modific genticamente a la bacteria E. coli Nissle 1917, para que sintetizara el autoinductor CAI-1, el cual promueve la inhibicin de los genes de virulencia de Vibrio
ensamblaje sistemtico y estandarizado de distintas secuencias de ADN, para generar informacin gentica nueva. Por esta razn, una contribucin importante para el progreso
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de la biologa sinttica fue el desarrollo de una base de datos en Internet llamada Registry of Standard Biological 2012), Parts con
que se han desarrollado hasta ahora, se basan en el conocimiento actual del
funcionamiento de los organismos vivos. Sin embargo, la informacin es numerosa y creciente, por lo que se requiere de y
(http://partsregistry.org,
informacin gentica que a la fecha, incluye ms de cinco mil biopartes estandarizadas o BioBricks. Cada uno de estas biopartes consta de una secuencia de ADN con caractersticas particulares que permiten
herramientas
computacionales
matemticas para integrar y hacer manejable esta gran cantidad de informacin, que sean una base clara para disear y construir
ensamblarlas sistemticamente. Casi todas las biopartes que se encuentran en esta base de datos fueron desarrolladas por los equipos de alumnos e investigadores del mundo que participan Genetically en el concurso International Machine
sistemas biolgicos artificiales. Algunas Metabolite de to las herramientas Metabolite computacionales ya existentes son From
(http://fmm.mbc.nctu.edu.tw/, 2012), con la que se pueden disear nuevas rutas metablicas, o el Standard Virtual Biological Parts, que contiene una coleccin de
Engineered
Competition (iGEM), en el cual se plantean y desarrollan proyectos de biologa sinttica (http://www.igem.org, 2012). Las
modelos computacionales que ayudan a predecir el funcionamiento de un circuito gentico, facilitando el diseo de circuitos genticos antes de decidir cul construir en el laboratorio (Cooling et al., 2010). Por otro
aplicaciones de los proyectos que han ganado este concurso incluyen propuestas en campos tan la y diversos como la la
biotecnologa, nanotecnologa
biomedicina, las
ciencias
lado, aplicaciones como BioJADE, SynBioSS, GenoCAD y ClothoCAD buscan conjuntar el acceso a bases de datos de biopartes, el ensamblaje de nuevos circuitos genticos y el modelaje matemtico y computacional de los mismos
computacionales (Goodman, 2008). Hoy en da se genera una extensa cantidad de datos gracias a las tecnologas como genmica, transcriptmica, protemica y metabolmica que sirven de base para el desarrollo de nuevos circuitos genticos (Nandagopal y Elowitz, 2011). Actualmente, se hace un gran esfuerzo para construir numerosos genes en formato de bioparte, caracterizar la interaccin de las mismas con otras molculas, su regulacin, expresin y funcionalidad en diferentes organismos. La mayora de los proyectos de biologa sinttica
(http://web.mit.edu/jagoler/www/biojade/, 2012; http://synbioss.sourceforge.net/, 2012; http://www.genocad.org, 2012;
http://www.clothocad.org/, 2012). An con la ayuda de ste tipo de herramientas, un circuito optimizado puede no funcionar como se espera una vez que se construye y se introduce a un organismo, esto debido a la
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complejidad inherente a todos los sistemas biolgicos. complejidad Una manera de reducir dicha sera construir una clula
haba extrado su propio genoma (Gibson et al., 2010). Adems de disear informacin gentica nueva, algunos cientficos buscan codificarla de una manera diferente. Ya se han creado ARNs de transferencia que pueden
mnima, que slo tuviera la informacin gentica necesaria para vivir y reproducirse. Por ejemplo, Mycoplasma laboratorium fue creada con ste propsito, siendo el
incorporar aminocidos modificados (Liu et al., 2007). Tambin, se han probado
organismo con el genoma ms pequeo con slo 382 genes (The J. Craig Venter Institute et al., 2007). Despus del diseo de los circuitos, hay que construir una cadena de ADN con la informacin gentica necesaria. Actualmente, la sntesis comercial de ADN la realizan compaas como Blue Heron, Geneart, DNA 2.0 y GenScript, aunque a un precio elevado en comparacin con las tcnicas estndar de biologa ensamblar molecular cadenas cuando largas se de quieren ADN
sistemas transcripcionales in vitro que usan codones de cuatro bases en vez de tres, los cuales codifican para aminocidos no
naturales (Taira et al., 2005). potencial de estos trabajos
El principal sera la
posibilidad de incorporar aminocidos con propiedades qumicas y estructurales
diferentes a los naturales para construir protenas funciones. con nuevas propiedades y
(amplificacin, restriccin, ligacin, clonacin, etc.). Para facilitar el ensamblaje se han
LOS
PROBLEMAS
DE
LA
VIDA
SINTTICA El Registro de Partes Biolgicas
propuesto mtodos ms eficientes, como el Golden-Gate (Engler et al., 2008), el ensamblaje Gibson (Gibson et al., 2009) y el DNA assembler (Shao et al., 2009). Con esta ltima tcnica, por ejemplo, se ha logrado el ensamblaje de 8 genes de una va metablica, formando una cadena de 19 mil nucletidos de ADN en un solo paso; aunque el record de ensamblaje lo tiene el genoma sinttico de Micoplasma mycoides, de ms de un milln de pares de bases, el cual fue ensamblado mediante recombinacin
Estandarizadas, al igual que las aplicaciones computacionales son gratuitas. Algunos
investigadores opinan que las herramientas que permiten hacer biologa sinttica
(biopartes, clulas mnimas, tcnicas de laboratorio y programas computacionales) deberan estar disponibles para cualquiera que desee usarlas, y que slo las
aplicaciones especficas que se desarrollen deberan patentarse (Erickson et al., 2011). Uno de los principales problemas con limitar el uso y distribucin de las biopartes, y de cualquier herramienta que facilite la tarea de los bilogos sintticos, es que cada grupo
homloga, y adems fue insertado con xito en una clula a la que previamente se le
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tendra que desarrollar sus propias biopartes y herramientas, lo que se reflejara en prdida de tiempo y recursos (Peccoud et al., 2011). Un ejemplo de ello es lo que sucede con varios de los proyectos que se publican en revistas cientficas, datos donde y slo no se las
vida,
la
sobrevida
ante
diferentes
enfermedades y padecimientos. Y no slo eso, tambin se encontrarn nuevas
maneras de producir energas renovables y alimentos para nuestro mundo en
crecimiento, as como nuevos materiales que impactarn en la vida que conocemos.
presentan
los
finales
secuencias de ADN o estrategias que se utilizaron (Peccoud et al., 2011). Por otro EL DISEO DE UN SISTEMA BIOLGICO SIMULADOR HOMLOGA Simular en bacterias (como en E. coli) la recombinacin somtica que sucede durante la generacin de anticuerpos en la DE RECOMBINACIN
lado, la convergencia de la biologa sinttica con otros campos de la ciencia, en especial con las tecnologas de la informacin y la nanotecnologa, dificulta la toma de
decisiones sobre qu debera ser patentable (Parens et al., 2009). Despus de todo, a nivel molecular los sistemas como biolgicos mquinas gentica
maduracin de linfocitos es un ejemplo claro de lo que se puede lograr con Biologa Sinttica. Es as como en nuestro grupo de investigacin se ha logrado el ensamblaje de las secuencias nucleotdicas que tienen la informacin codificante para generar
pueden
considerarse y la
moleculares,
informacin
aunque propia de los seres vivos, puede ser vista como otro tipo de informacin (Parens et al., 2009). Otro tema en discusin son los retos de bioseguridad que plantea el diseo de seres vivos (Schmidt, 2008; Schmidt et al., 2008; Schmidt et al., 2009). En todos los pases se deben discutir y crear los marcos regulatorios adecuados organismos benficos, para se que estos con las nuevos fines
mediante recombinacin protenas basadas en la estructura de DARPinas. Las
DARPinas son protenas muy estables con estructura alfa enlazadas por loops de forma repetida (Stumpp et al., 2008). Las
DARPinas se derivan de repeticiones de ankirinas, que son una familia de protenas de unin que se encuentran en mamferos y particularmente en humanos (Lander et al., 2001). Estas protenas tienen por funcin
construyan todas
tomando
medidas
precautorias (Schmidt et al., 2008). Es por esto que tanto la comunidad cientfica como el pblico en general, necesitan entender el potencial y los lmites de la biologa sinttica para aprovechar al mximo esta nueva disciplina. Con las aplicaciones que se
biolgica la unin a distintos blancos, debido a que poseen una superficie que interacta con diferentes molculas, adems de que la repeticin de los mdulos que las conforman las hacen verstiles, variadas y diferentes en tamao, sin que se altere su estructura
desarrollen se mejorarn las expectativas de
16
bsica (Forrer et al., 2004). A partir de las repeticiones de ankirinas, se han diseado molculas alternativas de reconocimiento por antgenos, entre ellas libreras de mdulos de DARPinas (Forrer et al., 2004). diferentes mdulos obtenidos, De los se han
anterior sustenta que en nuestro grupo estemos construyendo una secuencia
sinttica de ADN codificante para DARPinas, las cuales presentarn dominios conservados y distintos fragmentos variables que se introducirn mediante recombinacin usando el sistema CRE/lox. El sistema sinttico ser incorporado en la Bacteria E. coli, para que produzca hasta 18 DARPinas diferentes. Usando los elementos estructurales de las DARPinas y los posibles cambios en
construido protenas con alta estabilidad, solubilidad y semejanza con la protena de unin GA humana (Uniprot ID Q06547) (Stumpp DARPinas et al., 2008). Adems, son las
obtenidas
molculas
pequeas, de aproximadamente una dcima parte de un anticuerpo IgG convencional. Debido a sus propiedades, las DARPinas pueden ser usadas como andamiaje para el diseo de protenas de reconocimiento de diferentes blancos, para su uso en Lo
diferentes aminocidos que introducir la recombinacin, se realiz una prediccin estructural in silico de las posibles 18 combinaciones esperadas (Fig. 1). Los
modelos mostraron que no se alterar la estructura bsica que le confiere estabilidad a las DARPinas (Fig. 1). De ser exitoso,
biomedicina e investigacin bsica.
Fig. 1. Comparacin estructural entre la DARPina consenso con PDB ID 2QYJ (anaranjado), y la prediccin estructural de una de las protenas producto del sistema de recombinacin propuesto por nuestro grupo (rojo), usando el software I-TASSER (Ambrish et al., 2010).
17
este mecanismo de recombinacin en la bacteria, podra convertirse en el primer paso para desarrollar un mtodo alternativo de produccin de molculas variables anlogas a los anticuerpos monoclonales, con las ventajas estructurales de las DARPinas. Las DARPinas resultantes posteriormente deben ser caracterizadas blancos y para enfrentadas encontrar con sus
proceso de recombinacin somtica, propia de clulas de nuestro sistema inmune, podra servir como un sistema alternativo para la produccin de molculas anlogas a los anticuerpos. Aunque los desarrollos de la biologa sinttica tienen problemas de tipo tcnico, prctico, legal y tico, que tendrn que ser solucionados, la biologa sinttica seguir
distintos
antgenos. Hasta ahora, este trabajo es de Ciencia Bsica, y una vez que el sistema sinttico sea funcional se pueden introducir de forma racional especfico elementos al de
creciendo con la incorporacin de ms disiplinas al campo, y ser una de las principales herramientas para entender,
disear y crear nuevos sistemas biolgicos.
reconocimiento
andamiaje AGRADECIMIENTOS Los autores expresan su agradecimiento
diseado en este trabajo.
CONCLUSIONES La Biologa sinttica an est en sus inicios, muestran sin un embargo claro diversos desarrollo trabajos en la
al CONACyT Ciencia Bsica 104951-Z
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generacin de nuevas terapias mdicas, la obtencin de biocombustibles y la produccin de materiales novedosos. La identificacin
de conexiones entre las vas metablicas, regulatorias, y de respuesta de las clulas, permitir la construccin de cirucitos
genticos, cada vez ms complejos. De ah que el desarrollo de nuevas herramientas computacionales sea necesario para
identificar nuevos componentes que predigan el comportamiento de los sistemas sintticos diseados. Los ejemplos presentados en este escrito dan una visin del potencial de la biologa sinttica. Particularmente, el modelo
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20
Uso de Enzimas en Solventes Orgnicos en la Industria de Bioprocesos

