Biodiversidad de Las Bacterias Ácido

Jacobo López Seijas “TESE DE DOUTORAMENTO” Biodiversidad de bacterias ácido lácticas asociada a la variedad
Albariño (Vitis vinifera L.) cultivada en Val do Salnés. Estudio de sus aplicaciones. 2017
2017
aplicaciones.
Jacobo López Seijas

“TESIS DE DOCTORADO”
Biodiversidad de bacterias ácido lácticas
cultivada en Val do Salnés. Estudio de sus

asociada a la variedad Albariño (Vitis vinifera L.)
Escola Internacional de Doutoramento
TESIS DE DOCTORADO
Biodiversidad de bacterias ácido lácticas asociada a la variedad Albariño (Vitis

vinifera L.) cultivada en Val do Salnés. Estudio de sus aplicaciones.
Dirigida por la doctora: Carmen Sieiro Vázquez
Año: 2017
Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el proyecto PGIDIT06RAG018E “Estudio
de la microbiota maloláctica del Val del Salnés” concedido por la Xunta de Galicia y
desarrollado en colaboración con la bodega Condes de Albarei, así como con la Universidad
de Vigo
Jacobo López Seijas ha disfrutado de una Beca Predoctoral concedida por la Universidad de
Vigo, así como de una beca Leonardo concedida por la Excma. Diputación Provincial de
Lugo para la realización de una estancia en la Universidad de Viena, Austria.
A MI FAMILIA
AGRADECIMIENTOS
Me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que me han
acompañado a lo largo de estos años, y especialmente:
A la Dra. Carmen Sieiro Vázquez, por darme la oportunidad de realizar el doctorado

bajo su supervisión sin tan siquiera conocerme, por compartir sus amplios conocimientos
conmigo haciendo el trabajo mucho más fácil, y por la gran paciencia y comprensión mostrada
cuando las cosas no han salido como se esperaba.
A mis compañeras Belén, Abi y Andrea, siempre dispuestas a echar una mano, a dar
un consejo, ya sea personal o profesional, a compartir horas y horas haciendo esta aventura
más agradable y amena. Habéis sido un gran apoyo y tenéis gran parte de culpa de que esto
haya llegado a buen término. A Ana Belén, que a pesar de compartir poco tiempo contigo, me
ayudaste a integrarme en el laboratorio.
A todas las personas que han pasado por el laboratorio de Microbiología Industrial y
Biotecnología Microbiana: Guille, Iria, Fernando, Daniel, Ángeles,… así como a las/los demás
miembros del área de Microbiología, en especial a Rosa Farto y Leticia Rivera, ya que todos
habéis aportado vuestro granito de arena, aunque en muchos casos ni os hayáis dado cuenta.
A las Dras. Pilar Combarro, Elisa Longo y Teresa Pérez, por vuestras palabras
amables, vuestros consejos y, en muchos caso, por vuestro ejemplo.
A Sandra Álvarez, técnico del departamento de Biología Funcional y Ciencias de la

Salud, por compartir tu tiempo, por tus consejos y por tu inestimable ayuda.
Al área de Parasitología y, de manera especial, a los Dres. Jose M. García y Raúl

Iglesias.
A la Dra. Ana Gago y al Dr. J. Manuel Leão, por permitirme llevar a cabo una parte
importante de esta tesis en vuestro laboratorio. Gracias por vuestra amabilidad y paciencia, y
por adentrarme en el interesante mundo de la Química Analítica.
i
A mis padres y hermano, porque seguramente estaréis orgullosos de mí al tener este
“libro” en vuestras manos, sin saber que soy yo el que está orgulloso de vosotros. Os estaré
eternamente agradecido porque sólo gracias a vosotros esto se ha hecho realidad.
A mi familia, por vuestras incansables palabras de ánimo, vuestro cariño y vuestro

apoyo infinito.
A mis amigos, porque no todo va a ser trabajar. Habéis conseguido que no me vuelva
loco……creo.
A ti, Vanesa, por animarme cada día, por escucharme, por entenderme…, en
definitiva, por quererme. Sin ti mi vida ya no tendría sentido.
ii
TABLA DE CONTENIDOS
TABLA DE CONTENIDOS
 Abreviaturas .................................................................................................................................... i
 Introducción
1. Las bacterias malolácticas: consideraciones generales .................................................................... 3

2. Taxonomía, filogenia y hábitat de las bacterias lácticas .................................................................. 3
3. Fisiología de las bacterias lácticas ................................................................................................... 8
3.1. Metabolismo de azúcares ....................................................................................................... 9
3.2. Metabolismo de ácidos orgánicos ......................................................................................... 11
3.2.1. Metabolismo del ácido málico ...................................................................................... 11
3.2.2. Metabolismo del ácido cítrico ...................................................................................... 12
3.2.3. Metabolismo del ácido tartárico ................................................................................... 12
3.3. Metabolismo de proteínas y compuestos nitrogenados ......................................................... 12
3.4. Metabolismo de lípidos ......................................................................................................... 13
4. Las bacterias lácticas y el ser humano .......................................................................................... 14
5. Las bacterias lácticas en la industria alimentaria ........................................................................... 16
6. Identificación de bacterias ácido lácticas ...................................................................................... 22
6.1. Identificación fenotípica clásica ............................................................................................ 22
6.2. Identificación genotípica ...................................................................................................... 23
6.2.1. Identificación basada en la hibridación ........................................................................ 23
6.2.2. Identificación basada en PCR ....................................................................................... 24
6.2.2.1. Análisis del ADN ribosómico ............................................................................. 24
6.2.2.1.1. Secuenciación ........................................................................................... 26
6.2.2.1.2. ARDRA .................................................................................................... 27
6.2.2.1.3. Análisis de regiones hipervariables .......................................................... 27
6.2.2.1.4. Análisis de regiones espaciadoras intergénicas ........................................ 28
6.2.2.2. Análisis del gen recA .......................................................................................... 28
6.2.2.3. Otras secuencias de interés ................................................................................. 29
6.2.2.4. PCR múltiple ...................................................................................................... 30
6.2.3. PCR/DGG ..................................................................................................................... 31
7. Aplicaciones de las bacterias lácticas ............................................................................................ 32
7.1. Producción de enzimas de interés industrial y enológico ...................................................... 33
7.2. Biocontrol ............................................................................................................................. 34
7.3. Síntesis de nanopartículas ..................................................................................................... 35
 Justificación y Objetivos .............................................................................................................. 39
 Capítulo I: Aislamiento, identificación y caracterización de bacterias malolácticas en vino

albariño
1. Introducción ................................................................................................................................... 43
1.1. Industria vitivinícola en España: geografía y producción ..................................................... 43
1.2. Origen del exceso de acidez .................................................................................................. 45
1.3. Control de la acidez en los vinos ........................................................................................... 45
1.3.1. Control químico ............................................................................................................ 46
1.3.2. Control biológico: fermentación maloláctica ............................................................... 46
1.3.2.1. Concepto y factores físico-químicos que afectan al desarrollo ........................ 46
1.3.2.2. Impacto en vinos .............................................................................................. 48
1.3.2.2.1. Reducción de la acidez .......................................................................... 48
1.3.2.2.2. Modificación del perfil aromático, color y textura................................ 48
1.3.2.2.3. Estabilidad microbiológica ................................................................... 49
1.3.2.2.4. Seguridad del producto ......................................................................... 50
1.3.2.3. Biodiversidad de BAL ...................................................................................... 51
1.3.2.4. Dinámica poblacional ....................................................................................... 51
1.3.3. Fermentación malo-alcohólica con Schizosaccharomyces ........................................... 53
1.3.4. Enzima maloláctico ...................................................................................................... 54
1.3.5. Mejora genética de cepas vínicas ................................................................................. 54
1.4. Tecnología de la fermentación maloláctica ........................................................................... 55
1.4.1. Fermentación espontánea ............................................................................................. 55
1.4.2. Fermentación dirigida con cultivos iniciadores ............................................................ 56
1.4.2.1. Momento de la inoculación ................................................................................ 56
1.5. Problemática en la consecución de la FML ........................................................................... 57
1.6. Obtención de cultivos iniciadores ......................................................................................... 58
2. Materiales y Métodos .................................................................................................................... 60
2.1. Medios de cultivo .................................................................................................................. 60
2.2. Aislamiento de bacterias ácido lácticas ................................................................................. 61
2.3. Otras cepas bacterianas utilizadas en este estudio ................................................................. 61
2.4. Conservación de los aislados bacterianos ............................................................................. 62
2.5. Elaboración del perfil bioquímicos de asimilación de azúcares ............................................ 62
2.6. Manipulación de ácidos nucleicos......................................................................................... 63
2.6.1. Extracción de ADN ...................................................................................................... 63
2.6.2. Amplificación del ADNr 16S ....................................................................................... 63
2.6.3. Amplificación de la región espaciadora intergénica (ISR) 16S/23S ............................. 64
2.6.4. Amplificación del gen recA .......................................................................................... 64
2.6.5. Purificación de fragmentos de ADN a partir de gel de agarosa .................................... 65
2.6.6. Secuenciación ............................................................................................................... 65
2.6.7. Digestión de ácidos nucleicos con enzimas de restricción .......................................... 66
2.7. Análisis bioinformático ......................................................................................................... 67
2.7.1. Bases de datos y herramientas bioinformáticas empleadas .......................................... 67
2.7.2. Elaboración de los árboles filogenéticos 16S y recA.................................................... 67
2.8. Microfermentaciones ............................................................................................................ 68
2.9. Determinación molecular de la presencia de genes codificantes de enzimas carboxilasas de
ácidos fenólicos ..................................................................................................................... 68
2.10. Determinación de la actividad β-glucosidasa ....................................................................... 69
2.10.1. Actividad β-glucosidasa en células vivas ................................................................. 69
2.11. Determinación de la capacidad de producción de aminas biógenas..................................... 70
2.11.1. Determinación molecular de la capacidad de producción de ABs ............................ 70
2.11.2. Cuantificación de la producción de ABs .................................................................. 71
2.11.2.1. Reactivos y patrones ................................................................................... 72
2.11.2.2. Preparación de soluciones estándar y muestras de vino ............................. 72
2.11.2.3. Análisis UHPLC-MS/MS ........................................................................... 72
2.11.2.4. Parámetros de cuantificación ...................................................................... 73
2.12. Análisis de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa ........................... 74
2.13. Determinación de la capacidad de degradación de ABs ...................................................... 75
3. Resultados y Discusión .................................................................................................................. 76
3.1. Aislamiento de bacterias lácticas .......................................................................................... 76
3.2. Identificación de los aislados mediante perfil de asimilación de azúcares ............................ 77
3.3. Identificación de los aislados mediante pruebas moleculares ............................................... 80
3.4. Esquema general del proceso de identificación .................................................................... 89
3.5. Ecología de las bacterias lácticas aisladas ............................................................................. 92
3.6. Caracterización enológica de las cepas de bacterias lácticas ................................................ 96
3.6.1. Actividad maloláctica .................................................................................................. 96
3.6.2. Formación de ABs ........................................................................................................ 99
3.6.3. Determinación de la capacidad de degradación de ABs ............................................. 101
3.6.4. Actividades β-glucosidasa y descarboxilasa de ácidos fenólicos ............................... 102
 Capítulo II: Biocontrol de microorganismos patógenos mediante el empleo de LAB. Estudio
de aplicación en plantas de Solanum lycopersicum
1. Introducción ................................................................................................................................. 109

1.1. Microorganismos fitopatógenos y alterantes de los alimentos ............................................ 109
1.2. Impacto económicos ........................................................................................................... 110
1.3. Implicaciones sobre la salud ............................................................................................... 110
1.4. Deterioro causado por hongos ............................................................................................. 111
1.5. Deterioro causado por bacterias .......................................................................................... 112
1.6. Control de los microorganismos indeseados ....................................................................... 113
1.6.1. Control químico y su problemática............................................................................. 113
1.6.2. Control biológico ........................................................................................................ 114
1.6.2.1. Biocontrol mediante bacterias del ácido láctico ............................................... 116
1.7. Microorganismos como promotores del crecimiento vegetal.............................................. 118
2. Materiales y Métodos .................................................................................................................. 119
2.1. Cepas de bacterias, hongos filamentosos y levaduras utilizadas en este estudio ................ 119
2.2. Medios de cultivos .............................................................................................................. 119
2.3. Determinación in vitro del antagonismo de las BAL frente a bacterias y levaduras ........... 120
2.4. Determinación in vitro del antagonismo de las BAL frente a hongos filamentosos ........... 121
2.5. Determinación in vivo del antagonismo BAL-F. oxysporum .............................................. 122
2.6. Determinación del efecto fitoestimulador de las BAL ........................................................ 123
2.7. Metodología de análisis realizados y tratamiento estadístico .............................................. 124
3. Resultados y Discusión ................................................................................................................ 125
3.1. Antagonismo BAL-Bacteria y BAL-levadura ..................................................................... 126
3.2. Antagonismo BAL-hongo filamentoso ............................................................................... 130
3.3. Capacidad de biocontrol de las BAL ................................................................................... 136
3.4. Capacidad fitoestimulante de las BAL ................................................................................ 140
 Capítulo III: Biosíntesis de nanopartículas de plata, optimización y efecto microbicida
1. Introducción ................................................................................................................................. 145

1.1. Definición ........................................................................................................................... 145
1.2. Mecanismo de síntesis de NPs ............................................................................................ 146
1.2.1. Métodos químicos ..................................................................................................... 146
1.2.2. Métodos biológicos .................................................................................................... 147
1.3. Actividad antimicrobiana de las AgNPs ............................................................................. 149
2. Materiales y Métodos .................................................................................................................. 152
2.1. Cepas de bacterias y levaduras utilizadas en este estudio ................................................... 152
2.2. Medios y condiciones de cultivo ......................................................................................... 152
2.3. Reactivos ............................................................................................................................. 153
2.4. Obtención del extracto reductor .......................................................................................... 153
2.5. Síntesis de nanopartículas de plata ...................................................................................... 153
2.6. Determinación de la producción de nanopartículas............................................................. 155
2.7. Caracterización de las nanopartículas de plata .................................................................... 155
2.8. Determinación de la actividad antimicrobiana de las AgNPs ............................................. 156
2.8.1. Ensayo cualitativo ...................................................................................................... 156
2.8.2. Ensayo cuantitativo .................................................................................................... 156
3. Resultados y Discusión ................................................................................................................ 158
3.1. Obtención de extractos acuosos reductores ......................................................................... 158
3.2. Evaluación de la capacidad de los extractos acuosos para producir AgNPs ....................... 159
3.3. Efecto de la luz, agitación, temperatura y NaOH sobre la síntesis de AgNPs..................... 160
3.4. Determinación de los valores máximos de producción. Estabilidad de AgNPs .................. 165
3.5. Caracterización de AgNPs mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) .... 167
3.6. Capacidad de las AgNPs sintetizadas para penetrar en las células y efecto microbicida .... 170
 Conclusiones ................................................................................................................................ 179
 Referencias ................................................................................................................................... 183

ABREVIATURAS
Abreviaturas
AB Amina biógena
Abs. Absorbancia
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARDRA Análisis de restricción del ADN ribosómico
ARN Ácido ribonucleico
ATP Adenosín trifosfato
BAL Bacteria ácido láctica
CECT Colección Española de Cultivos Tipo
CMI Concentración mínima inhibitoria
CMM Concentración mínima microbicida
D.O. Denominación de Origen
DGG Gel con gradiente de desnaturalización
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
FA Fermentación alcohólica
FML Fermentación maloláctica
GRAS Generalmente reconocidos como seguros
hdc Histidina descarboxilasa
HILIC Cromatografía de interacción hidrofílica
HIS Histamina
ISR Región espaciadora intergénica
MS Espectrometría de masas
NCBI “National Center for Biotechnology Information”
NP Nanopartícula
odc Ornitina descarboxilasa
p/v Peso por volumen
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PUT Putrescina
PVDF Difluoruro de polivinilideno
SD Desviación estándar
i
sp. Especie
subsp. Subespecie
tdc Tirosina descarboxilasa
TEM Microscopía electrónica de transmisión
TYR Tiramina
U Unidad enzimática
UFC Unidad formadora de colonia
UHPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento
UV Ultravioleta
v/v Volumen por volumen
ii
INTRODUCCIÓN GENERAL
1. Las bacterias lácticas: consideraciones generales
El término “bacteria acido láctica” (BAL, o LAB, del inglés “lactic acid bacteria”)
tiene origen a principios del siglo XIX para denominar a un grupo heterogéneo de bacterias
que en la actualidad incluye a más de 30 géneros. La gran disparidad de criterios para la
definición de dicho término, con la formación de ácido láctico como único punto en común,
originaba una importante confusión en torno a qué bacterias o especies bacterianas debían ser
consideradas “bacterias ácido lácticas”.
Entre 1857 y 1863, Louis Pasteur desarrolla sus investigaciones en torno a las
fermentaciones vínicas, sin embargo, no será hasta 1873 cuando se produzca el primer
aislamiento de una bacteria acido láctica. Joseph Lister aísla una cepa de Bacterium lactis (en
la actualidad Lactococcus lactis) al tratar de reproducir los experimentos de Pasteur, lo que
permitirá el establecimiento de nuevos criterios fenotípicos para la determinación de los por
entonces denominados “lacto-bacilos”.
Ya en 1901, con la determinación de los Lactobacillus (L.) como bacterias Gram-

positivas por parte de Martinus Willem Beijerinck, se concreta la separación entre coliformes
y bacterias acido lácticas, que hasta entonces eran consideradas dentro del mismo grupo (Stiles
y Holzapfel, 1997).
2. Taxonomía, filogenia y hábitat de las bacterias lácticas
En 1907 Felix Löhnis estableció 4 grupos diferenciados de bacterias ácido lácticas: el

grupo de los coli-aerógenos, el grupo estreptococus, el grupo estafilococus y el grupo
lactobacilos (Heineman, 1920).
Pocos años después, en 1919, el trabajo de Orla-Jensen: “The lactic acid bacteria”
sentaría las bases de la sistemática de bacterias acido lácticas, para lo cual recurre a
características fenotípicas todavía en uso actualmente como son la morfología celular (cocos
3
o bacilos), el modo de fermentación de la glucosa, el crecimiento a ciertas temperaturas y el

rango de utilización de carbohidratos, concluyendo en una nueva clasificación de los tres
últimos grupos descritos por Lönis, en 7 géneros: Streptococcus, Tetracoccus,
Thermobacterium, Estreptobacterium, Betabacterium, Microbacterium y Betacoccus
(Heineman, 1920; Stiles y Holzapfel, 1997). A partir de este momento se abre el camino al
estudio de las relaciones filogenéticas.
Las características fenotípicas empleadas por Orla-Jensen permanecen en vigor y son

empleadas para una primera aproximación en la identificación de estos microorganismos. Sin
embargo, la llegada de las nuevas técnicas de análisis molecular ha originados numerosos
cambios en la ordenación filogenética de las bacterias ácido lácticas desde la primera
clasificación realizada por Löhnis.
En este sentido, el manual Bergey’s estima, en su edición de 1986, 5 géneros de

bacterias como bacterias ácido lácticas “tipo”: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus y Streptococcus (S.). Este último género sería posteriormente dividido en tres:
Enterococcus, Lactococcus (L.) y Streptococcus senso stricto.
Bacterias por entonces pertenecientes al género Lactococcus serían posteriormente

identificadas como género Vagococcus, así como los géneros Carnobacterium, previamente
incluido en el género Lactobacillus, y Tetragenococcus, que había sido descrito dentro del
género Pediococcus, como Pediococcus halophilus (Khalid, 2011).
A B C
Figura 1: A: Bifidobacterium adolescentes con forma de Y. B: L. casei (http://microbewiki.

kenyon.edu) C: Oenococcus oeni (http://www.rubliweb.ch/ ).
El género Bifidobacterium (Fig. 1) fue originalmente identificado como una especie

de Lactobacillus por lo que ha sido históricamente considerado dentro de las bacterias ácido
4
lácticas. Sin embargo, la presencia de la enzima fructosa 6-fosfato fosfoquetolasa, y la

ausencia de aldolasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, dos enzimas presentes en el género
Lactobacillus, dieron lugar a la separación de ambos géneros en 1967. Además, presenta
características particulares ya que a menudo desarrolla forma de V o de Y, con ramificaciones
en la que se acumula la cromatina (Ballongue, 2004). Este género adquiere importancia debido
a las implicaciones sobre la salud humana al ser un componente principal de la microbiota
intestinal humana, llegando a suponer el 99% de los microorganismos intestinales en recién
nacidos (Ballongue, 2004). Sin embargo, al no estar filogenéticamente relacionado con las
bacterias ácido lácticas propiamente dichas (Fig. 2) no será tratado extensamente en este
trabajo (Giraffa, 2014).
Figura 2: Árbol filogenético desenraizado de los géneros de bacterias lácticas más representativos
(Axelson, 2004).
Actualmente se consideran bacterias ácido lácticas aquellos cocos o bacilos Gram-

positivos, catalasa-negativos, no móviles, no formadores de esporas, anaerobios aunque
aerotolerantes y productores de ácido láctico (Axelson, 2004). Estas características, a
excepción de la no-formación de esporas y el carácter Gram-positivo, pueden sufrir
variaciones en función de la cepa, especie o condiciones de cultivo, lo que complica aún más
su identificación (Köning y Fröhlich, 2009; Axelsson, 2004; Khalid, 2011). Este grupo cuenta
con alrededor de 30 géneros, incluidos en el filo Firmicutes (a excepción del género
5
Bifidobacterium, que pertenece al filo Actinobacteria), alguno de los cuales (Lactobacillus)

incluye más de 150 especies conocidas.
Dentro del filo Firmicutes, las bacterias acido lácticas se engloban en el orden
Lactobacillales que incluye 13 géneros: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus, Aerococcus, Alloiococcus y Weissella siendo los géneros: Leuconostoc,
Oenococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus y Pediococcus los que tienen una
mayor presencia en procesos industriales de ámbito alimentario (Giraffa, 2014).
Su capacidad de adaptación a una amplia variedad de condiciones ambientales ha

permitido a las bacterias acido lácticas colonizar diversos nichos ecológicos. En la actualidad
se considera que estos microorganismo se encuentran distribuidos de forma ubicua en la
corteza terrestre, desde el tracto gastrointestinal de peces marinos, crustáceos (Merrifield et
al., 2014) y humanos, a vegetales y productos alimenticios como derivados lácteos o carnes
fermentadas (Vandamme et al. 2014).
El género Leuconostoc está formado por 12 especies bacterianas, de las cuales

Leuconostoc mesenteroides es la especie de este género que aparece con mayor frecuencia en
vino. Se trata de bacterias heterofermentativas obligadas, de forma esférica, y que
comúnmente aparecen en pares o de forma aislada (Dicks y Endo, 2009; Björkroth et al.,
2014). Son por lo general sensibles a bajos valores de pH, prefiriendo valores entre 6 y 7. Su
capacidad para desarrollarse en ambientes fríos, incluso por debajo de los 4 ºC, ha hecho que
su presencia sea a menudo considerada perjudicial, al aparecer en numerosos alimentos crio-
conservados de origen tanto animal como vegetal, como leche y productos lácteos, carnes,
pescados, aceitunas, pepinos, etc. (Björkroth et al., 2014).
En 1995, Dicks et al. reclasificaron el género Oenococcus (Gr. n. oinos, vino; N.L.
masc. n. coccus) a partir de una especie incluida dentro del género Leuconostoc con especiales
características en cuanto a la asimilación de carbohidratos o su crecimiento en medio ácido.
Esta especie fue denominada Leuconostoc oenos por Garvie en 1967, en cuyo estudio ya se
mostraban algunas características claramente diferenciadoras dentro de dicho género.
Posteriormente, mediante el análisis genético-molecular llevado a cabo por Dicks y
6
colaboradores, se confirmó su separación filogenética del género Leuconostoc, y con ello su

autonomía como género independiente.
Su importancia deriva de su implicación en la industria vitivinícola, que

históricamente ha considerado a la especie Oenococcus oeni (Fig. 1) (antiguo L. oenos), una
de las dos únicas especies que incluye el género junto con Oenococcus hitaharae (Dicks y
Endo, 2009), como la principal conductora de la fermentación maloláctica. Posiblemente su
preferencia por medios ácidos, la estimulación de su crecimiento en presencia de un 10% de
CO2 y su resistencia a etanol haya contribuido a esta consideración de especie de interés
enológico. Todo esto ha hecho que numerosas empresas hayan puesto interés en su explotación
comercial como cultivos iniciadores, lo que ha derivado en un mayor conocimiento de este
género, y más concretamente, de la especie O. oeni.
Inicialmente considerado una sarcina al aislarlo en cerveza deteriorada, el género

Pediococcus, fue identificado como tal en 1884. Se trata de cocos que aparecen en forma de
tétradas, lo que los distingue de otros géneros de bacterias acido lácticas, y están presentes en
un gran número de procesos fermentativos. Se desarrollan a temperaturas de entre 25 y 35 ºC
y valores de pH ligeramente ácidos (≈5).
Del mismo modo que varias especies del genero Leuconostoc, son considerados en
muchos casos agentes perniciosos cuando aparecen de forma no controlada en productos
alimentarios, principalmente por su capacidad para producir diacetilo, sin embargo su
presencia puede resultar positiva e incluso en ocasiones son inoculados. Tienen una importante
presencia en vegetales frescos y fermentados, lo que se refleja en su empleo como estárteres
para la producción de chucrut (col blanca fermentada), alubias fermentadas, así como de otros
productos de estas características con un consumo y distribución más localizado. La
producción de carnes procesadas es también otra importante aplicación de algunas especies de
este género al haber sido empleadas recurrentemente en la elaboración de salchichas o jamón
curado (Franz et al., 2014).
El género Lactobacillus es quizás el más conocido debido a la adición de algunas de

sus especies en productos de consumo popular, principalmente lácteos. Se trata del género más
amplio de bacterias ácido lácticas al contar más de 150 especies (Mattarelli et al., 2014). En
la actualidad, este género no se puede considerar completamente definido debido a la gran
7
divergencia entre los caracteres de estas especies, así como a su importante diversidad
genética. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en hábitats que van desde
el tracto gastrointestinal humano, a peces o plantas. Esta amplia variedad de hábitats abarca
un extenso rango de condiciones ambientales en las que estos microorganismos pueden
desarrollarse, lo que ha derivado en numerosas aplicaciones industriales, especialmente en la
industria alimenticia. Por ejemplo, estos microorganismos se encuentran entre las especies de
BAL más tolerantes a bajos valores de pH, con un rango entre 3 y 8, lo que les permite llevar
a cabo fermentaciones de productos alimentarios, principalmente vegetales (Axelson, 2004).
Del mismo modo, a pesar de que la temperatura óptima de crecimiento suele encontrarse entre
30 y 40 ºC, algunas especies pueden desarrollarse incluso a temperaturas cercanas al punto de
congelación o por encima de los 50 ºC (Pot et al., 2014).
Como el resto de las bacterias acido lácticas, el género Lactococcus incluye especies
de altos requerimientos nutricionales. Se trata de una especie homofermentativa que se
encuentra también ampliamente distribuida en la naturaleza, con forma oval, y que puede
aparecer de forma aislada o formando pares o cadenas. Son mesófilas y crecen a valores de
pH cercanos a la neutralidad. Su nombre deriva de su aislamiento en 1909 de leche fermentada
y en la actualidad, la producción de derivados lácteos es la principal aplicación de algunas
especies de este género, especialmente de Lactococcus lactis (Kim, 2014).
Filogenéticamente relacionado con el género Lactococcus se encuentra el género

Streptococcus, que incluye a 79 especie con morfología esférica u ovoide y que generalmente
aparecen en parejas o en cadenas. Son aerobios facultativos y tienen una temperatura óptima
de crecimiento a 37 ºC (Du Toit et al., 2014).
3. Fisiología de las bacterias ácido lácticas
Las bacterias ácido lácticas son organismos quimiotrofos, es decir, obtienen su energía
de la oxidación de compuestos químicos, concretamente azúcares o hexosas. La oxidación de
azúcares constituye la principal ruta metabólica para la producción de energía en bacterias
lácticas (Ribereau-Gayon et al., 2000).
Se trata de microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes, al necesitar

una gran variedad de sales minerales, vitaminas y aminoácidos. Su cultivo en medio sintético
8
es a menudo complejo y muestra un crecimiento escaso, debido en parte a que estas exigencias
nutricionales responden a necesidades específicas de cepa (Endo y Dicks, 2014).
3.1 Metabolismo de azúcares
Existen dos rutas metabólicas de asimilación de azúcares (hexosas) en las bacterias

ácido lácticas. Éstas son específicas de especie, lo que supone también un criterio para la
identificación de las mismas. Se trata del metabolismo heteroláctico o heterofermentativo y el
metabolismo homoláctico u homofermentativo (Fig. 3) (Khalid, 2011).
El metabolismo homoláctico emplea la ruta de Embden-Meyerjorf para obtener un

balance global de dos moles de ácido láctico (D o L dependiendo de la especie) y 2 ATPs por
mol de glucosa consumida (Fig. 3A) (Axelson, 1998; Liu, 2002; Muñoz et al., 2011). Esta ruta
se divide en dos fases, la primera incluye todas las reacciones de la glucólisis que conducen a
la formación de piruvato y NADH+H+; y en la segunda, el piruvato es reducido a ácido láctico
tomando los protones del NADH+H+ generado anteriormente (Ribereau-Gayon et al., 2000).
El metabolismo homoláctico es empleado por la mayor parte de las bacterias lácticas a
excepción de Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, y algunos Lactobacillus (Axelson, 2004).
El metabolismo heteroláctico emplea la ruta de las pentosas-fosfato (Fig. 3B). Tras la

entrada de la molécula de glucosa en el interior celular, ésta es fosforilada una vez y oxidada
dos veces hasta dar lugar a ribulosa-5-fostato que puede ser epimerizada bien a ribosa-5-
fosfato, componente de biomoléculas tan importantes como el ATP, CoA, ADN o ARN, o
bien a xilulosa-5-fosfato. La enzima xilulosa-5-P fosfoquetolasa cataliza la rotura de ésta
última molécula en acetil-fosfato y gliceraldehido-3-fosfato. A continuación, la ruta sigue dos
vías: por un lado el gliceraldehido-3-fosfato seguirá la misma ruta que en el metabolismo
homoláctico, para dar lugar a ácido láctico, mientras que el acetil-fosfato sufre, o bien
sucesivas reducciones para dar lugar a etanol o la intervención de una molécula de ADP para
dar lugar a ATP y acetato, en función de las condiciones del medio en que se encuentre el
organismo (Ribereau-Gayon et al., 2000; Liu, 2002).
Dadas las diferentes vías posibles, el resultado final de este metabolismo no es la

completa trasformación de la glucosa en ácido láctico, aunque sí es el principal producto. Se
originan además etanol y/o acetato, y CO2, en un balance final de 1 mol de ácido láctico, etanol
9
(o acetato, según la ruta), CO2 y ATP por cada mol de glucosa consumida (Liu, 2002; Muñoz
et al., 2011).
Figura 3: Rutas metabólicas para la fermentación de glucosa en bacterias ácido lácticas. A: Ruta
homofermentativa. B: Ruta heterofermentativa (Adaptado de Axelsson, 2004).
10
Las pentosas son incorporadas en la célula a través de permeasas donde son

rápidamente fosforiladas y convertidas en ribulosa-5-fosfato o xylulosa-5-fosfato e
incorporadas a las rutas antes mencionadas (Axelsson, 2004).
3.2 Metabolismo de ácidos orgánicos
3.2.1 Metabolismo del ácido málico
El metabolismo de ácidos orgánicos en general, y del ácido málico en particular ha

sido extensamente estudiado debido, principalmente, a las implicaciones que éste tiene en la
industria vínica (Ribereau-Gayón, 2000), al encontrarse dicho ácido en concentraciones de
hasta 20 g/L (Unden y Zaunmüller, 2009).
El ácido málico tiene su origen en la uva, y más concretamente en la semilla, cuya

concentración disminuye progresivamente según avanza la maduración, como consecuencia
del cambio de metabolizar azúcares a metabolizar dicho ácido a través de la ruta de los ácidos
tricarboxílicos o ciclo de Krebs. Esto tiene como consecuencia la reducción en la
concentración del mismo de más de 25 g/L a 4-6 g/L cuando se completa la maduración
(Volschenk et al., 2006).
En climas fríos, en cambio, la maduración de la uva no se completa, haciendo que

retengan elevadas concentraciones de ácido málico que es transferido al vino durante el
estrujado (Ribereau-Gayón, 2006).
Figura 4: Fermentación maloláctica. Estructura molecular del ácido málico y del ácido láctico
11
Algunas bacterias ácido lácticas son capaces de llevar a cabo la conversión del ácido
málico en ácido láctico del vino (Fig. 4) en un proceso denominado fermentación maloláctica
(MLF, del inglés “malolactic fermentation”), estableciendo así un subgrupo dentro de las
BAL, el de las bacterias malolácticas.
3.2.2 Metabolismo del ácido cítrico
El ácido cítrico tiene también un papel crucial al tratarse de un intermediario en la ruta

de síntesis de diacetilo, acetona o ácido acético, compuestos todos ellos de gran importancia
organoléptica de productos lácteos (Endo y Dicks, 2014) y vinos (du Toit et al., 2011). La
presencia del primero de estos compuestos en vino es aceptada hasta ciertos límites, aportando
complejidad en la cata hasta niveles de 2-3 mg/L en vinos blancos y 5 mg/L en vinos tintos,
pero sobrepasadas estas concentraciones, aporta un aroma a mantequilla que resulta
inaceptable (Ribereau-Gayón, 2006).
3.2.3 Metabolismo del ácido tartárico
Entre los ácidos orgánicos con mayor presencia en vino, el más abundante es el ácido
tartárico, pero la capacidad de las BAL para llevar a cabo su degradación es mucho menos
habitual que la mostrada para los dos casos anteriores, y generalmente implica a bacterias del
género Lactobacillus (Muñoz et al., 2011). Además, su degradación a menudo supone la
producción de ácido acético como producto final y con ello un incremento de la acidez volátil
del vino (Ribereau-Gayón, 2006; du Toit et al., 2011).
3.3 Metabolismo de proteínas y compuestos nitrogenados
Las bacterias ácido lácticas tienen una capacidad muy limitada para emplear el
nitrógeno inorgánico. Debido a esto, necesitan de una fuente exógena de aminoácidos y
vitaminas en el medio en el que se desarrollan y son, de hecho, la mayoría de las especies de
BAL auxótrofas para al menos un aminoácido. Así, L. plantarum parece ser la única especie
cuyo ADN codifica enzimas para la síntesis de todos los aminoácidos excepto leucina,
isoleucina y valina y, en el caso contrario, L. johnsonii es incapaz de sintetizar la mayor parte
de ellos (Mayo et al., 2010), si bien estos requerimientos son, nuevamente, dependientes de
cepa (Axelsson, 2004, Endo y Dicks, 2014).
12
Algunas especies presentan un sistema proteolítico que les permite la rotura de ciertas
proteínas presentes en el medio y el empleo de los aminoácidos resultantes de la misma para
su propio metabolismo. Estos sistemas proteolíticos tienen generalmente tres componentes
principales: proteinasas, o enzimas capaces de romper las proteínas en péptidos; un sistema de
transporte de estos al interior celular; y peptidasas en el citoplasma, encargados de convertir
estos péptidos en aminoácidos libres (Mayo et al., 2010). Este proceso proteolítico es de
especial importancia en la industria alimentaria en general y en la láctea en particular (Endo y
Dicks, 2014), donde los aminoácidos resultantes de la rotura de la caseína son a menudo
empleados por la célula bacteriana en la producción de sustancias aromáticas como alcoholes,
aldehídos, ácidos, esteres, y compuestos sulfurados.
Una situación similar ocurre en vinos, donde las proteínas procedentes de la uva y de
la lisis de las levaduras tras la fermentación alcohólica son transformados en péptidos y
aminoácidos libres cuyo catabolismo tiene importantes repercusiones organolépticas (Liu,
2002).
Las aminas biógenas, cuya repercusión sobre la salud del consumidor se tratará en
detalle más adelante, son también un producto del metabolismo de aminoácidos libres (Sumby
et al., 2014).
3.4 Metabolismo de lípidos
Los lípidos presentes en el vino tienen también su origen en la uva y las levaduras que
llevan a cabo la fermentación alcohólica (Liu, 2002).
La presencia de una excesiva concentración de ácidos grasos volátiles en vinos, como

resultado de la lipolisis llevada a cabo por las bacterias ácido lácticas, puede resultar negativa
para la características organolépticas de los mismos (Liu, 2002; Muñoz et al., 2011).
A pesar de que existen algunas referencias a este mecanismo en bacterias ácido lácticas
(Esteban-Torres et al., 2015), no se han estudiado en profundidad los sistemas lipolíticos
encargados de esta reacción en vinos (Mathews et al., 2004).
13
4. Las bacterias lácticas y el ser humano
Metchnikoff sugirió, a principios del siglo XX, que las bacterias ácido lácticas podían
contribuir positivamente a la salud del ser humano. Desde entonces han sido numerosos los
estudios realizados en ese ámbito (Quinto et al., 2014).
A pesar de que las bacterias lácticas se encuentran principalmente asociadas a

ambientes ricos en nutrientes como la leche, carne o vegetales, algunas especies pueden
encontrarse como componentes importantes en la boca, intestino y vagina de mamíferos
(Khalid, 2011).
El ser humano entra en contacto con estos microorganismos desde el momento del
nacimiento, al ser estas bacterias elementos principales de la microbiota vaginal. Una vez
comenzada la lactancia, la leche materna aporta en gran medida los organismos que
conformaran la microbiota intestinal del recién nacido (Mikelsaar et al., 1998). A partir de este
momento, las bacterias lácticas estarán presentes en diferentes biotopos, como la piel, intestino
o vagina, a lo largo de la vida del individuo, mientras éste se encuentre saludable.
Como se ha mencionado, los beneficios que las bacterias ácido lácticas pueden aportar
sobre la salud humana han sido ampliamente estudiados. Éstas forman parte esencial de la
microbiota intestinal humana, suponiendo una importante fuente de nutrientes como la
tiamina, riboflavina, ácido fólico o vitamina B12, que son absorbidos y empleados por el
hospedador (Ballongue, 2004).
En este aspecto, los géneros de BAL más representativos en la biota intestinal en

individuos sanos son Lactobacillus y Bifidobacterium, cuyas densidades celulares evolucionan
a lo largo de todo el tracto digestivo. Así, las especies de Lactobacillus ácido-tolerantes son
por lo general las principales bacterias asociadas al estómago, mientras que en el colon
predominan especies del genero Bifidobacterium. Esta distribución espacial de las BAL, así
como la estabilidad de la microbiota intestinal general se puede ver afectada por numerosos
factores como la dieta del individuo, la composición de la mucosa intestinal o la propia
capacidad adhesiva de los microorganismos (García-Ruiz et al., 2014).
Del mismo modo, son de sobra conocidas las actividades probióticas de este tipo de
microorganismos. En la actualidad existen evidencias de los efectos profilácticos y curativos
14
que las bacterias lácticas tienen sobre enfermedades como diarreas rinitis, patologías de la piel,
intolerancia a la lactosa o incluso cáncer (Sharma et al., 2014).
Un gran número de estudios están basados en la prevención y/o reducción de la

duración de episodios diarreicos de diferente origen, llevando a la confirmación de los efectos
beneficiosos de la aplicación de estos microorganismos. La administración por vía oral de
Lactobacillus reuteri se ha mostrado eficaz en la atenuación de diarreas causadas por rotavirus
(Villena et al., 2013), así como Lactobacillus GG, es capaz de reducir la duración de los
episodios de este tipo de diarreas, al mismo tiempo que previene la aparición de aquellas
causadas por la administración de antibióticos (Soomro et al., 2002; Salminen y Von Wright,
2004). La presencia de estos microorganismos supone además una barrera contra la
colonización de las vías gastrointestinales por parte de agentes patógenos bien sea por la
competición por los nutrientes y por los sitios de adhesión, como por la síntesis de sustancias
antimicrobianas. Así, por ejemplo, se ha demostrado la importancia de la concentración de
bacterias ácido lácticas en la prevención de la colonización por Clostridium difficile (Mikelsaar
et al., 2004). Por otra parte, la administración de Lactobacillus casei Shirota dio lugar a la
reducción de la colonización por Helicobacter pylori en individuos adultos (Cats et al., 2003).
El consumo habitual de ciertas especies de bacterias ácido lácticas como S.

thermophilus y/o L. bulgaricus, empleados habitualmente en la elaboración de yogurt, pueden
mejorar la digestión de lactosa debido a la presencia de la enzima β-galactosidasa (Martini et
al., 1991; London, 2015), reduciendo los síntomas de la intolerancia a dicho disacárido,
afección presente en entre un 5 y un 15% de la población europea (Hove et al., 1999; Guarner
y Malagelada, 2003; Salminen, y Von Wright, 2004).
Otro importante campo de estudio en la aplicación biomédica de las bacterias lácticas

es la prevención del cáncer en vías gastrointestinales. Este efecto antitumoral puede darse,
bien por la supresión de las enzimas activadoras de pro-carcinógenos, principalmente la β-
glucoronidasa, la nitrorreductasa y la azoreductasa, (Hove et al., 1999; Sharma et al., 2014),
o bien por la producción de sustancias antitumorales (p. ej. butirato) (Soomro et al., 2002).
Un gran número de especies de bacterias ácido lácticas han demostrado importantes

efectos antitumorales, especialmente en ensayos realizados en ratas, obteniendo reducciones
de hasta un 50% en la aparición de criptas aberrantes (precursoras de pólipos colorrectales) en
15
el intestino grueso tras 5 semanas de la administración de cepas de Bifidobacterium (Brady et

al., 2000). Aunque estas propiedades anticancerígenas no han sido verificadas en humanos, si
se ha demostrado la relación entre la presencia de estos microorganismos y una significativa
reducción de la actividad de las enzimas pro-carcinógenas mencionadas anteriormente tras la
ingesta de L. acidophilus (Hirayama et al., 2000).
A pesar de que sus efectos no se dirigen al tracto gastrointestinal, Lactobacillus casei

Shirota ha mostrado un importante efecto evitando la reaparición de cáncer de vejiga en
humanos (Yasui et al., 1999).
El efecto inmunomodulador viene principalmente determinado por su capacidad para

regular los niveles de linfocitos, inmunoglobulinas y citoquinas en el organismo. La
administración de leche fermentada, inoculada con L. casei DN-114001 (Actimel®), indujo un
incremento en el número de linfocitos circulantes tras 6 semanas de tratamiento en voluntarios
sometidos a estrés (Marcos et al., 2004). De LeBlanc et al. (2008) demostraron la capacidad
de esta cepa láctica para la estimulación de la producción de Inmunoglobulina A, así como de
macrófagos y células dendríticas en ratones.
Esta capacidad para regular el sistema inmune tiene como efecto colateral una
importante mejora en individuos que presentan alguna enfermedad atópica, como asma, rinitis
alérgica, etc. a través de la regulación de la síntesis de IgE mediante la estimulación de la
producción de citoquinas antinflamatorias (Yasui et al., 1999; Ouwehand et al., 2002).
5. Las bacterias lácticas en la industria alimentaria
Como se mencionaba anteriormente, las bacterias lácticas han sido empleadas en la

industria alimentaria desde su descubrimiento a finales del año 1800.
Desde sus primeras funciones como fermentos lácticos en la generación de queso y/o
leche agria, hasta la actualidad, el número de aplicaciones en esta industria se ha visto
enormemente ampliado debido, posiblemente, a la versatilidad y adaptabilidad de estas
bacterias a condiciones difíciles. Del mismo modo, la calificación de estas bacterias como
GRAS (Generally Regarded as Safe), ha impulsado la investigación en la aplicabilidad de estos
microorganismos para la sustitución de agentes químicos empleados en la conservación de
16
productos alimenticios, cuya reducción o desaparición es cada vez más demandada por los
consumidores (Crowley et al., 2013).
Los primeros cultivos comerciales de bacterias lácticas fueron preparados en el

laboratorio Chr. Hansen a finales del siglo XIX. Se trataba de cultivos mixtos de cepas
bacterianas desconocidas obtenidos de leches fermentadas (Stanley, 1998).
En la actualidad, los cultivos iniciadores de la fermentación (en adelante “estárteres”)

empleados en la industria alimentaria pueden clasificarte atendiendo a tres criterios: la
temperatura óptima de crecimiento, el modo de presentación y el número de especies o cepas
bacterianas que incluyan.
Basándose en el primer criterio, los estárteres se pueden denominar mesófilos,

aquellos que tienen su temperatura óptima de crecimiento alrededor de 30 ºC y crecen entre
10 y 40 ºC, y termófilos, que presentan una temperatura óptima de crecimiento entre 40 y 50
ºC (Stanley, 1998).
En el caso de los estárteres mesófilos, son las especies de Lactococcus y Leuconostoc

las más empleadas, mientras que las especies termófilas más utilizadas son S. salivarius subsp.
thermophilus y las especies de lactobacilos: L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus y
L. delbrueckii
Atendiendo al segundo criterio, los estárteres pueden ser, según Lawrence et al.
(1976):
- Estárteres de una sola cepa: presentan una sola cepa bacteriana.

- Estárteres multi-cepa: mezclas definidas de dos o más cepas de la misma especie.
- Estárteres multi-cepa mixtos: se trata de mezclas de cepas de varias especies. La
composición de los estárteres multi-cepa puede variar al realizar sub-cultivos.
Actualmente, la leche puede ser fermentada en más de 1000 productos, lo que ha

derivado en un gran esfuerzo a la hora de obtener fermentos específicos de producto, estables
y/o resistentes a bacteriófagos (Mäyrä-Maäkinen y Bigret, 1998).
En el caso de los yogures y leches fermentadas, las especies de bacterias lácticas más
habitualmente empleadas son S. salivarius subsp. thermophilus y L. delbrueckii subsp.
17
bulgaricus (Auclair y Accolas, 1983), previamente definidas como termófilas, y que por lo
general son inoculadas conjuntamente como fermento mixto (Stanley, 1998; Oberman y
Libudzisz, 1998).
Para el desarrollo de esta fermentación, se inocula la leche con entre un 0,5 y un 5%

de fermento tras la pasteurización y enfriado, y se incuba a temperatura de entre 30 y 45 ºC
(Auclair y Accolas, 1983).
En el caso de los quesos se emplean tanto fermentos mesófilos como termófilos, en

función del tipo del mismo que se desea producir. Así por ejemplo, los quesos Cheddar, Feta,
Brie o Edam se originan a partir de fermentos mesófilos mientras que los quesos suizos
Emmenthal y Gruyere, los italianos Parmigiano Reggiano y Mozzarella o el gorgonzola, tienen
lugar por la acción de fermentos termófilos (Stanley, 1998).
Además de la aplicación de los microorganismos en la producción propiamente dicha

de derivados lácteos, numerosos estudios de aplicación de las bacterias ácido lácticas derivan
hacia la obtención de sustancias bioactivas que aporten al consumidor un valor añadido a los
propios factores nutricionales.
La obtención de péptidos bioactivos está centrando el interés de numerosos

investigadores por los potenciales efectos beneficiosos sobre la salud de quien los consume.
Estos péptidos se originan tras la hidrólisis de proteínas lácteas. Se ha demostrado su acción
antihipertensiva al inhibir la actividad de la enzima conversora de la Angiotensina-I (Smachi
y Gobbetti, 2000; Haque y Chand, 2008), efecto antioxidante (Virtanen, 2005; Pihlanto, 2006),
efecto antitrombótico por inhibición de la unión del fibrinógeno a las plaquetas, e incluso la
inhibición de la actividad proteinasa del virus VIH (Smachi y Gobbetti, 2000). Las bacterias
lácticas presentan un sistema proteolítico anclado a su membrana así como numerosas
peptidasas intracelulares (Haque y Chand, 2008). Debido a esto, especies de bacterias lácticas
como Lactobacillus helveticus (Meisel y Bockelmann, 1999), S. thermophilus, L. bulgaricus
(Tsai et al., 2008), L. delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 y L. lactis subsp. cremoris (Gobbetti
et al., 2000) han mostrado la capacidad de incrementar la concentración de dichos péptidos en
los productos lácteos en los que son añadidos.
18
Si bien la industria láctea sigue siendo el principal mercado de este tipo de

microorganismos, también las industrias vínica o cárnica han hecho de ellos una parte
fundamental de sus procesos productivos.
En el caso de productos cárnicos fermentados como las salchichas o el salchichón,

gran parte de los microorganismos que presentan provienen de la propia mezcla o el material
de trabajo. Sin embargo, la adicción de fermentos lácticos proporciona importantes ventajas
ya que aceleran los procesos de fermentación, mejoran las características organolépticas y
limitan la proliferación de microorganismos indeseados (Auclair y Accolas, 1983).
Se emplean generalmente tres tipos de estárteres, aquellos que contienen cepas de

Lactobacillus, los elaborados a base de Pediococcus y los que contienen cepas de
Staphylococcus.
El empleo de cultivos iniciadores basados en bacterias acido lácticas es también una

práctica habitual en la industria enológica. Generalmente basados en la especie O. oeni (du
Toit et al., 2011), cada vez más se introducen en estos productos cepas otros géneros de
bacterias lácticas (Nisiotou et al., 2014) como Lactobacillus, ya sea en cultivos mono o
multicepa, que han demostrado su utilidad a la hora de llevar a cabo la fermentación
maloláctica en vinos con alto contenido de ácido málico, donde este proceso juega un papel
crucial en la calidad del producto, por lo que será tratado exhaustivamente más adelante.
A pesar de que históricamente el uso mayoritario de este tipo de microorganismos ha

sido la producción de los productos anteriormente mencionados, en la actualidad está tomando
fuerza el estudio y explotación de otra de sus principales características: el control
microbiológico.
Este control microbiológico tiene tres vías principales: el consumo de los nutrientes
necesarios para la proliferación de los microorganismos no deseados, la reducción del pH del
medio, o la síntesis y liberación de sustancias antimicrobianas como ácido láctico, ácidos
volátiles, peróxido de hidrógeno o las bacteriocinas anteriormente mencionadas (Reis et al.,
2012).
Los aspectos beneficiosos de este tipo de bacterias son numerosos, y habitualmente,

los únicos que tienen lugar durante el proceso de producción de determinados alimentos (el
19
control de diversos parámetros del proceso productivo así trata de garantizarlo), sin embargo,
en ocasiones la presencia de las bacterias acido lácticas puede suponer un deterioro en la
calidad del producto final, o incluso, un problema de salud para aquel que lo consuma. En este
sentido, algunas cepas de bacterias ácido lácticas pueden dar lugar a sustancias potencialmente
perjudicares como el carbamato de etilo o las aminas biógenas.
El carbamato de etilo es una sustancia carcinógena encontrada en alimentos

fermentados y bebidas, y formada por la reacción química entre el etanol y un precursor con
un grupo N-carbamil como la urea, la citrulina, o el carbamil-fosfato. El primero es originado
por las levaduras durante la fermentación alcohólica, mientras que la citrulina y el carbamil-
fosfato son producidos por las bacterias ácido lácticas durante la fermentación maloláctica
(Muñoz et al., 2011).
Figura 5: Principales aminas biógenas, aminoácidos precursores y enzimas que llevan a cabo su
síntesis.
Las aminas biógenas en cambio, son directamente sintetizados por las bacterias ácido
lácticas, a partir de la descarboxilación de aminoácidos residuales presentes en el medio, como
la histidina, tirosina u ornitina (Muñoz et al., 2011; Sumby et al., 2014). Esta reacción es
llevada a cabo por medio de las enzimas histidina descarboxilasa, tirosina descarboxilasa u
20
ornitina descarboxilasa, dando lugar a histamina, tiramina o putrescina respectivamente (Fig.

5). Estas tres aminas, junto con la cadaverina, son las de mayor presencia en productos
alimentarios, seguidas de la feniletilamina, espermina o triptamina (Smit et al., 2008)
La importancia de estos compuestos orgánicos nitrogenados radica en las severas

implicaciones que pueden tener sobre la salud humana. Las aminas biógenas son esenciales
para muchas funciones fisiológicas (Zotou et al., 2003). Sin embargo, en caso de superar
determinados umbrales de concentración en el alimento consumido pueden ser causa de
dolores de cabeza, dificultad respiratoria, palpitaciones, hipo o hipertensión y desordenes
alérgicos severos (Landete et al., 2005). Estos efectos se pueden ver agravados si existe
sensibilidad por parte del consumidor debido a una baja actividad amino-oxidasa (enzima
encargada de su detoxificación) en el tracto intestinal, o por la ingesta de alcohol, el cual
también inhibe dicha enzima (Landete et al., 2007), siendo este último aspecto el que da
especial importancia a su control en bebidas alcohólicas como el vino o la cerveza.
En concreto, la amina biógena más habitualmente relacionada con intoxicaciones

alimenticias es la histamina, asociada principalmente a vinos (Landete et al., 2005) y
escómbridos, y de elevada actividad biológica. Esta amina, además de los efectos antes
mencionados, puede causar edema, vómitos y/o diarreas.
A la hora de determinar la presencia/ausencia de aminas biógenas en productos

alimenticios, el método más empleado es la cromatografía líquida de alta presión o HPLC (de
las siglas en inglés: High-Performance Liquid Chromatography) (Marcobal et al., 2006; Smit
et al., 2008), que a pesar de ser altamente sensible, necesita de un equipamiento costoso y
personal altamente cualificado.
Debido a esto, los métodos moleculares se han convertido en la alternativa y/o en un

complemento a las técnicas antes mencionadas, al ser rápidos, fiables y no excesivamente
caros.
21
6. Identificación de bacterias ácido lácticas
6.1. Identificación fenotípica clásica
Desde su descubrimiento a finales del siglo XIX, las técnicas de identificación de

bacterias malolácticas basadas en los caracteres fenotípicos, también denominadas “técnicas
clásicas”, han sido la base del estudio microbiológico de este grupo bacteriano y de sus
relaciones filogenéticas.
Los caracteres empleados por Orla-Jensen a principios del siglo XX continúan en

vigor actualmente y permiten establecer una primera identificación de estos organismos, que
deberá posteriormente ser completada con métodos más actuales (Vandamme et al., 2014).
El estudio de la morfología bacteriana, el carácter Gram, la reacción frente a catalasa,

la capacidad de esporulación o la movilidad suponen, generalmente, los primeros pasos en el
protocolo de identificación de bacterias ácido lácticas tras la obtención de un cultivo puro en
medio sólido (Muñoz et al., 2011). Un segundo paso es establecido por la capacidad
fermentativa de dichos aislados frente a las hexosas, del que se deducirá su carácter hetero u
homofermentativo (Ribereau-Gayon et al., 2006).
Tras este análisis, es posible realizar una aproximación a nivel de género, basándose
en la descripción fenotípica aportada por el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
(Holt y Krieg, 1994).
Para alcanzar el nivel de especie en la identificación, tradicionalmente, se ha empleado

la prueba API 50CHL (Bio-Mérieux). Esta prueba permite establecer la capacidad de
asimilación de 49 carbohidratos, proporcionando perfiles específicos de especie.
A pesar de que este método ha sido empleado de forma rutinaria en laboratorios de

todo el mundo, los resultados arrojados por el mismo han de ser manejados con precaución
debido a las importantes diferencias encontradas entre perfiles de aislados pertenecientes a la
misma especie, hasta el punto de que algunos autores sostienen la no conveniencia de la
aplicación de este test a bacterias malolácticas provenientes de vino (Ribereau-Gayon, 2006).
22
6.2. Identificación genotípica
En la actualidad está ampliamente extendido y aceptado el empleo del ADN, ya sea

total o parcialmente, para la identificación bacteriana (Heyndrickx et al., 1996). Sin embargo,
en ocasiones, la dificultad a la hora de identificar aislados de bacterias ácido lácticas es tal que
solamente los estudios de homología ADN-ADN son capaces de resolver dicha identificación
(Axelsson, 1998).
En aquellos casos en que no se da una complicación tan elevada, existe una amplia
variedad de técnicas moleculares para la determinación a nivel de género, especie, subespecie
o incluso cepa, de un aislado de bacterias ácido lácticas (Muñoz et al., 2011).
Los métodos de identificación basados en ADN pueden dividirse en dos tipos: aquellos
que emplean técnicas de PCR y los que se basan en la hibridación.
6.2.1. Identificación basada en hibridación
Las técnicas basadas en hibridación se fundamentan en la capacidad de

desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos. Ya sea mediante agentes
químicos (como la urea, formamida o formaldehído), ácidos o bases, o por efecto de la
temperatura, las dos hebras del ADN pueden ser separadas. En este punto, la adición a la
mezcla de reacción de otros ADNs o ARNs que, una vez neutralizadas las condiciones de
desnaturalización, se unirán en mayor o menor medida a una de las dos hebras originales, da
como resultado la formación de tres posibles tipos de híbridos: los híbridos ADN-ADN, los
híbridos ARN-ARN y los híbridos ADN-ARN (Luque y Herráez, 2001), y con ello la
localización de la secuencia de interés.
El método basado en hibridación más empleado para identificación bacteriana es la

Hibridación fluorescente in situ o FISH (del inglés: Fluorescence in Situ Hybridization).
En esta técnica, la hibridación se produce con pequeños fragmentos de ADN (sondas)

marcados con compuestos fluorescentes (fluorocromos), que permite la detección posterior de
una determinada secuencia diana en el ADN o ARN bajo estudio (Pozo-Bayón et al., 2009).
Su efectividad depende del grado de especificidad en el apareamiento, también denominado
rigor, que hace referencia al grado de complementariedad entre la sonda y la secuencia diana.
23
6.2.2. Identificación basada en PCR
La PCR o reacción en cadena de la polimerasa consiste en la obtención in vitro de un

elevado número de copias de una determinada secuencia génica mediante el empleo de una
enzima polimerasa. Este gran número de copias es fácilmente identificable mediante una
electroforesis lo que permite detectar secuencias concretas en mezclas complejas, como por
ejemplo un homogeneizado celular o el resultado de una extracción de ADN (Ribéreau-Gayón
et al., 2006).
Existen en la actualidad numerosos genes empleados habitualmente para la

identificación bacteriana, como son el que codifica para el citocromo C, el gen recA
(codificante para la recombinasa A bacteriana), el gen tuf, codificante para el factor de
elongación Tu, el gen rpoB (codificante para la subunidad beta de la ARN polimerasa
bacteriana) o el ADN ribosómico 16S (Vandamme et al., 2014).
6.2.2.1. Análisis del ADN ribosómico
Las secuencias de ADN ribosómico codifican para ARN ribosómico que, junto con
una serie de proteínas, conforman el ribosoma procariota (Fig. 6), constituido por dos
subunidades: una subunidad grande (50S), compuesta a su vez por dos subunidades llamadas
23S y 5S; y una subunidad pequeña denominada 30S que incluye a la subunidad 16S y 21
proteínas (Puertas, 1999).
Subunidad Mayor = 34 proteínas + ARNr 23S

50S
ARNr 5S
Subunidad menor = 21 proteínas + ARNr 16S

30S
Figura 6: Ribosoma bacteriano y subunidades que lo conforman.
24
Su función es la traducción de las secuencias de ARN mensajero a proteínas, función

vital para la supervivencia de la célula por lo que cualquier modificación en la estructura
terciaria del mismo puede derivar en importantes consecuencias metabólicas o incluso la
muerte del organismo (Heyndrickx et al, 1996). Concretamente, el ARNr 16S permite el
reconocimiento de la secuencia Shine-Dalgarno del ARN mensajero, permitiendo el
posicionamiento correcto del mismo para el inicio de la traducción (Puertas, 1999).
Han sido numerosos los genes ribosómicos empleados tanto en la identificación

bacteriana como en la determinación de su posición filogenética. La secuencia codificante para
la subunidad 16S del ribosoma bacteriano, la codificante para la subunidad 23S o aquella que
codifica para la subunidad 5S han sido habitualmente empleadas para tales fines. Incluso las
secuencias existentes entre estos genes (23S-5S o 16S-23S) se han mostrado de gran utilidad
en este tipo de estudios (Nour, 1998).
Este hecho se debe principalmente a 5 aspectos (Eisen, 1995):
- Estos genes están presentes en todas las especies de vida libre conocidas, presentando
además una secuencia, estructura y función muy conservada.
- Se trata de genes relativamente fáciles de clonar y secuenciar, incluso cuando
provienen de bacterias no cultivables.
- La conservación de determinadas regiones permite el alineamiento de secuencias entre
especies.
- No parece probable la existencia de transferencia lateral de estos genes entre especies.
- Las elevadas tasas de sustitución entre especies permite inferir relaciones
filogenéticas.
En la actualidad, el gen más empleado tanto en identificación como en estudios

filogenéticos en bacterias, es el que codifica para la subunidad pequeña 16S del ribosoma
bacteriano, o secuencia ADNr 16S, debido en parte a su pequeño tamaño en comparación con
el 23S (Singh et al., 2009).
Esta secuencia cuenta con aproximadamente 1500 pares de bases, con dominios
altamente conservados a ambos extremos del gen, lo que supone un aspecto idóneo para la
elaboración de cebadores que permitan la obtención del gen completo por PCR (Heyndrickx
25
et al., 1996), y regiones variables que proporcionan la detección e/o identificación (Nour,
1998) .
Las secuencias ARNr 16S fueron originariamente empleadas para estudios

filogenéticos por Carl Woese en 1977, lo que le permitió identificar por primera vez el dominio
Archaea (Goldenfeld y Pace, 2013).
En la actualidad, las filogenias bacterianas derivan principalmente de las secuencias

ARNr 16S, y están basadas en más de 600000 secuencias completas, disponibles en las bases
de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), lo que ha hecho que el análisis de las
mismas se hayan convertido en la herramienta más fiable y rápida para la identificación
bacteriana.
Existe, sin embargo, una problemática en el empleo de la secuencia 16S para

diferenciar especies filogenéticamente cercanas, como es el caso de algunas especies
pertenecientes al género Lactobacillus. La secuenciación y posterior análisis comparativo de
este gen puede arrojar porcentajes de homología de más del 99% en algunas especies
consideradas diferentes, haciendo imposible su identificación a través de esta técnica. Un
ejemplo de ello son las especies L. casei y L. paracasei, cuyas secuencias 16S son
prácticamente idénticas a pesar de considerarse especies diferentes (Dellaglio et al., 2002), de
forma similar a lo que sucede con las especies L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus
(Singh et al., 2009). Esto hace que a menudo sea necesario un análisis secuencial o el empleo
de varios genes para la completa identificación de estas especies (Vandamme et al., 2014).
Estas secuencias pueden ser empleadas de diversos modos en función del objetivo del
análisis:
6.2.2.1.1. Secuenciación
La secuenciación del ADNr 16S y su posterior análisis bioinformático es quizás la

técnica que proporciona mayor información al permitir establecer las distancias filogenéticas
(en la mayor parte de los casos). Así, la comparación de la secuencia o secuencias bajo estudio
con aquellas depositadas en las bases de datos, aporta la identificación del organismo y la
posición taxonómica del mismo (Heyndrickx et al., 1996).
26
6.2.2.1.2. ARDRA
La técnica denominada ARDRA (del inglés: Amplified Ribosomal DNA Restriction

Analysis), consiste en la amplificación de determinadas secuencias de DNA ribosómico y su
posterior corte con enzimas de restricción. Estas enzimas son seleccionadas en base a la
secuencia de corte (secuencia diana) así como a la presencia, ausencia o número de dianas en
el DNA bajo estudio. Tras su empleo, arroja perfiles de corte diferentes en función de la
especie o cepa, que puede ser comparado con el obtenido a partir de cepas de referencia
(Vandamme et al., 2014).
Se ha mostrado como un método altamente discriminatorio tanto a nivel de género

como de especie (Bomono et al., 2008; Soto et al., 2010), si bien puede presentar algunas
limitaciones en especies filogenéticamente muy relacionadas (Singh et al., 2009). Esta técnica
ha sido empleada con éxito en la identificación de bacterias ácido lácticas en numerosos
productos alimenticios como vino (Sato et al., 2000; Rodas et al., 2003 y 2005) o salchichas
(Bonomo et al., 2008).
6.2.2.1.3. Análisis de regiones hipervariables
Una importante característica del ADNr 16S es la presencia de 9 regiones

hipervariables en su secuencia denominadas con siglas que van desde V1 a V9 (Fig. 7). Estas
son secuencias que muestran un importante grado de variabilidad interespecífica, lo que las
convierte en una herramienta para la identificación bacteriana. Además, están flanqueadas por
regiones muy conservadas, lo que permite el diseño de cebadores y a su vez su amplificación
(Guo et al., 2013; Chaudhary et al., 2015).
Figura 7: Distribución de las regiones hipervariables dentro de la secuencia de ADNr 16S (www.gatc-
biotech.com).
27
Presentan la ventaja de que pueden ser empleadas para la identificación masiva de

comunidades microbianas (metagenómica) pero, por otro lado, tienen la desventaja de que no
pueden ser empleadas individualmente (Chakravorty et al., 2007).
6.2.2.1.4. Análisis de regiones espaciadoras intergénicas
La secuencia que se encuentra entre los genes 16S y 23S (en adelante ISR, del inglés:
“Intergenic Spacer Region”) ha sido empleada con éxito también para la identificación de
bacterias acido lácticas (Singh et al., 2009).
La secuencia ISR presenta una gran heterogeneidad tanto en el número de

repeticiones, como en la longitud y composición de las mismas entre especies bacterianas, lo
que permite una rápida identificación tras la amplificación de dicha secuencia (Nour, 1998).
6.2.2.2. Análisis del gen recA
Debido a la problemática asociada a los genes ribosómicos antes mencionada,

especialmente en lo que respecta a especies muy cercanas filogenéticamente, se han
desarrollado nuevos métodos de identificación molecular.
Uno de estos métodos emplea el gen recA, que se ha mostrado como una importante
ayuda en la discriminación de bacterias, concretamente de bacterias ácido lácticas.
La proteína recA es un péptido de 352 aminoácidos (en E. coli) aislada por primera
vez en 1965 por Clark y Margulis, y presenta importantes funciones dentro de la célula (Miller
y Kokjohn, 1990; Eisen, 1995; Karling et al., 1995):
- Juega un papel fundamental en la recombinación homóloga al facilitar el pareado e

intercambio entre hebras de ADN.
- Está directamente implicada en la reparación del ADN (forma parte del sistema SOS)
en caso de producirse lesiones por radiación ultravioleta.
- Induce la expresión de aproximadamente 15 genes del sistema SOS para la reparación
de ADN, al catalizar la proteólisis del represor de la proteína LexA.
- La proteína recA es necesaria para el proceso de mutagénesis.
28
La implicación directa en estas funciones vitales para la célula hace que la secuencia
de aminoácidos se encuentre evolutivamente muy conservada, manteniendo también la
estructura cuaternaria de la proteína. Sin embargo, sí se aprecian modificaciones en la
secuencia nucleotídica, modificaciones que se dan mayoritariamente en la tercera posición de
cada codón (Fig. 8) (Miller y Kokjohn, 1990).
Estos dos factores han conducido a que, desde principios de la década de los 90, el gen
recA haya sido propuesto como un marcador filogenético en procariotas (Torriani et al, 2001;
Rodríguez et al., 2007) ya que incluso la comparación entre árboles filogenéticos obtenidos a
partir de secuencias completas de ARNr 16S y recA bacterianos, han arrojado resultados
altamente similares (Eisen, 1995).
Figura 8: Fragmento del alineamiento de secuencias recA de cepas de Bifidobacterium. Se aprecia la

sustitución nucleotídica mayoritariamente en la tercera base de cada codón (Kullen et al., 1997).
Los métodos habituales de estudio de la secuencia recA se centran en el análisis

comparativo de las mismas mediante las actuales herramientas bioinformáticas. La
comparación de secuencias obtenidas a partir de cepas silvestres con aquellas obtenidas de
cepas de referencia, así como el análisis en base a las secuencias depositadas en las bases de
datos, permite tanto la diferenciación bacteriana como la inferencia de sus filogenias.
6.2.2.3. Otras secuencias de interés
La importancia capital de gran número de microorganismos en la industria y en la

medicina ha desembocado en la investigación y desarrollo de numerosos marcadores genéticos
que permitan una identificación rápida y fiable de los mismos.
29
Además de los descritos anteriormente, son de uso habitual para este fin los genes
rpoB, el factor de elongación tu o el citocromo C.
El gen rpoB codifica para la subunidad beta de la ARN polimerasa bacteriana, que
tiene una importancia clave en la célula bacteriana al encargarse de la transcripción. Su
presencia universal en bacterias, al igual que la secuencia de ADNr 16S, y la presencia de
regiones altamente conservadas, ha hecho que sea considerado como marcador genético y/o
cronómetro molecular (Bou et al., 2011).
Presenta, sin embargo, la desventaja de la existencia de un menor número de

secuencias disponibles en las bases de datos, siendo este de aproximadamente 150000, frente
a las más de 600000 del ADNr 16S (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), lo que supone un
problema a la hora de estimar filogenias.
Su efectividad en la identificación de bacterias acido lácticas ha sido demostrada por