Claudia Maytorena-Verdugo y Fernando Garca-Carreo* Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste. Mar Bermejo 195. La Paz, BCS, Mxico. Tel. Fax: +52 612 123 84 01. E-mail: fgarcia@cibnor.mx .
RESUMEN En este trabajo se hace un recuento de los tipos de sistemas industriales en donde intervienen enzimas. Estos sistemas pueden ser medios acuosos los cuales se dividen en: a) Agua + solvente miscible en agua, b) Agua + solvente inmiscible en agua, y c) medios anhidros. Se presentan ventajas y desventajas de usar solventes en procesos que tienen como catalizadores a enzimas. Se aborda el papel del agua en estos sistemas y el de los solventes y su efecto en la actividad de las enzimas. Tambin se hace un listado de las enzimas usadas en estos sistemas y algunas caractersticas, enfocndose principalmente a lipasas. Palabras clave: Bioprocesos, enzimas, medios no acuosos
ABSTRACT This work emphasizes industrial process based on enzymes as catalyst in non-aqueous media. These systems are classified as water-water miscible solvents, water-water immiscible solvents and anhydrous medium. Advantages and disadvantages are discussed, also the role of water and solvents in the enzyme activity. A list of enzymes used in the industry with their characteristics is presented focusing on lipases and examples of companies that use enzymes and organic solvents. Keywords: Bioprocess, enzymes, non-aqueous media.
INTRODUCCIN La creciente necesidad de enzimas resistentes a las condiciones de trabajo de algunos procesos industriales hace
al estar en contacto las clulas con los solventes orgnicos, es posible que se d un efecto negativo en la clula (toxicidad) o en la enzima (desnaturalizacin) (Yeom & Daugulis, 1999). El objetivo de este trabajo es mostrar un nuevo panorama sobre el uso de enzimas en medios no acuosos, tipos de medios no acuosos, sus ventajas y desventajas y explicar el efecto de algunos solventes hidrolticas. orgnicos en enzimas
indispensable la bsqueda de enzimas resistentes a altas temperaturas por largos periodos de tiempo. Algunos solventes orgnicos han sido usados en diferentes campos de la en biotecnologa procesos en como donde
complemento
intervienen clulas y enzimas, sin embargo
21
USO DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA Los procesos biocatalticos difieren de los procesos qumicos convencionales
de detergentes en 1930, basndose en una patente de Otto Rhm, la cual describa el uso de enzimas pancreticas en
dadas las caractersticas del catalizador como parmetros cinticos, estabilidad de la protena bajo las condiciones del
detergentes (Damhus et al., 2008). La mayora enzimas de los bioprocesos o se utilizan en
hidrolticas
basan
proceso, si la enzima est aislada o forma parte del metabolismo de una clula, crecimiento celular, induccin de la
fermentacin. Las condiciones de reaccin para los bioprocesos generalmente estn basadas en parmetros interdependientes, por lo tanto una descripcin matemtica del proceso es esencial para su optimizacin. El desarrollo de un bioproceso requiere de diferentes pasos: a) Identificar una reaccin especfica para escalarla y que sea
actividad enzimtica y/o el uso de rutas metablicas para reacciones mltiples
(Schmid et al., 2001). El que un proceso sea sustentable implica una reduccin en los costos de energa y materia prima, disminucin de desechos, estabilidad y seguridad del proceso y calidad del
costeable, b) Encontrar un biocatalizador que pueda catalizar la reaccin deseada, c) Caracterizar el biocatalizador bajo las condiciones de trabajo del bioproceso (medio acuoso o mezcla agua-solvente), d) Aplicacin, ya sea por inmovilizacin o sistemas mltiples, e) Recuperacin del producto, (Figura 1).
producto. Algunas compaas han optado por usar enzimas, obteniendo un mayor rendimiento, reduccin de materia prima, disminucin de desechos y aumento en la calidad del producto (Schmid et al., 2002). La primera aplicacin de enzimas en procesos industriales fue en la elaboracin
Fig. 1. Desarrollo de un proceso de biocatlisis (Modificado de Schmid et al., 2000).
BIOPROCESOS
QUE
UTILIZAN
epoxidacin enantioselectiva de estireno en presencia de dioctil ftalato (50% v/v), obteniendo 307 gramos de xido de (S)estireno por destilacin. A nivel industrial, la
SOLVENTES ORGNICOS Panke y colaboradores (2002) disearon un reactor en escala piloto para
22
compaa DSM utiliza medios no acuosos para producir (2R,3S)-3-(p-metoxyfenil)
cabo reacciones imposibles en agua por restricciones cinticas o termodinmicas, estabilidad de la enzima, recuperacin eficiente del producto y la insolubilidad de las enzimas en medios orgnicos, lo que permite su recuperacin y reso, con lo cual se excluye la inmovilizacin de
glicidil metil ester a partir de una mezcla racmica de trans-3-(p-metoxyfenil) glicidil metil ester utilizando lipasas, produciendo 100 toneladas al ao (Kierkels & Peeters, 1994). A pesar de que algunos
mecanismos no estn claros sobre el efecto de solventes en catlisis, a
enzimas (Zaks y Klibanov, 1985). Un modelo de estudio ideal para reacciones enzimticas en solventes orgnicos debe satisfacer los siguientes criterios (Zaks y Klibanov, 1985): (a) La enzima debe estar disponible y debe ser costeable, (b) La enzima debe trabajar en ausencia de un cofactor, ya que la mayora de los
continuacin se presentan algunas bases para explicar estos fenmenos. En general las enzimas funcionan en soluciones acuosas, por lo que los estudios sobre sistemas enzimticos son en este tipo de soluciones, sin embargo, desde un punto de vista biotecnolgico, el usar enzimas en solventes orgnicos en lugar de agua tiene ventajas, como la alta solubilidad de compuestos orgnicos en medios no acuosos, la habilidad de llevar a
cofactores son insolubles en solventes orgnicos, (c) Los sustratos deben ser solubles en solventes orgnicos, (d) El agua no debe participar en la catlisis (Tabla 1).
Tabla 1. Ventajas y desventajas de usar solventes orgnicos en reacciones enzimticas. Ventajas Se incrementa la solubilidad de sustratos hidrofbicos Pueden producirse reacciones qumicas que no son posibles en soluciones acuosas El equilibrio termodinmico se ve favorecido a reacciones de sntesis En medios no acuosos algunas enzimas pueden presentar especificidad solo por alguna regin del sustrato o distinguir entre enantimeros Las enzimas pueden recuperarse y reusarse sin tener que inmovilizarlas Se incrementan los rendimientos de separacin de los productos Algunas enzimas son termoestables en sistemas anhidros. Se eliminan los riesgos de contaminacin microbiana Las reacciones enzimticas en las condiciones termodinmicas de Desventajas Algunas enzimas pueden perder actividad biolgica Se limita la transferencia de masas usando solventes viscosos En procesos en donde se requieren reacciones de condensacin, se necesita un control de la actividad de agua
solventes orgnicos proveen ventajas a la industria, ya que incrementan la solubilidad de sustratos no polares, se pueden revertir
equilibrio en reacciones de hidrlisis, se elimina la posibilidad de producir
reacciones alternas al igual que reacciones
23
que dependen de la cantidad de agua disponible en el medio, se puede tambin alterar la especificidad por el sustrato y la enantioselectividad, y se elimina la
limitaciones de transferencia de masa, teniendo como consecuencia mayor
eficiencia cataltica. Este sistema tiene la ventaja de que modifica el equilibrio
contaminacin microbiana. Sin embargo, la aplicacin de enzimas en solventes
termodinmico a favor de reacciones de sntesis. 2) Bifsico o sistema de dos fases. El
orgnicos es restringida ya que muchas de las enzimas son menos activas y estables en presencia de solventes. Por lo tanto, se han desarrollado varios mtodos para mantener o aumentar la actividad y
sistema est compuesto por dos fases, una fase acuosa que contiene a la enzima disuelta y otra fase compuesta por un solvente inmiscible en agua. Entre la fase acuosa y la fase orgnica se forma una interface. El sustrato (hidrofbico) se
estabilidad de las enzimas en presencia de solventes orgnicos para uso industrial. Estos mtodos incluyen la inmovilizacin de enzimas en soportes, la modificacin qumica de las enzimas, modificaciones fsicas con de lpidos o surfactantes, en micelas la e
encuentra en la parte orgnica. El producto presenta caractersticas hidrofbicas por lo cual puede extraerse de la fase orgnica. 3) Mezclas anhdridas. Las enzimas
inclusin
enzimas
en forma nativa son insolubles en solventes orgnicos, por lo tanto, en este tipo de sistemas, la liofilizacin, la inmovilizacin y la modificacin con compuestos anfipticos son opciones para solubilizar enzimas. La liofilizacin puede causar daos en la estructura de las protenas por lo que la coliofilizacin con aditivos como algunos carbohidratos, polmeros y algunas sales previenen estos daos. La enzima
ingeniera molecular. Algunas enzimas, de manera natural, son tolerantes a medios orgnicos, las cuales son las mejores candidatas para aplicaciones
biotecnolgicas ya que no se requiere modificar la enzima. La investigacin
dedicada a este tema durante los ltimos 10 aos ha sido a buscar enzimas de origen microbiano resistentes a solventes orgnicos.
proveniente de una solucin acuosa con condiciones ptimas, presentan las mismas
Clasificacin de los sistemas que usan solventes orgnicos Dependiendo de la miscibilidad del solvente en el agua y la relacin de stos en el medio, se pueden encontrar tres tipos de sistemas: 1) Co-solvente orgnico. En este tipo
caractersticas catalticas al liofilizarlas o precipitarlas, este fenmeno es llamado Memoria al pH. En estos sistemas, las enzimas liofilizadas exhiben alta
termoestabilidad, pero menor actividad que en sistemas acuosos. La actividad de agua es importante para la actividad enzimtica. Como regla general, se sabe que en solventes hidrofbicos, las enzimas
de mezclas, el solvente usado es miscible en agua. Estos sistemas tienen la funcin de incrementar la solubilidad de los
muestran mayor actividad, comparando con enzimas en solventes hidroflicos. La
compuestos hidrofbicos y reduciendo las
24
movilidad conformacional de las enzimas es restringida en sistemas con poco agua. Esto lleva a que las enzimas presenten especificidades por sustrato nicas. En este tipo de sistemas, las reacciones ms comunes son transesterificacin de steres y sntesis de pptidos (Doukyo & Ogino, 2010).
aadiendo una cantidad mnima de agua, puede conservarse la actividad (Klibanov 2001).
Estabilizacin sistemas orgnicos de
termodinmica transicin en
de
los
solventes
Muchas enzimas tienen sitios activos hidrofbicos, teniendo para que un los incentivo sustratos
Inactivacin orgnicos En
de
enzimas
en
solventes
energtico
hidrofbicos desplacen el agua cercana al el plegamiento de la sitio activo. Cuando el agua es
general,
estructura terciaria de las protenas en medios acuosos da como resultado que los grupos polares en el exterior de la molcula interaccionen con el medio y los grupos no polares a formar una coraza hidrofbica al interior de la protena. La estructura de la protena se mantiene gracias al balance de las interacciones hidrofbicas,
reemplazada con solventes orgnicos, se estabilizan los estados de transicin de los sustratos. El alterar puede el resultar equilibrio en un
termodinmico
decremento de la actividad enzimtica. En 1998, Torres y colaboradores propusieron un modelo para evaluar el efecto de los solventes en la actividad, ya que el coeficiente de particin no se puede aplicar a solventes miscibles en agua. La
interacciones electroestticas, fuerzas de Van der Waals y puentes de hidrgeno. La desnaturalizacin de las protenas se da cuando el equilibrio de las interacciones se rompe. En medios orgnicos, la prdida de actividad rompimiento enzimtica de la se coraza debe al
hidrofobicidad (H) se considera como el coeficiente de particin del sustrato en el sitio activo de la enzima y en el medio no acuoso. Al incrementar la hidrofobicidad del solvente, el sustrato se desplaza del sitio activo al medio no acuosos, observando un decremento en la actividad cataltica. Este parmetro de hidrofobicidad correlaciona la actividad termodinmica del solvente
hidrofbica
dentro de la protena. Los solventes polares pueden penetrar dentro de la protena e inducir algunos cambios estructurales a diferencia de los solventes no polares. La flexibilidad conformacional de las protenas es crucial para mantener la actividad biolgica de las protenas. Las enzimas requieren de ciertas molculas de agua unidas a la superficie de la estructura para funcionar. Como ya se menciono anteriormente, en medios anhidros, la actividad decrece considerablemente, sin embargo, se ha comprobado que
orgnico en la mezcla de reaccin y es inversamente proporcional a la polaridad del solvente. Ng y Tsai (2005) estudiaron las propiedades de una lipasa de papaya para sintetizar frmacos, especialmente el naproxeno y al hacer un anlisis
termodinmico encontraron diferencias en las energas de activacin para la
discriminacin de enantimeros, tambin
25
encontraron
una y
compensacin lo atribuyen
entre a la
con el sitio activo y propusieron cambios conformacionales en la protena, formando ismeros conformacionales encontrando dos procesos paralelos: aceleracin en las tasas de formacin del compuesto enzima-
entalpa-entropa
similitud de cadena de acilo de los sustratos.
Correlacin entre la actividad enzimtica y la naturaleza de los solventes orgnicos Muchos investigadores han intentado correlacionar la actividad enzimtica y el efecto de los solventes en sta. Laane y colaboradores diferentes (1987) han relacionado contante
sustrato y disminucin de la tasa de deacilacin (Figura 2). Para explicar este tipo de fenmeno se ha recurrido al concepto de barrido de puentes de
hidrgeno, en donde la formacin de un puente de hidrgeno entre Asp102 y His57 del sitio activo, tiene como consecuencia la alcalinidad del residuo His57 y su habilidad para atraer ms protones del residuo Ser195, facilitando el ataque nucleoflico al grupo carbonilo del sustrato y la formacin del intermediario tetradrico. La formacin del puente de hidrgeno entre Asp102 y His57 decrece la energa de activacin para el sustrato se convierta en el se
parmetros,
como
dielctrica, momento dipolar y coeficiente de particin. El coeficiente de particin es el parmetro ms usado para tratar de relacionar los efectos de los solventes en la actividad enzimtica, sin embargo, los solventes slo se pueden relacionar si pertenecen al mismo grupo funcional, por ejemplo alcoholes y polioles.
intermediario Biocatlisis en solventes orgnicos Existen pruebas de que las enzimas en medios orgnicos pueden tener actividad cataltica. reportado disminuye En que en algunos la casos se ha
tetradrico.
Tambin
propuso en este trabajo que los solventes orgnicos tienen un efecto de compresin estrica entre el sitio activo y el sustrato para formar este puente de hidrgeno y as aumentar la afinidad por el sustrato, y que el etanol acta como agente nucleoflico en la hidrlisis de la enzima acilada.
actividad
cataltica de
diversos
rdenes
magnitud cuando se exponen a medios orgnicos por lo cual hay que tener cuidado al momento de seleccionar los
Efecto del agua en las reacciones de biocatlisis Cuando se habla de reacciones en medios no acuosos, se debe entender que la mayor parte del medio que rodea a la enzima es no acuoso, ya que una enzima dentro de su estructura contiene molculas de agua que permanecen unidas a esta a pesar de tratamientos trmicos extremos. Una manera de cuantificar el agua en una
componentes de la mezcla de reaccin (solventes, pH, concentracin de iones y agua) para buscar una mayor actividad enzimtica. Se sabe que el mecanismo de catlisis en medios orgnicos para las quimotripsinas se ve afectado con
solventes miscibles en agua, Belyaeva y colaboradores en el 2002 encontraron que el dimetil sulfxido y el etanol interactan
26
Fig. 2. Representacin de la reaccin de catlisis de -quimotripsina en presencia de solventes orgnicos. E (Enzima), S (Sustrato: N-acetil-L- tirosina p-nitroanilina), ES (Complejo enzimasustrato), EA (Enzima acilada), P1 (Producto de la incubacin de la enzima con etanol: pnitroanilina), P2 (Producto de la enzima en medio acuoso: N-acetil-L-tirosina).
reaccin es usar concentracin de sta en molaridad o por porcentaje en peso o en volumen, sin embargo las propiedades catalticas de una enzima son las ms influenciadas por la cantidad de agua unida a la enzima que por la cantidad de agua en el medio; desafortunadamente la medicin de la cantidad de agua enlazada a una enzima puede ser un reto. Se acepta el concepto de actividad de agua para poder cuantificar el agua presente en el sistema (Drauz & Waldmann, 2002).
Control de la actividad de agua usando soluciones salinas saturadas Una manera de controlar la actividad de agua a nivel laboratorio es la de equilibrar el medio con soluciones salinas saturadas. Esto se basa en que la solubilidad de una sal en agua tiene un valor determinado a una temperatura determinada, podr
equilibrar el contenido de agua en una solucin de menor saturacin. La tabla 2 presenta el efecto de algunas sales en la actividad de agua (Carrera & Riva, 2008).
Tabla 2. Soluciones saturadas para controlar la actividad de agua. Los valores presentados se dan para trabajar a una temperatura de 25 C.
Sal
Actividad de agua
LiCl MgCl2 Acetato de potasio K2CO3 Mg(NO3)2 SrCl2 KCl KNO3 K2SO4 Lipasas como biocatalizadores Las lipasas (EC 3.1.1.3; triacilglicerol acilhidrolasas) son un grupo verstil de
0.113 0.225 0.328 0.432 0.529 0.708 0.843 0.936 0.973
biocatalizadores. Constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrlisis y
sntesis de acilglicridos de cadena larga
27
cuando se da una interface entre los lpidos y el agua, fenmeno llamado activacin interfacial (Kourist et al. 2010). La
todas estas tienen una pequea lid (Kourist et al. 2010). Un ejemplo sobre el efecto de los solventes en la actividad de lipasas es que pueden distinguir entre enantimeros, en el 2000, Overbeeke y Heijen estudiaron el efecto de la acetona y una mezcla de octanociclohexano para reacciones de hidrlisis y esterificacin aadiendo un exceso de enantimeros sustrato y de productos la ecuacin de la figura 3 en donde
aplicacin de lipasas en la industria ha sido destinada a la produccin de detergentes, alimentos steres, y saborizantes, frmacos, y Sin de
agroqumicos,
cosmticos
perfumera (Hasan et al. 2006). embargo, la creciente necesidad
enzimas resistentes a las condiciones de trabajo de algunos procesos industriales hace indispensable la bsqueda de
determinaron los excesos de enantimeros representando como ees y eep. Encontraron que la composicin de los solventes afecta a la enatioselectividad, aumentando este valor hasta en 50%. En el 2003, Ghanem estudio el efecto ciclodextrinas y solventes orgnicos en la capacidad de
enzimas termoresistentes. Se ha visto que el proceso de desnaturalizacin de algunas enzimas en presencia de solventes
disminuye dependiendo del solvente usado y de la actividad de agua (Ahmed et al. 2009, Mansfeld & Ulbrich-Hofmann 2007, Royter et al. 2009, Sekhon et al. 2005). Al contrario de las carboxil-esterasas (EC 3.1.1.1), la catlisis ocurre cuando se da una interface entre los lpidos y el agua, y se ha demostrado que la mayora de las lipasas presentan un fenmeno llamado activacin interfacial, lo que significa que una actividad cataltica alta solo se
tranesterificacin de lipasas y encontr que la tasa de enantioselectividad tambin aumentaba. La estrategia que sigui fue liofilizar una lipasa con ciclodextrinas y encontr que la lipasa poda catalizar la transesterificacin tolueno. de1-(2-furil)-etanol en
A nivel industrial, las lipasas se
utilizan para la produccin de alcoholes enantiopuros a partir de mezclas
observar en presencia de una fase hidrofbica (triacilglicridos dispersos en agua o en solventes orgnicos). Este fenmeno est relacionado con la
racmicas, por la compaa BASF (Schfer et al. 2001).
presencia de un oligopptido hidrofbico llamado lid o flat cubriendo la entrada al sitio activo. En presencia de un ambiente hidrofbico, este oligopptido o lid se desplaza y el sustrato puede entrar al sitio de enlace. Existen lipasas que no necesitan de activacin interfacial como las de Pseudomonas glumae, Pseudomonas
Efecto de solventes orgnicos en enzimas La aplicacin de enzimas en solventes orgnicos es restringida ya que muchas de las enzimas son menos estables en
presencia de solventes por lo que se han desarrollado mtodos para mantener o aumentar la actividad y estabilidad de las enzimas para uso industrial. Estos mtodos
aeruginosa y Candida antartica B, pero
28
Fig. 3. Ecuacin para estudiar la capacidad de enantioselectividad en enzimas en donde se relacionan constantes de especificidad para dos enantiomeros, ya sea del sustrato o del producto y la velocidad de reaccin para cada enantiomero.
incluyen la inmovilizacin de enzimas en soportes, modificacin qumica de las enzimas, modificaciones fsicas con lpidos o surfactantes, encapsulamiento de
transformar fidelidad y
molculas selectividad
con en
exquisita soluciones
acuosas (Serdakowski & Dordick, 2007). En medios no acuosos, las enzimas pueden presentar diferentes efectos como la separacin de las diferentes molculas de enzimas, esto se refiere a que en conformacin nativa el balance de la estructura proteica esta dado por
enzimas en micelas e ingeniera molecular. Algunas enzimas, de manera natural, son tolerantes a medios orgnicos, las cuales son las mejores candidatas para
aplicaciones biotecnolgicas ya que no se requiere modificar la enzima (Okamoto & Ueji 2000). En general, su lipasas actividad microbianas cataltica en
interacciones no covalentes, como puentes de hidrgeno, interacciones inicas,
fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofbicas. El agua es un requisito para que se den estas interacciones. En
aumentan
solventes con Log P igual o mayor a 2, y a valores menores a 2, la actividad
presencia de solventes orgnicos, estas interacciones se rompen, teniendo como consecuencia el desplegamiento de la estructura de la protena. Como
enzimtica disminuye considerablemente (Laane et al. 1987). El amplio uso de enzimas en procesos industriales ha
creado la necesidad de identificar nuevas fuentes de enzimas de bajo costo. El potencial uso de enzimas de peces y otros organismos marinos como fuentes de lipasas sigue en investigacin. Se tienen reportes de lipasas que mantienen su actividad cataltica en concentraciones
caracterstica de los solventes orgnicos polares, stos pueden penetrar dentro de la estructura proteica, siendo capaces de inducir cambios en las estructuras
secundaria y terciaria. En enzimas con estados de transicin altamente polares, la interaccin con solventes orgnicos reduce la polaridad del sitio activo desestabilizando los estados de transicin polares en la catlisis (Serdakowski & Dordick, 2007). En la figura 4 se presenta un modelo de interaccin del agua (esferas azules) y del
mayores a 40% de solventes polares (Kurtovic et al. 2010, Maytorena 2011). Una enzima en su forma nativa presenta una estructura tridimensional para con poder
geometras
precisas
29
octano (esferas rojas) en el sitio activo de subtilisina haciendo una modelacin de desplazamiento de molculas de agua por parte de las molculas de octano. En la tabla 3 se presentan algunos solventes usados en la industria y algunas
mxima de la banda de absorcin de mayor longitud de onda de un disolvente
determinado. El parmetro de solubilidad de Hildebrand se define como la suma de todas las fuerzas de atraccin
intermoleculares de una sustancia (Costa 2005).
caractersticas. El trmino coeficiente de particin es la razn entre las
concentraciones de esa sustancia en las dos fases de la mezcla formada por dos disolventes inmiscibles en equilibrio.
Uso de solventes en sntesis Las proteasas de origen microbiano pueden funcionar como catalizadores en medios con solventes orgnicos con lo cual se pueden ofrecen nuevas posibilidades a la industria, ya que puede darse un cambio en el equilibrio termodinmico a favor de la sntesis, incrementando la solubilidad de los sustratos hidrofbicos, puede
Constante dielctrica se refiere a la medida de las propiedades de un solvente para mantener cargas opuestas separadas. El parmetro de Reichardt-Dimroth es una medida de la polaridad ionizante (prdida de la polaridad) de un disolvente basado en la longitud de onda mxima de la banda de absorcin de mayor longitud de onda