Renouf et al. (2006), quienes fueron capaces de detectar la presencia de P. parvulus y O. oeni
de origen vínico.
Recientemente, González-Arenzana et al. (2013) consiguieron identificar cepas de las

especies O. oeni, L. mesenteroides, L. buchneri y P. parvulus mediante el empleo de este gen,
sin embargo, los mismo autores indican que el mayor número de especies analizadas en dicho
estudio fueron identificadas gracias al ADNr 16S.
El factor de elongación Tu, codificado por el gen tuf, cuya función en la célula
bacteriana radica en la traducción del ADN, ha sido menos empleado en la detección,
identificación y/o determinación de filogenias de bacterias ácido lácticas, aunque también se
ha demostrado su eficiencia para este fin (Chavagnat et al., 2002; Ventura et al., 2003).
6.2.2.4. PCR múltiple
En adición al análisis comparativo, existen otros métodos basados en los genes antes
mencionados que pueden ser empleados para la identificación bacteriana.
La técnica de PCR múltiple consiste en el empleo simultáneo de más de dos cebadores

en la misma reacción, que habitualmente son específicos de especie o cepa y por lo tanto dan
lugar a productos de amplificación también específicos (Markoulatos et al., 2002).
30
Torriani et al. (2001) emplearon una PCR múltiple para la obtención de fragmentos
que les permitieron identificar las especies L. plantarum, L. pentosus y L. paraplantarum.
Éstas se encuentran filogenéticamente muy cercanas y su identificación mediante el análisis
de ADNr 16S se hace a menudo improductiva al arrojar porcentajes de similitud en dicha
secuencia de más de un 99% (Torriani et al., 2001; Singh et al., 2009). El mismo método fue
empleado con éxito por Pang et al. (2011) para la identificación de bacterias ácido lácticas
procedentes de ensilados de maíz y por Nisiotou et al., (2014), para la identificación de cepas
aisladas en uvas y vino.
Petri et al. (2013) diseñaron un grupo de cebadores con los que fueron capaces de
identificar, mediante PCR múltiple, 13 especies de bacterias ácido lácticas pertenecientes a las
especies L. brevis, L. buchneri, L. curvatus, L. hilgardii, L. plantarum, L. mesenteroides, O.
oeni, P. acidilactici, P. damnosus, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus y Weissella
paramesenteroides, aisladas de vino.
Esta técnica destaca por su rapidez y fiabilidad, sin embargo su uso se limita a la
detección de especies o cepas determinadas, sin aportar información filogenética sobre las
mismas.
6.2.3. PCR/DGG
La técnica de PCR, combinada con la resolución de los fragmentos mediante

electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (PCR/DGG) permite la amplificación
y posterior separación de fragmentos de ADN, mostrando diferencias de incluso una sola base
entre las secuencias que se pretenden comparar. Esta pequeña diferencia supone también un
diferente punto de desnaturalización del ADN, y con ello, una diferente movilidad en el gel de
electroforesis (Fischer y Lerman, 1982).
Esta técnica resulta especialmente útil para el análisis de mezclas microbianas

complejas, eliminando la necesidad del aislamiento y cultivo de microorganismos (Fontana et
al., 2005).
Renouf et al. (2006) emplearon la amplificación por PCR del gen rpo, y su posterior
electroforesis en gradiente desnaturalizante, para el seguimiento de la evolución de bacterias
31
ácido láctica en varias áreas de la Denominación de Origen (D.O.) Burdeos, si bien los propios
autores reconocen la necesidad de complementar esta técnica con algún método cuantitativo.
Recientemente, Pérez-Martín et al., (2014) emplearon esta técnica sobre el gen ADNr-
16S para analizar la diversidad microbiológica de la D.O. Méntrida, permitiéndoles la
detección de O. oeni y Acetobacter sp. así como bacterias de la familia Enterobacteriaceae.
7. Aplicaciones de las bacterias lácticas
En apartados anteriores se han descrito una serie de aplicaciones de las bacterias

lácticas que van desde la reducción de la acidez del vino y elaboración de derivados lácteos y
cárnicos a la mejora de los sistemas de defensa naturales del cuerpo humano. Sin embargo, a
día de hoy son numerosas las aplicaciones que ofrecen este tipo de microorganismos, lo cual
ha impulsado un creciente interés por parte de laboratorios de todo el mundo.
Figura 9: Evolución en el número de entradas en NCBI relativas a bacterias ácido lácticas hasta 2012
(de Vos, 2011).
Un ejemplo de ello es el incremento en el número de estudios genéticos realizados en

bacterias ácido lácticas en los últimos 25 años (Fig. 9).
Algunas de estas aplicaciones se comentan a continuación.
32
7.1. Producción de enzimas de interés industrial y enológico
En vino e industria alimentaria en general, se están realizando importantes esfuerzos

en la obtención de enzimas de interés tanto para la conservación como para la mejora de
características físicas y/u organolépticas. La adicción de estas, libres o asociadas a
microorganismos, en procesos de elaboración de determinados productos alimenticios se ha
mostrado como una importante herramienta para la liberación de nuevas sustancias aromáticas
y la potenciación de otras ya presentes (Mathews et al., 2004).
Un ejemplo de este tipo de enzimas son las glucosidasas. Estas enzimas son capaces
de romper los enlaces que dan lugar a glucósidos o compuestos glucoconjugados formados
por la unión de un glúcido y una molécula aromática, generalmente monoterpenos,
norisoprenoides y compuestos alifáticos o fenólicos (D’Incecco et al., 2004; Sieiro et al.,
2012). La hidrólisis enzimática de estos enlaces permite la liberación de la molécula aromática
posibilitando también su percepción sensorial, convirtiéndose así en proceso de especial
importancia en vinos, donde aproximadamente el 95% de los compuestos aromáticos están en
forma de glucósidos (Matthews et al., 2004).
Grimaldi et al. (2005a) mostraron la existencia de actividad glucosidasa en cepas

vínicas de Lactobacillus y Pediococcus, así como en O. oeni (Grimaldi et al., 2005b).
Resultados similares fueron obtenidos por Hernandez-Orte et al. (2009) en cepas O. oeni, L.
casei y L. brevis aisladas de mosto y vino. En todos estos casos se da un incremento en la
concentración de sustancias aromáticas en el vino, lo que demuestra la potencialidad de estos
microorganismos en la mejora organoléptica del mismo.
Otras enzimas de interés, debido a la amplia variedad de sustratos sobre los que pueden
actuar, son las lacasas. Se trata de enzimas capaces de catalizar la rotura de substratos
orgánicos mediante la reducción de una molécula de oxígeno a dos moléculas de agua (Riva,
2006). Recientemente, Callejón et al. (2015) clonaron y caracterizaron una lacasa de L.
plantarum con capacidad para la degradación de aminas biógenas, tras demostrar que cepas
de esta especie eran capaces de degradar histamina, tiramina y putrescina, presentes en vino
(Callejón et al., 2014).
33
7.2. Biocontrol
Otro importante campo de estudio de aplicación de estos microorganismos es el

biocontrol, debido a la capacidad de las bacterias ácido lácticas para la inhibición o limitación
del crecimiento microbiano indeseado. Este efecto puede tener varios mecanismos
desarrollados de forma natural por las bacterias ácido lácticas, como la competencia por los
nutrientes, competencia por los sitios de adhesión o la acidificación del medio, sin embargo,
en ocasiones esta inhibición se da por la síntesis y liberación de agentes antimicrobianos, lo
que supone un importante aspecto desde el punto de vista de la industria alimentaria o la
medicina.
Ejemplos de estas sustancias son las bacteriocinas, nombre genérico empleado para
englobar a las sustancias antimicrobianas de origen bacteriano que tienen efecto inhibidor del
crecimiento sobre otras cepas o especies filogenéticamente cercanas al microorganismo
productor (Riley y Wertz, 2002).
La producción de bacteriocinas por parte de bacterias ácido lácticas ha sido estudiada

durante los últimos 30 años (Parente y Ricciardi, 1999) debido a su estabilidad en altas
temperaturas y el amplio rango de valores de pH en el que son activas (Pérez et al., 2014).
Dicha producción ha sido demostrada para bacterias de los géneros Pediococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc Weissella (Yang et al., 1992; Crowley et al., 2013).
La nisina, un péptido de los considerados “lantibióticos”, fue la primera bacteriocina

y una de las más estudiadas en la actualidad, es empleada en la industria alimentaria como
conservante (Parente y Ricciardi, 1999; Pérez et al., 2014).
Aunque en ocasiones se desconoce el mecanismo de acción, el antagonismo entre

bacterias ácido lácticas frente a otras bacterias y hongos no deseados y/o patógenos ha sido
estudiado en profundidad, especialmente en aquellos casos relacionados con productos
alimenticios (Visser et al., 1986). Estos estudios a menudo ponen de manifiesto las potenciales
aplicaciones de estos microorganismos al ser capaces de inhibir a conocidos patógenos
alimenticios como levaduras pertenecientes al género Candida (Okkers et al., 1999), hongos
de los géneros Fusarium, Aspergillus (Sathe et al., 2007; Rouse et al., 2008) o Penicillium
(Rouse et al., 2008), todos capaces de producir micotoxinas; o bacterias del género Bacillus,
especialmente B. cereus (Yang et al., 2008), presente en un largo historial de intoxicaciones
34
alimentarias. En numerosas ocasiones, al ser organismos considerados GRAS, no es necesario

conocer el mecanismo de inhibición, ya que el microorganismo de interés puede ser inoculado
directamente sin suponer un riesgo para el consumidor.
La producción de antimicrobianos sigue siendo a día de hoy una importante línea de

investigación en laboratorios de todo el mundo, tanto por sus potenciales aplicaciones en la
industria alimentaria como en clínica, siendo este último ámbito especialmente prometedor al
haberse demostrado estos compuestos efectivos frente a cepas resistentes a antibióticos
convencionales (Pérez et al., 2014).
7.3. Síntesis de nanopartículas
En las últimas décadas se ha producido un preocupante incremento de casos clínicos

en los que el agente causante es un microorganismo resistente a antibióticos. Debido a esto, se
han desarrollado líneas de investigación paralelas con las que hacer frente a esta problemática.
Una de estas líneas que más interés ha despertado en los últimos años es el empleo de
nanopartículas (Pal et al., 2007) bien sea como tratamiento o como un elemento de asepsia en
el entorno clínico-hospitalario.
El concepto nanopartícula hace referencia generalmente a partículas con un tamaño

no superior a los 1000 nanómetros (Krumov et al., 2009). Éstas pueden estar compuestas por
elementos metálicos, orgánicos o combinaciones de ambos y presentan una amplia variedad
de aplicaciones. En medicina por ejemplo, las nanopartículas pueden ser empleadas como
transportadores de fármacos o como agentes anticancerígenos (Krumov et al., 2009). En la
línea de lo mencionado anteriormente, se evalúa su empleo como sustituto de los antibióticos
al no dar lugar a la aparición de resistencia (Pal et al., 2007). En biología, la variedad de
aplicaciones es elevada, entre las que destaca la obtención de superficies antimicrobianas
mediante recubrimiento con nanopartículas de plata.
Numerosos organismos son capaces de sintetizar nanopartículas, tanto procariotas

como levaduras, algas o plantas superiores. La primera bacteria en la que se identificó esta
capacidad fue Pseudomonas stutzeri (Krumov et al., 2009) y desde entonces se ha descrito en
una importante cantidad de microorganismos.
35
Las bacterias han sido descritas como agentes productores de nanopartículas de

manera tanto intra como extracelular. En ambos casos parece tratarse de mecanismos de
defensa frente a concentraciones elevadas de los iones metálicos que posteriormente
conformarán las nanopartículas (Bitton y Freihofer, 1977; Krumov et al., 2009).
Varios estudios muestran la capacidad de las bacterias lácticas para sintetizar

nanopartículas. Sintubin et al. (2009) demostraron la capacidad de 4 especies de Lactobacillus
(L. fermentum, L. plantarum, L. farciminis y L. rhamnosus) para la síntesis de nanopartículas
de plata tanto intra como extracelular, dependiendo de la especie. Nair y Pradeep (2002) han
reportado la síntesis de nanopartículas de oro, plata y combinaciones de oro-plata por parte de
cepas de Lactobacillus aisladas de mantequilla.
Este modo de síntesis de nanopartículas, que se tratará en profundidad en el capítulo

3, supone un importante salto hacia una obtención económica y respetuosa con el medio
ambiente, dos aspectos que lo diferencian de los métodos químicos, que a menudo emplean
elementos o compuestos químicos altamente contaminantes.
36
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
La corrección de la excesiva acidez de los vinos mediante la denominada

fermentación maloláctica es una práctica habitual en el proceso de elaboración de muchos de
ellos. Tradicionalmente, y todavía en algunos casos en la actualidad, esta fermentación
transcurría espontáneamente con la microbiota indígena presente en el medio. Sin embargo,
la consecución óptima de este proceso de manera espontánea es difícil y falla con frecuencia.
Además, no siempre las cepas que consiguen desarrollarse son las más adecuadas para
conducir la fermentación pudiendo comprometer la calidad del producto final. Para tratar de
solventar estos problemas se comercializan cultivos iniciadores de bacterias malolácticas con
la finalidad de inducir y conducir de manera dirigida la mencionada fermentación. Sin
embargo, frecuentemente se ha constatado la imposibilidad de estos starters para llevar a
cabo la fermentación con éxito en los diferentes tipos de vinos, debido a su incapacidad para
implantarse y desarrollarse en los mismos. La situación descrita se da con frecuencia en los
vinos elaborados con la variedad Albariño en la comarca vinícola de Val do Salnés (D.O.
Rías Baixas) en Galicia. Es por ello, que en colaboración con una de las bodegas del sector
se planteó un proyecto de investigación (en el marco del cual se desarrolló esta Tesis), con la
finalidad principal de seleccionar cepas malolácticas autóctonas, adaptadas a los vinos de
Albariño de la citada comarca, capaces de realizar de manera óptima y segura la
fermentación maloláctica en los mismos.
Aunque uno de los principales usos de las bacterias del ácido láctico es la de ser
utilizadas como cultivos iniciadores para la elaboración y/o transformación de distintos
alimentos, entre ellos el vino, diferentes estudios han explorado y demostrado también su
potencial para otras aplicaciones de gran trascendencia. Dentro de ellas cabe resaltar, entre
otras, su interés para la producción industrial de distintos metabolitos (destacando las
bacteriocinas), su importancia como probióticos o su posible empleo como agentes
bioprotectores. Sin embargo, estos estudios se han llevado a cabo mayoritariamente con
bacterias lácticas aisladas de productos lácteos. Es por esta razón por la que, aprovechando la
colección de bacterias lácticas obtenidas del trabajo de la fermentación maloláctica de los
vinos de la comarca de Val do Salnés, se planteó también en esta Tesis el estudio de algunas
de sus otras posibles aplicaciones.
39
De acuerdo con todo lo expuesto, el objetivo general de la Tesis consistió en la selección

de bacterias lácticas asociadas los vinos de la comarca Val do Salnés para conducir de
manera eficiente y segura la fermentación maloláctica en estos vinos, así como en el estudio
del potencial de estas bacterias para ser utilizadas en otras aplicaciones. Este objetivo general
se desarrolló a través de los siguientes objetivos específicos:
1. Estudio de la biodiversidad de bacterias lácticas asociadas al vino Albariño

elaborado en la comarca arriba citada
2. Caracterización de las cepas aisladas en base a criterios que permitan la selección de
las más adecuadas para conducir la fermentación maloláctica en los vinos objeto de
estudio
3. Caracterización de la actividad antagónica de las cepas aisladas frente a
microorganismos patógenos y/o alterantes de alimentos: estimación de sus espectro
de actividad y efectividad
4. Evaluación de la capacidad bioprotectora de las cepas estudiadas frente a hongos
patógenos así como de su capacidad de fitoestimulación de cultivos vegetales
5. Evaluación de la capacidad de las bacterias lácticas del vino para sintetizar
nanopartículas de plata: optimización del método y determinación de su potencial
como antimicrobianos
40
CAPÍTULO I
CAPÍTULO I Introducción
BIODIVERSIDAD DE BACTERIAS MALOLÁCTICAS ASOCIADAS A LA

VARIEDAD ALBARIÑO: EVALUCIÓN DE SU POTENCIAL COMO
CULTIVOS INICIADORES
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Industria vitivinícola: geografía y producción
En España existen 68 Denominaciones de Origen (D.O.) (Fig. 1) que engloban una

gran cantidad de variedades enológicas, alcanzando una producción media total de 45000000
de hectolitros, de los cuales aproximadamente el 50% son de vino blanco (datos del Ministerio
de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente de España, para los años 2013- 2015).
Figura 1: Denominaciones de Origen de España.
Cinco de estas Denominaciones de Origen pertenecen a Galicia: Bierzo, Valdeorras,

Ribeira Sacra y Ribeiro en el valle del Rio Miño; y Rías Baixas (Fig. 2), al suroeste de esta
comunidad autónoma. Estas 5 D.O.s producen anualmente en torno a 40 millones de
kilogramos de uva, un 85% de ellos de variedades blancas.
43
Concretamente, la región que da nombre a la D.O. Rías Baixas se caracteriza por tener
un clima, en general, templado sub-mediterráneo, con temperaturas en torno a los 20 ºC de
media en agosto y 18 ºC en septiembre, meses de maduración de la uva (Fuente: Xunta de
Galicia y AEMET), un grado menos, por ejemplo, que la media en la región vitivinícola de los
vinos de rueda, y dos grados menos que en la región de La Rioja.
Figura 2: Localización geográfica de la Denominación de Origen Rías Baixas y posición de la sub-

zona de Val do Salnés (1) dentro de la misma.
Dentro de esta D.O se establecen a su vez las sub-zonas Val do Salnés, Condado do
Tea, Rosal y Ribeira do Ulla, zonas influenciadas por el Océano Atlántico (Vilanova y
Vilariño, 2005), en las que predomina el cultivar Albariño, uno de los más antiguos de la
región, siendo actualmente una de las variedades de uva más apreciadas de España (Diéguez
et al., 2003; Juega et al., 2014).
A pesar de esta influencia generalizada del Océano Atlántico, las sub-zonas de esta
región vitivinícola presentan diferencias climáticas que influyen directamente en el desarrollo
de las vides, y con ello, en las características y la calidad del vino producido en cada una de
ellas (Lorenzo et al., 2013). Así por ejemplo, la región de Rosal se diferencia de la región de
Val do Salnés, estudiada en este trabajo, por presentar temperaturas nocturnas más bajas, a
pesar de tratarse ambas de zonas templadas, mientras que la región de Condado do Tea está
incluida en un área de clima cálido (Queijeiro et al., 2006).
44
1.2. Origen del exceso de acidez
La acidez del vino viene determinada por la presencia de dos ácidos principales: el
ácido tartárico y el ácido málico (Ribéreau-Gayón, 2006).
Estos suponen más del 90% del total de ácidos de la uva, donde tienen su origen. La
concentración de ácido tartárico es relativamente constante, mientras que la de ácido málico
oscila en función del grado y condiciones de maduración, mostrando su mayor concentración
en la baya verde, contenido que se va reduciendo a medida que avanza dicha maduración
(Hidalgo, 2002). En consecuencia, los problemas derivados de la presencia de ácido málico en
el vino serán más marcados en climas fríos, donde a menudo la maduración no es completa y
por lo tanto hay una mayor transferencia de ese ácido al caldo durante el estrujado (Volschenk
et al., 2006).
A pesar de que la D.O. Rias Baixas no se encuentra entre las consideradas “de clima
frio” (Volschenk et al., 2006), las bajas temperaturas que se dan en esta zona durante el periodo
de maduración de la uva inciden directamente en la concentración de ácido málico (Sieiro et
al., 1990), que a menudo se encuentra en concentraciones en torno a los 4 - 5 g/L al final de la
fermentación alcohólica (FA).
Otro aspecto determinante en la presencia del ácido málico en vino es el procesado del
mismo. Mientras que los vinos blancos sufren una etapa de desfangado previo a la FA, donde
son retirados todos los elementos sólidos de la uva, los vinos tintos realizan dicha etapa en
presencia de la piel de la uva u hollejo, lo que, al encontrarse más tiempo en contacto con el
caldo, favorece el traspaso del ácido málico al mismo.
Debido a esto, los problemas de acidez ocasionados por este ácido son más habituales
en vinos tintos, pero su importancia se pone también de manifiesto en diferentes vinos blancos
(Nisiotou et al., 2014), siendo este el caso de la variedad Albariño cunado se cultiva en la ya
mencionada sub-zona de Val do Salnés.
1.3. Control de la acidez de los vinos
Como se ha mencionado, en aquellos vinos en los que la concentración de cualquiera

de los ácidos orgánicos antes mencionados es excesiva se hace necesaria la reducción de la
45
misma, existiendo principalmente dos formas de llevar a cabo esta corrección: la aplicación
de métodos químicos, y la conducción de la fermentación maloláctica (FML) (Ribéreau-
Gayón, 2006).
1.3.1. Control químico
El mezclado de vinos ha sido el método tradicional escogido por los enólogos y

viticultores de todo el mundo como la herramienta principal para corregir la excesiva acidez
de los vinos. Como su nombre indica, consiste en la mezcla de vinos de elevada acidez con
otros con una acidez mucho más baja en la proporción adecuada para la obtención de la acidez
deseada (Fugelsang y Edwards, 2007).
Los métodos de control de la acidez puramente químicos están basados principalmente

en la adición de carbonato cálcico o de bicarbonato potásico. Estos se combinan con el ácido
tartárico formando una sal insoluble que precipita y puede ser eliminado. Dicha precipitación
se puede dar también reduciendo la temperatura del vino tras la FA por lo que, a menudo, la
adición de dichas sales se emplea para facilitar este proceso (Volschenk et al., 2006).
Estos métodos presentan ciertos riesgos: la adicción de carbonato cálcico puede

derivar en un exceso de calcio en el vino y con ello en que este precipite tras el embotellado;
la desventaja de la adición de bicarbonato potásico es que a menudo tiene efectos
imprevisibles, lo que obliga a un estudio previo en laboratorio (Ribéreau-Gayón, 2006).
Además, el empleo de estos dos compuestos está limitado a la corrección del exceso de ácido
tartárico, no siendo aplicable a vinos en los que la elevada acidez deriva de un exceso de ácido
málico (Volschenk et al., 2006).
1.3.2. Control biológico: fermentación maloláctica
1.3.2.1. Concepto y factores físico-químicos que afectan al desarrollo
La corrección biológica de la acidez del vino se produce principalmente por la

conversión de ácido L-málico en ácido L-láctico a través de la FML. Esto conlleva una
reducción de la acidez total y sin afectar, en general, a las concentraciones de ácido tartárico
del vino (Ribéreau-Gayón et al., 2006; Muñoz et al., 2011), en un proceso que se da
46
generalmente en vinos tintos aunque también puede tener lugar en determinados blancos como
el Chardonnay (Juega et al., 2014).
La FML es llevada a cabo por bacterias malolácticas cuando las condiciones de pH y

temperatura, y las concentraciones de etanol y SO2, son las apropiadas (Bravo-Ferrada et al.,
2014).
Las bacterias ácido lácticas (BAL), en general, tienen un pH óptimo para su desarrollo
con valores que oscilan entre 4,2 y 4,5. El pH del vino se encuentra habitualmente entre 3 y 4
siendo el primero cercano al valor límite para la degradación de ácido málico, que se encuentra
en torno a pH 3,2. Aunque la conducción de la FML en estos valores supone por lo general
una ralentización en su desarrollo, evita la producción de ácido acético, al estar inhibida la
asimilación de azúcares por debajo de pH 3,5 (Hidalgo, 2002; Ribéreau-Gayón et al., 2006).
La temperatura óptima para crecimiento de las BAL, así como para el desarrollo de la
FML en vino se encuentra entre los 20 y los 25 ºC. Estas bacterias pueden desarrollarse a
temperaturas por debajo de estas temperaturas, aunque con una menor tasa de crecimiento, lo
que permite la conducción de dicha fermentación a las temperaturas habitualmente empleadas
en bodega, aunque de forma más lenta (van de Guchte et al., 2002; du Toit et al., 2011)
Las bacterias malolácticas son especialmente sensibles al proceso del sulfitado del
vino. Este proceso se realiza mediante la adición de metabisulfito potásico, de forma que
eliminan las bacterias que lo pueden deteriorar, mientras que se permite el desarrollo de las
levaduras, lo que tiene como consecuencia que, incluso a bajas concentraciones de SO, el
desarrollo de la FML puede verse afectado o incluso inhibido (Du Toit y Pretorius, 2000).
La presencia de etanol en el vino modifica la estructura de las paredes celulares de las

BAL, aumentando su permeabilidad y con ello la perdida de compuestos intracelulares (Bravo-
Ferrada et al., 2013). A partir de una concentración del 8% de etanol se empiezan a manifestar
estos efectos en las células, pero muchas especies de BAL son capaces de alterar sus paredes
celulares, incrementando también la concentración de etanol que son capaces de resistir
(Hidalgo, 2002).
Una adecuada selección de las cepas de bacterias malolácticas en base a su resistencia

a los parámetros anteriormente mencionados, facilita, por lo tanto, un correcto desarrollo de la
FML.
47
1.3.2.2. Impacto en vinos
1.3.2.2.1. Reducción de la acidez
La presencia desequilibrada de ácidos en el vino da lugar a sabores que habitualmente

se describen como inmaduros, verdes, o ácidos. La fermentación maloláctica es un proceso de
desacidificación biológica de los vinos consistente en la descarboxilación del ácido málico en
ácido láctico y CO2, dando lugar a una reducción en la acidez total del vino y a un ligero
aumento del pH (Ribereau-Gayon y Maujean, 2006).
El ligero incremento del pH del vino como consecuencia de la FML tiene efectos
colaterales en las características organolépticas del mismo. La conversión de ácido málico
sustituye el sabor agresivo de este por la acidez mucho más suave del ácido láctico (Lonvaud-
Funel, 1999).
1.3.2.2.2. Modificación del perfil aromático, color y textura
Además de la reducción de la acidez, las bacterias malolácticas pueden metabolizar

otros compuestos presentes en el vino, alterando la composición del mismo y aportando una
mayor complejidad en el aroma y el sabor (Sumby et al., 2014).
Por ejemplo, moléculas como terpenos, alcoholes alifáticos o norisoprenoides, se

encuentran formando glucósidos que no pueden ser detectados en la cata (Grimaldi et al.,
2005). Algunas BAL son capaces de romper los enlaces que mantienen unidas a estas
sustancias aromáticas gracias a la presencia de enzimas glucosidasas (Palmeri y Spagna, 2007;
Juega et al., 2013).
Del mismo modo, la presencia de enzimas esterasas, implicadas en la síntesis e

hidrolisis de esteres, también aporta al vino determinadas características organolépticas en
base a las diferentes concentraciones de esteres tras la FML (Liu, 2002).
A pesar de que, como se ha descrito, la FML es considerada habitualmente un proceso

favorable, en ciertas condiciones puede repercutir negativamente en la calidad del vino,
especialmente si se da de forma incontrolada.
48
En este sentido, destaca la capacidad de algunas BAL para liberar compuestos

fenólicos volátiles, que se encuentran de forma natural formando hidroxicinamatos, sustancias
imperceptibles al gusto y al olfato, pero pueden aportar sabores y aromas indeseados tras su
descarboxilación y reducción, y la consiguiente liberación de ácidos hidroxicinámicos (de las
Rivas et al., 2009; Sumby et al., 2014). Estos compuestos fenólicos tienen también una
incidencia directa sobre la astringencia del vino (Muñoz et al., 2011).
Por otra parte, la producción de diacetilo y acetoína por parte de las especies
heterofermentativas, como consecuencia del metabolismo del ácido cítrico, proporciona
aromas a mantequilla que son considerados negativos cuando sobrepasan los 5‐6 mg/L en los
vinos blancos y 8‐9 mg/L en los tintos (Liu, 2002).
En líneas generales, el desarrollo de la FML suele conducir a una reducción de los

aromas herbáceos, que son sustituidos por aromas más afrutados y mantecosos, en la medida
que se permita la liberación o formación de esteres y diacetilo. Otros aromas como los florales,
tostados, amargos o avainillados también pueden, en ocasiones, ser atribuidos a esta
fermentación (Muñoz et al., 2011).
La textura y el color del vino también se pueden ver afectadas durante el desarrollo de
la FML (Lonvaud-Funel, 1999; Muñoz et al., 2011).
Ciertas cepas de Pediococcus damnosus pueden dar lugar a un incremento indeseado

de la viscosidad del vino por la producción de polisacáridos, lo que puede afectar al “cuerpo”
del mismo e incluso a la etapa de filtrado, durante el su procesado (Liu, 2002).
El color puede verse afectado por una excesiva desacidificación, llevando a la

aparición de tonos azulados en el vino, en sustitución del color rojo esperado (du Toit y
Pretorious, 2000).
1.3.2.2.3. Estabilidad microbiológica
El incremento en la estabilidad microbiológica del vino está directamente relacionado

con el consumo y eliminación de los nutrientes que podrían ser metabolizados por
microorganismos indeseados. Entre estos se encuentran los ácidos cítrico y málico,
49
aminoácidos, vitaminas o azúcares residuales que no hayan sido empleados por las levaduras
durante la FA o liberados por las mismas durante su lisis (Volschenk et al., 2006).
Además, numerosas especies de BAL son capaces de producir compuestos

antimicrobianos capaces de inhibir el desarrollo de agentes contaminantes como hongos
filamentosos o levaduras (Rouse et al., 2007; Reis et al., 2012; Crowley et al., 2013).
1.3.2.2.4. Seguridad del producto
En adición al control de los efectos organolépticos anteriormente descritos, se ha de

garantizar también la seguridad del producto. Para ello, se han de evitar cepas productoras de
compuestos prejudiciales para la salud humana, como las aminas biógenas (ABs) o pro
carcinógenos como el carbamato de etilo (Leroy y De Vuyst, 2004).
La síntesis de ABs responde principalmente al proceso de descarboxilación de

aminoácidos por parte de los microorganismos presentes en el vino. Las bacterias acéticas, los
hongos filamentosos, las levaduras y las BAL han demostrados tener capacidad de síntesis de
estos compuestos nitrogenados (Smit et al., 2008), sin embargo, son los dos últimos grupos
microbianos los principales responsables de su producción. Los géneros de BAL
especialmente implicadas en dicha síntesis son Pediococcus, y Lactobacillus. Diferentes cepas
de Lactobacillus hilgardii han sido asociadas con la formación de histamina y putrescina en
vinos (Smit et al., 2008; Nannelli et al., 2008). O. oeni, principal especie implicada en
procesos de vinificación, también ha sido descrita como especie productora de ABs por
numerosos autores (Marcobal et al., 2004; Lucas et al., 2008).
La concentración de ABs en vinos no está en la actualidad regulada en la Unión

Europea por lo que en la mayoría de los países que la conforman solo existen recomendaciones
en cuanto al límite de concentración de estos compuestos. Así por ejemplo, el límite
recomendado de concentración para la histamina en Alemania es de 2 g/L, para Bélgica de
entre 5 y 6 g/L, de 8 g/L en Francia y de 10 g/L en Suiza (Landete et al., 2005; Yildirim et al.,
2007).
50
Estas restricciones responden a estudios que establecen la concentración de 20 mg/L

como el límite a partir del cual se pueden dar efectos sobre la salud del consumidor (Marcobal
et al., 2004).
El carbamato de etilo, es otro compuesto cuya producción ha de ser evitada por tratarse
de una sustancia pro carcinógena (Lonvaud-Funel, 1999). A pesar de que es producido
mayormente por las levaduras, algunas BAL pueden también originarlo a través del
metabolismo de la arginina (Volschenk et al., 2006).
1.3.2.3. Biodiversidad de BAL
Las BAL implicadas en los procesos de vinificación se engloban, principalmente,

dentro de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus y Pediococcus. De todos ellos,
es probablemente el género Oenococcus el más estudiado y principal conductor de la FML en
vinos de todo el mundo, y más concretamente la especie O. oeni (Torriani et al., 2001; du Toit
et al., 2011) siendo, además, componente principal de la mayor parte de los cultivos
iniciadores comerciales.
El género Lactobacillus, es el segundo género más habitualmente encontrado en

procesos de vinificación, especialmente en aquellos vinos de pH superior a 3,5, en los que,
junto con especies del género Pediococcus, dominan sobre el resto de BAL (du Toit et al.,
2011). La presencia de estos microorganismos en el vino ha sido históricamente considerada
negativa para la calidad del mismo, sin embargo, en la actualidad se está poniendo énfasis en
el estudio de especies de estos géneros y su aplicación para la conducción de la FML (Juega
et al., 2014; Bartowsky et al., 2015).
Además de los géneros anteriormente mencionados, se ha descrito la presencia de

otros géneros vinculados a vino, como Lactococcus, Leuconostoc o Weissella (Valdés La Hens
et al., 2014; Nisiotou et al., 2015).
1.3.2.4. Dinámica poblacional
Las BAL están presentes durante todos los pasos que llevan a la transformación del
mosto o zumo de uva en vino. Su principal fuente se encuentra en las uvas y hollejos, pero un
51
importante número puede provenir de los utensilios empleados o de las cubas en última
instancia (Muñoz et al., 2011).
A lo largo de todo el procesado del vino se pueden apreciar variaciones en las

dinámicas poblacionales de las bacterias lácticas (Fig. 3). Esto es debido principalmente a los
cambios en la composición química del vino en cuanto a la composición de azúcares y
concentración de etanol, así como a la disponibilidad de nutrientes, partiendo de una densidad
de BAL en el mosto y fases tempranas de la FA en un rango de entre 102 y 104 UFC/mL.
Una vez comenzado el desarrollo de las levaduras y la consiguiente liberación de

etanol como consecuencia de la FA, la densidad de bacterias lácticas se ve reducida
drásticamente hasta aproximadamente 102-103 UFC/mL en las primeras fases de la FA
pudiendo caer hasta las 102 UFC/mL al término de la misma. Este desplome en términos de
densidad celular se ve reflejado también en una caída en la variedad de especies de BAL.
Fin de la FML
Log (UFC/mL)
Inicio de la FML
FA
Latencia
Días
Figura 3: Evolución de la población de BAL en las diferentes fases de vinificación (Ribéreau-Gayón

et al., 2006).
Terminada la fermentación, las bacterias comienzan a multiplicarse debido a la

presencia de nutrientes derivados de la lisis de las levaduras y a unas condiciones de pH y
temperatura más adecuadas para su desarrollo. En este punto, las bacterias lácticas alcanzan
52
un pico de densidad poblacional de en torno a las 106 - 107 UFC/mL y, en caso de tratarse de
las cepas apropiadas (la capacidad de asimilación y transformación del ácido málico es
variable en función de la cepa bacteriana -Sumby et al., 2014- ), comienzan la FML, que durará
entre 5 días y 2-3 semanas (Muñoz et al., 2011).
La alternancia que se da entre levaduras y bacterias asegura unas óptimas condiciones

de vinificación, ya que la asimilación de los azúcares por parte de las primeras impide que las
bacterias empleen la ruta heterofermentativa para asimilarlos, lo que incrementaría la acidez
volátil del caldo (Ribéreau-Gayón et al., 2006).
Del mismo modo que existe una alternancia bacteria-levadura durante las etapas de
elaboración del vino, también se da una alternancia entre grupos bacterianos, principalmente
entre bacterias heterofermentativas y homofermentativas. Aunque la supervivencia de unas u
otras especies bacterianas depende principalmente de su adaptabilidad a las duras condiciones
de acidez y grado alcohólico del medio (Ribéreau-Gayón et al., 2006), en líneas generales
predominan las especies homofermentativas en las primeras fases del procesado (por ej. las
pertenecientes al género Pediococcus), que darán paso a las especies heterofermentativas,
habitualmente Lactobacillus, Leuconostoc y/u Oenococcus, pero sin que las primeras lleguen
a desaparecer completamente (Blasco-Escrivá, 2009).
Como es obvio, estas densidades poblacionales están estrictamente relacionadas con

numerosos parámetros implicados en la vinificación, como las condiciones climáticas de la
región, las técnicas empleadas en el proceso de elaboración o las características específicas de
cada vino (Ribéreau-Gayón et al., 2006).
1.3.3. Fermentación malo-alcohólica con Schizosaccharomyces pombe
El empleo de levaduras del género Schizosaccharomyces ha sido también estudiado

para la corrección del exceso de acidez en vinos. Éstas son capaces de llevar a cabo la
degradación del ácido málico a través de un proceso denominado fermentación malo-
alcohólica, que conduce a la transformación de entre un 75% y un 100% de este ácido orgánico
en etanol (Suárez-Lepe et al., 2012). Sin embargo, es la producción de ácido acético
nuevamente el mayor inconveniente para su empleo (Benito et al., 2013), sumado a que la
53
temperatura óptima a la que lleva a cabo esta fermentación está en torno a 30 ºC, lo que podría
afectar negativamente a las características del vino (du Toit y Pretorius, 2000).
1.3.4. Enzima maloláctico
Otra opción que ha sido objeto de estudio para llevar a cabo la FML ha consistido en
la adición directa de la enzima maloláctica al vino. Esto tiene obvias ventajas al no existir la
posibilidad de desarrollo de ninguno de los aspectos negativos derivados del metabolismo de
las BAL, pero parece que su funcionamiento en las condiciones del vino no es el óptimo, al
verse inhibida por numerosas componentes del mismo (Ribéreau-Gayón et al., 2006).
La aplicación de esta enzima inmovilizada parece mejorar la estabilidad de la misma,

pero el hecho de que su pH óptimo se encuentre en torno a 6, y la necesidad de adición de
cofactores para el que la enzima desarrolle su actividad (Maicas, 2001), supone un hándicap
en su aplicación en procesos de vinificación (Sumby et al., 2014).
1.3.5. Mejora genética de cepas vínicas
La aplicación de técnicas de ingeniería genética ha intentado en los últimos años dar

solución a una parte de la problemática anteriormente mencionada.
Betteridge et al. (2015) han recopilado recientemente las principales técnicas de

mejora genética en O. oeni. En líneas generales, los principales mecanismos de mejora
genética incluyen las técnicas de genética molecular que conducen a la sobreexpresión de
genes de interés propios o a la expresión de genes ajenos a la especie bajo estudio, la
mutagénesis, que produce mutaciones al azar (y exige la consiguiente selección de los aislados
con las características deseadas), la evolución dirigida (mediante la que se inducen cambios
fisiológicos a través de la multiplicación continuada de estos organismos), y el “genome
shuffling”, técnica empleada principalmente para la obtención de cepas con características
deseadas a partir de la combinación de las características de su cepas parentales, generalmente
por fusión de protoplastos.
Desde hace aproximadamente 20 años, se han llevado a cabo estudios para la

clonación del gen maloláctico en diferentes especies (Sumby et al., 2014), con la finalidad de
54
obtener buenos rendimientos malolácticos evitando las desventajas del uso de cepas de BAL.
Este desvío de recursos hacia este campo da idea de las dificultades para conseguir una cepa
maloláctica óptima para su empleo en procesos de vinificación.
La introducción de genes malolácticos en cepas vínicas no está exenta de problemas,

siendo el principal que la enzima maloláctica resultante de su expresión es intracelular. Esto
obliga a la entrada del ácido málico en el interior celular en un proceso llevado a cabo por
proteínas transportadoras (Ribereau-Gayon, 2006) que han de estar presentes en la célula, o
expresarse junto con el gen maloláctico, lo que, o bien reduce el abanico de cepas receptoras,
o complica clonación.
En este sentido, se están llevando a cabo numerosos intentos de clonación de este gen
en cepas de Lactobacillus que ya dispongan de la proteína transportadora. Schümann et al.
(2013), consiguieron expresar un gen maloláctico de O. oeni en una cepa de L. plantarum pero,
aunque consiguieron la conversión del ácido málico sin necesidad de una adaptación previa
de las células a las condiciones del vino, la expresión de la enzima maloláctica fue inhibida
rápidamente.
No sin detractores, la mayor barrera que alguna de estas técnicas y los productos de
las mismas encuentran para su aplicación son las restricciones legales presentes en la mayor
parte de los países productores de vino del mundo, así como la reticencia de la sociedad al
consumo de organismos modificados genéticamente o sus derivados.
1.4. Tecnología de la fermentación maloláctica
1.4.1. Fermentación espontánea
El desarrollo de la FML puede tener lugar de forma espontánea si no se ejerce un

control sobre las condiciones de almacenamiento y/o de la microbiota asociada al vino
pudiendo conllevar, como se ha dicho, serios riesgos de un detrimento de su calidad.
En numerosas bodegas se permite su desarrollo de forma intencionada, sin embargo,

su consecución es a menudo variable, siendo habitual que esta no se desarrolle completamente,
que sea extremadamente lenta, o que tan siquiera se inicie (Ribéreau-Gayón et al., 2006; Ruiz
et al., 2010; du Toit et al., 2011).
55
1.4.2. Fermentaciones dirigidas con cultivos iniciadores
La alternativa al problema referido previamente es la inducción de la FML con cultivos

iniciadores. Esto supone la adicción de las bacterias malolácticas en forma líquida o
deshidratada que pueden tener su origen en la propia bodega, a través del aislamiento y
selección de los mismos, o bien tratarse de cultivos iniciadores comerciales.
Existen en el mercado multitud de productos basados en BAL para la conducción de

la FML. Marcas como AEB Ibérica, Lallemand o Laffort, entre otras, han desarrollado
numerosos cultivos iniciadores, la mayor parte de ellos basados en O. oeni.
Sin embargo, el mal funcionamiento de esta especie en determinados vinos ha hecho

que, en la actualidad, alguna de estas empresas este introduciendo en el mercado cultivos
iniciadores basados en especies de Lactobacillus, o cultivos mixtos. Así por ejemplo, AEB
ibérica ha optado por la inclusión en sus estárteres de hasta 4 cepas de O. oeni a fin de
garantizar una FML satisfactoria en un rango más amplio de condiciones de vinificación.
Anchor Wine Yeast ha desarrollado cultivos iniciadores que incluyen cepas de O. oeni y L.
plantarum con los que garantizan la no formación de ácido acético o aminas biógenas y
Lallemand cuenta con ML Prime™ a base exclusivamente de L. plantarum, con el que afirman
degradar ácido málico en concentraciones de 3 g/L, pero a valores de pH de 3,4, y entre 20 y
26 ºC.
1.4.2.1. Momento de la inoculación
Existen dos modalidades principales para conseguir una FML dirigida: la inoculación
con bacterias malolácticas durante las primeras etapas de la FA, es decir, co-inoculadas con la
levadura, o al final de la misma (post-FA) (du Toit et al., 2011; Bartowsky et al., 2015). Ambas
prácticas presentan ventajas e inconvenientes, por lo que su empleo ha de establecerse en base
a las características de cada vino y/o de la cepa o especie de bacteria láctica empleada.
La inoculación post-FA minimiza la interacción entre las bacterias y las levaduras,

reduciendo el riesgo de inhibición mutua del crecimiento y con ello de una parada de la FA o
el no inicio de la FML. En cambio, se corre el riesgo de que, de no existir una adaptación
previa a las condiciones de vinificación, se ralentice el inicio de la FML, permitiendo el
desarrollo de microorganismos indeseados (Fugelsang y Edwards, 2007).
56
La co-inoculación permite la adaptación de las bacterias lácticas a las condiciones del

vino, lo que, en general, acelera el desarrollo de la FML (Bartowsky et al., 2015). Sin embargo,
si no se realiza una selección apropiada, puede interferir en el desarrollo de las levaduras o dar
lugar a un incremento de la acidez a través de la producción de ácido acético. Es por esto, que
esta modalidad está más indicada para vinos de elevada acidez y alta concentración de azúcares
(y la consiguiente alta concentración de etanol al final de la FA) (Sumby et al., 2014).
Abrahamse y Bartowsky (2012) analizaron los efectos de la co-inoculación de O. oeni

(Viniflora oenos™), así como de la inoculación a la mitad de la FA y al final de la misma, en
vino tinto Shiraz, obteniendo como resultado una más rápida FML en el primer caso, sin
afectar al desarrollo de las levaduras. Paralelamente se registraron concentraciones de ácido
acético superiores a las de aquellos vinos sin FML, aun siendo este incremento similar en las
dos modalidades de inoculación.
Respecto a este último parámetro, Guzzon et al. (2013) obtuvieron resultados

similares tras estudiar el efecto de la co-inoculacion con varios preparados de bacterias
malolácticas comerciales en vinos Merlot, Cabernet Sauvignon, Teroldego y Marzemino.
Ésta producción de ácido acético parece ser la principal causa de que el sector
vitivinícola este dividido entre los que apoyan esta práctica y los que la rechazan, ya que la
mayor parte de los estárteres comerciales están basados en cepas de la especie O. oeni, especie
heterofermentativa que puede dar lugar a ácido acético a través del metabolismo de los
azúcares del mosto (Bartowsky et al., 2015).
La alternativa sería el empleo de especies homofermentativas o heterofermetativas

facultativas como L. plantarum, evitando así el riesgo de producción de dicho ácido
(Ribéreau-Gayón et al., 2006). Así por ejemplo, empresas como Lalleman o Anchor Wine
Yeast reservan para co-inoculación los cultivos iniciadores que contienen cepas de L.
plantarum.
1.5. Problemática en la consecución de la FML
La inducción de la FML con cultivos iniciadores comerciales es una de las

herramientas más empleadas para la reducción de la acidez en vinos de todo el mundo. Sin
embargo, esta práctica no está exenta de problemas.
57
Como se ha mencionado, los estárteres comerciales a menudo están compuestos por

una sola cepa bacteriana o una única especie (generalmente O. oeni). Los requerimientos
nutricionales de ésta pueden verse o no satisfechos en función del vino en el que sea inoculado,
lo que hace que en ocasiones la FML no sea satisfactoria o no llegue a iniciarse.
A esto hay que sumar que, cuando estos cultivos iniciadores se inoculan tras la FA,
generalmente requieren de un período de latencia más largo, debido a la necesidad de las
células bacterianas de adaptarse a unas duras condiciones para su desarrollo. Este período
supone un riesgo de proliferación de organismos indeseados, prolongando además el tiempo
de consecución de una FML aceptable (Abrahamse y Bartowsky, 2012).
1.6. Obtención de cultivos iniciadores
Para la consecución de una FML satisfactoria han de seleccionarse bacterias

malolácticas que respondan adecuadamente a las condiciones de pH, temperatura y
concentración de etanol y SO2 que se van a encontrar una vez sean inoculadas, especialmente
en cultivos iniciadores que vayan a ser inoculados en etapas posteriores a la FA, al no existir
la posibilidad de adaptación de éstos a dichas condiciones (du Toit et al., 2011).
Sumado a esto, se ha de garantizar la seguridad del cultivo iniciador evitando aquellos

que produzcan aminas biógenas o carbamato de etilo, y aquellas que lleven a un detrimento de
la calidad final del producto. En este sentido se ha de analizar la capacidad de las mismas para
liberar compuestos aromáticos indeseados, o para alterar las características del vino en cuanto
a color y textura (Volshenk et al., 2006) del modo que se ha descrito anteriormente.
Cuando los cultivos iniciadores van a ser empleados en co-inoculación, adquiere una
especial importancia la selección de cepas homofermentativas debido a la presencia de
azúcares en elevadas concentraciones. El empleo de estos azúcares por parte de las cepas
heterofermentativas a menudo desemboca en la producción de ácido acético, y con ello de un
incremento indeseado de la acidez del vino. Del mismo modo, las bacterias inoculadas en esta
modalidad han de ser compatibles con la levadura conductora de la FA, a fin de evitar la
inhibición del crecimiento de las bacterias malolácticas por esta (Fugelsang y Edwards, 2007).
58
Si, además, se pretende comercializar el estárter, es recomendable que la cepa soporte

los procesos de liofilizado, ya que, aunque también puede distribuirse en forma líquida, lo
habitual es su comercialización en polvo (González et al., 2011; du Toit et al., 2011).
El aislamiento de cepas de bacterias lácticas asociadas al propio vino en el que serán

inoculadas supone, a menudo, la mejor opción a la hora de conducir la FML. Estas cepas están
adaptadas a las condiciones de vinificación, siempre que se haga un mantenimiento adecuado
de las mismas, reduciendo así el tiempo de desarrollo en el vino, y con ello, favoreciendo una
FML más eficiente (La Hens et al., 2014; Sumby et al., 2014).
59
CAPÍTULO I Materiales y Métodos
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Medios de cultivo
Medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe 1960, Panreac): Peptona 10 g/L, Extracto de
carne 5 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, D (+)-Glucosa 20 g/L, Di-potasio hidrogeno fosfato
2 g/L, Di-amonio hidrogeno citrato 2 g/L, Acetato sódico 5 g/L, Sulfato de magnesio 0,1 g/L,
Sulfato de manganeso 0,05 g/L, pH 6,5. Este medio fue suplementado con jugo de tomate
(10%) cuando fue necesario. Para la elaboración de medio sólido se añadió una concentración
de 15 g/L de agar.
Medio MLO (Medio para Leuconostoc oenos; Caspritz y Radler, 1983): Triptona 10
g/L, Extracto de levadura 5 g/L, Glucosa 10 g/L, Fructosa 5 g/L, Sulfato de magnesio 0,2 g/L,
Sulfato de manganeso 0,05 g/L, Citrato de diamonio 3,5 g/L, 1 ml de Tween 80, Cisteína HCl
0,5 g/L, ácido l-málico 10 g/L, pH 5,5. Cuando fue necesario se solidificó con agar a una
concentración de 20 g/L.
“Agar Vino” (diseñado en nuestro laboratorio): se preparó un medio utilizando como

base el mismo vino empleado en el estudio. Para ello se ajustó el pH del mismo a 4,5, mediante
la adición de NaOH 10N y se esterilizó a través de membranas con un tamaño de poro de 0,22
µm. Cuando fue necesario solidificarlo, se esterilizó en autoclave la cantidad apropiada de
agar, disuelta en agua, (1,5% p/v del total de vino empleado). Paralelamente, se mantuvo el
vino en incubación a 50 ºC en un frasco con tapón de rosca (minimizando así la evaporación
de alcohol) a fin de evitar la solidificación inmediata del agar al añadirlo al mismo, y
permitiendo una mezcla homogénea.
Todos los medios, excepto el que incluye vino natural, fueron esterilizados en
autoclave a 121 ºC durante 15 min, 1 atm de presión.
Los medios de cultivo destinados al aislamiento de bacterias ácido lácticas fueron

suplementados con 100 µg/mL de cicloheximida (CH) para evitar la proliferación de levaduras
y hongos filamentosos.
60
2.2. Aislamiento de bacterias ácido lácticas
Para llevar a cabo el muestreo se escogió la Bodega Condes de Albarei en la región

del Salnés perteneciente a la D.O Rías Baixas. Esta bodega fue seleccionada ya que funciona
en régimen de cooperativa y recibe uvas de las diferentes sub-zonas que componen la citada
región, todas ellas pertenecientes a la variedad Vitis vinifera Albariño.
Durante dos cosechas consecutivas (años 2007 y 2008), se tomaron muestras de 1L de

diferentes tanques de la bodega correspondientes a las etapas de: mosto sulfitado (M),
fermentación alcohólica (FA) y fermentación maloláctica (FML). Las muestras se
centrifugaron a 22000 x g, durante 10 min a 4 ºC. Obtenido el precipitado, éste fue
resuspendido en 10 mL de solución salina (NaCl 0,8%), volumen que fue posteriormente
dividido en 3 alícuotas de 3 mL que serían tratadas independientemente. La primera de las
alícuotas fue conservada a -20 ºC. Las otras dos alícuotas fueron empleadas para llevar a cabo
una siembra directa en placas de MRS y MLO suplementadas con CH (200 µL de muestra por
placa) e incubadas en anaerobiosis a 30 ºC durante 5 días.
Una primera selección de los aislados de presuntas bacterias malolácticas fue realizado
en base a su morfología celular, a su carácter Gram, y a la reacción frente a peróxido de
hidrógeno (catalasa). Se seleccionaron bacterias de forma cocoide o bacilar, Gram-positivas y
catalasa negativas.
2.3. Otras cepas bacterianas utilizadas en este estudio
Los métodos de identificación y caracterización que se describen a continuación tienen

su base en la comparación tanto de secuencias de ADN como de características bioquímicas
de los aislados de hipotéticas bacterias malolácticas frente a aislados de especies conocidas,
para lo cual se emplearon las cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Tabla
1):
61
Tabla 1: Cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo empleadas en la

identificación de los aislados de bacterias lácticas.
Especie Cepa
Lactobacillus brevis CECT 5354

Lactobacillus casei CECT 475
Lactobacillus helveticus CECT 403
Lactobacillus hilgardii CECT 4786
Lactobacillus paraplantarum CECT 5787
Lactobacillus pentosus CECT 4023
Lactobacillus plantarum CECT 220
Lactobacillus rhamnosus CECT 288
Lactobacillus paracasei subsp. tolerans CECT 4175
Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 185
Oenococcus oeni CECT 217
Pediococcus damnosus CECT 793
2.4. Conservación de los aislados bacterianos
Las cepas fueron conservadas en medio MRS o MLO suplementado con un 30% de
glicerol, a una temperatura de -20 ºC.
2.5. Elaboración del perfil bioquímico de asimilación de azúcares
Se empleó el kit comercial API® 50CHL (bioMérieux® SA). Para ello se inoculó el
medio incluido en el kit con una concentración celular correspondiente al grado 2 de la escala
de McFarland, proveniente de un cultivo crecido previamente en medio MRS a 30 ºC durante
2-7 días en función de la especie.
Se añadió este medio a las celdillas en la cantidad apropiada y se cubrieron con aceite
de parafina estéril para crear una atmosfera anaerobia. La incubación se realizó a 30 ºC y la
lectura se llevó a cabo tras 48 h, agrupando los aislados en base a la tabla de identificación
proporcionada por el fabricante.
62
2.6. Manipulación de ácidos nucleicos
2.6.1. Extracción de ADN
Para la extracción del ADN cromosómico, las bacterias fueron cultivadas durante 5 -
7 días en tubos con 10 mL de medio MRS suplementado con un 10% de jugo de tomate, a 30
°C. Un mililitro de cada cultivo fue transferido a viales Eppendorf y centrifugado a 14000 x g
durante 5 minutos (Microfuge® 22R Centrifuge, Beckman Coulter™). Una vez eliminado el
sobrenadante, el sedimento fue tratado con el kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit
(Promega).
Para ello las células se resuspendieron en 480 µL de EDTA (50 mM, pH 8), incluyendo
en este punto un paso consistente en un choque térmico, realizando un ciclo previo de
congelación/descongelación (-80 °C, 5 min; 80 °C, 5 min) para, en adelante, continuar con los
pasos indicados en dicho kit.
2.6.2. Amplificación del ADNr 16S
Para la amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) del fragmento

codificante del ADNr 16S bacteriano se preparó la siguiente mezcla de reacción en un volumen
total de 100 µL: 40-50 ng de ADN, 8,8 µM de cebador directo (5'- CCGAATTCGTC
GACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'), 8,8 µM de cebador inverso (5’- CC
CGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACCT -3'), empleados previamente por
Weisburg et al. (1991), 5 mM de mezcla de los 4 oligonucleótidos, 2 mM de MgCl2, 2,5 U de
Taq Polimerasa (BIOTAQ DNA polimerasa, Bioline).
Las condiciones utilizadas para amplificación utilizando un termociclador (Primus 96

plus, MWG AG Biotech) fueron: 1 ciclo a 95 °C durante 1 min para la desnaturalización
inicial, 30 ciclos de: 95 °C durante 1 min para la desnaturalización cíclica, 62 °C durante 1:30
min para hibridación, 72 °C durante 1:30 min para la elongación, y un último ciclo a 72 °C
durante 5 min para la elongación final.
63
2.6.3. Amplificación de la región espaciadora intergénica (ISR) 16S/23S
Para la amplificación de esta región del ADN bacteriano se empleó el método descrito
anteriormente por Moreira et al. (2005). Los cebadores empleados fueron: 16-1A: 5’-
GAATCGCTAGTAATCG -3’ como directo y 23-1B: 5’- GGGTTCCCCCATTCGGA -3’
como reverso.
La mezcla de reacción empleada fue la misma que para la amplificación del ADNr
16S y las condiciones de amplificación utilizadas fueron: 94 ºC durante 2 min, 35 ciclos de:
94 ºC durante 30 s, 55 ºC durante 1 min, 72 ºC durante 1 min, y una elongación final a 72 ºC
durante 10 min, en el termociclador Primus 96 plus, MWG AG Biotech.
En esta amplificación se observaron 3 bandas de diferente tamaño debido a que en

ocasiones esta región puede contener 1 o 2 genes, dependiendo de la especie (Moreira et al.
2005). La banda de tamaño más pequeño se correspondería con dicha región sin genes, la
banda de tamaño mediano se correspondería con el ISR más un gen, y la banda de mayor
tamaño se correspondería con el ISR más dos genes. Por ello se aisló, a partir del gel de
agarosa, la banda de 600 pares de bases (pb), correspondiente con la secuencia sin la inserción
de ningún gen, y que fue purificada con el kit Geneclean® Kit (MP Biomedicals, LLC).
2.6.4. Amplificación del gen recA
Para la amplificación del gen recA se empleó el método descrito por Torriani et al.
(2001). Se realizaron dos tipos de PCR, una múltiple con cebadores específicos de especie y
una PCR estándar con cebadores degenerados.
Los cebadores específicos de especie empleados fueron:
- paraF: 5’-GTCACAGGCATTACGAAAAC-3’ (Directo), específico de la especie L.

paraplantarum.
- pentF: 5’-CAGTGGCGCGGTTGATATC-3’ (Directo), específico de la especie L.
pentosus.
- planF: 5’-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3’ (Directo), específico de la especie L.
plantarum.
- pREV: 5’-TCGGGATTACCAAACATCAC-3’ (Reverso)
64
La mezcla de reacción se preparó en un volumen de 25 µL, a los que se añadieron 40

ng de ADN bacteriano. El resto de componentes de la mezcla de reacción fueron añadidos a
las concentraciones siguientes: cebadores paraF, pentF y pREV a 0,25 µM cada uno, el
cebador planF a 0,12 µM, 12 µM de la mezcla de los 4 oligonucleótidos (3 µM cada uno), 1,5
mM de MgCl2 y 1 U de Taq Polimerasa (BIOTAQ DNA polimerasa, Bioline).
Las condiciones utilizadas para la amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94

ºC durante 3 min, 30 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC, 30 s, anillamiento a 56 ºC, 10 s,
elongación: 72 ºC, 30 s, y extensión final a 72 ºC durante 5 min.
Los cebadores degenerados empleados fueron: RecAFw: 5’- TTYATH

GAYGCNGARCAYGC -3’ y RecARev: 5’- CCWCCWGKWGTHGTYTCNGG -3’. Las
condiciones de amplificación fueron las siguiente: desnaturalización inicial a 94 ºC durante 1
min, 30 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC, 1 min; anillamiento a 55 ºC, 1 min y 30 s y
elongación a 72 ºC durante 1 min, con una extensión final a 72 ºC durante 5 min.
La mezcla de reacción consistió en 50 ng de ADN, 50 µM de cada cebador, 100 µM

de la mezcla de oligonucleótidos, 50 mM de MgCl2 y 2,5 U Taq Polimerasa, en un volumen
total de 25 µL.
2.6.5. Purificación de fragmentos de ADN a partir de gel de agarosa
Los productos de las amplificaciones de ADN por PCR fueron, en ocasiones,

purificados a partir de geles de agarosa a fin de llevar a cabo re-amplificaciones sin secuencias
de ADN interferente o no deseado y/o el corte con enzimas de restricción.
Para ello, la banda que contenía el ADN de interés fue cortada con una cuchilla y el
fragmento depositado en un vial Eppendorf de 1,5 mL, y tratado con el kit Geneclean ® Kit
(MP Biomedicals, LLC).
2.6.6. Secuenciación
Las secuencias de ADN amplificado y purificado fueron secuenciadas mediante el

método de Sanger (Sambrook y Russell, 2001).
65
2.6.7. Digestión de ácidos nucleicos con enzimas de restricción
El fragmento de ADN correspondiente a la región codificante para el ADNr 16S

bacteriano fue digerido con las enzimas de restricción MseI, BfaI, AluI, HaeIII, BtgZI (New
England Biolabs® INC.) y la región ISR 16S-23S con VspI (Fermentas).
La selección de estas enzimas de restricción, en base a las referencias mostradas en la

Tabla 2, fue complementada con el corte in sílico de las secuencias de interés mediante el
programa pDRAW32.
Tabla 2: Enzimas de restricción empleadas en los análisis ARDRA.
Temp. Secuencia
Enzima Concentración BSA Tiempo Sitio de corte Referencia
(ºC) diana
MseI 2U 100 1 hora 37 T▼TAA 16S Rodas et al.

µg/ml (2003)
BfaI 2U - 1 hora 37 C▼TAG 16S Rodas et al.
(2003)
▼
AluI 2U - 1 hora 37 AG CT 16S Rodas et al.
(2005)
HaeIII 2U - 1 hora 37 GG▼CC 16S Rodas et al.
(2005)
BtgZI 2U 100 2 horas 60 GCGATG(N)10▼ 16S Este estudio
µg/ml
VspI 1 µL - 10 min. 37 AT▼T AAT ISR Moreira et al.
(2005)
La enzima BtgZI se seleccionó en base al alineamiento de las secuencias de ADNr 16S

de L. rhamnosus (D16552.1, AFZY01000009.1 y AF243146.1), L. casei (D86518.1,
D16549.1 y AB008204.1) y L. paracasei (NR_025880.1, D79212.1 y HQ423165.1), que
mostró una diana de reconocimiento (GCGATG (N) 10) en estas dos últimas especies, no
siendo así en L. rhamnosus. Dicho alineamiento se muestra en la Fig. 4.
L. casei (D86518.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. casei (D16549.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. casei (AB008204.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. paracasei (NR_025880.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. paracasei (D79212.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. paracasei (HQ423165.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. rhamnosus (D16552.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. rhamnosus (AF243146.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
L. rhamnosus (AFZY01000009.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG
********************************** ************************************************
Figura 4: Fragmento del alineamiento de las secuencias ADNr 16S de las especies L. casei, L. paracasei
y L. rhamnosus. Diana de reconocimiento de la enzima BtgZI marcada en verde. La flecha indica el
sitio de corte.
66
2.7. Análisis bioinformático
2.7.1. Bases de datos y herramientas bioinformáticas empleadas
Las bases de datos del NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information), fueron
empleadas para la búsqueda de las secuencias de ADN que serían incluidas en los árboles
filogenéticos para verificar el agrupamiento.
BlastN (Basic local alignment search tool) (Altschul et al., 1990), fue empleado para
realizar la comparación entre las secuencias obtenidas de las cepas objeto de estudio y aquellas
depositadas en las bases de datos. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
ClustalW (Larkin et al., 2007), fue empleado para realizar el alineamiento de las
secuencias de ADN obtenidas tanto de las bases de datos como a partir de las cepas aisladas
en este estudio. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.
MEGA versión 5.0 (Tamura et al., 2011), fue empleado para la elaboración de los
árboles filogenéticos.
pDRAW32 “DNA analysis software” (AcaClone), fue empleado para llevar a cabo la
predicción virtual de los cortes con las enzimas de restricción que serían posteriormente
empleadas. http://www.acaclone.com/.
2.7.2. Elaboración del árbol filogenético 16S y recA
Para obtener los árboles filogenéticos, utilizando las secuencias del gen 16S de un
fragmento del gen recA, se emplearon los programas ClustalW2 (Chenna et al., 2003) y
MEGA versión 5 (Tamura et al., 2011).
El primero de ellos proporcionó el alineamiento de las secuencias una vez acotadas al

tamaño de 1378 pb para el gen ADNr 16S y de 245 pb en el fragmento del gen recA.
Este alineamiento se trasladó al programa MEGA 5, con el que finalmente se obtuvo

dicho árbol. Se estableció un bootstrap de 1500 réplicas para elaborar un árbol de máxima
similitud y se empleó el modelo de sustitución de Tamura-Nei.
67
2.8. Microfermentaciones
Las microfermentaciones se llevaron a cabo en frascos de vidrio que contenían 100

mL de vino de la bodega Condes de Albarei, previamente centrifugado a 9800 x g durante 15
min. Las características químicas de dicho vino eran: Ácido málico: 4,8 g/L, Ácido Tartárico:
2,6 g/L, acidez total: 6,28 g/L, acidez volátil: 0,23 g/L, glicerol 5,2 g/L, SO2 total: 75 mg/L.
Un grado alcohólico del 12% y un pH de 3,8.
Se prepararon cultivos frescos de las diferentes cepas sembrando los mismos en Agar-
Vino (pH 4,5), a 28 ºC. Una vez crecidos en este medio, fueron inoculados en un medio líquido
compuestos por el mismo vino, suplementado con un 10% de MRS (pH final = 4) para preparar
los inóculos. Estos se utilizaron para inocular las microfermentaciones a una densidad celular
de 105 células/mL. El vino sin inocular se incluyó como control. La fermentación transcurrió
a 20 ºC durante 15 días, tras los cuales los vinos fueron centrifugados y conservados para su
posterior análisis. Los ensayos se realizaron por duplicado.
Los vinos resultantes de las microvinificaciones fueron analizados con el equipo

WineScan™ (Foss) para la determinación de la concentración de ácido málico, ácido láctico y
acidez volátil (concentración de ácido acético).
2.9. Determinación molecular de la presencia de genes codificantes de enzimas

descarboxilasas de ácidos fenólicos
Se determinó la capacidad de las bacterias seleccionadas en base a su actividad

maloláctica para la liberación de ácidos fenólicos en vino. Para ello se trató de detectar la
presencia del gen pdc, codificante para la enzima descarboxilasa de ácidos fenólicos, siguiendo
el protocolo descrito por Mtshali et al. (2009).
Se emplearon los cebadores PAD-1 (5’-AARAAYGAYCAYACYRTTGAT TACC-
3’) como directo y PAD-3 (5’-TTCTTCWACCCAYTTHGGGAAGAA-3’) como reverso, a
una concentración de 0,4 µM cada uno, en un volumen total de reacción de PCR de 50 µL. El
resto de componentes fueron: y 10 ng de ADN, 0,25 mM de mezcla de oligonucleótidos, 1,5
mM de MgCl2 y 1,25 U de Taq polimerasa (Takara),
68
Las condiciones de amplificación fueron las siguiente: desnaturalización inicial a 94

ºC durante 2 min, 35 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC, 40 s; anillamiento a 50 ºC, 1 min y
elongación a 72 ºC durante 30 s , con una extensión final a 72 ºC durante 5 min.
Se empleó la cepa de L. brevis CECT 5354 como control positivo, ya que había sido
previamente descrita su capacidad para producir ácidos fenólicos (Curiel et al., 2010).
2.10. Determinación de la actividad β-glucosidasa
La determinación de la capacidad para producir β-glucosidasa se llevó a cabo en las

cepas de bacterias malolácticas seleccionadas en base a su actividad maloláctica.
Para determinar la actividad β-glucosidasa se empleó el método descrito por Grimaldi

et al. (2005) con algunas modificaciones. La cuantificación de la actividad β-glucosidasa se
llevó a cabo en células vivas.
2.10.1. Actividad β-glucosidasa en células vivas
Las cepas de bacterias malolácticas fueron cultivadas en medio MRS a 30 ºC durante

el tiempo necesario hasta que alcanzaron la fase estacionaria (dato basado en las curvas de
crecimiento de cada una de ellas realizadas previamente).
En este punto se tomaron 10 mL de cultivo de cada una de las cepas y se centrifugaron

a 2894 x g durante 15 min. Se retiró el sobrenadante, que fue conservado a -20 ºC para el
estudio de la actividad β-glucosidasa.
El precipitado fue lavado dos veces con solución salina (NaCl 0,85%) a 13000 x g
durante 3 min tras lo cual las células fueron resuspendidas en dicha solución (1 mL).
A partir de ésta, se prepararon suspensiones celulares en un volumen de 5 mL para

cada una de las cepas a una densidad óptica de 1, medida a 600 nm, las cuales serían empleadas
en las reacciones posteriores.
La mezcla de reacción se llevó a cabo en un volumen total de 160 µL, de los cuales
80 µL corresponden a tampón McIlvaine (McIlvaine, 1921) 200 mM (ácido cítrico 0,1 M y
69
K2HPO4 0,2 M), preparado a pH 4,0. Cuarenta microlitros corresponden a la suspensión celular
descrita anteriormente, y los restantes 40 µL corresponden al sustrato 4-nitrofenil β-D-
glucopiranósido (Sigma-Aldrich GmBH), preparado a una concentración 4 mM en H2O
MilliQ, para obtener una concentración final de 1 mM. Se determinó la actividad β-glucosidasa
a 18 ºC, por ser esta una de las más habitualmente empleadas en procesos de vinificación.
Las reacciones se llevaron a cabo durante 1 hora, por duplicado, tras lo cual se
detuvieron mediante la adición de 320 µL de Na2CO3 0,5 M.
La determinación del p-nitrofenol liberado se llevó a cabo a 400 nm en un

espectrofotómetro (Thermo Scientific Evolution 201) empleando como blanco la misma
mezcla de reacción sin adición de células.
La recta patrón para cuantificación de la actividad enzimática se realizó midiendo la

absorbancia, a 400 nm, del producto de la reacción catalizada por la β-glucosidasa, 4-nitrofenol
(Sigma-Aldrich GmBH), preparado a diferentes concentraciones.
Una unidad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1
µM de 4-nitrofenol en un minuto de reacción a 18 ºC.
2.11. Determinación de la capacidad de producción de aminas biógenas
La capacidad de síntesis de aminas biógenas se determinó nuevamente para los

aislados de bacterias malolácticas que mejor actividad maloláctica mostraron. Además se
empleó la cepa L. brevis CECT 5354 como control positivo para el gen tdc, la cepa L.
helveticus CECT 403 como control positivo para el gen odc y la cepa L. rhamnosus CECT 288
como control positivo para el gen hdc.
2.11.1. Determinación molecular de la capacidad de producción de ABs
A fin de estimar la capacidad de producción de ABs se llevó a cabo la identificación

de aquellas cepas portadoras de los genes hdc, tdc y odc, codificantes para las enzimas histidina
descarboxilasa, tirosina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa, enzimas implicadas en las
rutas de síntesis de las ABs histamina, tiramina y putrescina respectivamente.
70
Para ello se emplearon tres PCRs por cada cepa estudiada, con los cebadores descritos
por de las Rivas et al. (2005), mostrados en la Tabla 3. La mezcla de reacción consistió en:
ADN 30 ng, 200 µM cada oligonucleótido, 2,5 mM de MgCl2 y 2,5 U de Taq polimerasa
(Takara) en un volumen total de 50 µL. Los cebadores empleados se añadieron a la mezcla de
reacción a las concentraciones: 2 µM para los cebadores P1-rev y P2-for, 0,3 µM para los
cebadores JV16HC y JV17HC, y 1 µM para los cebadores Nº 3 y Nº 16.
Las condiciones de amplificación, empleando un termociclador MyCycler™ (Bio-

Rad), fueron: desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, 30 ciclos de: desnaturalización
a 95 ºC durante 1 min, anillamiento a 52 ºC durante 1 min, elongación a 72 ºC durante 2 min,
y un período de extensión final a 72 ºC de 5 min.
A pesar de que los autores de este protocolo llevan a cabo el mismo a modo de PCR
múltiple, en nuestro caso se realizó de forma independiente para cada uno de los genes, ya que
la amplificación inespecífica de otras secuencias puede dar lugar artefactos que solapen las
bandas de interés, y por lo tanto, arrojar falsos positivos o negativos.
Tabla 3: Cebadores empleados en la determinación molecular de la presencia de los genes hdc, tdc y
odc.
Gen Cebador Secuencia
JV16HC 5’- AGATGGTATTGTTTCTTATG - 3’

hdc
JV17HC 5’- AGACCATACACCATAACCTT - 3’
P1-rev 5’- CCRTARTCNGGNATAGCRAARTCNGTRTG - 3’
tdc
P2-for 5’- GAYATNATNGGNATNGGNYTNGAYCARG - 3’
Nº 3 5’- GTNTTYAAYGCNGAYAARACNTAYTTYGT - 3’
odc
Nº 16 5’- TACRCARAATACTCCNGGNGGRTANGG - 3’
2.11.2. Cuantificación de la producción de ABs
Tras la determinación, a nivel molecular, de la capacidad de producción de ABs por

parte de las cepas de BAL objeto de estudio, se llevó a cabo la determinación cuantitativa de
las mismas en vino siguiendo el método descrito por Self et al., (2011), a fin de confirmar los
resultados de las pruebas moleculares.
La cuantificación de ABs en el vino resultante de las microvinificaciones
71
anteriormente descritas, se realizó mediante LC/MS-MS (Liquid Chromatography - Mass