controlarse la especificidad con el uso de solventes y tambin puede aumentar la
Fig. 4. Representacin de la interaccin de un solvente orgnico en el sitio activo de una enzima dependiendo de la polaridad del solvente (Serdakowski & Dordick, 2007). Las esferas azules representan a molculas de agua y las esferas rojas representan a molculas de solvente orgnico. Las esferas de mayor volumen simulan una mayor densidad de agua o solvente segn sea el caso. Los aminocidos del sitio activo estn representados en barras (Asp32, His64 y Ser 121). La figura 4a muestra la interaccin de subtilisina en agua. Cuando la enzima esta en contacto con octano, el agua difcilmente puede interactuar con el sitio activo (Fig. 4b). Sin embargo, cuando la enzima esta en contacto con un solvente relativamente polar (tetrahidrofurano), el solvente si puede interactuar con esa rea de la protena (Fig. 4c).
30
Tabla 3. Solventes usados en la industria y parmetros de solubilidad. Log P: Coeficiente de particin entre octanol y agua. : Constante dielctrica. ET: Parmetro de polaridad emprica de Reichardt- Dimroth. HS: Parmetro de solubilidad de Hildebrand. Sw/o: Solubilidad del agua en el solvente. So/w: Solubilidad del solvente en agua (Carrea & Riva, 2008). Solvente DMF Metanol Etanol 1,4-Dioxano Acetona 2-Butanona Piridina Acetato de etilo 1-Butanol ter dietlico Diisopropil ter Acetato de butilo Benceno 1,1,1-Tricloroetano Tolueno Hexano Heptano Log P -1.01 -0.77 -0.31 -0.27 -0.24 0.29 0.65 0.73 0.88 0.89 1.52 1.7 2.13 2.49 2.73 3.98 4.57 36.71 32.66 24.55 2.21 20.56 18.51 12.91 6.02 17.51 4.2 3.88 5.01 2.27 7.25 2.38 1.88 1.92 0.111 0.17 0.099 0.009 0.012 ET 0.404 0.762 0.654 0.164 0.355 0.327 0.302 0.228 0.506 0.117 0.102 HS 20.3 29.7 26.1 20.7 20.5 19 21.7 18.6 23.7 15.1 14.4 17.4 18.7 17.4 18.2 14.9 15.2 Sw/o 100 100 100 100 100 10 100 2.94 20.5 1.47 0.57 1.2 0.0635 0.034 0.0334 0.0111 0.0091 So/w 100 100 100 100 24 100 8.08 7.45 6.04 1.2 0.68 0.179 0.132 0.0515 0.00123 0.000357
termoestabilidad de las enzimas (Rahman, 2007). En 1996, Cerovsky y Jakubke estudiaron la especificidad nucleoflica de la subtilopeptidasa A, y encontraron que no es una opcin viable para sntesis de pptidos en medios acuosos, pero
p la constante de particin. Los autores concluyeron que los solventes orgnicos bajo condiciones alcalinas, los amino de los nuclefilos se encuentran desprotonados, siendo esto un requisito para que los nuclefilos participen en la transferencia de acilos. Tambin se encontr que se
explicaron las bases moleculares porque si es una buena opcin en medios orgnicos. Investigaron las constantes de particin de la subtilisina acilada en agua y en 10% de acetonitrilo, y una serie de derivados de aminocidos nuclefilos. constantes teniendo glicina como
necesitan residuos de glicina continuos u otros residuos hidroflicos pequeos para que puedan participar en la reaccin y se dedujo que existen entre interacciones los residuos
electroestticas
Los autores calcularon las de particin siguiendo el
cargados negativamente de la enzima y los residuos cargados positivamente del
siguiente esquema (Figura 5) y la ecuacin (d[P2]/dt)/(d[P3]/dt= p/[N], en donde [N] equivale a la concentracin del nuclefilo y
sustrato, concluyendo que los pptidos (sustratos) con residuos hidroflicos
alrededor de glicina en suspensiones
31
orgnicas
presentan
caractersticas
sntesis
en
medios
orgnicos,
en
la
nucleoflicas al contrario de aminocidos alifticos y aromticos alrededor de glicina. En la tabla 4 se presenta un listado de las enzimas ms usadas en reacciones de
columna 1 se enlistan las enzimas que no necesitan cofactores y en la columna 2 las enzimas que requieren cofactor y qu tipo de cofactor (Carrea & Riva 2008).
Fig. 5. Reaccin de catlisis en la transferencia de acilo. E (Enzima), S (Ester donador de acilo; componente carboxilo), N (nuclefilo; componente amino), P1 (Grupo saliente del compuesto ster), P2 (Producto de hidrlisis), P3 (Pptido producto), EA (Enzima acilada), EAN (Complejo nuclefilo-enzima, acilo). (Cerovsky y Jakubke 1996).
Tabla 4. Enzimas comnmente usadas en sntesis en medios orgnicos (Carrea & Riva, 2008). No requieren cofactores Esterasas Lipasas Amilasas Fosfolipasas Epoxido hidrasas Nucletido fosfoliasa SAM sintetasa Glucosa isomerasa Aspartasa Fenilalanina amonia liasa Fumarasa Cianohidrina sintetasa Requieren de cofactores Quinasas ATP Oxidoreductasas NAD(P)(H) Metiltransferasas SAM Enzimas que dependen de CoA Sufuriliasas - PAPS
Enzimas inmovilizadas La inmovilizacin de biocatalizadores para sistemas continuos de produccin se da cuando las enzimas, como las clulas se inmovilizan en un soporte de manera que el sustrato se vaya transformando continuamente sin que se pierda la enzima, como ocurre con los mtodos de lote. Sin embargo, a pesar de todos los esfuerzos y desarrollos tecnolgicos en este campo, estos mtodos presentan todava muchos problemas, por lo que no se han podido utilizar en forma generalizada. Entre los
podemos
mencionar
la
adsorcin
en
soportes polimricos, como los de polivinilo y de poliacrilamida; la microencapsulacin en membranas semipermeables de
celulosa o nylon; el entrecruzamiento para formar un producto insoluble, y la unin covalente a soportes insolubles. Esta
metodologa ha permitido que se diseen electrodos que, a semejanza de los de un potencimetro para medir pH, se utilizan en la determinacin de diversos compuestos, como son los azcares. En un nivel comercial pocas son las enzimas que se emplean de esta manera; entre ellas
mtodos ms comunes de inmovilizacin
32
destacan
la
glucosa (Badui,
isomerasa 1993).
la y
organic solvents with the active site of chymotrypsin. Biochem. (Moscow)
aminoacilasa
Tang
colaboradores en el 2007, inmovilizaron lipasas alcalinas en nanopartculas de
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quitosano para que trabajaran en medios cidos y encontraron que estas enzimas al inmovilizarlas en la superficie de las
esferas, presentaban actividad cataltica lo cual podra ser una opcin para estudiar enzimas lbiles en otro tipo de medios.
Nucleophile specificity of subtilisin in an organic solvent with low water content: Investigation of via acyl transfer
CONCLUSIN Se han encontrado enzimas resistentes a solventes orgnicos en la mayora de los microorganismos y en los ltimos 10 aos se han encontrado enzimas resistentes a solventes en otros organismos como
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35
Potencial de los Marcadores Moleculares para el Rescate de Individuos de Theobroma cacao L. de Alta Calidad
Alfredo Vzquez-Ovando*1,4, Francisco Molina-Freaner2, Juan Nuez-Farfn3, Miguel Salvador-Figueroa1 Centro de Biociencias, Universidad Autnoma de Chiapas. Carretera a Puerto Madero km. 2. Tapachula, Chiapas 30700. Tel (fax) 52 962 6427972. E-mail: jose.vazquez@unach.mx 2 Departamento de Ecologa de la Biodiversidad, Instituto de Ecologa, Unidad Hermosillo. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Hermosillo, Sonora. 3 Departamento de Ecologa Evolutiva, Instituto de Ecologa. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Ciudad Universitaria, Mxico D.F. 4 Posgrado en Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Ciudad Universitaria, Mxico D.F.
1
RESUMEN Aunque originario de Amrica tropical, en la actualidad el cacao (Teobroma cacao L.), planta algama, se cultiva en muchas regiones del mundo. Originalmente, los programas para obtener variedades mejoradas estuvieron basados en marcadores morfolgicos los cuales, poco a poco, se han sustituido cada vez ms por marcadores moleculares. Se discuten aqu las principales aplicaciones de las herramientas de la biologa molecular en la obtencin de mapas de ligamiento de este importante cultivo, loci de caracteres cuantitativos implicados en mayor rendimiento agronmico y resistencia a enfermedades, as como en la secuenciacin del genoma cuya reciente publicacin apertura una importante oportunidad de trabajo dirigido. Se hace nfasis en la falta de informacin y de investigacin en el uso de estas herramientas para la bsqueda de marcadores asociados de manera directa con las caractersticas de calidad sensorial de las almendras, siendo sta una de las razones principales que incentivaron su visionaria domesticacin hace unos 4 000 aos y su amplia distribucin alrededor del mundo hace unos 500 aos. Conocer a los individuos que muestran estas caractersticas resulta importante, ya que su posible extincin por cuestiones sociales o enfermedades, conllevara prdida de informacin cientfica y tecnolgica valiosa que puede ser empleada con fines de conservacin y explotacin. Palabras clave: calidad sensorial, chocolate, variedad Criollo, Soconusco
ABSTRACT Cacao (Theobroma cacao L.) is an allogamous plant native to tropical America, but nowadays it is grown in tropical regions across the world. Originally, programs to obtain "improved" cultivars were based on morphological markers. However, there is a trend to use molecular markers. Here we discuss the main applications of molecular biology tools to obtain linkage maps of this important
36
crop, to identify quantitative trait loci involved in major agronomic performance and disease resistance, as well as genome sequencing whose recent publication opens an important opportunity for specific investigations. We emphasize on the lack of information and research on the use of these tools to find markers associated directly with the sensory quality characteristics of almonds, which is one of the main reasons that encouraged its visionary domestication 4 000 years ago and its wide distribution around the world 500 years ago. Knowledge of the individuals who exhibit these characteristics is important, because its possible extinction by social or diseases entail loss of valuable scientific and technological information that can be used for conservation and exploitation. Key words: sensory quality, chocolate, Criollo cultivar, Soconusco
INTRODUCCIN Theobroma cacao L. (cacao) es el cultivo de mayor importancia comercial a nivel mundial de las 22 especies que comprenden el gnero Theobroma (Schnell et al., 2005); otras que tambin se comercializan pero solo a nivel local son T. bicolor Humb. y Bonpl. (pataste o pataxte), T. grandiflorum Schum. (cupuaz o copuaz) y T. angustifolium Moio y Sess (cacao de montaa o de mono) (Cervantes-Martnez et al., 2006). Adems de la relevancia industrial, el cacao es medular tambin desde la perspectiva social, pues su cultivo est vinculado, por sus requerimientos edafoclimticos, a pases, bsicamente en desarrollo localizados en la franja ecuatorial de Amrica, Asia y frica y del que dependen una gran cantidad de agricultores (Efombagn et al., 2007). La importancia del cacao radica en que, de ste rbol se obtienen frutos (mazorcas) de las cuales, se extraen de 30 a 50 semillas (almendras) por mazorca, que son utilizadas ampliamente en las industrias alimentaria, farmacutica y cosmtica; las cuales
cacao) para la elaboracin de chocolates. Esta industria genera divisas por unos 73 000 millones de dlares (Ploetz, 2007) y de esta actividad dependen unos 60 000 empleos en todo el mundo (Lanaud et al., 2009). Desafortunadamente su permanencia
como sistema de produccin, sobretodo en el Neotrpico, se ve amenazada por
enfermedades (Brown et al., 2007; Clement et al., 2003a; Queiroz et al., 2003) que estn orillando a quienes practican esta actividad a sustituir su cultivo o, en el mejor de los casos establecerlos con nuevos individuos que ofrezcan resistencia a los embates de los antagonistas. Esta caracterstica que parece ser ventajosa desde la perspectiva de la produccin, conlleva dos marcados aspectos negativos: 1). la prdida del ecosistema existente en los cultivos con la consecuente disminucin en la diversidad biolgica, y aumento en el potencial de erosin de suelos y, 2). demerita la aceptacin sensorial en los mercados ms exigentes, puesto que los genotipos con mayor tolerancia o resistencia a enfermedades en generalmente de estn calidad
demandan manteca de cacao (grasas) y torta de cacao o cocoa (obtenido al extraer las grasas) o bien licor de cacao (pasta de
limitados
caractersticas
sensorial de las almendras. Enfatizando en el segundo aspecto, los criterios de seleccin
37
ms
difundidos
en
los
programas
de
las accesiones introducidas a mediados del siglo pasado, dieron origen a gran parte de la variabilidad presente en los cultivos de Mesoamrica. Lo anterior convierte a las plantaciones asentadas en esta parte del mundo, junto con las caractersticas
mejoramiento son, precisamente tolerancia o resistencia a enfermedades (principalmente a moniliasis [Moniliophthora roreri Evans,
Stalpers, Samson & Benny], mancha negra [Phytopthora spp.] y escoba de bruja
[Moniliophthora perniciosa Stahel]) (PhillipsMora et al., 2005), el rendimiento agronmico (Irizarry & Goenaga, 2000) y solo en menor medida, la calidad de grano. Las almendras de cacao de calidad, provienen de la variedad Criollo que, a diferencia del cultivar Forastero y del
edafoclimticas, en candidatas a conservar y exhibir individuos con la calidad requerida por los mercadores ms exigentes. Baste como muestra el reciente inters de la comunidad europea al adquirir parte importante de la cosecha de cacao programada para el ao 2012 y reconocerlo como de uno de los mejores cacaos del mundo (Chiapas.gob, 2010). Como anteriormente se coment, los programas de mejoramiento del cacao
Trinitario (obtenido por la recombinacin de los dos primeros), fue domesticada (Whitkus et al., 1998) y empleada como materia prima en la alimentacin de los pueblos
precolombinos de Centroamrica hace unos 3 800 aos (Powis et al., 2011). El pueblo Olmeca (1800 a.C.-100 a.C), ubicado en lo que hoy es el estado de Veracruz fue el que originalmente cultivo esta planta (Powis et al., 2011), despus los Mokayas e Izapeos (1100 a.C.-1200 d.C.) en la regin
enfocaron su atencin en caractersticas fenolgicas de inters agronmico las cuales, estn fuertemente influenciados por el
ambiente (Azofeita-Delgado, 2006). A partir de la dcada de los ochenta del siglo pasado se empezaron a incorporar marcadores moleculares como herramientas auxiliares en los estudios y programas relacionados con esta planta. Se han empleado isoenzimas (Lanaud, 1986), AFLP (Lerceteau et al., 1997; Perry et al., 1998; Queiroz et al., 2003), RAPD (Lerceteau et al., 1997; Moreno et al., 2004; Whitkus et al., 1998), y SSR microsatlites (Trognitz et al., 2011; Zhang et al., 2006a; 2006b) con el objetivo de asociarlas a caractersticas de inters
Soconusco (Chiapas) (INAH, 2007) y Mayas en la selva Lacandona, (Chiapas) Tabasco y pennsula de Yucatn (Whitkus et al., 1998). El empleo como moneda de las semillas de cacao da cuenta de la importancia social, religiosa y econmica que lleg a tener este cultivo. El hallazgo de descendientes aislados de cacaos criollos en la regin poblada por los pueblos precolombinos, hasta nuestros das (Motamayor et al., 2002; Whitkus et al., 1998) muestra que, pueden haber fungido como reservorio gentico, y al recombinarse con
comercial (detallado ms adelante) como el rendimiento agronmico y resistencia a
enfermedades. Dichos marcadores tambin se han empleado para reducir la redundancia
38
y etiquetado errneo, conocer la estructura de las poblaciones tanto en bancos de germoplasma como ex situ, as como para analizar la genealoga de las accesiones. Pese al gran nmero de trabajos que emplean marcadores moleculares, muy poco se ha abordado sobre su uso y la asociacin de stos con la calidad que ostentan las almendras de cacao. En este trabajo se hace un repaso sobre la importancia del cacao, los grandes avances para descifrar los secretos guardados en su genoma, se particulariza en los hallazgos con el uso de los marcadores moleculares asociados con diversas
SITUACIN ACTUAL DEL CULTIVO DE CACAO Para el ao 2009, se produjeron, a nivel mundial, poco ms de 4.2 millones de toneladas de grano de T. cacao, reporte muy similar al obtenido los dos aos anteriores (2007-2008). Mxico ocup el lugar trece en produccin con 22 660 toneladas (en 2009), lo que represent un ingreso de 23.5 millones de dlares, produccin por arriba de
Venezuela, Malasia, Uganda e India (FAO, 2011), y mostrando un descenso gradual respecto de aos anteriores (Tabla 1). En Mxico, el 95% de cacao se obtiene de las plantaciones en los estados sureos de Tabasco y Chiapas; tan solo en la regin Soconusco (Chiapas) se cultivan 11 500 ha (Molina & Crdova, 2006) y de donde se han reportado morfotipos del cultivar Criollo.
caractersticas de inters en el cacao y se discute acerca del potencial de stos para ser correlacionados con las caractersticas de calidad.
Tabla 1. Produccin de almendras de cacao seco en Mxico en la ltima dcada. Ao 1999-2001 2003-2005 2007 2008 2009 Fuente: FAO, 2011. Produccin (Ton) 38 613 43 435 29 910 27 548 22 660
De las tres variedades cultivadas, los Trinitarios y Forasteros [de los cuales se hipotetiza que existen dos grupos genticos (los Forasteros del Alto Amazonas UA y los del bajo Amazonas LA) Efombagn et al., 2009] ocupan cerca del 95% del total
cultivado, en pases del Oeste de frica, Brasil y Ecuador, y del cual se obtiene igual porcentaje del chocolate que se comercializa. De la variedad Forastero, se obtiene el cacao a granel o bsico y contribuy como parental en la generacin de los Trinitarios
39
hace unos 250 aos (Motamayor et al., 2003). La variedad Criollo, clasificada como subespecie cacao (Cuatrecasas, 1964), y del cual se obtiene el cacao fino contribuye a la produccin mundial con el 5% (Afoakwa et al., 2008); aunque su consumo an est revalorndose, se encuentra en expansin y es mucho ms exigente respecto a la calidad de la materia prima y de los productos derivados de sta. Este mercado gourmet paga sobreprecios por almendras obtenidas del genotipo Criollo y destina el grano a la elaboracin de chocolates finos altamente cotizados en Estados Unidos y Europa. Esta situacin, sumada a otras caractersticas de mercadeo, que premia los productos con denominacin de origen y simplifica los requerimientos de comercio, estimula la conservacin, cultivo y comercializacin de razas o genotipos de calidad superior. Se ha reportado, que los individuos Criollos nativos o antiguos (Motamayor et al, 2002; Whitkus et al., 1998) estaran asociados con menor rendimiento
inters (pero no solo desde la perspectiva del rendimiento), se vislumbra un horizonte poco alentador, ya que los cacaocultores optan por cambiar el sistema a otro que demande menores esfuerzos y mayores rendimientos, siendo muchas veces la eleccin poco acertada. beneficio representan, Los cacaotales, y adems del que parte
social
econmico como la
contribuyen
soporte de nichos ecolgicos para una gran diversidad de especies vegetales y animales, encontrando desde especies maderables, florales y animales como mamferos, aves y ardillas. La existencia de individuos criollos en Mesoamrica, es importante por varios
motivos, muestra evidencia inequvoca de su cultivo y domesticacin, adems que ha contribuido con la diversidad gentica
presente en las plantaciones intensivas del sur de Mxico. Pese a que los individuos de cacao presentan un sistema de
entrecruzamiento preferentemente alogamo, se ha documentado una clara distincin entre sistemas de auto-incompatibilidad de los genotipos Forasteros y de auto-
agronmico, al poseer mazorcas de menor tamao y menos nmero de almendras por fruto, adems a de una marcada roreri y
compatibilidad de los Criollos (Cheesman, 1944). Sin embargo, existen reportes de segregacin hacia los dos sistemas de polinizacin por parte de los dos genotipos (Bartley & Cope, 1973). Hoy da y dada la fuerte recombinacin de parentales por parte de algunos buscando programas aumentar el y cacaocultores, vigor hibrido
susceptibilidad Phytophtora
Moniliophtora La
palmivora.
moniliasis,
provocada por M. roreri, desde su primer reporte en Mxico (Phillips-Mora et al., 2006) ha provocado el abandono del cultivo de cacao, o la reduccin, tanto del rea
cultivada como de la produccin de grano (cerca del 50% en los ltimos seis aos). De no atenderse esta situacin y establecer programas serios de rescate de genotipos de
(heterosis) como la principal responsable de mejoramiento, se pueden hallar plantaciones de cacao en el Soconusco, Chiapas (como en otras partes del mundo) con individuos
40
que
responden
ambos
sistemas
de
los productos y, en el caso particular del cacao se coment antes de la preferencia de los consumidores ms exigentes hacia
entrecruzamiento tal como ha demostrado Efombagn et al. (2009) ocurre en la
recombinacin
abierta
de
poblaciones
productos obtenidos de las plantaciones de Soconusco (Chiapas).
cultivadas y de invernadero en Camern donde ha encontrado hasta 28.3% de
descendencia proveniente de polinizacin no controlada. Los individuos que descienden de estos sistemas de entrecruzamiento, se vuelven un importante reservorio de genes que potencialmente pueden exhibir las
LA UTILIDAD DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA COMPRENDER
LOS SECRETOS DEL CACAO Marcadores moleculares Previamente se enfatiz, que hasta antes de las primeras aplicaciones de los
caractersticas de sus parentales, siendo la calidad sensorial (aroma, sabor y textura principalmente) una de stas (cuando la heterosis y la auto-incompatibilidad en
marcadores moleculares en estudios de gentica y mejoramiento de organismos, los marcadores por eleccin, eran aquellos regulados por genes asociados a caracteres morfolgicos y de rendimiento, en general fenotipos de fcil cuantificacin e
genotipos Criollos coinciden), y que mejora las caractersticas agronmicas de
rendimiento y tolerancia a enfermedades, como se ha demostrado puede ocurrir en las variedades Trinitario (Johnson et al., 2009). Por otro lado, Aikpokpodion (2010), llev a cabo una correlacin entre marcadores agro-morfolgicos con individuos de inters desde el punto de vista de la calidad. Reporta, que factores ajenos a la gentica del cacao, tales como las condiciones edafoclimticas del lugar (Nigeria), permiten el desarrollo de caractersticas nicas de sabor en razas Amelonadas nativas de ese pas Africano, derivadas de Forasteros del Bajo Amazonas y del Amelonado del Oeste Africano. Este estudio, adems de poner en evidencia lo que ya se ha documentado ampliamente, acerca de la influencia del ambiente sobre la expresin de los
identificacin visual. Sin embargo, el limitado nmero de estos marcadores y la
interferencia episttica o ambiental acotaron su expansin (Azofeita-Delgado, 2006). La revolucin en este mbito se inici con el descubrimiento marcadores y utilizacin los de cuales los se
moleculares,
desarrollaron rpidamente y su nmero fue ampliado, expandiendo su aplicacin a
prcticamente a todas las especies de organismos vivos y acelerando los avances en los programas de bsqueda de
organismos de inters. En el caso de T. cacao, su empleo ha resultado de gran utilidad en estudios
relacionados con diversos aspectos de la biologa y genealoga de esta planta tropical. As, han sido auxiliares en estudios de etiquetado de accesiones en los bancos de germoplasma ms importantes del mundo,
marcadores morfolgicos; apoya la hiptesis de que un microclima especfico puede potenciar las caractersticas sensoriales de
41
donde la clasificacin y muchas veces el etiquetado errneo (Motamayor et al., 2008; Motilal et al., 2011; Takrama et al., 2005; Zhang et al., 2009, 2008) se realiz en base a caracteres morfolgicos. Otras aplicaciones incluyen el estudio de la diversidad gentica tanto en bancos de germoplasma como en campos de cultivo, estudios de la genealoga de individuos y poblaciones y caracterizacin del germoplasma, bsicamente orientado a caractersticas agronmicas de inters. Los primeros marcadores moleculares (no basados en ADN) empleados en cacao fueron las isoenzimas (Lanaud, 1986), pese a las desventajas inherentes a esta
Los RFLP, se han empleado dada su alta reproducibilidad y la naturaleza allica
codominante, en la construccin de mapas de ligamiento gentico y etiquetado de genes y en la localizacin de loci que afectan a caracteres cuantitativos (QTL) vinculados a fenotipos de importancia agronmica
(Lanaud et al., 1995; Risterucci et al., 2000) y la evaluacin de la diversidad gentica (Motamayor et al., 2002; N'goran et al., 1994). Los principales inconvenientes de estas herramientas son, debido a que las sondas de RFLP son siempre especficas para un nmero limitado de lugares, RFLP no es una herramienta muy eficaz para la identificacin de genotipos de cacao, no se puede automatizar su aplicacin y la