Spectrometry).
2.11.2.1. Reactivos y patrones
Se emplearon agua y acetonitrilo (Grado LC/MS) de Panreac (Barcelona, España) y

Metanol (grado de HPLC). Se empleó también ácido clorhídrico (pureza del 37%) (Merck,
Barcelona, España). El ácido fórmico (98 - 100% de pureza), el formiato de amonio (pureza ≥
99%), la tiramina (TYR, HOC6H4CH2CH2NH2, PM = 137,18 g/mol, pureza del 99%), la
putrescina (PUT, NH2 (CH2) 4NH2, PM = 88,15 g/mol, pureza del 99%) y la histamina (HIS,
C5H9N3 2HCl, PM = 184,07 g/mol, pureza ≥ 99%) fueron proporcionados por Sigma-Aldrich
Madrid, España.
2.11.2.2. Preparación de soluciones estándar y muestras de vino
Se prepararon soluciones patrón con concentraciones de 10 mg/mL de cada amina

biógena (TYR, PUT y HIS) en 1% v/v de HCl y se almacenaron a 4 ºC. A partir de éstas se
prepararon semanalmente soluciones de trabajo en metanol acuoso (50% v/v) en
concentraciones entre 0,25 y 2,5 μg/mL.
Las muestras de vino se diluyeron en fase móvil y se filtraron a través de un filtro de

PVDF con un tamaño de poro de 0,2 μm (PVDF Membrana, Millipore, Cork, Irlanda).
2.11.2.3. Análisis UHPLC-MS / MS
La separación cromatográfica se realizó usando un sistema Agilent 1290 Infinity

UHPLC (Ultra-High Performance Liquid Chromatography). Las aminas biógenas se
separaron usando una columna HILIC: Aquity UPLC® BEH Amida, Lote número 0104191311
(2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm) de Waters, a 40 °C. La fase móvil A fue agua al 100% conteniendo
30 mM de formiato de amonio y 1 ml de ácido fórmico, y la fase móvil B consistió en 100%
de acetonitrilo. Se llevó a cabo un programa en gradiente con un caudal de 0,6 mL/min,
comenzando con un gradiente lineal de 100% a 30% de B en 14 minutos. Después de un tiempo
de espera isocrática de 1 min a 100% de B, el tiempo total de ejecución fue de 15 minutos. La
72
detección por MS se realizó usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent

G6460A equipado con una fuente ESI Agilent Jet Stream. Las condiciones de fuente e interfaz
se optimizaron para el análisis de aminas biógenas en modo de ionización positiva y se
ajustaron para obtener la mejor sensibilidad para las tres aminas biógenas anteriormente
mencionadas. El voltaje capilar se ajustó a 3,5 kV en modo positivo. Se seleccionó un flujo de
gas de secado (N2) de 10 L/min a una temperatura de 300 ºC, una presión de gas de
nebulización de 45 psi y un flujo de gas de envoltura de 11 L/min a una temperatura de 250
ºC. Las energías de colisión y voltajes de los aceleradores se optimizaron para cada analito
utilizando el software Mass Hunter Optimizer. La transición con mayor intensidad se utilizó
para la cuantificación (Q) y aquella con la menor intensidad (q) para la confirmación. La
histamina con el ion precursor 112.1 proporciona una Q = 95.1 y q = 68.1 (energía de
fragmentación a 70 V y energía de colisión 13 V y 21 V respectivamente), la putrescina con
un ion precursor 89.1 proporciona una Q = 72.1 y q = 55.1 (energía de fragmentación a 70 V
y energía de colisión a 9 V y 21 V respectivamente) y la tiramina con ión precursor 138.1
proporciona una Q = 121.1 y q = 77.1 (energía de fragmentación a 60 V y energía de colisión
a 9 V y 29 V respectivamente).
2.11.2.4. Parámetros de cuantificación
La calibración se llevó a cabo utilizando soluciones estándar de una mezcla de aminas

biógenas que incluía putrescina, tiramina e histamina, en un intervalo de 0,25 a 10 μg/mL
(Tabla 4). Se inyectó un control como blanco antes y después de los conjuntos de calibración
para comprobar la posible sobrecarga de la columna.
Tabla 4: Datos de calibración derivados de una calibración de siete puntos para la histamina, tiramina
y putrescina, utilizando el método HILIC-MS/MS para la determinación de aminas biógenas en el vino.
Coeficiente de
Rango Lineal LDD a LDC b
Compuesto Pendiente Intersección determinación
(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
(R2)
Histamina 0,25-10 1265111,40 1724726,02 0,9839 0,010 0,034
Tiramina 0,25-10 808162,85 1172034,52 0,9953 0,003 0,010
Putrescina 0,25-10 62363,37 167677,48 0,9939 0,007 0,024
(a) Límite de detección

(b) Límite de cuantificación
73
Para el cálculo de los límites de detección y de cuantificación (LOD y LOQ)

respectivamente, se utilizó la relación señal/ruido (S / N = 3 y S / N 10) utilizando la solución
de calibrado más baja preparada en disolvente y basada en inyección triplicada.
2.12. Análisis de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa
Para la comprobación del éxito en la extracción de ADN se realizó una electroforesis

en gel de agarosa (1% agarosa, TAE - 40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8-, 100 v). Se
cargó 1 µL del ADN extraído y se empleó un marcador comercial de 200 a 10000 pb
(HyperLadder™ I - Bioline).
Los productos de amplificación de la secuencia ISR y ADNr 16S se analizaron

mediante electroforesis en gel de agarosa (1 % agarosa, TAE -40 mM Tris/Acetato, 1 mM
EDTA, pH 8-, 85 v). Se cargaron 15 µL del producto de amplificación y se empleó,
nuevamente, el marcador comercial HyperLadder™ I (Bioline) de 200 a 10000 pb.
Los productos de amplificación del gen recA fueron comprobadas mediante

electroforesis en gel de agarosa (2 % agarosa, TAE - 40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH
8 -, 60 v) empleándose un marcador comercial de 200 a 10000 pb (HyperLadder™ I - Bioline
-) en el caso de las amplificaciones obtenidas con los cebadores degenerados y de 100 a 1000
pb (Low Ladder - Sigma-Aldrich -) tras el empleo de los cebadores específicos.
Los cortes enzimáticos fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa (2

% agarosa, TAE - 40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8 -, 50 v), empleándose un marcador
comercial de 200 a 10000 pb (HyperLadder™ I - Bioline -), a excepción del corte realizado
con la enzima BtgZI sobre el ADNr 16S y con la enzima VspI sobre la secuencia ISR, para los
que se empleó un marcador de 100 a 1000 pb (Low Ladder - Sigma-Aldrich -).
Los productos de amplificación de los genes codificantes para las enzimas amino
descarboxilasas se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (2 % agarosa, TAE -
40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8-, 80 v) empleándose un marcador comercial de 100
a 1000 pb (Biorom).
Los productos de amplificación de los genes codificantes para las enzimas
74
descarboxilasas de ácidos fenólicos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (3

% agarosa, TAE -40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8-, 90 v) empleándose un marcador
comercial de 100 a 1000 pb (Biorom).
2.13. Determinación de la capacidad de degradación de ABs
Se determinó la capacidad de las cepas seleccionadas para degradar las aminas

biógenas: histamina, tiramina y putrescina.
Se empleó el método descrito por Callejón et al. (2014) con algunas modificaciones.
Para ello, las cepas de bacterias malolácticas fueron cultivadas en MRS suplementado con
histamina, tiramina y putrescina, cada una de ellas a 10 mg/L, a 30 ºC hasta alcanzar la fase
exponencial, en un volumen de 50 mL. Posteriormente, los cultivos fueron centrifugados a
2894 x g durante 10 min, lavadas con 40 mL de tampón fosfato (50 mM, pH 7,4) y, finalmente
resuspendidas en el mismo tampón suplementado con el inhibidor de proteasas fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM.
Para obtener el extracto celular, las células se rompieron mecánicamente con perlas de
vidrio de 107 µm (Sigma-Aldrich), mediante vortex durante 10 min, tras lo cual se
centrifugaron a 25000 x g durante 15 min y el sobrenadante se conservó a -20 ºC hasta su uso.
La detección de actividad degradadora de aminas biógenas se llevó a cabo en gel de

poliacrilamida (PAGE) en condiciones no-desnaturalizantes. Para ello, el gel concentrador se
preparó a una concentración del 4% mientras que el gel separador contenía una concentración
del 8% de poliacrilamida. Se cargaron 25 µL de cada uno de los extractos mezclados con 5 µL
de tampón de carga (Glicerol 10%, Tris-HCl 50 mM, verde de bromocresol 0,02%, pH 6,8), y
se llevó a cabo la electroforesis a 200 V durante 60 min, en tampón Tris-Glicina (Tris-Base 25
mM, Glicina 0,19 M). Tras este tiempo, los geles (uno por cada amina) se trasladaron a tampón
fosfato (50 mM, pH 7,4) suplementado con cada una de las aminas a una concentración de 1
mM durante 15 min.
El revelado se realizó en el mismo tampón suplementado con 1 U/ml de peroxidasa

(Sigma) y 0,25 mM de 3,3’-diaminobenzidina (Sigma) como agente cromogénico durante 1:30
h.
75
CAPÍTULO I Resultados y Discusión
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La región vinícola Val do Salnés, perteneciente a la D.O. Rías Baixas en España, posee
un clima Atlántico de temperaturas suaves (Lorenzo et al., 2013), diferenciado por presentar
temperaturas nocturnas bajas, y que cultiva mayoritariamente la variedad blanca Vitis vinifera
Albariño.
Los vinos obtenidos con esta variedad en esta zona, debido a su exceso de acidez,
deben completar en muchas ocasiones la FML. Sin embargo, con frecuencia, se ha constatado
la dificultad para conseguir un exitoso desarrollo de este proceso de manera espontánea o la
implantación de cultivos iniciadores comerciales en estos vinos. Estas razones han justificado
llevar a cabo este estudio sobre la biodiversidad de BAL asociada a los vinos de esta región,
así como su caracterización con objeto de determinar su potencial para la preparación de
nuevos starters autóctonos.
3.1. Aislamiento de bacterias lácticas
Durante dos cosechas consecutivas (2007 y 2008) se llevó a cabo el aislamiento de

bacterias malolácticas en fermentaciones realizadas con la variedad Vitis vinífera Albariño
cultivada en la región Val do Salnés-España, perteneciente a la Denominación de origen Rías
Baixas. Se seleccionó para ello la bodega “Condes de Albarei” considerada representativa de
la zona ya que funciona en régimen de cooperativa y recibe uvas de los diferentes viñedos de
la misma. Las muestras se tomaron de mosto (M), fermentación alcohólica (FA) y
fermentación maloláctica (FML). De entre todos los aislados se seleccionaron como
potenciales bacterias del ácido láctico las Gram positivas/catalasa negativas. En el año 2007
el 8,7 % (2) de los aislados se obtuvieron de FA y un 93% (21) de FML. En el año 2008 el
46,2% (6) de los aislados se obtuvieron de M y el 53,8% (7) de FML. En total se consiguieron
35 aislados (UVI-1 - UVI-35).
Analizando la distribución de estas especies en base a las etapas de procesado del vino
se aprecia que la gran mayoría de las cepas se aíslan durante la fase de fermentación
maloláctica con un 77,1% (27) de éstas, mientras que solo un 5,7% (2) se obtienen durante la
76
fermentación alcohólica. En la etapa de mosto se aislaron un 17,1% (6) del total de cepas,
siguiendo la progresión habitual, descrita previamente (Pardo et al. 1989; Sieiro et al. 1990;
Renouf et al. 2006).
Esta frecuencia de aislamiento puede calificarse como baja o muy baja si se compara
con los datos de muchas regiones vinícolas estudiadas (Mesas et al., 2011; Sebastian et al.,
2011), sobre todo si se tiene en cuenta que fue necesario concentrar las muestras para conseguir
aislar las bacterias, aunque frecuencias de aislamiento bajas han sido reportadas también en
otras regiones productoras (Bae et al., 2006; Valdés La Hens et al., 2014). Los resultados
encontrados en el presente estudio son consistentes con las dificultades para la consecución
exitosa de la fermentación maloláctica en la región objeto de estudio, manifestadas
frecuentemente por los productores.
3.2. Identificación de los aislados mediante perfil bioquímico de asimilación de

azúcares
El empleo del kit comercial API® 50CHL permitió la elaboración del perfil de
asimilación de azúcares de cada uno de los aislados bajo estudio, comparativamente con el
obtenido a partir de las cepas de colección de las especies de bacterias lácticas más
comúnmente encontradas en vino. Dichos perfiles bioquímicos se muestran en la Fig. 5.
Los resultados obtenidos no permitieron una identificación concluyente de todos los

aislados, como ya había sido descrito en trabajos previos que emplearon este mismo test (Testa
et al., 2014). Sin embargo, sí permitió un primer agrupamiento de los aislados.
Doce de ellos fueron agrupados como potencialmente pertenecientes a la especie

Lactobacillus hilgardii, 3 a la especie Pediococcus damnosus, uno a la especie Lactococcus
lactis, 6 de ellos fueron agrupados como Lactobacillus casei/Lactobacillus paracasei y 4
fueron incluidos en el grupo Lactobacillus plantarum/Lactobacillus
paraplantarum/Lactobacillus pentosus, al no ser este test válido para discriminar entre las
especies incluidas en estos dos últimos grupos. Para el resto de los aislados no fue posible
obtener un perfil claro de asimilación de carbohidratos debido a su débil crecimiento.
77
CAPÍTULO I
78
Figura 5: Perfiles bioquímicos de asimilación de azúcares obtenidos mediante el empleo del kit comercial API ® 50CHL.
Resultados y Discusión
El grupo de las cepas potencialmente pertenecientes a L. hilgardii se caracterizó por

su capacidad para asimilar D-xilulosa (DXYL) en un 100% de los aislados, coincidiendo así
con los datos mostrados en el Manual Bergey de Sistemática Bacteriológica, 1-Metil-D-
glucósido (MDG) en el 76% (el 24% restante incluye a la cepa de colección) y melecitosa
(MEL) en el 69% de los casos.
El grupo L. plantarum / L. paraplantarum / L. pentosus se caracterizó por ser positivos

para glicerol (GLY), L-arabinosa (LARA), rhamnosa (RHA) y D-arabitol (DARL), y en él se
incluyen 5 cepas.
El grupo L. rhamnosus / L. casei / L. paracasei agrupó a 7 aislados, que fueron los

únicos capaces de asimilar tagatosa (TAG) lo que concuerda con los datos aportados por
Collins et al. (1989).
En un estudio llevado a cabo en cepas de colección, Dicks y Endo (2009) analizan la

capacidad de asimilación de 6 carbohidratos: amigdalina, celobiosa, manitol, melibiosa,
rafinosa y sacarosa, en cepas de colección de bacterias ácido lácticas. Según este estudio, el
grupo L. casei /paracasei/ rhamnosus es capaz de emplear amigdalina, celobiosa, manitol y
sacarosa en sus rutas metabólicas, no siendo así en el caso de los carbohidratos melibiosa y
rafinosa. Los mismos resultados se han obtenido en este estudio, excepto para la cepa de
colección de L. paracasei CECT 4175.
En el mismo estudio, estos autores describen características fenotípicas para la

diferenciación de P. damnosus frente a otras especies del mismo género, estableciendo en esta
especie la capacidad de asimilación de galactosa, y la incapacidad para el metabolismo de
arabinosa, lactosa, ribosa y xilosa, del mismo modo que ocurre en el grupo de aislados objeto
de este estudio, potencialmente pertenecientes a la especie P. damnosus.
El método no fue válido para determinar la asimilación de carbohidratos de las cepas

que posteriormente fueron identificados como O. oeni, ni tampoco para algunos de los aislados
incluidos en la especie P. damnosus.
Si bien el estudio de asimilación de carbohidratos permitió discernir los grupos de

microorganismos arriba mencionados, no mostró diferencias claras que permitan identificar, a
nivel de especie, sobre todo a los aislados pertenecientes a los dos grupos más homogéneos.
79
Por otra parte, es interesante destacar las importantes diferencias encontradas entre los
perfiles de asimilación de carbohidratos de los aislados y sus respectivas cepas de referencia.
Estas diferencias pueden tener su explicación en los distintos medios de los que fueron
aisladas. Un ejemplo claro se encuentra en los aislados vínicos del grupo L. plantarum, que se
mostraron incapaces de asimilar lactosa, al contrario que las cepas de referencia incluidas en
dicho grupo y que fueron aisladas de productos lácteos. Este medio presenta una elevada
concentración de este carbohidrato y las cepas aisladas a partir del mismo están adaptadas para
su utilización.
Aunque el test API 50CH no permitió la identificación definitiva de los aislados, sí

pone de manifiesto diferencias en la asimilación de carbohidratos entre la mayoría de ellos.
Por esta razón y debido al número relativamente bajo de aislados se continuó la identificación
molecular con todos ellos.
3.3. Identificación de los aislados mediante pruebas moleculares
La secuenciación del ADNr 16S de las bacterias aisladas en este trabajo y su posterior
comparación con la misma región disponible en las bases de datos, agrupó los 35 aislados en
6 grupos (Tabla 4): grupo Lactobacillus hilgardii, grupo Oenococcus oeni, grupo Lactococcus
lactis, grupo Pediococcus damnosus, grupo Lactobacillus paracasei/ casei y grupo
Lactobacillus plantarum/ pentosus.
En el caso de los 4 primeros grupos, la secuenciación del ADNr 16S permitió la

identificación de los aislados pertenecientes a dichas especies, aunque ésta fue confirmada con
posterioridad mediante el análisis ARDRA.
La identificación de los aislados pertenecientes a la especie Lactococcus lactis fue

llevada a cabo únicamente mediante secuenciación del ADNr 16S y posterior análisis con el
programa blastn. Este programa arrojó un porcentaje de identidad del 100% únicamente con
secuencias de dicha especie depositadas en las bases de datos.
80
Tabla 4: Identificación de los aislados mediante secuenciación del ADNr 16S.
Nombre del aislado Especie según 16S* Nombre del aislado Especie según 16S*
UVI-1 L. paracasei/casei UVI-19 L. paracasei/casei

UVI-2 L. paracasei/casei UVI-20 L. hilgardii
UVI-4 L. hilgardii UVI-22 L. hilgardii
UVI-6 L. plantarum/ pentosus UVI-24 O. oeni
UVI-7 L. paracasei/casei UVI-25 O. oeni
UVI-8 L. plantarum/ pentosus UVI-26 L. hilgardii
UVI-9 L. plantarum/ pentosus UVI-27 L. lactis
UVI-10 L. plantarum/ pentosus UVI-28 P. damnosus
UVI-11 L. plantarum/ pentosus UVI-29 O. oeni
UVI-12 L. paracasei/casei UVI-30 L. lactis
UVI-13 L. hilgardii UVI-31 P. damnosus
UVI-18 L. hilgardii
* La columna “Especie según 16S” refleja la especie o especies en que sería incluido el aislado si solo
se tuviese en cuenta el porcentaje de identidad de la secuencia 16S (no mostrado) arrojado por el
programa blastn de Blast® (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
En aquellos grupos que incluyen dos especies, el porcentaje de identidad obtenido fue
del 100% para cualquiera de las dos, corroborando los agrupamientos realizados mediante el
test API® 50CHL. En ambos casos se incluyó en el análisis una especie filogenéticamente
cercana, L. rhamnosus CECT 288 en el grupo L. casei/paracasei y L. paraplantarum CECT
5787 en el grupo L. plantarum/ pentosus, a fin de verificar la ausencia de las mismas entre los
aislados incluidos en dichos grupos.
A partir de las secuencias génicas codificantes para la subunidad 16S del ribosoma
bacteriano de los aislados utilizados en este trabajo, así como de las depositadas en los bancos
de datos, se pudo establecer un árbol filogenético (Fig. 6) que agrupó los aislados en 6 grupos,
4 de ellos coincidentes con los grupos establecidos mediante el perfil de asimilación de
carbohidratos. Además, permitió incluir en algunos de estos grupos los aislados que no
pudieron ser incluidos en el test API® 50CHL por su pobre crecimiento y permitió el
agrupamiento de los aislados pertenecientes a las especies O. oeni y L. lactis.
81
Figura 6: Árbol filogenético de máxima verosimilitud del gen ADNr 16S para las especies objeto de
estudio elaborado mediante los programas ClustalW2 y MEGA 5. Bootstrap de 1500 réplicas.
Tal como se indicó anteriormente, la identificación de los aislados fue completada y/o
confirmada mediante un análisis ARDRA. La digestión enzimática del ADNr 16S con enzimas
de restricción permitió confirmar las cepas pertenecientes a los géneros Oenococcus y
Pediococcus, así como las de la especie L. hilgardii.
82
Concretamente, el corte enzimático del ADNr 16S con BfaI y AluI resultó en el mismo
perfil de bandas para las cepas UVI-24 , UVI-25 y UVI-29 que el obtenido para la cepa O.
oeni CECT 217, incluyendo a los aislados obtenidos en este estudio dentro de dicha especie
(Fig. 7).
A B
C
Figura 7: Perfil de restricción obtenido tras el

corte de los fragmentos de ADNr 16S con las
enzimas AluI (A) y BfaI (B). M: Marcador
HyperLadder™ I (Bioline); 1: O. oeni CECT 217;
2: Perfil correspondiente a los aislados UVI-24,
UVI-25 y UVI-26.
El corte de esta secuencia génica con HaeIII y, de nuevo con AluI, confirmó la
pertenencia de los aislados UVI-28, UVI-31, UVI-33, UVI-34, y UVI-35 a la especie
Pediococcus damnosus (Fig. 8).
A B
Figura 8: Perfil de restricción obtenido tras el corte de

los fragmentos de ADNr 16S con las enzimas AluI (A)
y HaeIII (B). M: Marcador HyperLadder™ I (Bioline);
1: P. damnosus CECT 793; 2: Perfil correspondiente a
los aislados UVI-28, UVI-31, UVI-33, UVI-34, y UVI-
35.
83
El corte con MseI, tanto de las muestras analizadas en este estudio como de las cepas
de colección correspondientes, proporcionó el mismo patrón de bandas en los aislados UVI-4,
UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-17, UVI-18, UVI-20, UVI-21, UVI-26 y en la cepa
de colección perteneciente a la especie L. hilgardii. La pertenencia de los aislados a esta
especie fue verificada, además, mediante la digestión con AluI y HaeIII. El patrón de digestión
de estos aislados con las enzimas AluI y HaeIII y MseI se muestra en la Fig. 9.
A B C
Figura 9: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los fragmentos de ADNr 16S con las enzimas
MseI (A), AluI (B) y HaeIII (C). M: Marcador HyperLadder™ I (Bioline); 1: Lactobacillus hilgardii
CECT 4786; 2: Perfil correspondiente a los aislados UVI-4, UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-
17, UVI-18, UVI-20, UVI-21 y UVI-26.
Recientemente, Nisiotou et al. (2014) realizaron un estudio similar, obteniendo una

identificación satisfactoria de L. hilgardii mediante el corte de la secuencia de ADNr 16S con
MseI, cuyo patrón de bandas fue igual al obtenido en el presente estudio. La misma técnica
había sido empleada por Rodas et al. (2005) para la identificación de esta especie mediante las
enzimas BfaI y MseI.
Del mismo modo que en el estudio de Rodas et al. (2005), el corte enzimático de esta
secuencia génica con BfaI (Fig. 10) nos permitió establecer la diferenciación entre los dos
grupos más homogéneos anteriormente descritos: L. casei/ paracasei y L. plantarum/
pentosus/ paraplantarum. Dada la proximidad entre las especies del primero de estos grupos
y L. rhamnosus, se introdujo en el análisis ARDRA la cepa de colección L. rhamnosus CECT
84
288 para descartar la presencia de esta especie entre los aislados obtenidos en este trabajo. Esta
enzima proporciona un patrón de bandas diferente en cada uno de ellos, corroborando el
agrupamiento realizado previamente. Tras este corte enzimático se procedió a trabajar con
cada uno de ellos de forma independiente.
A B
B B
C C
Figura 10: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los fragmentos de ADNr 16S con la enzima
BfaI. (A): M: Marcador HyperLadder™ I (Bioline); 1: L. rhamnosus CECT 288; 2: L. casei CECT 475;
3: L. paracasei CECT 4175; 4: Perfil correspondiente a los aislados UVI-2, UVI-12, UVI-1, UVI-5,
UVI-3 y UVI-7 (grupo L. casei/ paracasei/ rhamnosus). (B): M: marcador HyperLadder™ I (Bioline);
1: L. plantarum CECT 220; 2: L. pentosus CECT 4023; 3: L. paraplantarum CECT 5787; 4: Perfil
correspondiente a los aislados UVI-6, UVI-8, UVI-10, UVI-11 y UVI-19 (grupo L. plantarum/
pentosus/ paraplantarum).
En el primero de ellos (L. casei/ paracasei/ rhamnosus), el proceso de identificación

continuó con la digestión del ADNr 16S con BtgZI, lo que descartó la presencia de L.
rhamnosus entre las cepas aisladas en el presente trabajo, al ser la cepa de colección en la única
en la que no se apreció corte enzimático tal y como se esperaba tras realizar cortes in sílico de
las secuencias depositadas en las bases de datos (Fig. 11).
Tanto en las digestiones correspondientes a los aislados que se estudian en este trabajo,
como en las pertenecientes a las cepas de L. casei y L. paracasei de la CECT, se obtuvieron
dos fragmentos de 250 y 1.250 pb aproximadamente, lo que de nuevo coincide con los cortes
in sílico realizados previamente.
85
Figura 11: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los

fragmentos de ADNr 16S con la enzima BtgZI: M: Marcador
PCR 100 bp Low Ladder (Sigma-Aldrich); 1: L. casei CECT
475; 2: L. paracasei CECT 4175; 3: L. rhamnosus CECT 288;
4: Perfil correspondiente a los aislados UVI-2, UVI-12, UVI-
1, UVI-5, UVI-3, UVI-7, UVI-19.
En este punto, y debido a la similitud entre las secuencias del ADNr 16S (100% de
identidad), se hizo imprescindible el empleo adicional de otras herramientas moleculares como
la región intergénica 16S/23S (ISR o “intergenic spacer region”) y el gen recA. Esta similitud
ya había sido descrita por Dellaglio et al. (2002) para las cepas de la ATCC (American Type
Culture Collection) de dichas especies, proponiendo la inclusión de ambas especies en la
especie L. casei.
Figura 12: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los

fragmentos ISR con la enzima VspI. M: Marcador PCR 100 bp
Low Ladder (Sigma- Aldrich); 1: L. casei CECT 475; 2: L.
paracasei CECT 4175; 3: L. rhamnosus CECT 288; 4: Perfil
correspondiente a los aislados UVI-2, UVI-12, UVI-5, UVI-3,
UVI-7, UVI-1 y UVI-19.
La secuencia ISR había sido empleada con éxito por Moreira et al. (2005) para la
identificación de especies pertenecientes al género Lactobacillus. El análisis RFLP de esta
86
secuencia con la enzima VspI nos aportó la identificación definitiva de los aislados de ese
grupo como pertenecientes a la especie L. paracasei, al proporcionar fragmentos de 250 y 350
pares de bases, tanto en los aislados como en la cepa de colección CECT 4175, no siendo así
en L. casei CECT 475, confirmando la utilidad de dicha secuencia como herramienta a la hora
de discernir entre estas especies. En la Fig. 12 se puede apreciar el perfil de restricción
obtenido para la cepa de L. paracasei CECT 4175, mientras que la enzima no presenta ningún
sitio de corte sobre el ISR de L. casei CECT 475. En este análisis se introdujo nuevamente L.
rhamnosus que había sido descartada anteriormente, a fin de verificar dicho descarte y con
ello confirmar la utilizad de la enzima BtgZI para la identificación de las especies de este grupo
filogenéticamente próximo.
A continuación se procedió a la diferenciación de las especies en el segundo grupo de

aislados (L. plantarum/ paraplantarum/ pentosus) utilizando el gen recA.
La amplificación con los cebadores específicos de especie empleados por Torriani et

al. (2001) permitieron descartar la presencia de L. pentosus entre los aislados, sin embargo no
fue suficiente para diferenciar entre L. plantarum y L. paraplantarum.
Figura 13: Amplificación del gen recA con cebadores específicos: M: Marcador HyperLadder™ I
(Bioline); 1: L. plantarum CECT 220; 2: L. pentosus CECT 4023; 3: L. paraplantarum CECT 5787; 4:
Perfil correspondiente a los aislados UVI-6, UVI-8, UVI-9, UVI-10 y UVI-11.
87
Se esperaba, tras la amplificación del gen recA con sus cebadores específicos, un
fragmento de 107 pb en la especie L. paraplantarum CECT 5787, sin embargo lo obtenido fue
un producto de PCR similar al de L. plantarum CECT 220 (318 pares de bases). Dichas
amplificaciones se muestran en la Fig. 13.
Este resultado sólo podría ser explicado asumiendo una identificación incompleta de
la cepa proporcionada por la Colección Española de Cultivos Tipo. Muchas de las cepas
depositadas en las distintas colecciones de microorganismos han sido identificadas solamente
empleando métodos bioquímicos, insuficientes para una identificación correcta a nivel de
especie. Además, el alineamiento de las secuencias recA de estas dos cepas (L. plantarum
CECT 220 y de L. paraplantarum CECT 5787), obtenidas con los oligonucleótidos
degenerados, aporta un 100% de identidad entre las 245 pares de bases alineadas, lo que
confirma esta posibilidad.
El alineamiento de las secuencias recA de 245 pares de las cepas aisladas en nuestro
laboratorio y las disponibles en las bases de datos generó unos agrupamientos con una marcada
diferenciación interespecífica, permitiendo identificar a los aislados estudiados en este trabajo
(UVI-6, UVI-8, UVI-9, UVI-10 y UVI-11) como L. plantarum. Este agrupamiento se aprecia
claramente en el árbol filogenético generado a partir de dicho alineamiento (Fig. 14).
UVI-6
UVI-10
L.paraplantarum CECT 5787
L.plantarum AJ2861191
100
L.plantarum CECT 220
UVI-9
UVI-8
L.paraplantarum AJ2719631
100
L.pentosus AJ2861181
0.02
Figura 14: Árbol filogenético de máxima verosimilitud obtenido con un fragmento de 245 pares de
bases del gen recA elaborado mediante el programa MEGA 5. Bootstrap de 1500 réplicas.
88
En consecuencia con lo anteriormente expuesto, la cepa de L. paraplantarum CECT

5787 quedó incluida dentro del “cluster” de L. plantarum (Fig. 14).
Por lo tanto, los resultados de este análisis corroboran la utilidad del gen recA para la
identificación de estas especies del género Lactobacillus que se encuentran filogenéticamente
muy cercanas, como ya había sido propuesto anteriormente (Torriani et al., 2001; Rodríguez
et al., 2007), e identifican los aislados incluidos en este grupo como L. plantarum.
Desde el punto de vista de la diversidad intraespecífica, todos los aislados mostraron

perfiles diferentes en la prueba API 50CH, a excepción de UVI-4, UVI-22 y UVI-23 en el
grupo de L. hilgardii, y UVI-9 y UVI-10 en el grupo de L. plantarum. Atendiendo a este
criterio, dichos aislados podrían ser considerados la misma cepa quedando el grupo L. hilgardii
reducido a un total de 10 cepas diferentes y el grupo L. plantarum a 3 cepas diferentes. En el
grupo L. paracasei no hay coincidencias entre perfiles por lo que mantendría el numero
mencionado previamente. Lo mismo sucede con los aislados identificados como O. oeni, L.
lactis y P. damnosus, si bien algunos de los aislados no pudieron ser incluidos en el análisis
API 50CH y por lo tanto este criterio no pudo ser utilizado para determinar si son cepas
diferentes.
El estudio realizado en este trabajo muestra que, aunque el ADNr 16S puede ser
utilizado con éxito en la identificación a nivel de especie de algunos microorganismo, en
muchos casos no es suficiente, al igual que ocurre con las pruebas bioquímicas. En estos casos
es necesario recurrir a otro tipo de estudios, que serán diferentes en función del grupo de
microorganismos del que se trate, y que deben ser utilizados conjuntamente con los primeros
en una identificación polifásica.
3.4. Esquema general del proceso de identificación
Como resumen de todo lo expuesto anteriormente se muestra en la Fig. 15 y en la Tabla

5, de manera esquemática, la secuencia de procedimientos y el resumen de las técnicas que
condujo a la identificación de los aislados.
89
Figura 15: Esquema general del proceso de identificación de los aislados de bacterias ácido lácticas.
90
Tabla 5: Tabla resumen del proceso de identificación de los aislados de bacterias lácticas.
Análisis
Año de Etapa de Secuenciación 16S-ARDRA restricción Secuenciación
Nombre API 50CH
Aislamiento muestreo* ADNr 16S (enzima/s) ISR gen recA
(enzima/s)
L. plantarum
CECT 220
L.
paraplantarum
CECT 5787
L. plantarum/L.
UVI-6 paraplantarum/L.
pentosus
L. plantarum/L.
pentosus L. plantarum/L.
L. plantarum/L.
2007 FML L. plantarum/L. paraplantarum/L.
paraplantarum/L. - L. plantarum
pentosus
UVI-9 paraplantarum/L. pentosus
pentosus (BfaI)
L. plantarum/L.
pentosus
UVI-11 -
l. casei CECT 475
L. paracasei
CECT 4175
L. rhamnosus
CECT 288
L. casei/L.
UVI-1 paracasei/ L.
rhamnosus
L. casei/L.
UVI-2 paracasei/ L.
rhamnosus
L. casei/L.
UVI-3 paracasei/ L.
rhamnosus L. casei/L.
L. casei/L. paracasei/ paracasei/ L. L. paracasei
2007 FML L. casei/L. -
L. rhamnosus rhamnosus (VspI)
UVI-5 paracasei/ L.
rhamnosus (BfaI, BtgZI)
L. casei/L.
UVI-7 paracasei/ L.
rhamnosus
UVI-12 -
L. casei/Lb.
UVI-19 paracasei/ Lb.
rhamnosus
L. hilgardii CECT
4786
UVI-4
UVI-13
UVI-14
UVI-15
UVI-16 FML
UVI-17 2007 L. hilgardii
L. hilgardii L. hilgardii - -
UVI-18 (MseI, AluI, HaeIII)
UVI-20
UVI-21
UVI-22 FA
UVI-23 FA
UVI-26 2008 M
O. oeni CECT
217
UVI-24
O. oeni
UVI-25 2008 M - O. oeni
(AluI, BfaI)
- -
UVI-29
P. damnosus
CECT 793
UVI-28 -
UVI-31 P. damnosus
UVI-32 - P. damnosus
2008 FML P. damnosus - -
UVI-33 P. damnosus (AluI, HaeIII)
UVI-34 -
UVI-35 P. damnosus
L. lactis CET 185
UVI-27 Lc. lactis
2008 M Lc. lactis - - -
UVI-30 -
*M= Mosto
FA= Fermentación alcohólica
MLF= Fermentación maloláctica
91
3.5. Ecología de las bacterias lácticas aisladas
Al término del aislamiento y a la vista de todos los datos aportados en la identificación

bioquímica y molecular, se procedió al análisis ecológico de bacterias ácido lácticas en los
vinos estudiados.
La distribución anual de las distintas especies aisladas se presenta en la Fig. 16. En