herramienta, como son el bajo nmero tanto de loci como en el polimorfismo, en su momento ofrecieron excelentes resultados y encontraron gran aplicacin en estudios de diversidad gentica, en la identificacin de genotipos, as como en la construccin de mapas de ligamiento (Lachenaud et al., 2004; Ronning & Schnell, 1994; Sounigo et al., 2005; Warren, 1994). Otro tipo de marcadores que ms
generacin de datos es laboriosa y puede ser costosa (Guiltinan et al., 2008). Los RAPDs fueron los primeros
marcadores basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) que se aplicaron para la caracterizacin gentica del cacao (Wilde et al., 1992). Se ha empleado dada la facilidad de su aplicacin, para identificacin clonal, clasificacin de acuerdo al origen geogrfico (Rusell et al., 1993), as como en estudios de etiquetado incorrecto y la duplicidad (Faleiro et al., 2002; Sounigo et al., 2005). Los RAPD tambin han sido ampliamente utilizados en los anlisis de la diversidad gentica (Figueira et al., 1994; Lerceteau et al., 1997; N'goran et al., 1994; Whitkus et al., 1998). Aunque este sistema es tcnicamente fcil de realizar, se obtiene una baja reproducibilidad entre experimentos y entre laboratorios. RAPD no mide
frecuentemente se usan en cacao, son los marcadores de ADN, especficamente, los polimorfismos fragmentos en de la longitud de los
restriccin
(RFLP),
polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD), fragmentos polimorfismo de longitud (AFLP), de y
amplificados
secuencias simples repetidas (SSR). Estos marcadores difieren en abundancia
genmica, el nivel de polimorfismo detectado, la especificidad hacia el locus, la
reproducibilidad, los requerimientos tcnicos y el costo (Guiltinan et al., 2008).
directamente la heterocigosidad, lo que hace
42
que sea menos til para determinar el genotipo en vez de simplemente distinguir entre clones. El nmero de marcadores variables que pueden ser generados por RAPD es pequeo y no es adecuado para aplicaciones de alto rendimiento (Guiltinan et al., 2008). Los AFLP ofrecen las ventajas
en serie y de forma aleatoria a travs de todo el genoma de los seres vivos. Existen varias clasificaciones, pero la ms comn es de acuerdo al nmero de nucletidos que posea el motivo repetido, sea como: mono, di, tri, tetra, penta o hexanucletido (Figura 1). Poseen varias ventajas frente RFLP, a otros RAPD,
marcadores
(minisatlites,
combinadas de los RAPD y RFLP (Vos et al., 1995), como alto polimorfismo y
AFLP, etc.); sean o no basados en PCR, ya que son muy polimrficos como
reproducibilidad aceptable entre laboratorios, no requerir datos de la secuencia para la construccin de primers. Sin embargo, su uso en cacao ha sido limitado, debido a la dominancia allica, lo que no permite medir la heterocigosidad, esto debido a la posible falta de homologa en la comigracin de los fragmentos pertenecientes a diferentes loci.
consecuencia de la alta tasa de mutacin en los loci. Puesto que, la repeticin no codifica para formar ninguna protena, y debido a que las secuencias de ADN repetitivo pueden recombinarse y expandirse con ms
frecuencia, estas regiones son a menudo altamente variables y consecuentemente
tiles para medir el polimorfismo entre especies o variedades muy relacionadas
Los microsatlites Las secuencias simples repetidas (SSR) por su nombre en ingls, Simple Sequence Repeat o microsatlites son segmentos cortos de ADN (de 1 a 10 pb), que se repiten
(Azofeita-Delgado, ampliamente poblaciones gentica.
2006), en
caracterstica los la estudios diversidad
deseable para
evaluar
Cebador R T A GC A A A A GA C C A A C GGGT 5G C A G G G C A G G C T C A G T G A A G C A - - - C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T - - - A T C G T T T T C T G G T T G C C C A-3 Microsatlite 3C G T C C C G T C C G A G T C A C T T C G T - - - G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A - - - T A G C A A A A G A C C A A C G G G T- 5 GC A GGGC A GGC T C A GT GA A GC A Cebador F
Fig. 1. Microsatlite di-nucletido (CT)14 mTcCIR1 y cebadores para su amplificacin. Nmero de accesin Y16883. (Lanaud et al., 1999).
Adems,
estos
marcadores
son
se encuentran de forma abundante (estn uniformemente dispersos a travs del
generalmente neutros con relacin a los efectos fenotpicos y efecto episttico o pleiotrpico herencia mnimo o nulo; presentan y revelan
genoma, aproximadamente cada 10 Kbp), se requieren solo pequeas cantidades de ADN, son relativamente fciles de medir (aunque no de estandarizar) y analizar, pueden automatizarse para el anlisis de muchas
mendeliana
simple
codominancia (pudindose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos),
43
muestras en tiempos relativamente cortos. Debido a estas importantes ventajas, los microsatlites han sido el mtodo de eleccin para conducir investigaciones en cacao en la ltima dcada.
el apoyo de la estadstica Bayesiana. As por ejemplo Bhattacharjee et al. (2004) hallaron baja tasa de adopcin de germoplasma mejorado en los campos agrcolas de
diferentes zonas agroecolgicas en Nigeria. De los pocos estudios conducidos en
Principales aplicaciones de los SSR en los estudios del Cacao Por las caractersticas antes apuntadas, los microsatlites han sido empleados para analizar diversos aspectos del manejo de germoplasma de cacao, entre destacan: 1. En la identificacin de las accesiones duplicadas y mal etiquetado en colecciones de germoplasma. Debido a las limitantes para discriminar entre accesiones, ya que sus conclusiones tenan poco rigor las que
Mesoamrica, Ruiz et al. (2011), empleando diez microsatlites analizaron 70 accesiones de Nicaragua, encontraron deficiencia de heterocigosis, pero un nivel moderado de diversidad gentica pese al corto historial de cultivo extensivo en ese pas reportado por Trognitz et al. (2011) y lo atribuyen a un posible muestreo entre consanguneos o derivados mayoritariamente de
autofecundaciones o, como resultado de diferente poblaciones. Tambin con apoyo de los SSR se ha hipotetizado en varios reportes acerca de que la Amazonia Peruana posee alto nivel de diversidad gentica, presentando estructura espacial, adems de alta diversidad allica en poblaciones cultivadas (Zhang et al., 2006a). Del mismo modo, Johnson et al. (2009), encontraron una estrecha relacin gentica entre genotipos Trinitarios selectos y los posibles parentales, colectados 70 aos antes. Adems obtuvieron, usando 35 frecuencia allica entre
estadstico (Sounigo et al., 2005), los AFLPs y RAPDs, fueron sustituidos en su totalidad por los SSR. Los avances en este sentido, han permitido establecer mediante la
creacin de un consorcio internacional, un conjunto de 15 microsatlites estndares para el etiquetado correcto de las accesiones y la identificacin inequvoca, los cuales son utilizados en varios de los bancos de germoplasma alrededor del mundo, y han permitido identificar por ejemplo, de entre 105 accesiones, 10 grupos mal etiquetados (Zhang et al., 2006b). 2. En estudios de diversidad gentica, relaciones genealgicas y filogeografa. Los estudios buscando explicar la diversidad y estructura poblacional tanto de colecciones como de plantaciones de cacao, han
microsatlites una diferenciacin espacial de los genotipos Trinitarios y Criollos (agrupados en un clster) al compararlos con
poblaciones del Alto y Bajo Amazonas y de Ecuador obtenidos de banco de
germoplasma. Por su capacidad para revelar
mostrado un incremento pronunciado con la aparicin de los microsatlites y ms an con
codominancia, los microsatlites resultan muy adecuados en la bsqueda y
44
esclarecimiento de relaciones genealgicas y estas investigaciones, a su vez son
heterocigosidad observada, lo que revela alta tasa de homocigotos que coincide con la aseveracin de Ruiz et al. (2011), en el sentido de estarse presentado altas
sumamente tiles para comprender el flujo de genes en las poblaciones naturales, la contribucin de los genotipos antiguos en la estructura de las poblaciones actuales as como para rastrear la posible contribucin de parentales en los programas de
frecuencias de autopolinizacin o el muestreo incluye alta consanguinidad. La poblacin del Alto Amazonas exhibi la mayor diversidad gentica y por lo tanto, los autores la sugieren en concordancia con otros autores como parte del centro de diversificacin de la especie y, posible centro de origen
mejoramiento de variedades. Otros estudios adems han abordado la bsqueda de patrones de genealoga
asociados con la geografa presente o pasada (filogeografa), en el supuesto de que, al conocer los patrones espaciales de biodiversidad, los procesos de flujo de genes, los efectos histricos y climticos sobre la distribucin de la diversidad gentica, se tendrn ms herramientas para la
(Cheesman, 1944; Motamayor et al., 2002; Schultes, 1984). En el trabajo de Motamayor et al. (2002) se evalu la composicin allica en las variedades de Amrica Central (genotipos de Guayana, la Amazonia y el Orinoco). Los resultados apoyan la hiptesis de que el cacao se origin en el Alto Amazonas y sugieren la probable ruta de dispersin mediada por humanos desde el Amazonas hasta Amrica Central y Mxico para establecer el cacao Criollo que l os Olmecas domesticaron hace casi cuatro mil aos. Sin embargo reportada la por baja estos diversidad autores gentica para las
conservacin sostenible y el uso efectivo de germoplasma de cacao (Guiltinan et al., 2008). En este sentido, Trognitz et al. (2011), evaluaron estructura la composicin a allica partir de y la 44
gentica
plantaciones y dos accesiones silvestres de Nicaragua, demuestran estructura espacial entre parcelas cultivadas la cual es atribuida por el manejo agronmico, prcticas de seleccin y condiciones ambientales, adems reportan un genotipo nico para las
accesiones de Criollos de Mesoamrica y que, contradice lo antes reportado (De la Cruz et al., 1995; Whitkus et al., 1998), debe ser corroborada y en su caso, podra ser explicada por la gran presin de seleccin a la que estuvo sometida la planta en los procesos de domesticacin sensoriales buscando y
accesiones silvestre e hipotetizan acerca de la posible relacin gentica con individuos cultivados por los Mayas en la precolonia. Sereno et al. (2006) compararon 94 accesiones de cuatro poblaciones naturales de la Amazonia de Brasil. Exceptuando a la poblacin restantes del Alto Amazonas, bajo en las de
caractersticas
agradables
agronmicas que pudieron haber sido de inters para los pueblos precolombinos
(como pulpa ms dulce, mayor nmero de semillas) durante varios siglos y que se
encontraron
ndice
45
promovi fuertemente por las caractersticas de auto compatibilidad casi exclusiva
Si la propagacin fue mediada por el hombre, como hipotetizan los estudios, cul sera la intencin de dispersar una semilla o planta que, en su centro de diversidad (Alto Amazonas) no tena uso agronmico o social?- o al menos no hay evidencia arqueolgica de esto, como si existe de manera abundante en
reportado para los Criollos y presuntamente observada en otras accesiones (Ruiz et al., 2011; Sereno et al., 2006). Respecto a la dispersin de individuos del Alto Amazonas, para dar origen sta a los Criollos de
Mesoamrica,
enfrenta
algunas
cuestiones por ejemplo, se ha reportado que de manera natural el rbol del cacao tiene una baja o nula capacidad de dispersin, en estado silvestre, los rboles de cacao por lo general se multiplican a travs de
Mesoamrica y; cmo se llevara a cabo el traslado, con semillas de la naturaleza antes descrita para recorrer los aproximadamente 2000 km de distancia entre el Alto Amazonas y accesiones de Nicaragua empleadas en el reporte (Motamayor et al., 2002) en perodos breves para garantizar la no desecacin y prdida de viabilidad de las semillas?. 3. En la construccin de mapas de ligamiento y bsqueda de loci asociados a caracteres cuantitativos (QTL) Se han desarrollado una gran cantidad de mapas genticos para detectar QTL para varios rasgos sobre todo de importancia agronmica. Los principales intereses en la bsqueda de estos marcadores han sido: a) resistencia enfermedades a las tres por principales hongos,
propagacin vegetativa (Lachenaud & Zhang, 2008), los frutos son indehiscentes con un pericarpio espeso y duro (sobre todo los Criollos), y no presenta abscisin, lo cual significa que se mantiene unido
indefinidamente al rbol. Las semillas son altamente susceptibles a la desecacin
(recalcitrantes), sobre todo las de la variedad Criollo (Rangel, 2009), germinan dentro de la fruta y puede perderse fcilmente si las plntulas no tienen una va de dispersin exgena. Si este papel es realizado por animales (principalmente monos), quienes pueden tragar semillas enteras sin
causadas
caracteres de rendimiento, b) vigor de la planta, c) nmero de vulos y d)
masticarlas y terminan en el suelo en las heces, donde germinan se han rpidamente reportado
caractersticas de mazorca y grano (Tabla 2). Las enfermedades son responsables de prdidas que pueden llegar a alcanzar 100%, debido a esto, la gran mayora de los trabajos en este sentido han dedicado esfuerzos a localizar los genes responsables de conferir resistencia a algunos genotipos y como estos pueden ser transferidos (Brown et al., 2007; Cervantes-Martnez et al., 2006; Clement et al., 2003a; Feltus et al., 2011; Lanaud et al.,
(endozoocoria),
principalmente a Cebus nigrivittatus y C. apella o Alouatta seniculus (Lachenaud & Zhang, 2008), este ltimo gnero
caracterizado como de baja actividad (Muoz et al., 2002) y que enfrentara grandes retos por transportar las semillas en distancias considerables.
46
2009; Pugh et al., 2004; Risterucci et al., 2003). Un porcentaje menor de los trabajos, se enfoca en la bsqueda de genes
Martnez et al., 2006; Clement et al., 2003a, 2003b; Crouzillat et al., 1996; Feltus et al., 2011), lo cual denota hacia donde se orientan las prioridades de la investigacin en cacao.
involucrados en caracteres morfolgicos de arboles, frutos y almendras (Cervantes-
Tabla 2. Principales investigaciones en Theobroma cacao L. empleando marcadores moleculares en la bsqueda de caracteres de inters agronmico Brown et al., 2007; Cervantes-Martnez et al., 2006; Clement et al., 2003a; Crouzillat et al., QTLs asociados con resistencia a Phytophthora palmivora 2000; Feltus et al., 2011; Flament et al., 2001; Lanaud et al., 1995; Lanaud et al., 2009; Pugh et al., 2004; Risterucci et al., 2000; Risterucci et al., 2003
QTLs asociado con resistencia a Crinipellis (Moniliophthora) perniciosa QTLs asociados con caracteres floracin, de vulos,
Brown et al., 2005; Faleiro et al., 2006; Figueira et al., 2006; Lanaud et al., 2009; Queiroz et al., 2003
morfolgicos rendimiento,
(vigor, nmero
Cervantes-Martnez et al., 2006; Clement et al., 2003a; Clement et al., 2003b; Crouzillat et al., 1996; Feltus et al., 2011 Brown et al., 2007; Cervantes-Martnez et al., 2006; Lanaud et al., 2009 Borrone et al., 2004
ndice de grano y peso de mazorca) Localizacin de QTLs asociados a resistencia a Moniliophtora roreri Marcador asociado a tolerancia al estrs
La reciente publicacin de la secuencia genmica del cacao (Argout et al., 2011), ofrece importantes aportaciones a la
interrogantes guardadas en el genoma de esta planta. De los hallazgos importantes, se estima de manera ms precisa (mediante citometra de flujo) el tamao del genoma de esta planta (430 Mb del genotipo criollo B9761/B2), con numero cromosmico 2n= 20, el cual es considerado como pequeo en comparacin con individuos de las mismas
comprensin de posibles explicaciones en la sntesis de compuestos de inters (algunos implicados en la calidad sensorial) y ofrece una oportunidad nica a los investigadores para dirigir estudios buscando explicar las
47
caractersticas fenotpicas que el rbol del cacao y, que haba sido estimado en 390 Mb por reasociacin cintica (Couch et al., 1993). En este estudio, de basndose los en el
extraos y libre de cualquier evidencia de adulteracin, b) de tamao bastante
uniforme, considerablemente libre de granos fragmentados, cscara, y fragmentos prcticamente y piezas exentas de de
conocimiento
mecanismos
materias extraas (Dongo et al., 2009). Aunque esta definicin no incluye de manera total, los aspectos importantes del sabor y aroma que determinan la aceptacin de algunos mercados gourmet, se puede entender que, hay caractersticas que
moleculares y bioqumicos de plantas modelo y, despus de realizar anlisis de ortologa con genes de Arabidopsis thaliana, Vitis vinifera, Populus sp. y Glycine max, muestra asociaciones entre genes posibles
candidatos relacionados con la resistencia a enfermedades y, con la calidad de las almendras. sta ltima, entendida como la cantidad genes potencialmente involucrados en las sntesis de macromolculas (grasa, protenas, almidn) y metabolitos
dependen del manejo poscosecha, como la uniformidad de las semillas, la presencia de materia extraa y otras; pero tambin otras en las que se involucran procesos
microbianos (fermentacin) y de secado que de realizarse de manera inadecuada
secundarios como flavonoides, terpenoides y alcaloides, que se sabe desempean un papel importante en las caractersticas
demeritan la calidad de las almendras (Criollo y Trinitario), ya que no permiten potenciar la transformacin o aparicin de molculas implicadas en algunas de las caractersticas sensoriales importantes de estos cultivares
sensoriales del cacao.
La
calidad
sensorial
del
cacao,
su
(Rodrguez-Campos et al., 2011). Algunos argumentos, atribuyen una carga sumamente importante para conservar la calidad del cacao al tiempo de cosecha y seleccin de frutos y semillas que debern fermentarse, as como al mismo proceso de fermentacin pues se ha reportado que, emplear frutos (mazorcas) fuera de madurez aumenta el contenido de acido ctrico
asociacin con marcadores La calidad en el cacao, como en todo producto o materia prima, est dada por un nmero amplio de atributos o caractersticas, muchos de ellos intrnsecos a la gentica del vegetal y otros, atribuibles a las condiciones ambientales donde se desarrolla, as como a las prcticas pre y poscosecha. Para calidad tratar se ha de homogenizar acordado la
(Papalexandratou et al., 2011a), lo cual ejerce efecto indeseable sobre el proceso de fermentacin y el posterior secado y tostado, que conllevara la aparicin de metabolitos especficos deseados responsables (cidos de aroma no
terminologa y atributos entendibles como mediante
estndares internacionales, establecer que el cacao de buena calidad comercial debe ser: a) fermentado, completamente seco, libre de almendras vanas, libre de olores anormales o
carboxlicos),
principalmente cido butrico (Rodrguez-
48
Campos et al., 2011), acido propinico y metilpropinico (Frauendorfer & Schieberley, 2008) que demeritan la calidad de cacaos deficientemente tostados. La fermentacin por s misma, fermentados, secados o
de aroma y sabor halladas en mazorcas (pulpa) de diferente variedad y la calidad sensorial de las almendras, mostrando la variacin asociada con el genotipo pues reportan la presencia de astringencia y poco dulzor en variedades de baja calidad y gustos dulce y notas de sabor afrutado en genotipos de calidad superior, adems de poder diferenciar a las accesiones por su origen gentico. En Ecuador, se han empleado algunas caractersticas sensoriales para la seleccin de individuos que forman parte del llamado cacao fino producido en ese pas (Eskes et al., 2007), lo que da cuenta una vez ms, que la calidad desde este punto de vista podra ser correlacionada con algn tipo de
indudablemente tiene un papel crucial en mantener o realzar la calidad de los cacaos Criollos o Trinitarios, pero es cuestionable el argumento de que aplicada bajo ciertos estndares, puede mejorar la calidad del grano de aquellos considerados de calidad inferior en un estudio conducido con cacao Brasileo (Papalexandratou et al. 2011b). Estas conclusiones, son ciertas solo de manera parcial, puesto que se ha
documentado de antao que los genotipos Criollos, independientemente de los procesos poscosecha ofertan caractersticas superior u otros con procesado poscosecha similar (Afoakwa et al., 2008; Ciferri & Ciferri, 1957; Clapperton et al., 1994). Siendo ms realista, podra pensarse que los factores ambientales y procesos practicados posteriores al corte (fermentacin, secado, tostado) influyen en un 50% de la calidad final del producto, mientras que la mitad restante est guardada en la gentica de cada individuo. El otro factor que tampoco es tomado en cuenta en los estndares y que supone la mayor predisposicin para obtener calidad superior es el origen gentico, ya que, como antes se apunt de la variedad Forastero se obtiene cacao de calidad inferior, del
marcador y, los moleculares, se prestan como los candidatos ms apropiados en esta encomienda. La evaluacin sensorial es una
herramienta ampliamente utilizada en el campo de los alimentos, tanto para el desarrollo de productos, como para los estudios de clasificacin y determinacin de la calidad de productos de alto valor
comercial. Su aplicacin como herramienta de medicin supone el entrenamiento de un panel de evaluadores quienes fungen como instrumentos de medicin y emiten su veredicto inequvoco en alguna caracterstica especfica. Su correlacin con mediciones qumicas (acidez, pH) o fsicas (viscosidad, textura) resulta til pero, tediosa puesto que las caractersticas sensoriales evaluadas, son la resultante de una suma compleja de atributos fisicoqumicos y, evaluar una sola caracterstica resulta insuficiente.
Trinitario de calidad intermedia y los granos de alta calidad son producidos por los cacaos Criollos (Sukha & Butler, 2005). Eskes et al. (2007), encontraron correlacin entre notas
49
De
manera
similar,
las
pruebas
extender su alcance a buscar cada vez ms marcadores o QTL con la calidad; el
sensoriales pueden ser desde el punto de vista operativo costosas y tardadas, puesto que no siempre se dispone de un panel entrenado en el momento de querer evaluar la calidad de una accesin de cacao en particular. Establecer marcadores moleculares que puedan estar asociados a regiones no codificantes (SSR) vinculadas a genes que estran potencialmente involucrados en la calidad como sugieren Argout et al., (2011), pero que permiten al ser detectados,
conocimiento del genoma de esta planta resulta una herramienta til para este
propsito. Otro campo de inters que se apertura y que deber ser explotado en su totalidad, es de la bioinformtica, puesto que ahora se cuenta con un cdigo que deber ser descifrado con ms claridad para tratar de comprender los enigmas que esta planta ha guardado por varios milenios.
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segregar a individuos de diferente calidad sensorial (Smulders et al., 2010), podra ser una realidad que ofrecera ventajas de tiempo y costo a los programas de
mejoramiento de variedades cuando esta calidad sea el objeto de inters o, ayudar a proteger accesiones con potencial en este mismo sentido.
CONCLUSIONES El mercado del cacao lejos de extinguirse, a pesar de las enfermedades y problemticas sociales que le aquejan continuar en
Argout X, Salse J, Aury J, Guiltinan M, Droc G, Gouzy J, Allegre M, Chaparro C, Legavre T, Maximova S, Abrouk M, Murat F, Fouet O, Poulain J, Ruiz M, Roguet Y, Rodier-Goud M, Barbosa-Neto J, Sabot F, Kudrna D, Ammiraju J, Schuster S, Carlson J, Sallet E, Schiex T, Dievart A, Kramer M, Gelley L, Shi Z, Brard A, Viot C, Boccara M, Risterucci A, Guignon V, Sabau X, Axtell M, Ma Z, Zhang Y, Brown S, Bourge M, Golser W, Song X, Clement D, Rivallan R, Tahi M, Akaza J, Pitollat B, Gramacho K, DHont A, Brunel D, Infante D, Kebe I, Costet P, Wing R, McCombie W, Guiderdoni E, Quetier F, Panaud O, Wincker P, Bocs S & Lanaud C (2011)
expansin en los aos venideros, como tambin habr de aumentar el mercado que exige productos con mayor contenido de chocolate (no cocoa o manteca de cacao) y que ste sea de calidad superior. Esto supone rescatar y aumentar el cultivo e introduccin de genotipos que producen semillas de calidad superior. Debido a esto, los estudios moleculares relacionados con T. cacao, que cada vez se apoyan o lo harn de herramientas bsqueda de como los SSRs, SCARs, ISSRs, debern
SNPs,
50
The genome of Theobroma cacao. Nat. Genet. 43(2): 101-109. Azofeita-Delgado marcadores Aplicaciones A (2006) en del Uso de
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Aspectos Qumicos y Moleculares del Proceso de Produccin del Mezcal

Pilar Escalante-Minakata1,2, Ana P, Barba de la Rosa2, Leticia Santos2 y Antonio De Len-Rodriguez2
1
Laboratorio de Bioingeniera Ambiental, FIC, Universidad de Colima. Km 9 Carretera Colima-Coquimatln, CP. 28017. E-mail:minakata@ucol.mx 2 Divisin de Biologa Molecular, Instituto Potosino de Investigacin Cientfica y Tecnolgica A.C. Camino a la presa San Jos 2055, Col. Lomas 4 secc. CP 78216, San Luis Potos, S.L.P., Mxico. E-mail: aleonr71@gmail.com
RESUMEN En este trabajo se presentan los aspectos qumicos y moleculares del proceso de produccin del mezcal obtenido a partir de Agave salmiana. En este estudio se incluye la optimizacin de las condiciones fermentativas, la identificacin molecular de la microbiota nativa y la cuantificacin de los compuestos voltiles que impactan en las caractersticas finales de la bebida. Los resultados de la optimizacin de la etapa fermentativa mostraron que la concentracin mxima de alcoholes superiores se alcanz a los 28C y una concentracin de azcar de 105 g/l. La productividad mxima se logr a 34.6C y 90 g/l y el mximo rendimiento de etanol se obtuvo a 28C y 77 g/l. Se identificaron 11 microorganismos diferentes en la fermentacin; tres de ellos fueron las levaduras Clavispora lusitaniae, Pichia fermentans y Kluyveromyces marxianus. Los otros ocho microorganismos fueron Zymomona mobilis subsp. mobilis y pomaceae, Weissella cibaria, Weissella paramesenteroides, Lactobacillus pontis, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus farraginis . Referente al anlisis cromatogrfico de los mezcales jvenes, reposados y aejos, se identificaron 37 compuestos voltiles. Se incluye una discusin de los trabajos realizados sobre mezcales obtenidos a partir de otras especies del gnero Agave, as como un anlisis comparativo del perfil sensorial de 105 compuestos voltiles identificados en las bebidas que cuentan con distintas denominaciones de origen. Se concluye que 17 de ellos podran ser referidos como marcadores de autenticidad. Palabras clave: Mezcal, agave, fermentacin, compuestos voltiles.
ABSTRACT We present a study on the most relevant chemical and molecular aspects of the production process of the mezcal, obtained from Agave salmiana. The study includes the optimization of fermentative conditions, the molecular identification of native microbiota as well as the volatile compounds quantification that impacts on the final characteristics of the spirit. The fermentative stage optimization results showed that the maximum concentration of the higher alcohols was produced at 28C and initial sugar concentration of 105 g/l. The maximum productivity process was attained at 34.6C and 90 g/l and, the highest ethanol production was reached at 28C and 77 g/l. Eleven different microorganisms
57
were identified in the mezcal fermentation. Three of them were the following yeast: Clavispora lusitaniae, Pichia fementans and Kluyveromyces marxianus. The other microorganisms found were Zymomona mobilis subsp. mobilis and pomaceae, Weissella cibaria, Weissella paramesenteroides, Lactobacillus pontis, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus farraginis. Thirtyseven compounds were identified in commercial mezcals (white, rested and aged). Additionally, a comparative analysis of the sensory profile of mezcals obtained from different species of Agave genus is included. One hundred and five different volatile compounds were identified in Mezcal and others distilled beverages with distinct denomination of origin. We conclude that 17 compounds could be used as markers for authenticity. Keywords: Mezcal, agave, fermentation, volatile compounds
INTRODUCCIN El maguey llamado metl o mexcalmetl en lengua nhuatl, es una planta conocida y utilizada en Mxico desde la poca prehispnica. De sus jugos se preparaban bebidas
otra, entre los que destacan: tequila, sotol, bacanora, raicilla, sisal y mezcal (De Len et al., 2008 ). En el caso particular del mezcal, la norma Mexicana de bebidas alcohlicas (NOM070, 1994) establece que nicamente puede ser producido en los estados de Durango,
a
fermentadas utilizadas para fines medicinales o rituales y sus hojas se empleaban para la produccin de fibras, papel, clavos, cuerdas, costales y telas (Cervantes, 2002). Actualmente, la fabricacin de bebidas alcohlicas destiladas es el uso ms importante que se le ha dado a diversas plantas del gnero Agave (Herrera, 2008). Se cree que el proceso de destilacin fue introducido a Mxico con la llegada de los espaoles; sin embargo, estudios realizados en la Pirmide de las Flores en la zona arqueolgica Xochitcatl en el estado de Tlaxcala, muestran indicios de que se destilaba mezcal en
Zacatecas, San Luis Potos, Guerrero y Oaxaca. El proceso de elaboracin del mezcal involucra 5 etapas principales que incluyen la recoleccin de las pias, coccin y molienda de las mismas para extraer las azcares, la fermentacin y
finalmente la destilacin (Figura 1).
ORIGEN
DE
LA
MATERIA
PRIMA
OBTENCIN DE JUGO En Mxico crecen alrededor de 150 especies del gnero Agave y se encuentran distribuidas en ms de 75% del territorio nacional
Xochitcatl-Cacaxtla antes del arribo de los espaoles (Serra & Lazcano, 2011), aunque este proceso al parecer no fue generalizado entre las culturas prehispnicas. En casi todos los estados de la Repblica Mexicana se producen bebidas alcohlicas con mtodos tradicionales a partir de la fermentacin de las azcares de los agaves. El nombre que se usa para referirse a ellas vara de una regin a
predominando en las zonas ridas y clidas del sur (Garca, 2007). En el estado de Oaxaca se encuentran 52 especies siendo el estado con mayor diversidad de agaves en Mxico. El mezcal en dicho estado se obtiene de tres especies principales: 1) Agave angustifolia Haw conocido comnmente como agave espadn con extensos cultivos, 2) plantas de Agave potatorum y 3) Agave karwinskii (Segura, 2010). En la
58
Fig. 1. Etapas del proceso de produccin de mezcal.
regin del altiplano Zacatecano-Potosino, la especie que predomina es el Agave salmiana Otto ex salm-dick distribuida en forma silvestre (Esparza-Frausto et al., 2008). El proceso para la elaboracin del mezcal comienza cuando la planta ha alcanzado su estado de madurez alrededor de 10 aos y es en autoclaves cuyo objetivo principal es la hidrlisis de los fructanos. Estos representan el 60% del total de los carbohidratos solubles
candidata a ser jimada; proceso que consiste en retirar las hojas o pencas de la planta para obtener el corazn o pia. Posteriormente es transportada a la fbrica para su procesamiento. Despus de la recoleccin de las pias se lleva a cabo el proceso de coccin el cual puede realizarse en hornos de piso, de mampostera o presentes en la planta. La inulina es un oligofructano con enlaces (21) y constituye el carbohidrato de reserva de A. tequilana, A.
59
americana, A. mapisaga, A. antrovirens y A. salmiana. Entre las especies de Agave se presentan diferencias en la distribucin de otros carbohidratos solubles como sacarosa, fructosa y glucosa. Esto se debe a las caractersticas ambientales que prevalecen en las regiones donde son cultivadas o cosechadas (MancillaMargalli & Lpez, 2006). Durante el proceso trmico, las fibras se ablandan lo que facilita la molienda y la extraccin del jugo que contiene azcares simples, principalmente fructosa, que es un fcilmente metabolizada por las levaduras y bacterias alcoholognicas (Segura, 2010; Lpez et al., 2003). En sta etapa tambin ocurren reacciones de caramelizacin o de Maillard que forman compuestos como 3-metil-1butanol y alcohol feniletlico (Mancilla-Margalli & Lpez, 2002). El sobrecalentamiento de los azcares incrementa la concentracin de furfural dando un sabor a ahumado y el exceso de caramelizacin reduce el rendimiento de etanol (Cedeo, 1995). En el estado de Oaxaca, la coccin se realiza en hornos de piso (Segura, 2010) y en la regin de Zacatecas-San Luis Potos se lleva a cabo en hornos de
procede a preparar el mosto. Esto se hace ajustando el grado de slidos disueltos en el medio para tener una concentracin de azcares que puede ir de 4 a 10% (p/v). El anlisis de los carbohidratos no estructurales del Agave
salmiana realizado por Michel-Cuello et al. (2008) revel que el jarabe est compuesto de fructosa, glucosa, sacarosa, xilosa y maltosa.
FERMENTACIN DE LOS JUGOS DE AGAVE Durante la etapa de la fermentacin se emplea comnmente el mosto ajustado a una concentracin definida de slidos disueltos, el inculo formado por la microbiota nativa y sales inorgnicas como el sulfato de amonio. Esta prctica vara de una mezcalera a otra e incluso entre estados. De Len-Rodrguez et al. (2008 ) realizaron la optimizacin de las condiciones de fermentacin del mezcal de A. salmiana con el objetivo de maximizar la productividad, el
a
rendimiento y la produccin de etanol. Para ello, se utiliz la metodologa de optimizacin por superficie de respuesta, fueron la y los factores de
seleccionados
concentracin
azcares reductores y la temperatura. Los resultados mostraron que las condiciones de fermentacin afectaron la concentracin de alcoholes superiores (utilizados como
mampostera principalmente, aunque ya hay empresas que utilizan autoclaves de acero. Como siguiente etapa, las cabezas de las plantas cocidas se muelen con el objeto de extraer los azcares fermentables. Esta
marcadores de calidad) en el mezcal as como la concentracin de etanol. La concentracin
molienda se realiza de dos maneras: Mediante una tahona (molino de piedra) como el que se muestra en la Figura 1 o con la accin de molinos mecnicos. El subproducto generado (bagazo) representa cerca de un 40% del peso total. Una vez que se ha extrado el jugo se
mxima de 3133 mg/l de alcoholes superiores se alcanz a los 28C y una concentracin de azcar de 105 g/l. La productividad mxima de 2.2 g/l-h se logr a 34.6C y 90 g/l de azcares y el mximo rendimiento de etanol de 0.44 se obtuvo a 28C y 77 g/l de azcares. Se concluy
60
que la optimizacin simultnea de productividad y rendimiento de producto no son compatibles. Adems de que la cintica de crecimiento present un comportamiento tpico de inhibicin por sustrato (De Len-Rodrguez et al., 2008a). Otro aspecto importante que se debe tomar en cuenta durante el proceso fermentativo es el comportamiento de los consorcios de levaduras y bacterias. Las variables analizadas son
indicador de la actividad metablica de los microorganismos durante la etapa fermentativa.
ANLISIS DE LA MICROBIOTA. Las bebidas fermentadas que se producen de forma tradicional como el mezcal, se obtienen mediante fermentaciones espontneas, es decir, no se aaden inculos comerciales sino que actan los microorganismos naturales presentes en el sustrato. Durante ste tipo de
denominadas estados como la concentracin de microorganismos, concentracin del producto, concentracin de sustrato y en algunos casos concentracin interna de enzimas (EscalanteMinakata & Ibarra-Junquera, 2007). Sin
fermentaciones no se obtiene el producto de la accin de una nica especie, ya que en ellas se llevan a cabo procesos bioqumicos muy
complejos, en los que intervienen e interaccionan levaduras y bacterias (Torija, 2002). El principal argumento a favor se indica consiguen que en estas
embargo, todos estos estados son difciles de evaluar en tiempo real. Una solucin a este problema es el desarrollo de modelos basados en ecuaciones diferenciales ordinarias que
fermentaciones
caractersticas
organolpticas tpicas de la zona que no estaran presentes si se utilizara un inculo de cepas forneas. La composicin cualitativa y
contemplen entre sus estados, variables que sean fcilmente monitoreables en tiempo real. Dichos modelos permitiran el desarrollo de controladores que atiendan las perturbaciones inherentes a estos sistemas. Escalante-Minakata et al. (2009) describieron un algoritmo para el monitoreo continuo de la concentracin de biomasa y etanol as como de la velocidad de crecimiento en el proceso de fermentacin del mezcal de A. salmiana basado en la medicin del potencial redox en lnea. El procedimiento combin una red neuronal artificial que relaciona el potencial redox con la concentracin de etanol y de biomasa mediante un algoritmo basado en un observador no-lineal que utiliza las
cuantitativa de la microbiota presente a lo largo de la fermentacin del mosto puede depender principalmente de los siguientes factores: La regin de origen de la materia prima, el procedimiento de produccin, la temperatura y el pH, (Torija et al., 2001; Granchi et al., 1999). Un resumen de los microorganismos identificados en los diferentes procesos fermentativos se muestra en la Tabla 1. Lachance (1995), identific por primera vez la microbiota nativa en un proceso fermentativo de A. tequilana, mediante tcnicas
morfofisiolgicas. En este trabajo se destaca la presencia de Candida intermedia, Candida
estimaciones de biomasa para inferir la velocidad de crecimiento de los microorganismos durante el proceso fermentativo. Los resultados
krusei, Brettanomyces anomalus, Kluyveromyces marxianus, Pichia membranifaciens, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora spp., Candida spp.,
mostraron que el potencial redox es un buen
61
Tabla 1. Microorganismos detectados en los mostos para la produccin de diferentes bebidas alcohlicas de plantas del gnero Agave.
Tipo de bebida Microorganismos identificados Candida intermedia, Candida krusei, Brettanomyces anomalus, Kluyveromyces marxianus, Pichia membranifaciens, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora spp., Candida spp., Saccharomyces cerevisiae, Pichia anomala, Issatchenkia/Pichia spp., Saccharomyces ludwigii, Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri, Brettanomyces bruxellensis, Zygosaccharomyces rouxii . Kluyveromyces marxianus, Clavispora lusitaniae, Schwanniomyces castelli, Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae. Kluyveromyces marxianus, Hortaea werneckii, Pichia mexicana, Rhodotorula glutinis, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces cerevisiae, Pichia delftensis, Geotrichum klebahnii, Clavispora lusitaniae, Pichia membranifaciens. Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces cerevisiae, Pichia kluyveri, Pichia guilliermondii, Pichia mexicana, Clavispora lusitaniae, Zygosaccharomyces bailii, Candida parapsilopsis. Candida sp., Kloeckera, Rhodotorula Brettanomyces sp., Candida sp., Candida boidinii, Candida coliculosa, Candida intermedia, Candida parapsilosis, Citeromyces matriensis, Cryptococcus kuetzingii, Hanseniaspora sp., Issatchenkia orientalis, Pichia membranifaciens, Rhodotorula sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccaromyces pombe, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces sp., Zygoascus sp. y Zygosaccharomyces rouxii Clavispora lusitaniae, Pichia fementans y Kluyveromyces marxianus Zymomona mobilis subsp. mobilis y pomaceae, Weissella cibaria, Weissella paramesenteroides, Lactobacillus pontis, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus farraginis. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc pseudomesenteroides, Microbacterium arborecens, Flavobacterium johnsoniae, Acetobacter pomorium, Gluconobacter oxydans, Hafnia alvei. Lactobacillus paracasei, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sp., Leuconostoc citreum, Acetobacter orientalis, Leuconostoc lactis. Mtodo empleado Tcnicas morfofisiolgicas Referencia Lachance, 1995
Tequila
Mezcal de Durango
RFLP-PCR de la regin 18S. Anlisis de la regin ITS-5.8S
Mezcal de Tamaulipas
MartellNevrez et al., 2009 JacquesHernndez et al., 2009
Anlisis de la regin 26S Arratia et al., 2009 RFLP-PCR de la regin ITS-5.8S AndradeMeneses y Ruiz-Tern, 2004
Mezcal de Oaxaca
RFLP-PCR de la regin ITS-5.8S Segura, 2009
Mezcal de San Luis Potos y Zacatecas
RFLP-PCR de la regin del ITS5.8S, 16S ADNr
EscalanteMinakata et al., 2008
16S ADNr
Escalante et al., 2004
Pulque
16S ADNr Herrera, 2008
62
Saccharomyces
cerevisiae, spp.,
Pichia
anmala,
PCR y los patrones de restriccin obtenidos con las endonucleasas CfoI, HaeIII y HinfI mostraron un patrn nico para cada especie. La extraccin directa de ADN y la amplificacin de la regin del gen 16S ARNr en procariotes y 18S ARNr en eucariotas prove una alternativa en estudios taxnomicos y filogenticos (Borneman et al., 1996; Dojka et al., 1998; Escalante et al., 2001; Daz & Wacher, 2003; Rivas, 2004). EscalanteMinakata et al. (2008) identificaron la comunidad de levaduras en la fermentacin del mezcal de A. salmiana producido en San Luis Potos mediante el uso de la tcnica de RFLP-PCR de la regin del ITS-5.8S. Las levaduras identificadas fueron Clavispora lusitaniae, Pichia fementans y
Issatchenkia/Pichia ludwigii, milleri,
Saccharomyces bailii, Candida y
Zygosaccharomyces Brettanomyces
bruxellensis
Zygosaccharomyces rouxii. La identificacin y clasificacin de bacterias y levaduras por tcnicas microbiolgicas dependen del aislamiento, de sus caractersticas
morfolgicas y fisiolgicas (Heras-Velazquez et al., 2003; Daz & Wacher, 2003; Orber, 2004). Estos mtodos tienen la desventaja de ser complejos, laboriosos y tiempo-demandantes (Dek, 1998; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Granchi et al., 1999; Las Heras-Velazquez et al., 2003). Adems, algunas veces los resultados pueden ser dudosos, porque la morfologa de los microorganismos dependen de las
Kluyveromyces marxianus. En el caso del mezcal de Sola de Vega en el estado de Oaxaca obtenido a partir de A. angustifolia Haw, el grupo principal de levaduras identificadas pertenecen al gnero Candida sp., seguido por Kloeckera y Rhodotorula. Se encontr a Saccharomyces cerevisiae al inicio de la fermentacin pero en pequea cantidad (Andrade-Meneses & RuizTern, 2004). En contraste, estudios reportados por Segura (2009) en los fermentos de A. angustifolia Haw, mostraron 26 especies de levaduras pertenecientes a 18 gneros mediante la tcnica de RFLP-PCR de la regin ITS-5.8S. El estudio se realiz en 3 fbricas del estado de Oaxaca conocidas y como Las Las Margaritas, levaduras
condiciones del cultivo. De ah, que el uso de mtodos microbiolgicos para la identificacin precisa de microorganismos en procesos
fermentativos resulte inadecuada (Dek, 1998). Una alternativa para la identificacin de bacterias y levaduras es aislarlos y tipificarlos mediante tcnicas de biologa molecular, otra es utilizar mtodos que no dependen del cultivo, en los que se extraen los cidos nuclecos directamente del alimento. El anlisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP) es una de las tcnicas comnmente utilizadas para la clasificacin de microorganismos basadas en el ADN y por medio de la cual es posible distinguir microorganismos a nivel de especie (Penderson, 1986; Granchi et al., 1999; Orber, 2004). Con el uso de sta tcnica, Esteve-Zarzoso et al. (1999) generaron una base de datos para la
Danzantes
Chagoya.
encontradas fueron: Brettanomyces sp., Candida sp., Candida boidinii, Candida Candida coliculosa, parapsilosis,
Candida
intermedia,
Citeromyces matriensis, Cryptococcus kuetzingii, Hanseniaspora Pichia sp., Issatchenkia orientalis, sp.,
identificacin rpida y fcil de 132 levaduras pertenecientes a 25 diferentes gneros. En la mayora de los casos el tamao del producto de
membranifaciens,
Rhodotorula
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccaromyces
63
pombe,
Torulaspora sp.,
delbrueckii, Zygoascus sp. y
Gluconobacter oxydans y Hafnia alvei. Mediante la secuenciacin del gene 16S ADNr, Herrera (2008) diferenci 6 especies de bacterias
Zygosaccharomyces
Zygosaccharomyces rouxii. En los mostos de A. durangensis se report la presencia de
diferentes a partir de aislados de aguamiel, pulque y semilla, entre las que se encuentran Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
Kluyveromyces marxianus, Clavispora lusitaniae, Schwanniomyces Castelli, Saccharomyces
unisporus y S. cerevisiae en las fbricas Nombre de Dios y el Mezquital en el estado de Durango (Martell-Nevrez et al., 2009). Jacques-
sanfranciscensis, Lactobacillus sp., Leuconostoc citreum, Acetobacter orientalis y Leuconostoc lactis. Escalante-Minakata et al. (2008) realizaron la identificacin molecular de bacterias en el
Hernndez et al. (2009) analizaron los mostos de mezcal de la regin de la Sierra de San Carlos en Tamaulipas, en el que cual se emplea principalmente A. americana L, A. lophantha torrey, A. funkiana k., A. montium-sancticaroli e identificaron mediante la amplificacin y
proceso de fermentacin del mezcal de A. salmiana a partir de la regin del gene 16S ADNr. Los resultados mostraron la presencia de 8 especies diferentes, siendo las bacterias cidolcticas las que se encontraron en mayor abundancia. Entre las bacterias identificadas destacan la Zymomona mobilis subsp. mobilis y pomaceae, Weissella cibaria, Lactobacillus Weissella pontis,
secuenciacin de la regin ITS-5.8S la presencia de K. marxianus, R. Hortaea T. werneckii, delbrueckii, P. S.
mexicana,
glutinis,
cerevisiae, P. delftensis, Geotrichum klebahnii, C. lusitaniae y P. membranifaciens. Arratia et al. (2009), identificaron la presencia K. marxianus, T. delbrueckii, S. cerevisiae, P. kluyveri, P. guilliermondii, P. mexicana, C. lusitaniae, Z. bailii y C. parapsilopsis en los mostos de la regin de San Carlos, San Nicols y Burgos en
paramesenteroides,
Lactobacillus kefiri, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus farraginis. Lappe-Oliveras et al. (2008), confirmaron los trabajos publicados por Escalante-Minakata et al. (2008) ya que en los procesos fermentativos de bebidas mexicanas de agave estn presentes bacterias lcticas principalmente y levaduras Saccharomyces y noSaccharomyces formando consorcios
Tamaulipas. Referente a las bacterias, Escalante et al. (2004) estudiaron la caracterizacin de la
microbianos complejos y que esto impacta significativamente en las caractersticas
diversidad bacteriana en pulque, una bebida alcohlica (no destilada) mediante libreras de clonas del 16S ADNr. Este anlisis revel que la diversidad bacteriana en pulque es dominada en un 80.97% por Lactobacillus como son: L. acidophilus, kefir, acetotolerans, hilgardii, y
sensoriales as como el valor nutricional.
DESTILADO Y SU AROMA Para la destilacin se utilizan alambiques de cobre tipo charentais de que est construido para una
plantarum, adems demostraron la presencia de Leuconostoc Microbacterium johnsoniae, pseudomesenteroides, arborecens, Acetobacter Flavobacterium pomorium,
completamente aumentar su
cobre y
laminado conseguir
resistencia
superficie lisa con el propsito de evitar la
64
incrustacin de sustancias gruesas y realizar ms fcil la limpieza (Flanzy, 2003). El
una ves producido es embasado sin un proceso de maduracin. El mezcal reposado permanece en recipientes de madera de roble blanco o encino para su estabilizacin por al menos 6 meses y en el caso del mezcal aejo, es sujeto a un proceso de maduracin de por lo menos un ao en recipientes de roble blanco o encino cuya capacidad mxima es de 200 litros. Todos los mezcales pueden ser abocados. En mezclas de diferentes mezcales aejos, la edad para el mezcal resultante ser el promedio ponderado de las edades y volmenes de sus componentes. El aroma de un alimento o bebida se puede definir como la sensacin global producida por los compuestos que interaccionan con las terminaciones nerviosas sensitivas del gusto, olfato y la visin (Goff & Klee, 2006). El aroma est compuesto por centenares de compuestos voltiles que pertenecen a distintas familias qumicas y que se encuentran en concentracin muy variable (Ruiz y Martnez, 1997). Cabe mencionar que el umbral de percepcin de las sustancias que condicionan el aroma puede variar desde g/l a mg/l, pero no necesariamente por encontrarse en mayor concentracin su incidencia ser mayor (Riu, 2005). En este sentido, el impacto sensorial est relacionado con la presencia de compuestos voltiles. El aroma puede provenir de la planta llamado aroma primario que incluye dos subcategoras: El varietal (compuestos voltiles libres presentes en la planta que dependen de la variedad utilizada y sus caractersticas) y el
alambique se compone de una olla (es comn que tenga capacidad de 1100 litros) en la que se colocan los mostos fermentados, por encima de la olla se encuentra la cabeza o turbante que recoge los gases y los conduce a los platos refinadores, pasando posteriormente al
refrigerante donde se enfran y licuan los gases al pasar por un serpentn sumergido en una pileta de agua (Zamora, 1997). El proceso finaliza cuando el alcohmetro colocado a la salida del serpentn indica aproximadamente 3% (v/v). A lo largo del proceso de destilacin se obtienen tres fracciones principales: Las
cabezas, el corazn y las colas. Las primeras fracciones del destilado que constituyen las cabezas son ricas en alcohol pero tambin en compuestos voltiles indeseables (acetato de etilo, etanal, metanol, etc.), despus continua la segunda fraccin o corazn hasta
aproximadamente un 60% (v/v), que ser el futuro mezcal y finalmente se obtienen los compuestos de alto peso molecular.
Posteriormente, el destilado es estandarizado con agua con base en la norma mexicana de bebidas alcohlicas y el producto terminado se almacena (Gonzalez-Hernndez, 2005). Durante el proceso fermentativo se desarrollan la mayor cantidad de compuestos voltiles que son obtenidos mediante la destilacin de los mostos. Durante la permanencia de los destilados en barricas de roble blanco o encino se llevan a cabo una serie de reacciones qumicas que transforman al producto adquiriendo
prefermentativo (aromas que se liberan de su combinacin con otras sustancias llamadas precursores, debido a la actividad enzimtica provocada por la tecnologa aplicada). El aroma secundario proviene de los microorganismos que
caractersticas organolpticas propias. Segn su maduracin el mezcal se clasifica en joven, reposado y aejo. El mezcal joven es aquel que
65
se desarrollan durante la primera fermentacin; est ligado a la presencia de ciertos tipos de enzimas y es el aroma mayoritario. El aroma terciario o post-fermentativo es el que se forma durante el aejamiento. Este ltimo se desarrolla mediante reacciones qumicas y/o bioqumicas a partir de aromas de etapas anteriores (Riu, 2005). De ah que los compuestos voltiles presentes en los mezcales provienen de la planta y se van acumulando a lo largo del proceso. Pea-lvarez et al. (2004) analizaron los terpenos presentes en plantas de A.
aldehdos, steres, furanos, cetonas, fenoles, piracinas, compuestos con azufre y terpenos. Entre los ms importantes y que podran ser los responsables isovaraldehdo, del olor alcohol se encuentra: isoamlico, El -
damascenona, 2-feniletanol y vainillina (Benn & Peppard, 1996). Lpez (1999) report que los compuestos mayoritarios presentes en el tequila son el etanol, alcohol isoamlico, feniletanol, y los cidos actico, decanoico y dodecanoico. De Len-Rodrguez et al. (2006) identificaron 37 compuestos voltiles en mezcales comerciales (joven, reposado y aejo) de A. salmiana, mediante el uso de tcnicas cromatogrficas. Nueve de los compuestos identificados fueron clasificados como compuestos mayoritarios;
salmiana, A. angustifolia y A. tequilana . De un total de 32 terpenos identificados, 21 de ellos se encontraron exclusivamente en el A. tequilana. El linalool, geraniol, p-cimene, limoneno, -transocimo y trans-nerolidol fueron encontrados en las tres especies de agave analizados. Otras
entre los que destacan los alcoholes saturados, el lactato de etilo, etil 2-hidroxipropanoato y el cido actico; aquellos que se encontraron en menor concentracin se encuentran alcoholes, aldehdos, cetonas, etil steres de cadena larga, cidos orgnicos, furanos, terpenos, alquenos y alquinos. Algunos ya se encuentran reportados en tequilas
b
molculas de inters son los cidos grasos de cadena larga presentes en las plantas de agave ya que stos juegan tambin un papel importante en el perfil aromtico de la bebida. Los cidos grasos en presencia de altas concentraciones de etanol, durante el aejamiento, reaccionan entre s formando steres. En plantas de A. salmiana, A. angustifolia y A. tequilana se han identificado cidos grasos de cadena larga (Pea-lvarez et al., 2004). Vallejo-Cordoba et al. (2004),
otras De
bebidas
alcohlicas. et al.
Posteriormente,
Len-Rodrguez
(2008 ), realizaron un anlisis exhaustivo de compuestos que permitieran clasificar o
identificar los orgenes de destilados de agave producidos en la Repblica Mexicana. Entre las bebidas estudiadas se encuentran la Raicilla, Sisal, Sotol, Bacanora, Mezcales obtenidos a partir de diferentes especies de agave, Tequila y Pulque (bebida alcohlica de agave no
proponen que la cuantificacin de los steres puede ser una alternativa para la clasificacin de los diferentes tequilas En los tequilas se han reportado alrededor de 175 compuestos que pertenecen a las familias de los acetales, cidos, alcoholes, diferentes compuestos voltiles mediante el uso de microextraccin en fase slida del espacio de cabeza de los diferentes destilados;
destilada). En el trabajo se identificaron 105 posteriormente fueron separados y analizados por cromatografa de gases acoplado al
espectrmetro de masas. Se determin que 17
66
compuestos voltiles podran ser referidos como marcadores de autenticidad. El anlisis
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multivariante de los compuestos mayoritarios (concentraciones superiores a 10 mg/l) mostr que es posible distinguir las diferentes bebidas a partir de ellos, es decir, es posible obtener una clasificacin de acuerdo a su concentracin.
AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Departamento de Ciencias de los Alimentos y Nutricin Humana de la Universidad de Illinois, al programa UIUCTIES del UAQ, al Laboratorio de Qumica de Productos Naturales del Departamento de
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agradecemos
a la Sociedad Mexicana de
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Agricultura, Ganadera y Desarrollo Rural, Espaa. Segura LE, (2010) Identificacin y caracterizacin por mtodos moleculares de levaduras
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RESEA PREMIOS XIV CONGRESO NACIONAL