2007 se observó una clara prevalencia de L. hilgardii con un 45% (9) de los aislados mientras
que en 2008 fue la especie Pediococcus damnosus la dominante al suponer el 50% (6) de los
aislados.
2007 2008
100% 100%
37% 33%
75% Lc. lactis
75%
L. paracasei
P. damnosus
50% 100% 21% 50% 100%
L. plantarum 50% O. oeni
25% L. hilgardii 25% L. hilgardii

42%
17%
0% 0%
M FA FML M FA FML
Figura 16: Distribución anual de las especies de bacterias lácticas aisladas.
Se apreciaron importantes diferencias en cuanto a la ecología de bacterias lácticas

entre los años 2007 y 2008, tanto cuando se tomaron los datos en su conjunto como cuando se
analizan en función de la fase de vinificación en la que fueron aisladas. Las diferencias entre
anualidades también habían sido descritas previamente en otras regiones vinícolas (Ruiz et al.,
2010).
Estas diferencias se manifestaron desde la primera fase de muestreo. En 2007 no se

obtuvieron aislados en mosto, mientras que, en 2008, la variedad de especies aisladas en éste
estuvo compuesta por O. oeni 50% (3), L. lactis 33,3% (2) y L. hilgardii 16,7% (1), especies
descritas previamente como parte de la microflora de las uvas (Lafon-Lafourcade et al., 1983;
Agrelo et al. 1987; Bae et al., 2006), y que explicaría su presencia en el mosto analizado.
Tanto el número de aislados como su diversidad ecológica sufrieron una fuerte

reducción en la fase de fermentación alcohólica en 2008, debido probablemente al incremento
92
en la concentración de etanol, a la competencia con las levaduras y a la caída en la

concentración de azúcares (Sieiro et al., 1990; Renouf et al., 2006). En 2007, los primeros
aislamientos se obtienen en esta fase, pertenecientes a la especie L. hilgardii (1 aislado).
La especial resistencia de la especie L. hilgardii a elevadas concentraciones de etanol

(Couto et al., 1997) podrían explicar el hecho de que, analizando ambas anualidades, esta
especie sea la única aislada en esta etapa de vinificación.
En FML, se obtuvieron también resultados dispares entre ambas vendimias. En 2007,

fue el año en que se encontró la mayor diversidad de bacterias ácido lácticas, con aislados
pertenecientes a las especies: L. plantarum, L. paracasei y L. hilgardii, en proporciones muy
similares (21% -4-, 37% -7- y 42% -8-, respectivamente). En 2008, en cambio, la fermentación
estuvo dominada exclusivamente por P. damnosus, con un total de 6 aislados.
Datos aportados por otros autores (Mesas et al., 2011; González-Arenzana et al.,
2013), muestran una mayor diversidad en las etapas previas a la fermentación maloláctica de
vinos tintos, lo que, en nuestro caso solo se cumple el segundo año.
Analizando los resultados de los dos años en conjunto, destaca L. hilgardii como la
única especie encontrada en FA, además de dominar en la etapa de FML, etapa en la que
comparte presencia con L. paracasei, L. plantarum y P. damnosus. En la primera etapa del
proceso de vinificación sería O. oeni la especie dominante, aunque, de nuevo, L. hilgardii tiene
una presencia importante, junto con L. lactis (Fig. 17).
Considerando los aislados en su totalidad e independientemente de la fase de

muestreo, destaca L. hilgardii como especie mayoritaria abarcando a un 31,3% (10) de los
aislados, seguida por L. paracasei con un 21,9% (7) del total de 32 aislados, y P. damnosus
con un 18,8% (6) de los aislados. Las especies L. plantarum, O. oeni y L. lactis resultaron las
especies minoritarias, con un 12,5, 9,4 y 6,3% de los aislados, respectivamente. Estas
proporciones se muestran en la Fig. 18.
93
Figura 17: Distribución de los aislados (gráfico central) y diversidades microbiológicas (gráficos
adyacentes) por especie en función de la etapa de vinificación. Verde: FML; Naranja: FA; Azul: M.
Proporciones de BAL por especie
6,3%
9,4% L. hilgardii
31,3% L. paracasei
P. damnosus
12,5%
L. plantarum
O. oeni
L. lactis
18,8%
21,9%
Figura 18: Distribución de los aislados de BAL en función de especie, teniendo en cuenta las dos
anualidades.
94
En total se han identificado 6 especies diferentes lo que podría estimarse como una
elevada diversidad dado el bajo número de aislados analizado. Además es destacable que, a
diferencia de lo que se ha descrito para la mayoría de las regiones vinícolas estudiadas
tradicionalmente (Ruiz et al., 2010; González-Arenzana et al., 2012; Pérez-Martín et al.,
2015), las especies de BAL predominantes en los vinos de la variedad Albariño cultivada en
esta región pertenecen al género Lactobacillus y no a la especie O. oeni que, además, no se ha
encontrado en FML en ninguno de los años analizados. Sin embargo, nuestros datos coinciden
con los de algunas regiones vinícolas estudiadas recientemente para las que también se han
descrito como predominantes las especies del género Lactobacillus (Bravo-Ferrada et al.,
2013; Testa et al., 2014; Henríquez-Aedo et al., 2016).
Los primeros estudios sobre bacterias malolácticas llevados a cabo en Galicia, y

pioneros en España, se realizaron en el laboratorio del Prof. Tomás G. Villa (Universidad de
Santiago) en vinos de las sub-zonas de Rosal y Condado do Tea (Sieiro et al., 1990) situadas
al sur de la D.O. Rías Baixas. Estos vinos se elaboran con una mezcla de variedades de uva,
mayoritariamente Albariño y Treixadura en la primera de ellas y Albariño y Loureira en la
segunda. El estudio de estas zonas, junto con el presentado en este trabajo sobre la sub-zona
Val do Salnés, situada más al norte de la D.O., y cuyos vinos están elaborados exclusivamente
con la variedad Albariño, ponen de manifiesto que la especie O. oeni no solo no es dominante
ni lleva a cabo la FML en ninguna de las sub-zonas, sino que se encuentra en muy baja
proporción con respecto a las otras especies aisladas. Sin embargo, analizando el resto de las
especies encontradas se aprecia una importante variabilidad entre las sub-zonas del sur y la del
norte. Así, mientras en las comarcas de Rosal y Condado do Tea aparece un único género
(Lactobacillus) alternativo a Oenococcus, la comarca Val do Salnés muestra una mayor
diversidad con tres géneros alternativos distintos (Lactobacillus, Lactococcus y Pediococcus).
Además, analizando las especies del género compartido por las dos zonas (Lactobacillus) se
observa que, excepto L. plantarum, que es la mayoritaria en las comarcas del sur, pero
minoritaria en la del norte, el resto de las especies difieren en Val do Salnés de las aisladas en
las comarcas del sur. Estos datos pueden ser explicados por las conclusiones a las que han
llegado recientemente Bokulich et al. (2014) en un estudio metagenómico sobre los vinos
blancos y tintos del Napa Valley (California), que demuestra una adaptación de las
comunidades microbianas a la variedad de uva y, sobre todo, a la zona vinícola.
95
3.6. Caracterización enológica de las cepas de bacterias lácticas
3.6.1. Actividad maloláctica
La baja frecuencia de aislamiento de BAL en la región vinícola estudiada podría estar

relacionada con las constatadas dificultades en la consecución de la FML en los vinos de la
misma. Por otra parte, el hecho de que la especie O. oeni ni es predominante en esta región ni
se ha aislado en la fermentación maloláctica, cuestiona la idoneidad de los starters comerciales
existentes para conducir la fermentación maloláctica en los vinos de Albariño de esta región.
A ello hay que añadir que se ha demostrado que el éxito de un starter depende de la cepa
utilizada y de su adaptación a las condiciones específicas de cada vino (Ruiz et al., 2010). Por
todo ello, en el presente trabajo se planteó evaluar el potencial de las BAL aisladas en esta
región para ser utilizadas en la consecución de la FML.
Varios criterios se han establecido para la selección de cepas BAL como cultivos
iniciadores en enología (Volschenk et al., 2006). Un rápido crecimiento en vino, una elevada
actividad maloláctica, la no producción de aminas biógenas (principalmente histamina) o
aromas desagradables, entre otros, son factores importantes a considerar para esta selección.
Para llevar a cabo la caracterización enológica de las bacterias lácticas aisladas en este
trabajo, en una primera selección se escogieron los aislados que mostraron mejor crecimiento
en los medios de laboratorio y agar vino, y que presentaron un perfil diferente de asimilación
de azucares en la prueba API 50CH: 1 aislado de la especie L. plantarum (UVI-9), 2 aislados
de O. oeni (UVI-25), 3 aislados de la especie L. paracasei (UVI-2, UVI-3 y UVI-5) y 10
aislados de la especie L. hilgardii (UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-17, UVI-18, UVI-
20, UVI-21, UVI-23 y UVI-26).
Se descartaron todos los aislados pertenecientes a la especie P. damnosus ya que,

debido a su débil crecimiento, no permitieron alcanzar en los medios de laboratorio las
densidades celulares adecuadas para la inoculación de las microvinificaciones. Con las cepas
seleccionadas (16) se llevó a cabo un ensayo de microvinificación en vino Albariño de esta
región y los resultados sobre el consumo de ácido málico y producción de ácido láctico y ácido
acético se muestran en la Tabla 6.
96
Del total de cepas de bacterias ácido lácticas incluidas en el estudio, el 50% (8) fueron
capaces de llevar a cabo una fermentación maloláctica satisfactoria tras 15 días de incubación
a 22 ºC, alcanzando una reducción en el contenido de ácido málico de más de un 75% (Fig.
19), dejando su concentración por debajo de 1,5 g/L. La actividad maloláctica fue altamente
variable entre y dentro de las especies estudiadas, desde un 2,67% en la cepa UVI-3 a un 76,7%
en la cepa UVI-17 (Fig. 19).
Tabla 6: Ensayos de microvinificación con las cepas seleccionadas: Concentración de ácido málico,
ácido láctico, y acidez volátil tras 15 días de fermentación a 22 ºC.
Cepa Ácido málico g/L Ácido láctico g/L Acidez volátil g/L b
Control a 3,95 (± 0,39) 0,67 (± 0,43) 0,21 (± 0,01)
UVI-2 (L. paracasei) 0,98 (± 0,11) 3,40 (± 0,07) 0,12 (± 0,01)
UVI-3 (L. paracasei) 3,65 (± 0,07) 0,08 (± 0,04) 0,22 (± 0,00)
UVI-5 (L. paracasei) 2,48 (± 0,25) 1,95 (± 0,28) 0,18 (± 0,00)
UVI-9 (L. plantarum) 3,48 (± 0,04) 0,10 (± 0,00) 0,23 (± 0,01)
UVI-13 (L. hilgardii) 3,58 (± 0,04) 0,08 (± 0,04) 0,22 (± 0,01)
UVI-14 (L. hilgardii) 1,23 (± 0,04) 3,68 (±0,04) 0,21 (± 0,03)
UVI-15 (L. hilgardii) 3,55 (± 0,07) 0,03 (± 0,04) 0,23 (± 0,01)
UVI-16 (L. hilgardii) 3,55 (± 0,07) 0,03 (± 0,04) 0,22 (± 0,01)
UVI-17 (L. hilgardii) 1,03 (± 0,04) 4,00 (± 0,07) 0,22 (± 0,01)
UVI-18 (L. hilgardii) 1,05 (± 0,00) 3,35 (± 0,14) 0,11 (± 0,03)
UVI-20 (L. hilgardii) 1,18 (± 0,04) 3,93 (± 0,04) 0,23 (± 0,01)
UVI-21 (L. hilgardii) 1,10 (± 0,14) 3,78 (± 0,25) 0,16 (± 0,02)
UVI-23 (L. hilgardii) 1,08 (± 0,11) 3,90 (± 0,00) 0,19 (± 0,01)
UVI-24 (O. oeni) 3,55 (± 0,07) 0,03 (± 0,04) 0,23 (± 0,00)
UVI-25 (O. oeni) 3,48 (± 0,04) 0,18 (± 0,04) 0,23 (± 0,01)
UVI-26 (L. hilgardii) 4,03 (± 0,25) 0,83 (± 0,18) 0,33 (± 0,01)
Medias ± desviación estándar.
a: Vino sin inocular; b: acidez volátil expresada como g/L de ácido acético.
Los aislados pertenecientes a la especie O. oeni (UVI-24 y UVI-25) incluidos en este

estudio no mostraron actividad maloláctica apreciable, en contra de los numerosos estudios en
los cuales O. oeni es la especie que mejor conduce la fermentación maloláctica. En nuestro
caso, fueron los aislados incluidos dentro del género Lactobacillus los que mejor rendimiento
maloláctico proporcionaron.
97
Las cepas que mostraron mayor actividad se incluyen dentro de la especie

Lactobacillus hilgardii, a excepción de la cepa UVI-2, perteneciente a la especie Lactobacillus
paracasei. Otra cepa de esta especie, UVI-5 (L. paracasei), fue capaz de reducir el contenido
de ácido málico en un 50%. Es importante destacar que la acidez volátil no sufrió
modificaciones importantes con ninguna de las cepas ensayadas.
100
90
Consumo de ác. málico (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aislado
Figura 19: Porcentaje total de ácido málico consumido por cada uno de los aislados tras 15 días de
incubación a 22 ºC.
Estos resultados son consistentes con los obtenidos por Juega et al. (2009) en vinos
blancos Albariño y Caíño, en los cuales ni las cepas autóctonas de O. oeni ni las comerciales,
inoculadas al final de la fermentación alcohólica, fueron capaces de llevar a cabo una
fermentación maloláctica satisfactoria. Du Toit et al. (2011) describen también una mejor
actividad maloláctica de varias especies de Lactobacillus frente a la obtenida tras la
inoculación de O. oeni en vinos con un pH superior a 3,5, como es el caso del vino empleado
en el presente estudio (pH 3,8).
En el presente estudio se confirma, por lo tanto, que L. hilgardii no solo es capaz de

llevar a cabo la fermentación maloláctica en vino blanco Albariño, sino que lo hace con un
rendimiento similar a otras especies de Lactobacillus, como L. paracasei, que cuenta con un
historial más amplio en cuanto a su utilización como cepa para conducir la FML, y mejor que
los aislados pertenecientes a la especie O. oeni.
98
3.6.2. Formación de ABs
Las bacterias lácticas son consideradas las principales responsables del incremento en
aminas biógenas de los vinos (Landete et al., 2007). Las aminas biógenas, dependiendo de su
concentración, pueden ocasionar numerosos efectos adversos sobre la salud (Shalabay, 1996).
En concreto, la histamina da lugar a una toxicidad significativa, sobre todo en personas con
especial sensibilidad (Landete et al., 2005).
Por ello, esta capacidad debe ser testada a la hora de proponerlas como estárteres
malolácticos. La habilidad para la síntesis de las tres principales aminas biógenas presentes en
los vinos (histamina, tiramina y putrescina) (García-Ruiz et al., 2011) fue evaluada en las ocho
cepas que mostraron una mayor actividad maloláctica. En una primera aproximación se intentó
poner de manifiesto esta capacidad a nivel molecular mediante la amplificación por PCR de
los genes hdc (histidina descarboxilasa implicada en la ruta de síntesis de histamina), odc
(ornitina descarboxilasa implicada en la síntesis de putrescina) y tdc (de la ruta de síntesis de
tiramina) de acuerdo con el protocolo de De las Rivas et al., 2005. Los resultados se muestran
en la Fig. 20.
pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000 - 11 12
A 700 -
2000 -
B 1500 -
500 -
C
300 -
Figura 20: Amplificación de los genes tdc (A), odc (b) y hdc (B) en las BAL seleccionadas. M: 1 kb
Ladder (Biorom); 1: Control positivo (A: L. brevis CECT 5354 para el gen tdc, B: L. helveticus CECT
403 para el gen odc y C: L. rhamnosus CECT 288 para el gen hdc); 2: UVI-14; 3: UVI-5; 4: UVI-20;
5: UVI-17; 6: UVI-18; 7: UVI-21; 8: UVI-23; 9: UVI-22; 10: UVI-2.
99
Al tratar de amplificar el gen tdc se obtuvo una banda de menor tamaño al esperado y
que sí se amplificó en el control positivo L. brevis CECT 5354 con su tamaño correcto (Fig.
20A). Ante lo dudoso de este resultado, tres de la bandas amplificadas se secuenciaron
comprobándose, efectivamente, que no corresponden a la tirosina descarboxilasa, por lo que
este método no resultó concluyente para las especies L. hilgardii y L. paracasei. El gen odc
solo fue amplificado en la cepa UVI-5 y en la cepa de L. helveticus CECT 403 empleada como
control positivo, encontrándose ausente en el resto de las cepas estudiadas (Fig. 20B). Por
último, el gen hdc no fue amplificado a partir de ninguna de las cepas analizadas
comparativamente con la cepa L. rhamnosus CECT 288 utilizada como control positivo (Fig.
20C). Estos datos coinciden con los obtenidos por Nisiotou et al. (2004) quienes también
encontraron una muy baja presencia del gen codificante para la histidina descarboxilasa en
bacterias lácticas.
En segundo lugar, la capacidad de las citadas 8 cepas para liberar aminas biógenas al
vino fue estudiada mediante LC/MS-MS. La separación completa de las tres aminas biógenas
en muestras de vino se llevó a cabo satisfactoriamente usando cromatografía de interacción
hidrofílica (HILIC). Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Presencia de los genes hdc, odc y tdc, y concentraciones de histamina, tiramina y putrescina
detectadas en los análisis de vino mediante LC/MS-MS, tras 15 días de fermentación con las cepas de
bacterias ácido lácticas seleccionadas.
Cepa Especie Aminas biógenas†
hdc odc tdc

UVI-2 L. paracasei - - nd (0,035)
UVI-5 L. paracasei - + nd (0,065)
UVI-14 L. hilgardii - - nd
UVI-18 L. hilgardii - - nd (0,152)
† Presencia (+) o ausencia (-) de los genes tdc, odc y/o hdc (incremento en concentración de la
correspondiente amina biógena frente al control, en mg/L). nd: no detectado. SD < 0,01.
100
Se observó un incremento en los niveles de tiramina en el caso de las cepas de L.

paracasei UVI-2 y UVI-5 y en dos cepas de L. hilgardii (UVI-18 y UVI-22), no detectándose
en el resto de las cepas de L. hilgardii. No se ha encontrado incremento en los niveles de
putrescina ni histamina con ninguna de las cepas analizadas.
En los vinos inoculados con la cepa UVI-5, que presenta el gen odc, no se detectó
putrescina, lo que puede ser explicado teniendo en cuenta que el incremento significativo en
aminas biógenas en el vino depende no solo de la capacidad de la cepa para producirlas sino
de la concentración de los precursores presentes en el mismo (Lonvaud-Funel, 2001). Esto
explica también que la concentración de aminas biógenas sea habitualmente superior en vinos
tintos que en blancos en los que estos precursores aparecen generalmente en menor
concentración (Bauzá et al., 1995; Smit et al., 2008).
El análisis de los resultados obtenidos en relación a la capacidad para producir aminas

biógenas por parte de las cepas estudiadas confirma que se trata más de una característica de
la cepa que de la especie, no solo para el género Lactobacillus sino también para las cepas de
O. oeni (Landete et al., 2005), sosteniendo la necesidad de estudiar este carácter para la
selección de starters malolácticos y confirmando la idoneidad de las cepas seleccionadas de
las especies del género Lactobacillus para ser empleadas como cultivos iniciadores.
3.6.3. Determinación de la capacidad de degradación de ABs
Se ha demostrado que algunas bacterias del ácido láctico pueden degradar aminas
biógenas mediante enzimas amino oxidasas (Capozzi et al., 2012). Esta característica está
considerada también de interés en los estárteres malolácticos. Utilizando el método descrito
por Callejón et al. (2014) se intentó determinar la capacidad para sintetizar enzimas amino
oxidasas en las cepas malolácticas seleccionadas. La ausencia de éstas tras los análisis
realizados descartan la capacidad para degradar aminas biógenas en las cepas de bacterias
lácticas incluidas en dicho análisis.
101
3.6.4. Actividades β-glucosidasa y descarboxilasa de ácidos fenólicos
La influencia de la FML en la composición aromática del vino ha sido puesta de

manifiesto por diferentes autores (Pérez-Martín et al., 2012; Michlmayr y Keneyfel, 2014).
Entre las principales ventajas atribuidas a las especies del género Lactobacillus a la hora de
considerarlas como posibles starters cabe destacar su potencial capacidad para sintetizar
enzimas implicadas en el perfil aromático de los vinos. Entre las enzimas con mayor impacto
en los aromas están las β-glucosidasas y las descarboxilasas de ácidos fenólicos diferenciando,
en este sentido, favorablemente al género Lactobacillus del género Oenococcus.
Teniendo en cuenta que en los genomas de las especies de L. paracasei y L. hilgardii

hay genes que codifican β-glucosidasas, esta actividad se testó, en un valor medio del rango
de condiciones desfavorables en que transcurre la fermentación en la bodega (18 ºC, pH 4),
para las ocho cepas que presentaron carácter maloláctico y los resultados se muestran en la
Tabla 8.
Todas las cepas producen actividad β-glucosidasa, en cantidades variables

dependiendo de la cepa, destacando la cepa de L. paracasei UVI-2. Muchos precursores de los
aromas se encuentran en forma de moléculas glicosiladas sensorialmente imperceptibles
(Michlmayr et al., 2010). La actividad de las β-glucosidasas puede liberar la aglucona
olfativamente activa que contribuye al perfil sensorial de los vinos (Palmeri y Spagna, 2007).
En consecuencia, las cepas malolácticas caracterizadas en este estudio podrían contribuir a
potenciar y diferenciar el perfil aromático de los vinos de la región estudiada, aportando
tipicidad a los mismos.
Tabla 8: Actividad β-glucosidasa en las ocho cepas seleccionadas por su actividad maloláctica.
Cepa Especie Actividad β-glucosidasa (U)*

UVI-2 L. paracasei 36,9 (± 1,7)
UVI-5 L. paracasei 23,6 (± 5,0)
UVI-14 L. hilgardii 14,7 (± 0,8)
* Media (± SD).
102
A pesar del gran número de estudios sobre O. oeni, son escasas las referencias acerca
de la actividad β-glucosidasa tanto en L. paracasei como en L. hilgardii. Marazza et al. (2008)
encontraron actividad β-glucosidasa en cepas de L. paracasei, con una gran variabilidad entre
las cepas estudiadas, y Honi et al. (2013) y Pérez-Martin et al. (2012) encontraron dicha
actividad en cepas de L. paracasei aisladas de productos lácteos. Hasta donde nosotros
sabemos, solamente el estudio de Pérez-Martin et al. (2012) analiza cepas vínicas de la especie
L. hilgardii en busca de actividad β-glucosidasa, obteniendo resultados negativos, aunque
Mtshali et al. (2010) han demostrado la presencia de genes codificantes para esta enzima en
cepas vínicas de L. hilgardii, lo que es consistente con los resultados obtenidos en este estudio.
Además, algunos autores han estudiado esta actividad en especies cercanas, como L. casei
(Coulon et al., 1998) o L. plantarum (Sestelo et al., 2004; Spano et al., 2005).
Las bacterias malolácticas pueden también metabolizar ácidos fenólicos presentes en

el vino mediante descarboxilasas de ácidos fenólicos. De las Rivas et al. (2009) encontraron
una relación directa entre la presencia del gen que codifica una descarboxilasa de ácidos
fenólicos y la capacidad de las bacterias ácido lácticas para producir fenoles volátiles a partir
de ácidos hidroxicinámicos. Para determinar la capacidad para liberar fenoles volátiles por
parte de las bacterias malolácticas caracterizadas en este trabajo, se testó la presencia en su
genoma del gen pdc que codifica una descarboxilasa de ácidos fenólicos. Los resultados se
muestran en la Fig. 21, comparativamente con el control positivo (L. brevis CECT 5354), en
la que se puede observar que ninguna de las cepas analizadas es portadora del gen pdc.
pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
400 -
300 -
200 -
Figura 21: Amplificación mediante PCR del gen pdc. M: Marcados 100 pb Bioron Plus Ladder; 1: L.
brevis CECT 5354; 2: UVI-21; 3: UVI-20; 4: UVI-23; 5: UVI-17; 6: UVI-18; 7: UVI-14; 8: UVI-5; 9:
UVI-2.
103
Los fenoles volátiles producidos por las bacterias malolácticas pueden añadir
complejidad aromática al vino o impactar negativamente en sus características sensoriales
dependiendo de su concentración (Mtshali et al., 2010). En concreto, en algunos estudios, se
ha cuestionado la idoneidad de L. hilgardii como bacteria maloláctica de interés al atribuírsele
la capacidad de impactar negativamente en el aroma del vino debido a la producción de fenoles
volátiles (du Toit et al., 2011). Al igual que en otras características estudiadas, nuevamente,
en este caso, se demuestra que se trata de una propiedad de la cepa más que de la especie y,
las caracterizadas en este estudio, no presentarían el riesgo referido anteriormente.
En resumen, el estudio ecológico de la diversidad de bacterias lácticas asociadas a

mostos y vinos de la región Val do Salnés (Denominación de origen Rías Baixas) se presenta
en este trabajo. Los aislados fueron agrupados en 4 géneros y 6 especies: L. hilgardii, L.
paracasei, L. plantarum, L. lactis, P. damnosus y O. oeni. A diferencia de lo descrito para la
mayoría de las regiones vinícolas las especies predominantes fueron L. hilgardii, L. paracasei
y L. plantarum y no O. oeni.
La capacidad de 16 aislados para conducir la FML en las condiciones y características

de los vinos de esta región se evaluó en microfermentaciones. Ocho de las cepas estudiadas
mostraron una capacidad notable para consumir ácido málico (30-78%) sin incrementar los
niveles de ácido acético. Estas cepas fueron caracterizadas, además, por su capacidad para
incrementar el contenido en aminas biógenas del vino demostrándose que cinco carecen de
capacidad aminogénica y el resto incrementa alguna de las aminas biógenas probadas en
cantidades muy bajas y, en cualquier caso, muy inferiores a los valores permitidos más
restrictivos.
Por otra parte, la capacidad para producir fenoles volátiles que pudieran afectar
negativamente al aroma del vino fue descartada en las ocho cepas que mostraron actividad
maloláctica. Por último, tanto las cepas de L. hilgardii como L. paracasei mostraron capacidad
para producir β-glucosidasa en distintas concentraciones por lo que podrían contribuir a
mejorar y diferenciar el perfil aromático de los vinos de la región estudiada confiriéndoles
tipicidad. Los resultados muestran que las cepas del género Lactobacillus seleccionadas en
este trabajo (en particular L. paracasei UVI-2 y L. hilgardii UVI-23) son buenas candidatas
104
para estudios de vinificación a escala piloto y ser propuestas como nuevos starters
malolácticos autóctonos.
105
CAPÍTULO II
CAPÍTULO II Introducción
BACTERIAS MALOLÁCTICAS COMO AGENTES DE BIOCONTROL
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Microorganismos fitopatógenos y alterantes de los alimentos
El desarrollo de determinados hongos, bacterias y/o levaduras tanto en vegetales como

en productos alimenticios supone un problema, tanto en términos económicos como de salud
pública, de escala global.
En agricultura, el desarrollo de estos microorganismos puede darse en dos etapas del

procesado, en cada una de las cuales muestra efectos claramente diferenciados; se trata de la
etapa pre-cosecha, en la que la infección por fitopatógenos y sus consecuentes daños se
producen sobre la planta, y la etapa post-cosecha, en la que la infección se da sobre los frutos,
o los productos derivados de la etapa anterior. En ambos casos, la aplicación de agentes para
el control de los microorganismos implicados es diferente, siendo la regulación especialmente
restrictiva en el segundo caso, al tratarse de productos más próximos al consumo (Janisiewicz
y Korsten, 2002; Hasan et al., 2013; Abdel-Aziz et al., 2014; Mari et al., 2014).
En productos alimenticios, la proliferación de microorganismos indeseados es

favorecida por dos factores principales: la elevada cantidad de agua en muchos de ellos,
especialmente en frutas y verduras, y las pequeñas heridas o cortes que sirven de vía de entrada
a estos microorganismos y que aparecen como resultado de la inevitable manipulación, ya sea
en su origen, en su distribución o en su venta, lo que suele desembocar en el deterioro del
mismo, y con ello en su descarte (Spadaro y Gullino, 2004; Trias et al., 2008a).
El desarrollo de estos microorganismos en alimentos y, especialmente, los productos

resultantes de su metabolismo, alteran las características sensoriales de los mismos (Remenant
et al., 2015). Estas alteraciones pueden ser daños físicos, alteraciones químicas como
oxidaciones y cambios en la coloración, apariciones de aromas desagradables o el desarrollo
de texturas indeseadas como viscosidad (Gram et al., 2002).
Concretamente, la proliferación de levaduras indeseadas tiene especial impacto en

derivados lácteos como queso o yogurt, mientras que los vegetales y las frutas son
109
especialmente afectados por hongos filamentosos como Fusarium, Alternaria o Botritis

(Maurya et al., 2015).
1.2. Impacto económico
El desarrollo de hongos filamentosos, bacterias y levaduras indeseadas supone una de

las principales causas de deterioro de alimentos y cultivos (Gerez et al., 2013; Mari et al.,
2014).
Las pérdidas debidas a la proliferación de microorganismos se estiman en torno a un

25% de la producción mundial de alimentos (Gram et al., 2002) y de un 50% en países en vías
de desarrollo, por la falta de instalaciones adecuadas de almacenaje (Nunes, 2012). En
agricultura, se ha estimado que la proliferación de los hongos causa entre un 5 y un 10% de
pérdidas en la producción mundial total (Rouse et al., 2008) y que el 25% de los cultivos
alimentarios mundiales se ven afectados por estos microorganismos (www.FAO.org). Como
ejemplo, se estima que las pérdidas derivadas del desarrollo de hongos en el pan es de en torno
a 250 millones de euros solo en la parte occidental de Europa (Schnürer y Magnusson, 2005).
1.3. Implicaciones sobre la salud
Incluso cuando el crecimiento de estos organismos no alcanza el punto de obligar a

desechar el producto alimenticio, su mera presencia puede suponer un serio peligro para la
salud humana en base a las sustancias tóxicas que pueden sintetizar, de las cuales se conocen
efectos como la inducción de tumores o la supresión del sistema inmune (Filtenborg et al.,
1996; Sathe et al., 2007).
La producción de toxinas es el principal problema asociado a la proliferación

incontrolada de hongos. Éstas se engloban en seis clases: aflatoxinas, fumonisinas,
acratoxinas, patulinas, tricotecenos y zearalenonas, las cuales presentan una amplia variedad
de efectos nocivos sobre la salud, entre los que destacan la carcinogénesis, la hepatotoxicidad,
la inmunotoxicidad o la neurotoxicidad (Dalié et al., 2010).
En el caso de las bacterias, los efectos del consumo de determinadas especies son de
sobra conocidos y expuestos en la bibliografía médica. Las infecciones por Salmonella, por
110
ejemplo, pueden causar dolores abdominales, náusea, vómito y diarrea, mientras que aquellas
producidas por Clostridium presenta un cuadro clínico que va desde una diarrea acuosa con
dolores abdominales de diferente intensidad, a una enterocolitis hemorrágica necrosante (Acha
y Szyfres, 2005).
1.4. Deterioro causado por hongos
Los hongos filamentosos son microorganismos que aparecen habitualmente asociados

al deterioro de productos agroalimentarios como frutas, patatas, queso o cereales (Schürer y
Magnuson, 2005; Hasan et al., 2013). Entre estos, los más habituales son incluidos dentro de
los géneros Botritis, Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium, Phytophthora o
Penicillium (Filtenborg et al., 1996; Sathe et al., 2007).
Especies de Fusarium son importantes contaminantes pre-cosecha en plantaciones de

cereal y grano. En éstas, pueden dar lugar a toxinas como el deoxinivalenol, capaz de soportar
sin degradarse todo el procesado post-cosecha, y llegar al consumidor final en industrias como
la cervecera (Filtenborg et al., 1996). Aspergillus o Penicillium aparecen ya en el
almacenamiento post-cosecha, especialmente en frutas y cereales, y pueden también producir
toxinas (Ström, 2005; Rouse et al., 2008).
En enología, los hongos pueden tener un impacto variable. Su presencia puede ser
considerada positiva en determinados vinos (por ejemplo, el vino Mâcon del Domaine de la
Bongran, elaborado tras la contaminación con Botritis), sin embargo, en la mayoría de los
casos son tratados como contaminantes que han de ser erradicados, a fin de evitar la pérdida
total del producto. Especies de Aspergillus aparecen habitualmente asociadas a la uva.
Concretamente, A. niger, supone la especie de Aspergillus más común en este fruto, siendo
además una de las principales fuentes de ocratoxina A (Hocking et al., 2007). En la vid, los
principales hongos patógenos incluyen las especies Botritis cinerea, Uncinula necátor (Oídio),
Plasmopara vitícola (Mildiu o “Mildew”), Guignardia bidwellii (podredumbre negra o “Black
rot”), Phomopsis vitícola (excoriosis de la vid), Eutipa lata (Cantoral y Collado, 2011) y
Fusarium oxysporum (Omer et al., 1999).
Aunque las referencias a este tipo de hongos es mucho menor, la proliferación

incontrolada de levaduras puede llevar también a una caída importante en la calidad del
111
producto, especialmente en alimentación (Huis in’t Veld, 1996). La presencia de algunas

especies de los géneros Rhodotorula, Zygosaccharomyces o Candida están a menudo
asociadas al deterioro de frutas y verduras (Rouse et al., 2008), así como especies de los
géneros Zygosaccharomyces, que aparecen asociados a contaminaciones de vinos (Alonso et
al., 2015) o Yarrowia, en leche y carnes (Nagy, 2014), lo que hace que su control sea también
un aspecto importante en el procesado de dichos productos.
1.5. Deterioro causado por bacterias
Ciertos géneros o especies bacterianos presentan la misma problemática mencionada

anteriormente, asociada a su desarrollo indeseado o incontrolado en productos alimenticios.
Escherichia coli, Bacillus cereus, Salmonella sp. o Staphylococcus aureus son habitualmente
encontrados en productos alimenticios (Pepe et al., 2003), lo que supone un grave riesgo para
la salud humana por su largo historial patológico.
Desde el punto de vista de la alteración organoléptica de los productos alimenticios,

el abanico de especies con efectos negativos es aún más amplio. Por ejemplo, especies de
Enterococcus, como E. faecium y E. faecalis, aparecen habitualmente asociados al
reverdecimiento de productos cárnicos, y especies de Leuconostoc como L. gelidum o L.
mesenteroides, pueden producir gas y sustancias viscosas (Remenant et al., 2015).
Esta problemática se ve agravada cuando la contaminación se produce con especies

psicrófilas o psicrotolerantes, cuyo control con los métodos convencionales de conservación
en frio se hace imposible. Es el caso de Brochothrix thermosphacta, importante contaminante
de productos cárnicos por su capacidad para crecer a 4 ºC, y en condiciones anaerobias
(Gribble et al., 2014) o del género Listeria, capaz de crecer en las condiciones de conservación
anteriormente descritas, y que tiene importantes implicaciones sobre la salud (Fang et al.,
2013).
112
1.6. Control de microorganismos indeseados
1.6.1. Control químico y su problemática
En la permanente lucha contra los agentes que afectan tanto a la industria agrícola
como a la alimentaria, a menudo y de manera recurrente se han empleado pesticidas de origen
químico como mecanismo de control frente a las bacterias, hongos, nematodos o insectos que
las causan. Así, es habitual el empleo de organofosforados, carbamatos y/o hidrocarburos
clorados en el tratamiento o prevención de plagas en cultivos (Koul, 2011). Sin embargo,
muchos de estos compuestos permanecen inalterados a lo largo de la cadena alimentaria,
alcanzando al consumidor final, además de las graves implicaciones medioambientales que
supone su uso indiscriminado.
Tras la cosecha, y en productos alimenticios procesados, los principales compuestos

químicos empleados para el control de microorganismos indeseados son el ácido benzoico y
el benzoato de sodio. El antibiótico natamicina, que es empleado para el control de levaduras,
es efectivo también contra algunos hongos filamentosos y es empleado habitualmente en la
conservación de queso (Schnürer y Magnusson, 2005). En el caso de las bacterias es habitual
el uso de metabisulfito potásico en frutas y vino, o de nitratos y nitritos en carnes
(http://www.fao.org/).
A pesar de que el empleo de conservantes químicos es, a menudo, la principal opción

para el tratamiento o prevención de este tipo de problemas (Spadaro y Gullino, 2004; Nunes,
2012), el consumidor demanda cada vez más el uso de bioconservantes debido a los riesgos
que los primeros suponen para la salud, en forma de alergias o problemas gástricos (Ström,
2005; Sathe et al., 2007; Gerez et al., 2013), así como el posible o probable efecto
carcinogénico de algunos de ellos (Guyton et al., 2015).
La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, del inglés

“International Agency for Research on Cancer”), organismo perteneciente a la Organización
Mundial de la Salud, clasifica a muchos de estos compuestos en 5 categorías (Guyton et al.,
2015):
- Grupo 1 (Carcinógeno para humanos)

- Grupo 2A (Probable carcinógeno para humanos)
113
- Grupo 2B (Posible carcinógeno para humanos)

- Grupo 3 (No es clasificable en cuanto a carcinogenicidad en seres humanos)
- Grupo 4 (Probablemente no carcinógeno para los seres humanos)
Así, por ejemplo, pesticidas como el malatión, insecticida de uso generalizado en todo
el mundo, se encuentran en el grupo 2A, y fungicidas como el clorotalonil, es clasificado como
posible carcinógeno (Grupo 2B).
Sus efectos sobre el medio ambiente alimentan también la discrepancia en torno a su

empleo, así como la aparición de cepas patógenas resistentes a los mismos (Mari et al., 2014)
y motivan la búsqueda de nuevos agentes de biocontrol frente a estos microorganismos
(Spadaro y Gullino, 2004; Schnürer y Magnusson, 2005; Hasan et al., 2013). Todo esto se
suma al hecho de que muchos de ellos no pueden ser aplicados una vez realizada la cosecha
(Trias et al., 2008) por lo que la tendencia de los diferentes gobiernos es a la restricción de su
empleo.
1.6.2. Control biológico
El empleo de organismos vivos y/o productos derivados de los mismos para el control
de plagas, pestes y microorganismos indeseados para la industria alimentaria y agrícola, ha
experimentado un fuerte auge en los últimos 150 años. Esto se ha reflejado en un incremento
de un 10% anual del mercado de este tipo de productos, frente al 1-2% de incremento de
aquellos basados en agentes químicos (Koul, 2011).
Agentes de control biológico (ACB) incluyen bacterias, hongos, virus, y/o nematodos,
que han demostrado una elevada eficiencia en el control de organismos perniciosos, con el
valor añadido de ser poco o nada nocivos para el medio ambiente.
Se han establecido 3 clases de agentes de biocontrol (Chandler et al., 2011):
- ACB bioquímicos: se trata de metabolitos de plantas que son empleados de forma

natural por las mismas para evitar el ataque de los herbívoros. En más empleado es el aceite
de neem que actúa como insecticida natural.
114
- ACB semioquímicos: un agente semioquímico consiste en una señal producida por un

organismo, que altera el comportamiento de individuos de la misma o diferentes especies. Un
ejemplo de esto son las feromonas sexuales de insectos, tratándose también de uno de los ACB
semioquímicos más ampliamente empleados.
- ACB microbianos: emplean organismos vivos e incluyen bacterias, hongos, virus, y/o
nematodos, y que han demostrado una elevada eficiencia en el control de agentes perniciosos,
con el valor añadido de ser poco o nada nocivos para el medio ambiente. Uno de los más
empleados es Bacillus thuringiensis, que produce una endotoxina que resulta nociva para los
insectos una vez entra en su sistema digestivo. En el caso de los antifúngicos, destacan especies
del género Trichoderma (AgroGuard® WG - LST S.A.-), Candida, como C. oleophila (Aspire®
-Ecogen-) o C. sake (Candifruit® -IRTA-), del género Pseudomonas (Bio-Save® -JET Harvest
Solutions-) o de Bacillus (Rhizo-Plus® -FZB Biotechnik GmbH-) entre otros (Mari et al.,
2014).
Recientemente, Di Francesco et al. (2016) revisaron los 4 mecanismos de control

biológico de agentes microbianos: competencia por los nutrientes y el espacio, antibiosis,
resistencia inducida y parasitismo.
La competencia entre microorganismos supone la ventaja competitiva del agente de

biocontrol sobre el agente patógeno. Para ello, el primero ha de crecer rápidamente, reduciendo
así la disponibilidad de nutrientes para el patógeno (Nunes et al., 2012).
En el grupo de los mecanismos mediados por antibiosis, Di Francesco et al. (2016)

incluyen a todas aquellas sustancias que inhiben el desarrollo de microorganismos, sin ser
necesariamente antibióticos propiamente dichos. Así, destacan la iturina, producida por
Bacillus sp., o la pirrolnitrina y la siringomicina, producidas por especies Pseudomonas
(Nunes, 2012). En otro orden dentro de este grupo, aparecen los compuestos orgánicos
volátiles, como el 2-metil-1-butanol y el 3-metil-1-butanol, producidos por Aureobasidium
pullulans y que son activos frente a Botritis o Penicillium. Otras sustancias como el peróxido
de hidrógeno, reuterina o ácidos orgánicos como el ácido fenil-láctico han sido también
descritos como agentes inhibidores del desarrollo de diversos microorganismos patógenos
(Dalié et al., 2010).
115
La resistencia inducida se basa en la estimulación por parte del agente de biocontrol,

de la activación de enzimas defensivas, refuerzo de paredes celulares o producción de
compuestos antimicrobianos en la planta tratada (Janisiewickz y Korsten, 2002; Nunes et al.,
2012).
El parasitismo es un mecanismo que se da especialmente sobre hongos, al suponer la

adhesión del agente de biocontrol a las hifas, sobre las que induce algún tipo de cambio o
bloquea su acceso a los nutrientes, reduciendo así su viabilidad (Nunes, 2012; Di Francesco et
al., 2016).
Nunes (2012) definió 9 parámetros de interés para la selección de un agente

microbiano de biocontrol:
- El agente ha de ser genéticamente estable

- Debe ser efectivo a bajas concentraciones
- Debe sobrevivir bajo condiciones ambientales adversas
- Tener requerimientos nutricionales simples
- Barato de producir
- Fácil de aplicar
- Compatible con las técnicas de procesado
- No patógeno para la salud humana
1.6.2.1. Biocontrol mediante bacterias del ácido láctico
La capacidad de las bacterias lácticas para el biocontrol de estos organismos

perjudiciales, ya sean bacterias, hongos filamentosos y/o levaduras, ha sido descrita
previamente en cepas de diferentes orígenes (Laitila et al., 2002; Lowe et al., 2004; Schnürer
y Magnusson, 2005; Ström, 2005; Rouse et al., 2007; Hassan y Bullerman, 2008a; Trias et al.,
2008; Sathe et al., 2007; Dalié et al., 2010).
A pesar de que en numerosas ocasiones, su presencia en productos alimenticios y

agrícolas conduce a un deterioro de los mismos, especialmente cuando su presencia es
incontrolada (Remenant et al., 2015), son varias las especies de BAL que han sido empleadas
116
para evitar o reducir el impacto que los microorganismos más perniciosos tienen sobre estos
productos.
Las BAL además, cumplen la mayor parte de los criterios establecidos por Nunes
(2012) para la selección de agentes de biocontrol mencionados en el apartado anterior, a
excepción de sus necesidades nutricionales, que a menudo son relativamente complejas
aunque dependen de la cepa utilizada. Sin embargo, las condiciones que encuentran en la
mayor parte de los productos alimenticios proporcionan aquellas sustancias que las BAL
necesitan para su desarrollo, al tratarse muchos de ellos del hábitat natural de estos
microorganismos, como es el caso de frutas y verduras, o derivados de los mismos (Douillard
y de Vos, 2014).
Estos microrganismos son capaces de liberar un gran número de sustancias

antimicrobianas como bacteriocinas, ácidos orgánicos (fundamentalmente láctico), peróxido
de hidrogeno, etc., que actúan sobre el resto de microrganismos presentes en el medio,
inhibiendo su desarrollo total o parcialmente (Schnürer y Magnusson, 2005; Ström, 2005;
Sathe et al., 2007; Garcha et al., 2012). Por ejemplo, muchas BAL son capaces de producir
peróxido de hidrógeno que, como se ha mencionado, es un importante compuesto
antimicrobiano, así como ácido acético, diacetilo, etc. (Ström, 2005), si bien su presencia en
productos alimentarios puede resultar perjudicial.
Quizás los compuestos antimicrobianos más ampliamente estudiados sean aquellos de

naturaleza proteica. A pesar de que los efectos antibacterianos de las BAL están ampliamente
documentados, existen pocos autores que hayan evidenciado la síntesis de agentes fungicidas
de esta naturaleza (Schnürer y Magnusson, 2005). El efecto, posiblemente sinérgico de estos
compuestos, junto con otros que a menudo son producidos por estas bacterias (reuterina,
diacetil, dióxido de carbono, etc.), proporcionarían el efecto antimicrobiano de algunas de
estas bacterias (Schnürer y Magnusson, 2005).
Las especies de Lactobacillus, L. plantarum (Laitila et al., 2002; Sathe et al., 2007;
Trias et al., 2008), L. paracasei (Hassan y Bullerman, 2008), L. acidophilus (Garcha et al.,
2012), L. casei o L. fermentum (Wang et al., 2011) así como especies del género Pediococcus:
P. pentosaceus (Rouse et al., 2008) y Lactococcus: L. lactis (Trias et al., 2008), han
117
demostrado su eficiencia en el biocontrol de hongos, levaduras y bacterias causantes de

contaminaciones alimenticias, así como en especies perniciosas en la industria agrícola.
Todo esto, sumado a su consideración de microorganismos GRAS (del inglés

“Generally Regarded As Safe”) los convierte en candidatos idóneos para su empleo en las
industrias alimentaria y agrícola.
1.7. Microorganismos como promotores del crecimiento vegetal
La interacción entre las plantas y la microbiota de su entorno tiene un efecto crucial

para el desarrollo de las primeras. Como se ha mencionado, la presencia de microorganismo
patógenos conlleva cuantiosas pérdidas ya sea por la pérdida del o de los frutos producidos
por la especie vegetal, como por una significativa reducción de las tasas de crecimiento de las
mismas.
Sin embargo, a menudo la presencia de microorganismos asociados a los vegetales,

especialmente a las raíces, tiene un efecto positivo sobre su desarrollo. Existen varios
mecanismos para la promoción del crecimiento vegetal por parte de microorganismos entre
los que destacan la síntesis de hormonas vegetales, o la mejora de la captación de nutrientes a
través de la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfato inorgánico o la mineralización
de fosfatos orgánicos (Shrestha et al., 2014; Giassi et al., 2016).
Los microorganismos más estudiados para esta finalidad han sido los asociados a la
rizosfera. Concretamente, especies de los géneros Bacillus, Azospirillum o Rhizobium han
demostrado tener efectos beneficiosos sobre la germinación y sobre el crecimiento de
determinadas plantas (Vaikuntapu et al., 2014; Giassi et al., 2016). Aunque en menor medida,
varios autores han estudiado también la capacidad de las BAL para la estimulación del
crecimiento vegetal. Concretamente, Limanska et al. (2013) pusieron de manifiesto esta
habilidad sobre plántulas de tomate y Shrestha et al. (2014) mostraron que cepas de bacterias
lácticas eran capaces de estimular el crecimiento de plantas de pimiento, lo que justifica la
búsqueda de efectos fitoestimuladores entre algunas de las bacterias lácticas aisladas de otros
orígenes, en particular de las aisladas en el capítulo anterior.
118
CAPÍTULO II Materiales y Métodos
2.1. Cepas de bacterias, hongos filamentosos y levaduras utilizadas en este estudio
Para comprobar el efecto antimicrobiano de las cepas aisladas e identificadas en el

capítulo anterior sobre bacterias, levaduras y hongos, se emplearon las cepas testigo
relacionadas en la Tabla 1:
Tabla 1: Cepas empleadas en la determinación del efecto antimicrobiano de las bacterias lácticas.
Microorganismo Especie Cepa
Aspergillus niger CECT 2088

Hongos filamentosos
Fusarium oxysporum subsp. lycopersici CECT 2715
Saccharomyces cerevisiae UVI-SC (Nuestro laboratorio)

Levaduras
Cándida glabrata CECT 1448
Bacillus cereus CECT 193

Bacillus thuringiensis CECT 4497
Bacterias
Staphylococcus epidermidis CECT 231
Staphylococcus aureus subsp. aureus CECT 4439
Xanthomonas campestris CECT 97
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo
Las cepas de bacterias ácido lácticas (BAL) utilizadas fueron aquellas pertenecientes
a las especies Lactobacillus hilgardii (UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-17, UVI-18,
UVI-20, UVI-21, UVI-23 y UVI-26), Lactobacillus plantarum (UVI-6, UVI-8 y UVI-10),
Lactobacillus paracasei (UVI-3, UVI-5, UVI-1, UVI-2, UVI-7, UVI-11, UVI-12 y UVI-19)
y Lactococcus lactis (UVI-27).
2.2. Medios de cultivo
Medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, Panreac): ver composición en el Capítulo 1,
Sección 1.1. Este medio fue utilizado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas de
bacterias ácido lácticas.
119
Medio Glucosa-Sabouraud (Panreac): D (+)-Glucosa 40 g/L, Peptona 10 g/L. Este

medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas comerciales de hongos
filamentosos.
Medio Mueller-Hinton (Panreac): Almidón 1,5 g/L, Infusión de carne 2 g/L y Peptona
de caseína hidrolizada 17,5 g/L. Este medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento
de las cepas de los géneros Xanthomonas, Staphylococcus y Bacillus.
Caldo Nutritivo (Panreac) suplementado con MRS (MRS-CN): Extracto de carne 3

g/L y Peptona de gelatina 5 g/L, pH 6,7. Este medio fue suplementado con medio MRS
(Panreac) a un 50% de la concentración recomendada por el fabricante. Este medio fue
empleado para los ensayos de inhibición in vitro.
Medio YEPD: Extracto de levadura 20 g/L, Peptona bacteriológica 10 g/L, Glucosa

20 g/L. Este medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de las levaduras.
Para la elaboración de medio sólido se añadió, en todos los casos, agar a una
concentración de 20 g/L. Todos los medios, tanto sólidos como líquidos, fueron esterilizados
mediante autoclave a 121 ºC y 1,1 atmósferas de presión, durante 15 min.
2.3. Determinación in vitro del efecto antagónico de las BAL frente a bacterias y
levaduras
La estimación del antagonismo entre las bacterias lácticas seleccionadas y las bacterias
objeto de biocontrol se llevó a cabo en medio MRS+CN a fin de permitir el crecimiento de
todos los microorganismos ensayados, lo cual fue verificado previamente.
Las bacterias susceptibles de inhibición se cultivaron en el medio de cultivo y

temperaturas adecuadas hasta alcanzar la fase exponencial. A continuación se preparó una
suspensión de 106 células/mL empleando la escala McFarland y 100 µL de la misma se
sembraron por extensión en placas Petri de 90 x 15 mm. Paralelamente, las cepas de bacterias
lácticas se cultivaron también en el medio apropiado, a 30 ºC, hasta la fase exponencial de
crecimiento y se preparó una suspensión de las mismas a una concentración de 106 células/mL.
Cinco microlitros de esta suspensión se depositaron sobre la placa sembrada con la bacteria a
120
inhibir y fue incubada a la temperatura óptima de crecimiento de las bacterias susceptibles de

inhibición (recomendada por el proveedor) durante 48 h.
La determinación del antagonismo frente a levaduras se realizó en placas de medio

YEPD. Para ello, las levaduras se cultivaron previamente en medio YEPD líquido hasta
alcanzar una densidad de 106 células/mL y se siguió el mismo método descrito anteriormente
para bacterias. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
2.4. Determinación in vitro del efecto antagónico de las BAL frente a hongos
filamentosos
La determinación de la capacidad antagónica de las cepas de bacterias lácticas frente

a los hongos se llevó a cabo placas Petri de 60 x 15 mm, y en medio MRS, previa
comprobación de que los dos tipos de microorganismos se desarrollan en el citado medio. Para
ello, los hongos filamentosos (Tabla 1) fueron previamente cultivados en MRS líquido, a las
temperaturas recomendadas por el proveedor.
Una vez crecidos éstos, se realizó un raspado de la superficie de los mismos y se añadió
solución salina (NaCl 0,8%) a fin de obtener una suspensión de esporas o conidios que fue
posteriormente ajustada a 104 conidios/mL.
La suspensión celular de las cepas de BAL seleccionadas para el estudio fue obtenida
como se ha indicado en el apartado anterior. La densidad celular de cada una de las cepas de
bacterias lácticas se ajustó a 106 células/mL.
Para el ensayo en placa se añadió una gota de 5 µL de la suspensión de conidios a un

centímetro del borde de la placa. Del mismo modo, se depositó una gota de 5 µL de suspensión
de la cepa de bacteria láctica correspondiente en el extremo opuesto de la placa y, de nuevo, a
un centímetro del borde de la misma. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.
Este ensayo se realizó contemplando dos variantes: en una de ellas se sembraron las
bacterias y los hongos simultáneamente, mientras que en la otra se estableció un tiempo de
incubación de 48 h entre la inoculación de las bacterias y la de los hongos (en ese orden).
Como controles, se dispusieron placas sembrando cada uno de los hongos, como se indicó
121
anteriormente, sin la presencia de bacterias. En ambos casos, las placas se incubaron durante
72 horas en el caso de A. niger y 144 h en el caso de F. oxysporum, a 28 ºC.
2.5. Determinación in vivo del antagonismo BAL – F. oxysporum
Una vez seleccionadas las BAL en base a su capacidad para el biocontrol in vitro de
F. oxysporum, se realizó un ensayo para determinar su potencial aplicación en cultivos reales.
Al tratarse de un hongo patógeno, entre otros cultivos, del tomate, se emplearon semillas de
Lycopersicum esculentum de la variedad Marmande Cuarenteno (Eurogarden Iberica S.A.)
como modelo para llevar a cabo los ensayos in vivo.
Para el ensayo de germinación de las semillas se siguió el protocolo descrito por

Browne y Cooke (2005). Se analizó el efecto que la presencia del hongo tiene sobre la
germinación de las semillas de dicha especie y la capacidad de las bacterias lácticas L.
plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12 para reducir o inhibir tal efecto, para lo cual se
siguió también el método descrito por Browne y Cooke (2005). Para ello, se procedió a realizar
una cobertura de las semillas con los microorganismos. Las semillas fueron previamente
esterilizadas por inmersión en NaClO al 2,5% durante 2 min y posteriormente lavadas con
agua destilada estéril. Se tomaron 30 semillas por tratamiento y se realizaron 4 tratamientos.
Los controles consistieron en un tratamiento sin cobertura de BAL, donde las semillas se
mantuvieron en agua corriente estéril; un tratamiento con cobertura de hongo F. oxysporum,
donde las semillas se incubaron durante 6 h en una suspensión densa de conidios (108
conidios/mL) de dicho hongo, en solución salina estéril; y dos tratamientos con la cobertura
fúngica descrita anteriormente a la que se sumó la cobertura de la correspondiente suspensión
de bacterias lácticas (L. plantarum UVI-10 o L. paracasei UVI-12) a una densidad de 106
células/mL mediante pulverizado.
La tasa de germinación se calculó tras el recuento de las semillas que, después de 6

días de incubación, mostraron una longitud de raíz de al menos 0,5 cm.
Por otra parte, se analizó el efecto que la presencia del hongo tiene sobre plantas de
tomate y la capacidad de las BAL para reducir dicho efecto, para lo cual se siguió el protocolo
descrito por Omar et al. (2006) con algunas modificaciones. Las semillas se mantuvieron a
remojo durante 3 h, tras lo cual se trasladaron a un germinador donde se mantuvieron durante
122
5 días, en oscuridad. Posteriormente se trasladaron a cultivo en sustrato natural Compo Sana®

Universal (Nutrientes: N = 200 - 450 mg/L, P2O5 = 200 - 500 mg/L, K2O = 1500 - 2200 mg/L,
pH = 5,0 - 6,5) donde se desarrollaron durante 10 días. Transcurrido este tiempo fueron
trasplantadas a macetas individuales de 4 x 4 cm con el mismo sustrato.
Tras 4 días de adaptación post-trasplante, se inoculó en la base del tallo 1 mililitro de

una suspensión de conidios (108 conidios/mL) de F. oxysporum, tras lo cual se añadió en la
base de la planta un mililitro de una suspensión de la correspondiente cepa láctica (L. paracasei
UVI-12 o L. plantarum UVI-10) a una densidad celular de 106 células/mL en agua corriente
estéril.
Todas las plantas fueron regadas cada 4 días con 13 mL de agua corriente estéril por
planta, aplicada desde la base de la maceta para evitar el lavado de bacterias, y con un mililitro
de suspensión bacteriana (106 células/mL) aplicada en la base del tallo. Cada tratamiento
estuvo conformado por 13 réplicas. Se establecieron dos controles: uno de ellos tratado solo
con el hongo, inoculado del modo y a la densidad antes mencionados, y otro sin adición de
hongo ni de bacteria.
El experimento se desarrolló durante 30 días al cabo de los cuales se cosecharon las

plantas y se determinó su peso seco (Wilson et al., 1999; Vaikuntapu et al., 2014).
2.6. Determinación del efecto fitoestimulador de las BAL
Se procedió también a determinar si las BAL seleccionadas podían mostrar un efecto

estimulador sobre el desarrollo de las plantas de tomate. Para la determinación del efecto
estimulador de la germinación de las semillas y el efecto promotor del crecimiento en la planta
tras la germinación se siguieron los protocolos descritos en el apartado anterior disponiendo
un experimento adicionando cada una de las BAL probadas y un control sin ningún aditivo.
El experimento se desarrolló, como en el apartado anterior, durante 30 días.
123
2.7. Metodología de análisis realizados y tratamiento estadístico
El grado de inhibición del crecimiento de las bacterias y levaduras probadas por parte
de las cepas lácticas bajo estudio se determinó mediante la medición del radio del halo de
inhibición de las mismas en torno a la gota de la suspensión de las BAL.
En el caso del antagonismo BAL- hongo filamentoso, esta determinación se llevó a

cabo mediante la estimación del radio de la colonia del segundo, medido en dirección al centro
del inóculo de la bacteria láctica correspondiente. Se determinó el centro de la colonia fúngica
en los primeros estadios de crecimiento, en los cuales presenta una morfología circular. Este
punto se trasladó a siguientes puntos de medida en los que la colonia adquiere forma ovalada
debida, por un lado a la inhibición si la hubiese, y por otro, al contacto con el límite de la placa
Petri. De esta manera se garantiza la toma de datos desde el centro real de la colonia, evitando
el desplazamiento de este por el crecimiento en una u otra dirección.
En ambos casos, la medidas se tomaron empleando el programa de edición fotográfica

Adobe® Photoshop® CS3 versión 10.0.
Los análisis estadísticos fueron realizados empleando el programa SPSS® Statistics

versión 22 (IBM® Corp.). En todos los casos, se llevó a cabo una comparación de medias
mediante ANOVA y el test Dunnet (Gerez et al., 2013), aceptando un nivel de significación
del 95% (p ≤ 0,05) tras la comprobación de normalidad mediante la prueba Kolmogorov-
Smirnov y asumiendo igualdad de varianzas.
124
CAPÍTULO II Resultados y Discusión
Numerosos alimentos y cultivos son altamente perecederos debido en parte a que su

superficie y/o composición suponen un hábitat idóneo para determinados microorganismos,
cuyo desarrollo generalmente desemboca en la pérdida total o parcial de los mismos
(Remenant et al., 2015).
En estos nichos ecológicos, los microorganismos comparten espacio y compiten por

los nutrientes de forma natural, lo que ha estimulado en estos el desarrollo de mecanismos que
les proporcionen una ventaja competitiva, facilitando así su supervivencia (Gram et al., 2002).
A ello hay que añadir que cuando los microorganismos desarrollados son determinados hongos
filamentosos, su capacidad para producir toxinas puede convertir al alimento en un producto
tóxico (Cheong et al., 2014).
Para evitar este problema, convencionalmente, se utilizan preservativos químicos que

inhiben el desarrollo de los citados microorganismos pero que no están exentos de efectos
adversos para los humanos, el resto de los animales, ni para el medio ambiente (Mnif y Ghribi,
2015). En consecuencia, en particular en la Unión Europea, la legislación que regula el uso de
los pesticidas se hace cada vez más restrictiva (Chandler et al., 2016). Además, un problema
añadido al ya expuesto es la constante aparición de resistencias frente a los pesticidas químicos
desarrollados (Varsha y Nampoothiri, 2016). Debido a ello existe un interés creciente en la
búsqueda y desarrollo de nuevos preservativos naturales, carentes de riesgos, para reemplazar
a los tratamientos químicos. Este interés se ve intensificado por el hecho de que los
consumidores están cada vez más concienciados del problema y sus riesgos y demandan
alimentos más seguros (Kivanç et al., 2011).
El biocontrol y la biopreservación hacen referencia al uso de microrganismos o

sustancias antimicrobianas producidas por estos para ser utilizadas en el control de plagas
agrícolas o para prolongar la vida útil de los alimentos (Koul et al., 2011). Las bacterias ácido
lácticas (BAL) forman parte de la microbiota asociada a muchos de los hábitats mencionados
en el primer párrafo y han desarrollado múltiples formas de competencia frente a hongos y
bacterias de su entorno (Trias et al., 2008; Dalié et al., 2010; Gerez et al., 2013; Emerenini et
al., 2014). La producción de ácidos orgánicos, sustancias antimicrobianas o peróxido de
hidrógeno son algunos de estos mecanismos y conducen a una inhibición total o parcial del
125
crecimiento del microorganismo competidor, cuando no a su muerte (Schnürer y Magnusson,

2005).
La consideración de las BAL como microorganismos GRAS, sumado a esta propiedad

demostrada de inhibición de determinados microorganismos patógenos, justifica que puedan
ser utilizadas como agentes biopreservativos y/o de biocontrol. Aunque la capacidad de
biocontrol mostrada por las BAL ha sido puesta de manifiesto en cepas procedentes de
productos lácteos o asociadas a distintos vegetales (Cheong et al., 2014; Sathe et al., 2007;
Askari et al., 2012), nunca se había estudiado con anterioridad en cepas ácido lácticas de
mostos y vinos. Muchas de estas cepas, provenientes de la vid, están adaptadas al ambiente
hostil que representa el vino, con escasez de nutrientes, elevadas concentraciones de etanol y
SO2.
3.1. Antagonismo BAL - bacteria y BAL – levadura
Con objeto de determinar el posible efecto antimicrobiano de las cepas de bacterias

lácticas asociadas a la fermentación maloláctica de los vinos, de entre las cepas caracterizadas
en el Capítulo 1, se escogieron 22 para este ensayo. Dadas las dificultades de crecimiento que
manifiestan algunas cepas de este origen, la selección se realizó, en primer lugar, atendiendo
a este criterio y escogiendo las que presentaban una mayor tasa de crecimiento y, en segundo
lugar, a la diversidad específica optando por cuatro especies distintas: L. plantarum, L.
hilgardii, L. paracasei, y L. lactis.
Como microorganismos susceptibles de inhibición se eligieron las siguientes cepas de

especies de bacterias y levaduras de importancia ambiental o que pueden comportarse como
patógenos y/o alterantes de alimentos: Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Xanthomonas campestris, Saccharomyces
cerevisiae y Candida glabrata.
La actividad antimicrobiana de las cepas de BAL frente a las bacterias y levaduras

escogidas como testigos se puso de manifiesto y se cuantificó mediante el bioensayo en placa
de antagonismo microbiano descrito en Materiales y Métodos. La Fig. 1 muestra algunos
ejemplos de los halos obtenidos y el conjunto de los resultados se presentan en la Tabla 2.
126
Figura 1: Halos de inhibición mostrados por algunas de las cepas lácticas frente a Bacillus cereus CECT
193 (A) y Bacillus thuringiensis CECT 4497 (B).
Tabla 2: Efecto antagónico mostrado por cada una de las cepas objeto de estudio en función del halo
de inhibición.
Cepas testigo
Cepa
BAL B. cereus B. thuringiensis
S. S. X. S.
C. glabrata
epidermidis aureus campestris cerevisiae
UVI-26 * ** - - - - -
UVI-13 - * - - - - -
UVI-14 * ** - - - - -
UVI-15 * *** - - - - -
L. hilgardii UVI-16 * ** - - - - -
UVI-17 * * - - - - -
UVI-18 * * - - - - -
UVI-20 * ** - - - - -
UVI-21 ** - - - - - -
UVI-23 * ** - - - - -
UVI-6 - nd *** ** - - -
L. plantarum UVI-8 - - - - - - -
UVI-10 - ** ** ** - - -
UVI-3 * * * ** - - -
UVI-5 - * * ** - - -
UVI-1 * * ** *** - - -
UVI-2 *** nd - - - - -
L. paracasei
UVI-7 * * ** ** - - -
UVI-11 * * *** ** - - -
UVI-12 * * ** *** - - -
UVI-19 * * ** ** - - -
L. lactis UVI-27 *** nd *** ** - - -
(-) no inhibición; (*) radio de inhibición < 3,6 mm; (**) radio de inhibición entre 3,6 y 6,1 mm, (***) radio de
inhibición > 6,1 mm; (nd) no determinado.
127
En primer lugar se observa que ninguna de las cepas ensayadas fue capaz de inhibir el
desarrollo de las levaduras probadas, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Rouse
et al. (2007) quienes fueron también incapaces de inhibir el crecimiento de cepas de los
géneros Saccharomyces o Cándida, mediante el empleo de una cepa de L. plantarum. En este
estudio se demuestra, además, que las especies L. hilgardii, L. paracasei y L. lactis tampoco
tienen capacidad para inhibir el crecimiento de las levaduras.
En segundo lugar, se aprecia también que ninguna de las cepas probadas tiene
capacidad para inhibir a la bacteria Gram negativa X. campestris, patógena de plantas. En este
sentido, Anas et al. (2008) describen un mayor efecto inhibidor frente a bacterias Gram
positivas que sobre Gram negativas tras la aplicación de varias cepas de Lactobacillus,
observación que concordaría con los resultados del presente estudio. Sin embargo, la ausencia
de efectos inhibitorios sobre dicha bacteria fitopatógena discrepa con otros resultados descritos
previamente en los que se aprecia un importante antagonismo de algunas cepas de L.
plantarum o L. casei frente a esta especie (Visser et al., 1986, Trias et al. 2008).
Con respecto a las cepas Gram positivas utilizadas como testigo, se observa que todas
ellas fueron inhibidas por, al menos, una de las especies de bacterias lácticas mencionadas
anteriormente apreciándose, además, una elevada variabilidad intraespecífica tanto en el grado
de inhibición como en el espectro de actividad. Es destacable también que una de las cepas
lácticas probadas, L. plantarum UVI-8, no mostró capacidad para inhibir a ninguno de los
microorganismos testigo. Esta cepa, aunque no tendría utilidad aplicada, podría ser de gran
interés en próximos estudios encaminados a dilucidar el/los mecanismos de inhibición
utilizados por las cepas efectivas.
Es destacable la especificidad de la especie L. hilgardii, que inhibe solamente a las

cepas del género Bacillus (Fig. 2); tanto B. cereus, patógeno tradicional alterante de alimentos
como, B. thuringiensis, considerado recientemente por la EFSA (Allende et al., 2016) de igual
potencial riesgo para la salud pública. Hasta donde nosotros sabemos, esta es la primera vez
que se describe el efecto inhibidor de esta especie de bacteria láctica frente al género Bacillus.
En contraposición, las cepas de L. plantarum probadas en este trabajo resultaron más efectivas
frente al género Staphylococcus, tanto para la especie patógena S. aureus como para S.
epidermidis que, aunque comensal, puede comportarse como oportunista (Otto et al., 2009) y,
128
recientemente, ha sido descrita como responsable de los elevados niveles de histamina

encontrados en algunos vinos (Benavent-Gil et al., 2016).
La mayor efectividad, considerando tanto el grado de inhibición como el número de

especies inhibidas, fue mostrada por las cepas de L. lactis y L. paracasei. L. paracasei mostró
antagonismo frente a un abanico más amplio de cepas testigo, manifestando efectos
inhibitorios sobre las 4 especies Gram positivas ensayadas, si bien el mayor efecto fue
detectado frente a las especies del género Staphylococcus. Aunque Anas et al. (2008) habían
demostrado previamente el potencial de esta especie láctica para la inhibición de S. aureus,
hasta el momento no había sido descrito su efecto antagónico frente a las especies B. cereus,
B. thuringiensis y S. epidermidis.
Diferentes estudios han mostrado el efecto antagonista de las BAL de distintos

orígenes frente a microorganismos patógenos (Anas et al., 2008; Amin et al., 2009; Askari et
al., 2012). Khandakar et al. (2014) describen un antagonismo variable de ciertas cepas de BAL
aisladas de derivados lácteos frente a S. aureus. Esta misma variabilidad fue encontrada por
Kivanç et al. (2009) al testar la capacidad inhibitoria de 24 cepas de L. plantarum aisladas de
boza (bebida a base de trigo fermentado) frente a cepas patógenas entre las que se encontraban
S. aureus y B. cereus.
Figura 2: Distribución interespecífica de las medidas de los halos de inhibición frente a cada uno de las
de las cepas testigo. Los resultados se muestran como la media entre los radios de cada especie ± SD.
129
El presente trabajo, estudiando las bacterias procedentes de la fermentación

maloláctica de los vinos, confirma que tanto el espectro de actividad como el poder inhibitorio
son dependientes de la cepa, ya no sólo entre las cepas de la especie L. plantarum, sino en la
totalidad de las especies probadas en el mismo. Esto indica la necesidad de la caracterización
a este nivel, previa a un posible empleo de estos microorganismos como agentes
bioprotectores.
Aunque con anterioridad habían sido descritas las propiedades de algunas

bacteriocinas producidas por bacterias lácticas de origen vínico (Saad et al., 1993; Navarro et
al., 2000; Ndlovu, 2015; Dündar, 2016), la actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas
procedentes de la fermentación maloláctica de los vinos no había sido estudiada hasta ahora.
La actividad antibacteriana mostrada por las cepas lácticas aisladas de este origen las convierte
en microorganismos con potencial interés como agentes biopreservativos. Esta propiedad
puede tener, en primer lugar, un gran interés durante el propio proceso de elaboración de los
vinos ya que podría permitir una reducción en la cantidad de conservantes químicos añadidos
a los mismos, particularmente SO2, cuyos efectos perjudiciales para la salud han sido
fehacientemente constatados (Lester, 1995). Este interés se ve incrementado debido a la
capacidad, puesta de manifiesto en este trabajo, de algunas cepas de bacterias lácticas para
inhibir el desarrollo de la especie S. epidermidis, responsable del incremento en aminas
biógenas de algunos vinos (Benavent-Gil et al., 2016) hecho que, además, enfatiza la
importancia y el interés del género Lactobacillus para preparar estárteres malolácticos. Pero
además, la caracterización de la actividad antimicrobiana de diferentes especies de bacterias
lácticas (además de la más estudiada hasta ahora, L. plantarum), permitió seleccionar distintas
cepas de amplio espectro así como otras más específicas, identificando nuevas especies
efectivas frente a microorganismos alterantes no deseables. Estas cepas, utilizadas de manera
individual o bien combinadas entre ellas o con cepas de otros orígenes, podrían ser utilizadas
como conservantes naturales, seguros, para reemplazar a productos sintéticos y alargar la vida
útil de los alimentos.
3.2. Antagonismo BAL - hongo filamentoso
Distintas especies de Lactobacillus, Lactococcus o Pediococcus de diferentes fuentes

han mostrado importantes efectos inhibidores sobre el crecimiento de determinados hongos
130
(Hamed et al., 2011; Gerez et al., 2013; Gomah y Zohri, 2014) debido a su capacidad para
producir y liberar metabolitos como reuterina, ácidos orgánicos como el ácido láctico, o
compuestos fenólicos (Dalié et al., 2010) o a la producción de sustancias antifúngicas de
naturaleza proteica (Gerez et al., 2013). Sin embargo, la posible capacidad antifúngica de las
bacterias lácticas procedentes del vino no había sido estudiada con anterioridad. Por esta razón,
se decidió probar también en este trabajo el posible efecto inhibitorio de las bacterias
malolácticas sobre hongos fitopatógenos y/o alterantes de alimentos.
Para llevar a cabo el estudio se seleccionaron las cepas lácticas de L. paracasei y L.