RESEA DESDE LA COMISIN DE PREMIOS DEL XIV CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGA Y BIOINGENIERA
El Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera es tambin el foro para distinguir a estudiantes e investigadores por su trabajo y trayectoria. La evaluacin de los premios se lleva a cabo por una comisin que renueva sus miembros cada 2 aos y que ahora se encuentra integrada por los doctores Laura Palomares Aguilera, Gabriela Seplveda Jimnez, Carlos Regalado Gonzlez y Jaime Ortega Lpez, sin embargo durante el congreso contamos adems con el apoyo de expertos en diferentes reas para la evaluacin de los carteles: Blanca E. Garca Almendrez, Maricarmen Quirasco Baruch, Sara Sols Pereira, Daniel Genaro Segura Gonzlez, Mara Elena Rodrguez Alegra, Jos Adelfo Escalante Lozada, Marcela Ayala Aceves, Beatriz Ruiz Villafan y Mara Soledad Crdova Aguilar. Mi agradecimiento a todos ellos por su invaluable participacin. El martes 21 de junio del 2011 se entreg el premio Alfredo Snchez Marroqun que distingue a las mejores tesis en Biotecnologa y Bioingeniera en los niveles de licenciatura, maestra y doctorado. En este premios se reconoce el esfuerzo y el mrito intelectual de estudiantes, que trabajando en instituciones mexicanas, contribuyen al desarrollo de estas disciplinas en nuestro pas. Este premio es patrocinado desde 1999 por la empresa Yakult quien siempre se ha mostrado interesado y generoso con la Biotecnologa y Bioingeniera en Mxico. Se inscribieron 29 tesis, todas ellas de calidad excepcional, as que la comisin de premios tuvo que revisarlas una y otra vez para llegar a un acuerdo unnime. Por su trabajo quiero felicitar a todos los participantes y en especial a los ganadores que en esta ocasin fueron: En la categora de Doctorado, el Dr. German Plascencia Villa por el trabajo Desarrollo de nanopartculas mediante la funcionalizacin de protenas virales de rotavirus. UNAM. En la categora de Maestra, la M. en C. Andrea Sabido Ramos por el trabajo Construccin y caracterizacin de un sistema para la expresin cromosomal de genes en Escherichia coli. UNAM. Y en la categora de Licenciatura al Ing. Jos Israel Hernandez Oropeza por el trabajo Construccin de rutas bioqumicas simplificadas y anlisis metablico de la acumulaci n de trehalosa en Sacharomyces cervisiae. IPN.
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El jueves 23 se realiz la entrega del premio Sergio Snchez Esquivel que fue establecido para estimular a estudiantes mexicanos sobresalientes durante la realizacin de su tesis. Para lograr este objetivo, se apoya a los estudiantes que inician el trabajo experimental que los llevar a obtener el Ttulo de Licenciatura o el Grado de Maestro o Doctor en cualquiera de las reas de la Biotecnologa o Bioingeniera, y se les convoca a participar enviando los protocolos de sus proyectos de investigacin. Este premio fue patrocinado por Applikon Biotechnology, mi agradecimiento al Ing. Manuel Melo y a John Chory (Presidente de Applikon) por su amable disposicin para ser parte de la SMBB y de sus premios. En respuesta a esta convocatoria se recibieron 16 protocolos de estudiantes de diversas instituciones de enseanza del pas y la comisin de premios dictamin por unanimidad premiar los siguientes trabajos: En la categora de doctorado, al estudiante Alfredo Vazquez Ovando por el protocolo: Relaciones entre marcadores moleculares y las caractersticas de calidad del grano de Theobroma cacao L. cv. Criollo cultivado en el Soconusco, Chiapas Universidad Autnoma de Chiapas (UACH). En la categora de maestra al estudiante Reynaldo de la Cruz Quiroz por el protocolo Optimizacin de las condiciones de produccin de una elagitanasa fngica. Universidad Autnoma de Coahuila (UAC).
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En la categora de licenciatura al estudiante Daniel Isui Aguilar Salvador por el trabajo Estudio de mecanismos de recombinacin gentica codificante para protenas con potencial teraputico en E. coli. UNAM.
La participacin en el congreso y el reconocimiento para los miembros consolidados de la SMBB tambin se hizo presente; en especial, se destac la contribucin de los doctores Sergio Snchez Esquivel y Enrique Galindo Fentanes, quienes se hicieron merecedores del reconocimiento Miembro de Honor, el cual se instituy hace 2 aos en el congreso de Acapulco.
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Adems, durante el congreso se evalan y distinguen todos los das los tres mejores carteles presentados por estudiantes, importante distincin considerando que el nmero diario de carteles expuestos es en promedio de 180. Finalmente, tuvimos el gusto de escuchar a los ganadores del premio Carlos Casas Campillo 2010: Dres. Isabel Gmez (IBT-UNAM) y Francisco Barona (Langebio, IPN) quienes presentaron su trabajo al pleno. Toda la informacin referente a las distinciones (Convocatorias, mecnica de seleccin, Comisin de premios, ganadores, etc.) puede consultarse en la pgina de la SMBB. Quiero reiterar mi felicitacin a todos los ganadores y mi agradecimiento a los patrocinadores Yakult S.A. de C.V. y Applikon Biotechnology; a la comisin de premios y a todos los que nos apoyaron en la seleccin de los trabajos.
Dra. Romina Rodrguez Sanoja Presidente de la Comisin de Premios SMBB
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INFORME FINANCIERO XIV CONGRESO NACIONAL