plantarum por ser las que presentaron en el estudio anterior un más amplio espectro de acción
y un mayor grado de inhibición frente a las bacterias. Como hongos susceptibles de ser
inhibidos se escogieron los hongos filamentosos Aspergillus niger y Fusarium oxysporum, dos
hongos fitopatógenos, que pueden aparecer también como contaminantes de semillas y como
alterantes de frutos post-cosecha y alimentos (Tournas, 2005) y cuyo desarrollo acarrea
importantes pérdidas en agricultura. Concretamente, el segundo de ellos ha sido clasificado en
el 5º puesto del ranking de hongos patógenos de plantas elaborado por Dean et al. (2012).
Ambos están emergiendo además, como potenciales patógenos humanos, especialmente en
pacientes inmunodeprimidos (Schuster et al., 2002; Nucci y Anaissie, 2007).
La actividad antimicrobiana de las cepas de bacterias lácticas frente a los hongos

escogidos como testigos se puso de manifiesto y se cuantificó mediante el bioensayo en placa
de antagonismo microbiano descrito en Materiales y Métodos. El efecto antagónico en este
bioensayo se estimó en base la reducción del radio de la colonia del hongo enfrentada al cultivo
de la bacteria láctica probada, comparativamente con el control. El grado de inhibición se
estimó a las 144 horas de incubación, al ser este el momento en el que se alcanzaron los valores
máximos, y a partir de los cuales se apreció una leve reducción de la misma, posiblemente por
la entrada en fase de declive de las BAL ensayadas.
Para cada bacteria probada se realizaron dos ensayos, uno en el que el hongo y la
bacteria se sembraron simultáneamente y otro en el que se cultiva la bacteria previamente
durante 48 h, antes de sembrar el hongo. Un ejemplo de este bioensayo se muestra en la Fig.
3 y el conjunto de los resultados se presentan en las Fig. 4 y 5.
131
A B
Figura 3: Efecto antimicrobiano de la cepa L. plantarum UVI-10 frente F. oxysporum (B) y control
mostrando el crecimiento normal del hongo en ausencia de la bacteria (A).
Primeramente se observa que ninguna de las cepas bajo estudio fue capaz de inhibir
al hongo Aspergillus niger, cuyo crecimiento alcanzó a cubrir la placa de medio de cultivo en
menos de 72 horas, sin apreciarse reducción de su desarrollo en aquellas que contenían
suspensión de BAL. Este resultado concuerda con un estudio llevado a cabo por Hassan y
Bullerman (2008), en el que ninguna de las cepas de bacterias lácticas ensayadas, y aisladas
de estárteres comerciales de levadura, fue capaz de reducir el crecimiento de A. niger NRRL
326. Su rápido desarrollo en medio MRS podría estar detrás de esta observación, al no permitir
la proliferación suficiente de las bacterias y con ello la formación de las sustancias
antimicrobianas implicadas en la inhibición. Sin embargo, parece más probable que sea debido
a la incapacidad de las cepas probadas para sintetizar sustancias inhibitorias ya que, la
inhibición del crecimiento de este hongo por parte de cepas de bacterias lácticas como L. casei
o L. plantarum ha sido descrito en otras ocasiones (Dalié et al., 2010; Gerez et al., 2013).
Todas las cepas ensayadas, en cambio, fueron capaces de inhibir in vitro el

crecimiento de Fusarium oxysporum, en mayor o menor grado, tanto cuando fueron pre-
incubadas durante 48 h antes de sembrar el hongo, como cuando fueron inoculadas
simultáneamente.
132
Figura 4: Inhibición del crecimiento de F. oxysporum, expresado como % de reducción del radio de la
colonia en presencia de cada una de las cepas lácticas ensayadas tras la inoculación simultanea de ambos
microorganismos (barras de rayas) y con una incubación de 48 horas de la batería láctica previa a la
inoculación del hongo (barras de puntos). Se presenta la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias
significativas (p ≤ 0,05) entre las dos modalidades de inoculación antes mencionadas.
Si tomamos las cepas en su conjunto y comparamos los dos ensayos para cada una de
ellas (Fig. 4), se observa que para 4 (UVI-3, 5, 7 y 10), el efecto inhibitorio es
significativamente mayor cuando las bacterias tienen la posibilidad de desarrollarse antes de
enfrentarse al hongo, sin embargo, para las otras cuatro no; aunque en todos los casos parece
detectarse una tendencia en el sentido de un efecto favorecedor de la pre-incubación de la
bacteria antes de la inoculación del hongo.
Comparando el grado de inhibición del hongo por parte de las distintas cepas de
bacterias lácticas, sin (Fig. 5A) y con (Fig. 5B) pre-cultivo de la bacteria láctica, se observa
una cierta variabilidad en el poder inhibitorio de las distintas cepas probadas, manifestada por
las diferencias significativas encontradas ente ellas, siendo el grado de inhibición del hongo
superior al 44% en todos los casos. Las diferencias oscilan entre un 44% para la cepa UVI-5
y un 55% para la cepa UVI-10, en el caso del ensayo en el que la bacteria y el hongo se
siembran simultáneamente y, entre un 56% para la cepa UVI-12 y un 76% para la cepa UVI-
7, en el caso del ensayo en el que la bacteria se incuba previamente. Cuando se comparan estos
resultados con los mejores datos obtenidos por otros autores con cepas de otros orígenes, se
constata una vez más la alta eficacia antifúngica en el caso de las bacterias malolácticas. Laitila
133
et al. (2002) describen inhibiciones de F. oxysporum de en torno al 50%, mientras que en

nuestro caso es posible alcanzar hasta un 76 % cuando las cepas son previamente cultivadas
durante 48 horas. A este hecho hay que añadir que Wang et al. (2011) demuestran un marcado
efecto del pH sobre la actividad antifúngica antes mencionada, con una drástica caída a partir
de valores de pH superiores a 6. En el caso del presente estudio, los ensayos fueron realizados
a pH 6,7, por lo que presumiblemente la actividad antifúngica mostrada por las cepas bajo
estudio podría ser incluso superior a pH más ácido.
Figura 5: Inhibición del crecimiento de F. oxysporum en presencia de cada una de las cepas lácticas
ensayadas tras la siembra simultanea de ambos microorganismos (A) y con una incubación de 48 horas
de la bacteria láctica previa siembra del hongo (B). Se presenta la media ± SD. Letras diferentes indican
diferencias significativas (p ≤ 0,05).
En estudios previos, la capacidad de las bacterias lácticas para inhibir a las especies
del genero Fusarium resultó controvertida. Los trabajos llevados a cabo por Hassan y
Bullerman (2008) revelaron un importante efecto inhibidor de cepas de L. paracasei, aisladas
a partir de boza, sobre dos especies de Fusarium (F. graminearum, F. proliferatum). En
cambio, en el lado contrario, Gomah y Zohri (2014) obtuvieron una escasa o nula reducción
del crecimiento de F. graminearum, F. proliferatum y F. culmorum al aplicar cepas de la
especie L. plantarum. En el presente trabajo se demuestra la efectividad de las bacterias
lácticas de origen vínico sobre este género al inhibir las cepas de L. plantarum y L. paracasei
el desarrollo de la especie F. oxysporum.
134
Si bien cepas de L. plantarum de distintos orígenes han sido estudiadas en diferentes

trabajos como herramientas de biocontrol de hongos fitopatógenos (entre ellos Fusarium y
más concretamente F. oxysporum y patógenos de humanos), mostrando un importante efecto
inhibidor en la mayoría de los casos (Schürer y Magnusson, 2005; Rouse et al., 2007; Dalié et
al., 2010), en el caso de L. paracasei, a excepción del trabajo llevado a cabo por Liang et al.
(2010) estudiando una cepa de origen humano, no existen prácticamente datos respecto al
antagonismo de esta especie frente a F. oxysporum.
La actividad antifúngica de las bacterias lácticas ha sido atribuida, en particular en el

género Lactobacillus, a su capacidad para producir y liberar metabolitos como reuterina,
ácidos orgánicos como el ácido láctico, o compuestos fenólicos (Dalié et al., 2010), así como
a la producción de sustancias antifúngicas de naturaleza proteica (Gerez et al., 2013). Es
además probable que otros compuestos estén implicados, como por ejemplo las enzimas
quitinolíticas, que pueden tener una marcada actividad antifúngica (García-Fraga et al., 2015).
Esta actividad enzimática ha sido descrita en L. lactis (da Silva et al., 2016, in press) y la
presencia de secuencias codificantes de estas proteínas demostrada en otras cepas/especies del
género Lactobacillus (LOCK919_0612, LOCK919_0378). El efecto combinado y sinérgico
de algunos, o de todos, estos factores sería el responsable del espectro de actividad (generando
una mayor o menor especificidad de acción), así como de la variabilidad en los niveles de
efectividad antimicrobiana.
Las cepas de L. plantarum y L. paracasei de origen vínico estudiadas en el presente

trabajo mostraron una actividad antifúngica frente a F. oxysporum variable, confirmando que
la capacidad inhibitoria responde a una especificidad a nivel de cepa, de ahí la necesidad y el
interés de los estudios a este nivel. En cuanto a la efectividad mostrada, no solo puede
considerarse competitiva respecto a la descrita para otras cepas, sino que en algunos casos
superan la presentada por cepas de otros orígenes estudiadas con anterioridad. Todo ello las
convierte en cepas de potencial utilidad para el biocontrol de F. oxysporum en cultivos y
productos post-cosecha. Por otra parte, su actividad antifúngica en combinación la actividad
antibacteriana demostrada en el apartado anterior, incrementa su potencial interés como
agentes biopreservativos. Su demostrada incapacidad para inhibir el crecimiento de A. niger y
de las levaduras probadas en este estudio, les confiere un cierto grado de especificidad si se
comparan con otras cepas de más amplio espectro (Hassan y Bullerman, 2008; Rouse et al.,
135
2008; Gerez et al., 2013), propiedad ésta que depende también de la cepa, justificando
nuevamente el screening a este nivel, y que puede considerarse muy deseable de cara a su uso
como bioconservantes en productos en cuya elaboración y/o composición se requiere la
presencia de hongos o levaduras viables, como en el caso del queso, pan o vino. Además de
las ya mencionadas ventajas, en relación con la seguridad alimentaria, del uso de las bacterias
lácticas como bioconservantes alternativos a los productos sintéticos, su desarrollo puede tener
otros beneficios. Gomah y Zohri, (2014) y Shi et al. (2014), demostraron que además del efecto
antifúngico, el crecimiento de estas bacterias junto al hongo alterante puede acarrear un
importante descenso en la producción de micotoxinas (entre el 50 y el 75%), así como una
reducción de su concentración por la unión de estas a la biomasa bacteriana (Dalié et al., 2010).
De gran interés para un futuro próximo será poder indagar y profundizar más sobre los
mecanismos utilizados por estos microorganismos para inhibir el desarrollo de otras bacterias
y/o hongos.
3.3. Capacidad de biocontrol de las BAL
Una vez determinada la capacidad de las bacterias lácticas de origen vínico para inhibir
in vitro el desarrollo del hongo fitopatógeno F. oxysporum, se llevó a cabo un primer estudio
con el fin de estimar el potencial efecto protector que dichas bacterias pueden tener in vivo
sobre las plantas de Lycopersicon esculentum var. Marmande Cuarenteno. Se escogieron para
ello las cepas L. plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12, seleccionadas en base a una
elevada actividad antifúngica en los ensayos previos.
En primer lugar, se evaluó la capacidad de las dos bacterias lácticas para proteger a
las semillas de la acción perniciosa del hongo evaluando su efecto sobre la tasa de
germinación. Como se muestra en la Fig. 6, y a diferencia de lo descrito para bacterias lácticas
de otros orígenes (Abdel-Aziz et al., 2014), no se encontraron diferencias significativas en la
tasa de germinación entre los ensayos que incluían las semillas inoculadas con el hongo y
aquellos en los que se adicionaron además las bacterias probadas, no permitiendo concluir un
efecto protector por parte de las bacterias malolácticas en las condiciones de este experimento.
Sin embargo, sí parece apreciarse una tendencia en el sentido de un efecto favorable cuando
se añaden las bacterias lácticas.
136
Figura 6: Tasa de germinación de semillas de tomate inoculadas con conidios de F. oxysporum y, en

su caso, con las bacterias L. plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12. Se muestran las medias ± SD.
(p ≤ 0,05).
Tras determinar el efecto de las bacterias en la protección de las semillas, se procedió

a comprobar su potencial para llevar a cabo el biocontrol en las plantas infectadas por el hongo.
En este caso tanto el efecto del hongo como el posible efecto protector de las bacterias, se
estimaron determinando su influencia en el peso seco de la planta al haber demostrado estudios
previos el efecto de la presencia de determinados hongos sobre la cantidad de biomasa
acumulada por la planta (Maron et al., 2011) y que es un parámetro más adecuado que la
determinación del efecto sobre partes individuales de la planta (Vaikuntapu et al., 2014). El
peso seco, además, está estrechamente relacionado con la producción de fruto (Koning, 1994).
En la Fig. 7 se observa, cualitativamente, el efecto sobre las plantas del tratamiento

con el hongo o con el hongo y las bacterias, que posteriormente fue analizado
cuantitativamente.
137
Figura 7: Efecto cualitativo de la inoculación de las plantas de tomate con F. oxysporum y con las
combinaciones F. oxysporum + L. paracasei UVI-12 y F. oxysporum + L. plantarum UVI-10.
En la primera parte del experimento se estudió el efecto de la infección del hongo

sobre la planta. Los resultados se muestran en la Fig. 8 en la que se observa una reducción
significativa (de casi un 20%) en el peso seco de las plantas infectadas, tras 30 días de cultivo.
Figura 8: Efecto de la inoculación de las

plantas de tomate con F. oxysporum. Se
presenta la media ± SD. Letras diferentes
indican diferencias significativas (p ≤ 0,05).
En una segunda parte del ensayo se evaluó el posible efecto protector de las bacterias
lácticas seleccionadas sobre la infección inducida en la planta con F. oxysporum. Los
resultados se muestran en la Fig. 9 en la que se aprecia una reducción significativa del 24 %
sobre el efecto dañino de F. oxysporum, usado como control, en las plantas tratadas con L.
138
plantarum UVI-10. No se apreciaron diferencias significativas en el tratamiento con la cepa

L. paracasei UVI-12.
Figura 9: Efecto de la inoculación de las plantas de tomate con F. oxysporum y con las combinaciones
F. oxysporum + L. paracasei UVI-12 y F. oxysporum + L. plantarum UVI-10. Se presenta la media ±
SD. Letras diferentes indican diferencias significativas (p ≤ 0,05).
Son relativamente pocos los estudios que hacen referencia a la inhibición in vivo de F.
oxysporum por parte de bacterias lácticas, a pesar de que el interés en el control de este hongo
con métodos biológicos se ha visto incrementado desde el año 2000 (Raza et al., 2016) debido
a las importantes repercusiones económicas que tiene para la industria agroalimentaria. En la
mayor parte de los casos, son especies o géneros bacterianos y/o fúngicos propios de la
rizosfera los empleados en dichos estudios. Especies de Trichoderma, Bacillus, Burkholderia
o Pseudomonas (Larkin y Fravel, 1998; Mao et al., 1998; Omar et al., 2006) han demostrado
un notable efecto inhibidor de este hongo tras su aplicación en plantas de tomate. Sin embargo,
hasta donde alcanza nuestro conocimiento, solo Hamed et al. (2011) han demostrado, en un
experimento que exige la protección previa de la semilla, la capacidad de las bacterias lácticas
(aisladas a partir de productos lácteos), para la bioprotección de plantas frente al ataque o los
efectos perniciosos de F. oxysporum.
139
Estudios previos han demostrado que, en el caso de las bacterias de la rizosfera, su

eficacia como agentes de biocontrol depende de que sean utilizadas para proteger al cultivo a
partir del cual fueron aisladas, mostrando escasa o nula eficacia en la protección de otros
cultivos (Vaikuntapu et al., 2014), lo que implicaría la necesidad de obtener agentes de
biocontrol específicos. En el presente estudio se demuestra que la cepa maloláctica L.
plantarum UVI-10 es capaz de reducir el efecto pernicioso de F. oxysporum en plantas de
tomate proviniendo de un hábitat distinto demostrando así su potencial interés como agente de
biocontrol y, probablemente, una eficacia más transversal.
3.4. Capacidad fitoestimulante de las BAL
En la agricultura convencional, además del uso de pesticidas sintéticos para el control

de plagas agrícolas, los fertilizantes químicos se emplean también extensivamente para
fortalecer, estimular y acelerar el crecimiento de las plantas. Este uso de fertilizantes químicos,
además de sus posibles efectos perjudiciales para los seres vivos, da lugar a importantes
alteraciones ambientales, en particular la eutrofización de las aguas (Savci, 2012). Los
planteamientos más innovadores relativos a la producción agrícola demandan nuevos
fertilizantes de base biológica como alternativa a los agroquímicos. Estos biofertilizantes están
basados en microorganismos que pueden estimular el crecimiento de las plantas y son
conocidos como BPCP (Bacterias Promotoras del Crecimiento de Plantas) o PGPB (en inglés
Plant Growth-Promoting Bacteria) (Bhardwaj et al., 2014.).
Este efecto ha sido previamente estudiado en una gran diversidad bacteriana que, de
manera habitual, se encuentra asociada a las raíces conformando el microbioma de la rizosfera
(Urrea et al., 2011; Vaikuntapu et al., 2014; Giassi et al., 2016). Este tipo de estudios, sin
embargo, no se habían realizado con bacterias lácticas de origen vínico por lo que,
paralelamente a los estudios de biocontrol, en este trabajo, se trató de determinar si las cepas
lácticas seleccionadas L. plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12 podían afectar
positivamente al desarrollo vegetal, empleando nuevamente plantas de tomate como modelo.
Con esta finalidad se realizó un estudio de estimulación del crecimiento en plantas

jóvenes con las dos bacterias vínicas arriba mencionadas, estimando su efecto también
mediante la determinación del peso seco.
140
Los resultados obtenidos muestran un incremento en el contenido en materia seca en

las plantas de tomate inoculadas con las cepas de BAL seleccionadas, y de manera significativa
(en un 24%) en aquellas que fueron regadas con L. plantarum UVI-10, cuando se comparan
con el control no tratado con las bacterias (Fig. 10A). Este incremento representaría alrededor
de un 41% con respecto a las plantas infectadas por F. oxysporum (Fig. 10B), lo que parece
indicar que la bioprotección que ejerce la bacteria sobre las plantas infectadas puede ser debida
a una combinación de su acción antagónica sobre el patógeno y su efecto fitoestimulante sobre
la planta.
Figura 10: Efecto del tratamiento de las plantas de Lycopersicon esculentum con las bacterias L.
plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12 (A) y comparativa con las plantas infectadas con F.
oxysporum (B). Se presenta la media ± SD. Letras diferentes indican diferencias significativas (p ≤
0,05).
Esta estimulación del desarrollo vegetal de Lycopersicon esculentum por parte de

cepas de L. plantarum había sido descrita por Limanska et al. (2013) para cepas obtenidas de
orígenes diferentes a los empleados en el presente estudio. En este trabajo se demuestra
también el potencial de las bacterias malolácticas para ser utilizadas como potenciales
biofertilizantes.
La capacidad de los microorganismos para actuar como biofertilizantes ha sido

atribuida al hecho de que mantienen el suelo rico en micro y macronutrientes vía fijación de
nitrógeno, solubilización de fosfato y potasio, liberación de sustancias reguladoras del
crecimiento vegetal del tipo de las auxinas, producción de antibióticos y biodegradación de la
materia orgánica del suelo (Compant et al., 2005; Gangwar y Sinha, 2014). En este sentido
sería interesante encaminar los estudios futuros para llegar a dilucidar exactamente los
141
mecanismos responsables del efecto fitoestimulador de los microorganismos, en particular de

las bacterias acido lácticas, sobre las plantas.
En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las bacterias
lácticas asociadas a los vinos, seleccionadas adecuadamente, podrían ser potencialmente
utilizadas como agentes biopreservativos, de biocontrol y como biofertilizantes, bien de
manera individual o en tratamientos integrales con otras sustancias y/o prácticas, permitiendo
la producción de alimentos más seguros en el marco de una agricultura más sostenible. En este
sentido, sería de gran interés repetir y reproducir los resultados de este experimento en un
estudio más amplio, así como probar la actividad de las bacterias estudiadas en este trabajo
frente a otros patógenos y en diferentes cultivos. Por otra parte, el uso real de estos
microorganismos para las citadas aplicaciones dependerá también de que se siga
profundizando en el estudio de los mecanismos responsables de su actividad antimicrobiana y
de sus propiedades fitoestimuladoras, pero sobre todo, de la puesta a punto de protocolos de
campo eficaces para su aplicación.
142
CAPÍTULO III
CAPÍTULO III Introducción
BIOSÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA MEDIANTE

BACTERIAS MALOLÁCTICAS: EVALUACIÓN DE SU POTENCIAL
COMO ANTIMICROBIANOS
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Definición
El término “nanopartícula” (NP) hace referencia a aquellas con un tamaño

comprendido entre los 0,2 y los 100 nm (Rudramurthy et al., 2016). En comparación, una
molécula de ADN mide aproximadamente 2,5 nm de ancho y un pelo humano unos 10000 nm
de grosor (Thakkar et al., 2010). Este pequeño tamaño le aporta a estas partículas propiedades
únicas como una elevada relación superficie - volumen, propiedades ópticas particulares
debido a la absorción del plasmon en superficie, o comportamientos eléctricos y térmicos
específicos (Singh et al., 2015).
La primera de ellas permite la funcionalización de su superficie, es decir, la adhesión

de moléculas a las mismas, y con ello, una de sus principales aplicaciones, la administración
dirigida de fármacos o “drug delivery” (Mittal et al., 2014). Además, esta elevada superficie
proporciona también una mayor interacción con células vivas, lo que deriva en, por ejemplo,
un mayor efecto microbicida cuando son aplicadas con este propósito (Rudramurthy et al.,
2016).
Existen en la actualidad varios tipos de nanopartículas, que son generalmente

clasificadas en base a su naturaleza química, esto es NPs orgánicas, inorgánicas y mixtas, si
bien se han clasificado también en base a su forma o en función de la disposición de sus átomos
o subpartículas.
Nos referiremos aquí a la primera de las clasificaciones, al tratarse de la más

fundamental y por definir en gran medida el uso al que serán destinadas. Así, en el caso de las
nanopartículas orgánicas, se incluyen nanomateriales como micelas, dendrímeros o liposomas,
mientras que el segundo grupo incluye fulerenos, puntos cuánticos, NPs de sílice o NPs
145
metálicas entre otros.
1.2. Mecanismo de síntesis de NPs
Aunque se han descrito dos mecanismos principales de síntesis de NPs (Grzelczak y

Liz-Marzán, 2014), en el caso de las NPs metálicas, y más concretamente en la síntesis de
nanopartículas de plata (AgNPs), en líneas generales el proceso comienza con la reducción de
iones Ag+ liberando Ag0. Los agentes que llevan a cabo esta reducción son los que determinan
la naturaleza química o biológica del proceso. Esta plata cero-valente conforma el núcleo de
las futuras nanopartículas, que sufrirán un engrosamiento por adhesión de más Ag0 (Sudeep
et al., 2005; Pacioni et al., 2015) en un proceso denominado “nucleación/crecimiento” (Fig.
1).
Figura 1: Proceso general de síntesis de AgNPs a partir de AgNO3. Adaptado de Sudeep y Kamat,
(2005).
Como se ha mencionado, es en el primer paso en la formación de nanopartículas de

plata, la reducción del ion Ag+ en Ag0, y el mecanismo por el cual tiene lugar esta reacción, el
que define la naturaleza del proceso de producción, pudiendo éste ser llevado a cabo por
métodos químicos, o por métodos biológicos.
1.2.1. Métodos químicos
Los procesos de producción química de NPs generalmente se llevan a cabo mediante

la reducción de los iones metálicos en soluciones que contienen compuestos químicos o la
reducción por exposición a altas temperaturas en presencia de determinados gases
(Raveendran et al., 2002).
146
Estos compuestos químicos reductores son a menudo altamente tóxicos lo que en

ocasiones imposibilita su aplicación biomédica, o encarece los costes de producción al añadir
pasos de eliminación de los mismos en las NPs sintetizadas, cuando no son los propios agentes
reductores los que son extremadamente caros (Wei et al., 2012; Mittal et al., 2014). Ejemplos
de los agentes reductores utilizados en la síntesis química de AgNPs son el borohidruro de
sodio: corrosivo, inflamable y toxico por inhalación; el hidrógeno elemental: inflamable; el
reactivo de Tollens: puede ser explosivo; o la N, N-dimetilformamida (DMF): inflamable y
tóxica por inhalación y contacto (Iravani et al., 2014).
En cambio, como característica favorable se puede destacar que, al tratarse de

mecanismos y/o mezclas de reacción de los que se conocen todos sus componentes, se facilita
el control de la síntesis, sobre todo en lo que respecta a la forma y al tamaño de las NPs (Iravani
et al., 2014).
1.2.2. Métodos biológicos
Numerosos autores han descrito la producción biológica (o síntesis verde) de

nanopartículas por parte de microorganismos y organismos superiores, o los productos
derivados de su desarrollo. En este sentido, se ha comprobado la capacidad de bacterias,
hongos y algas para la síntesis de NPs metálicas (Mohampuria et al., 2008; Krumov et al.,
2009; Dhanjal y Cameotra, 2010; Arockiya et al., 2012).
La biosíntesis de estas partículas puede tener lugar de manera intracelular en un

proceso, por lo general, mediado por enzimas, que puede aparecer en organismos de
metabolismo quimiolitótrofo, con funciones microbianas especiales como la orientación por
magnetosomas, o con capacidad para la detoxificación para la supervivencia en medios tóxicos
(Krumov et al., 2009). Esta biosíntesis se ha visto también en otros microorganismos. Ejemplo
de esto es la síntesis intracelular de AgNPs llevada a cabo por Kalimuthu et al. (2008) en
bacterias de la especie Bacillus licheniformis, proponiendo un mecanismo mediado por una
enzima nitrato reductasa.
La síntesis extracelular, en cambio, responde aparentemente a un mecanismo de

óxido-reducción en el que intervienen componentes celulares reductores como proteínas,
147
glúcidos y/o sales liberados al medio de forma natural o artificial (Sintubin et al., 2009).
En base a la forma de liberación de agentes reductores, la síntesis extracelular de NPs

se ha llevado a cabo de dos modos diferentes: en uno de ellos se emplea el sobrenadante
obtenido tras la eliminación de las células del medio de cultivo, donde los agentes reductores
son liberados de forma natural por los microorganismos. En el otro, en cambio, se emplean
extractos procedentes del lavado o rotura de las células, generalmente en agua, aunque también
pueden emplearse diferentes medios tamponados (Sintubin et al., 2012).
Dos especies del género Bacillus, Bacillus flexus y Bacillus cereus, fueron empleadas
por Priyadarshini et al. (2013) y Babu y Gunasekaran (2013) respectivamente para la síntesis
extracelular de AgNPs a partir de medio de cultivo, mientras que Thiruneelakandan et al.
(2013) llevaron a cabo la síntesis de este tipo de NPs a partir de un extracto acuoso obtenido
del lavado de L. plantarum.
El empleo de hongos ha arrojado también resultados positivos en la síntesis de

nanopartículas en general y de AgNPs en particular, predominando los estudios de biosíntesis
a partir de hongos filamentosos, frente a aquellos que emplean levaduras (Mohampuria et al.,
2008; Sintubin et al., 2009). En el caso de las levaduras, Gericke y Pinches (2006) y Agnihotri
et al. (2009) describen la síntesis en medio acuoso de NPs mediante el empleo de Pichia
jadinii y Yarrowia lipolytica respectivamente, así como Eugenio et al. (2016), quienes
lograron sintetizar AgNPs a partir de células de Candida lusitaniae, de manera extracelular,
en el medio de crecimiento de dicha levadura.
En el caso de los hongos filamentosos es el género Fusarium el más estudiado para la

biosíntesis de NPs, si bien cabe destacar también el empleo del género Aspergillus para tal fin
(Taranath et al., 2014), dándose, en la mayor parte de los casos, de manera extracelular
(Mohampuria et al., 2008; Sintubin et al., 2009; Poulose et al., 2014). En el caso de las AgNPs,
son numerosas las referencias sobre su producción mediante estos hongos (Mukherjee et al.,
2001; Ahmad et al., 2003; Bhainsa y D’ Souza, 2006; Duran et al., 2011).
148
1.3. Actividad antimicrobiana de las AgNPs
Los mecanismos de acción mediante los cuales las AgNPs ejercen su actividad
antimicrobiana están siendo objeto de numerosas investigaciones, y hasta el momento han sido
solo parcialmente esclarecidos. La mayor parte de los estudios se han realizado en bacterias.
Tras su aplicación, las AgNPs tienen su primera diana en las envueltas celulares
(Morones et al., 2005; Lok et al., 2006) actuando, posteriormente, sobre otras estructuras
celulares (Fig. 2).
Figura 2: Diferentes mecanismos de acción antimicrobiana de las AgNPs (Pandey et al., 2014).
Se ha demostrado la afinidad de los iones Ag+ por los grupos hidroxilo de los azúcares
y el ion carboxilato de los aminoácidos presentes en estas cubiertas (Lin et al., 2005).
Mirzajani et al. (2011) han sugerido que el principal efecto se da sobre la pared de
peptidoglucano en bacterias Gram positivas, generando huecos en la misma por la liberación
de unidades de ácido n-acetil murámico procedente del peptidoglucano. Estas modificaciones
en la estructura y morfología de la pared celular y el consiguiente acceso de las NPs a
membrana plasmática, inducirían un incremento de la permeabilidad de la misma y,
finalmente, llevarían a la muerte celular (Morones et al., 2005).
149
Lok et al. (2005) plantean un mecanismo de acción de las AgNPs sobre las envueltas
celulares de E. coli según el cual estas partículas podrían romper ciertos componentes
(lipopolisacáridos) de la membrana externa de bacterias Gram negativas. Al mismo tiempo, la
liberación de iones Ag+ induciría una caída de la fuerza protón motriz, llevando a una pérdida
masiva de potasio intracelular. Esta pérdida de la fuerza protón motriz podría darse por la
unión de los iones Ag+ a los grupos tiol de las proteínas transportadores de membrana lo que
lleva a su inactivación (Feng et al., 2000).
Este mismo mecanismo podría, por lo tanto, explicar la rotura de la membrana

plasmática en bacterias Gram positivas, ya que según los datos aportados por Mirzajani et al.
(2011), la rotura del peptidoglucano conlleva la liberación de iones Ag+, con la consiguiente
alteración del potencial de membrana.
La liberación de oxígeno activo (ROS) es otro de los mecanismos por los cuales las
AgNPs ejercen su acción antimicrobiana. Este oxígeno activo puede reducirse a H2O2 o grupos
OH, entre otros radicales libres, que provocan importantes daños en las células microbianas
(Dakal et al., 2016).
Otra diana de las AgNPs se encuentra en el interior celular. Los iones Ag+ tienen
tendencia a unirse y reaccionar con compuestos que presentan fósforo en su estructura
molecular (Morones et al., 2005). Uno de los principales compuestos intracelulares de estas
características es el ADN, sobre el que las AgNPs ejercen su actividad inhibiendo la
replicación y la expresión de proteínas vitales para la célula (Pal et al., 2007).
También se han obtenido efectos microbicidas importantes sobre levaduras silvestres

(Kim et al., 2007). Rodríguez-Argüelles et al. (2011) describen los efectos microbicidas de
NPs compuestas de plata y quitosano sobre Candida glabrata, mostrando un importante
incremento de dicho efecto frente al observado tras la aplicación de AgNO3. A pesar de esta
mejora en la capacidad microbicida, las concentraciones de AgNPs necesarias para la
inhibición de levaduras resultan por lo general mayores que en el caso de las bacterias (Kim
et al., 2007; Egger et al., 2009; Rodríguez-Argüelles et al. 2011), lo que podría ser explicado
por la presencia de una pared celular, de estructura y composición variable dependiendo de la
levadura de la que se trate, que podría dificultar el acceso de las NPs a las dianas descritas
anteriormente.
150
Del mismo modo, los hongos filamentos han sido también objeto de estudio para su
control mediante AgNPs. Así por ejemplo, Kim et al. (2012) consiguieron inhibir el desarrollo
de un importante número de hongos fitopatógenos, mediante la aplicación de AgNPs, si bien
éstas fueron producidas por métodos químicos. Vivek et al. (2011) mostraron un importante
efecto inhibidor del crecimiento de Mucor indicus, Fusarium dimerum, Trichoderma reesei y
Humicola insolens tras la aplicación de AgNPs producidas de manera biológica.
El mecanismo de acción antimicrobiana de las AgNPs frente a hongos parece ser

similar al expuesto anteriormente en el caso de las bacterias, con una diana principal en las
envueltas celulares causando la desestructuración de las mismas y el consiguiente colapso
celular (Kim et al., 2009)
151
CAPÍTULO III Materiales y Métodos
2.1. Cepas de bacterias y levaduras utilizadas en este estudio
Se emplearon 3 cepas de tres especies distintas pertenecientes al género Lactobacillus,

aisladas e identificadas previamente, a partir de vino, en el Capítulo 1 de esta Tesis: L. hilgardii
UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6.
Para la determinación de la actividad antimicrobiana de las nanopartículas se

emplearon las cepas testigo: Candida glabrata CECT 1448, Klebsiella sp. (aislada