Informe Financiero del XIV Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera
Durante el 2011 la Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera (SMBB) celebr la dcima cuarta edicin de su Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera, del 19 al 24 de Junio en la ciudad de Quertaro. La organizacin del evento inici desde que la actual Mesa Directiva de la SMBB tom posesin en septiembre del 2010. A continuacin se presenta el informe financiero detallado del Congreso, en funcin del nmero de participantes (socios y no socios), financiamiento por entidades institucionales y empresas, egresos y balance final.
Participacin e inscripciones Durante la realizacin del Congreso se logro tener 962 participantes donde el 51 % (495) fueron estudiantes, 38 % profesionales (254) y el 11 % (106) expositores en stands empresariales e institucionales (figura 1).
Figura 1. Distribucin de participantes en el Congreso. La participacin de no socios en este Congreso fue muy similar a la participacin de socios, donde un 52% eran no socios frente un 48% de socios. Adems, el mayor nmero de participantes se centro en los estudiantes (71%), donde el 40% no eran socios y el 31% si eran socios. Por su parte, en los profesionales/numerarios se tuvo una participacin del 29 %, donde el 17 % fueron socios y solamente el 12 % no socios (figura 2).
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Figura 2. Distribucin de socios/no socios participantes en el Congreso.
Financiamiento E Congreso es pagado con los ingresos directos a la SMBB, tales como pagos de membresas de los socios, donativos de diversas instituciones y aportaciones de proveedores. Como puede observarse en la figura 3 se logr un 51% del apoyo de manera externa a los ingresos de la SMBB (entidades acadmicas y empresas). Las inscripciones y las membresas lograron un 49 % del total de los ingresos. En este Congreso se cobr de manera diferencial siendo para estudiantes socios $850 y profesionales socios $ 2500. Para no socios el cobro fue de $ 2000 para estudiantes y $4000 para profesionales. Posterior a una primera fecha lmite de recepcin de pagos, se tuvo un incremento en estas cuotas entre un 13 y 15%. As, en la figura 4 se presenta como el 66 % de los ingresos fue aportado por los no socios (41 % de estudiantes y 25% de profesionales), mientras que los socios aportaron el 34% de los costos (21 % de profesionales y 13 % de estudiantes).
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Figura 3. Distribucin de ingresos totales al Congreso.
Figura 4. Distribucin de pagos de inscripcin de socios y no socios participantes en el Congreso. El 21% de los ingresos que se recibieron fueron de ingresos institucionales (figura 3). La distribucin de estos ingresos se presenta en la figura 5. Donde el 44% se recibi del Concejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) a travs de la Direccin de Planeacin de Ciencia, DADC, a travs de la Subdireccin de Evaluacin y Seguimiento Cientfico, Convenio de Referencia I010/300/2011 C-450/2011. Adems, la Secretara de Educacin Pblica (SEP) a travs de la Subsecretara de Educacin Superior y de la Direccin General de Educacin Superior Universitaria (Convenio No.: 2011-09-172-066) aportaron el 26 % de los ingresos institucionales (figura 5). Apoyos institucionales tambin fueron aportados por diferentes Unidades de la Universidad Autnoma Metropolitana (Lerma, Cuajimalpa e Iztapalapa), la Universidad Autnoma de Coahuila Unidad Saltillo, el
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Cinvestav (Centro de Investigacin y Estudios Avanzados del Politcnico Nacional), MxicoBio (Inciativa del gobierno municipal de Irapuato, el gobierno del estado de Guanajato y el Cinvestav) y la Universidad Nacional Autnoma de Mxico a travs del Instituto de Biotecnologa, el Instituto de Ingeniera, el Programa Universitario de Alimentos y el Instituto de Investigaciones Biomdicas (figura 5).
Figura 5. Distribucin de ingresos institucionales al Congreso. El 30% de los ingresos que se recibieron para la realizacin del congreso fueron provenientes de empresas (figura 3). La distribucin se presenta en la figura 6. La mayora de las empresas aportaron en efectivo por la compra de stands en la feria de proveedores que se llevo a cabo en el Expocentro Juriquilla durante el congreso. Pero otras empresas participaron en especie pagando los elementos que consistan el morral del participante. Es as como Qiagen don los morrales, Biofbrica Siglo XXI S.A. de C.V. don los programas, Sigma-Aldrich las memorias en formato digital e IbMol las plumas y las libretas. Se agradece la participacin de las siguientes compaas: Applikon Biotechnology, MerkMillipore, Elga LabWater, PerkinElmer, Biorad, Qumica Valaner, Thermolab, Qiagen, PureProcess, Ibmol, Yakult, Accesolab, Sigma-Aldrich, Prepotech, Alta Tecnologia En Laboratorio, Biosistemas Avanzados (Biosis), Pharmacur, Alcesa, Petramin, Biofabrica Siglo XXI, Equipar , Uniparts, Inolab, Beckman, Lab Tech y Sartorius.
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Figura 6. Distribucin de ingresos de empresas al Congreso.
Egresos del Congreso La figura 7 presenta de manera detallada los gastos del Congreso. Los gastos ms
relevantes son aquellos asociados a la empresa operadora del Congreso (Grupo Ecodsa) quienes con un 24% de los costos tuvieron a su cargo todo el Registro in situ de participantes, reservaciones en hoteles (sede y subsedes), adems de la logstica de sonido y audiovisual, como la ejecucin completa de la feria de proveedores en el ExpocentroJuriquilla. Los recesos de caf (15%) y recesos en la sesin de poster (8%) fueron el
segundo rubro que alcanz los niveles ms representativos de gastos. Es de remarcar que con la buena negociacin de la Mesa Directiva Nacional de la SMBB con el Hotel Misin Juriquilla (y el apoyo del Grupo Ecodsa) se pudo, por primera vez en los Congresos Nacionales, tener un receso de cervezas y refrescos para la sesin de presentacin de carteles. Adems, y gracias al apoyo de la SEP y del CONACyT, se logr becar a 60 estudiantes de diferentes Universidades del Pas, quienes adems colaboraron como miembros del staff. Estas becas consistieron en las noches de hotel y alimentacin durante el congreso, que adems de aquellas noches de los conferencistas y de la Mesa Directiva Nacional fueron un 16% del gasto del congreso. Las bolsas de los participantes que se presentan en la figura 7, con un gasto equivalente al 8% del costo total del congreso fue patrocinado por empresas
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privadas como se coment previamente. Con los ingresos de la SMBB se adquirieron a su vez 6 caones de 2500 lmenes y 6 notebooks para trabajo del congreso y de la MDN. Estos ahora en resguardo en las oficinas de la SMBB sern utilizados en los Simposios y Congresos Nacionales de la Sociedad. En la figura tambin se pueden observar los % de los costos de otras cosas como autobuses, soporte de la pgina web de la SMBB, papelera y los eventos culturales y el coctel de bienvenida.
Figura 7. Distribucin de gastos durante el Congreso.
Balance final La figura 8 presenta el balance global del XIV Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera, donde del monto total de ingresos se utiliz un 69% para eventos del Congreso. El 31% de estos ingresos son de saldo a favor. Este monto a favor permitir a la SMBB mantener sus funciones y celebrar este 2012 sus 30 aos. Adems, de lograr las negociaciones correspondientes para poder llevar a cabo el XV Congreso Nacional en 2013, a realizarse en Conjunto con el 12th. International Symposium of the Genetics of Industrial Microorganisms en Cancn, Quintana Roo.
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Figura 8. Distribucin de gastos durante el Congreso.
Agradecimientos De manera particular se agradece especialmente los apoyos al XIV Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera de: Proyecto realizado con financiamiento de la Secretara de Educacin PblicaSubsecretara de Educacin Superior-Direccin General de Educacin Superior Universitaria, Convenio No.: 2011-09-172-066 Proyecto realizado con financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, Direccin de Planeacin de Ciencia, DADC, a travs de la Subdireccin de Evaluacin y Seguimiento Cientfico, Convenio de Referencia I010/300/2011 C450/2011.
Dr. Mauricio Alberto Trujillo Roldn Tesorero Nacional de la SMBB 2010 2012 tesoreriasmbb@gmail.com
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Ao 2012 Volmen 16 Nmero BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 161No.

COORDINADOR EDITORIAL Ing. Rubn Castillo Alamilla

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

Editorial Ventajas del uso de Cocultivos en Biotecnologa

Uso de Enzimas en Solventes Orgnicos en la Industria de Bioprocesos

Aspectos Qumicos y Moleculares del Proceso de Produccin del Mezcal

Resea Comisin de Premios XIV Congreso Nacional

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BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

Ventajas del uso de Cocultivos en Biotecnologa

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BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

Biologa Sinttica: Diseando Sistemas Biolgicos con Piezas Genticas

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

LA BIOLOGA SINTTICA La promesa de la biologa sinttica es disear y construir diferentes sistemas

convencional se extrae de la planta Artemisia annua. La E. coli fue modificada

genticamente introducindole informacin gentica involucradas codificante en la va para enzimas del

del cual se puede sintetizar la artemisinina) en E. coli,. Posteriormente, en 2006 el

complejos o combustible para aviones, podr descargar de una base de datos la

turbosina), mediante la insercin de la ruta biosnttica de la cianobacteria

Synechococcus elongatus (Schirmer et al.,

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

La ruta biosntetica incluye dos

formato de bioparte para su posterior uso en otros circuitos genticos

(http://2011.igem.org/Team:Washington). La Biologa Sinttica, tambin ha

generado alternativas para la biomedicina, mediante diferentes el diseo y construccin para de

(Constante et al., 2011).

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

que se han desarrollado hasta ahora, se basan en el conocimiento actual del

(http://web.mit.edu/jagoler/www/biojade/, 2012; http://synbioss.sourceforge.net/, 2012; http://www.genocad.org, 2012;

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

incorporar aminocidos modificados (Liu et al., 2007). Tambin, se han probado

naturales (Taira et al., 2005). potencial de estos trabajos

posibilidad de incorporar aminocidos con propiedades qumicas y estructurales

(amplificacin, restriccin, ligacin, clonacin, etc.). Para facilitar el ensamblaje se han

SINTTICA El Registro de Partes Biolgicas

Estandarizadas, al igual que las aplicaciones computacionales son gratuitas. Algunos

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

enfermedades y padecimientos. Y no slo eso, tambin se encontrarn nuevas

maneras de producir energas renovables y alimentos para nuestro mundo en

crecimiento, as como nuevos materiales que impactarn en la vida que conocemos.

mediante recombinacin protenas basadas en la estructura de DARPinas. Las

desarrollen se mejorarn las expectativas de

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

anterior sustenta que en nuestro grupo estemos construyendo una secuencia

biomedicina e investigacin bsica.

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

disear y crear nuevos sistemas biolgicos.

andamiaje AGRADECIMIENTOS Los autores expresan su agradecimiento

diseado en este trabajo.

al CONACyT Ciencia Bsica 104951-Z

bacteriano diseado en nuestro grupo del

BioTecnologa, Ao 2012, Vol. 16 No. 1

Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat.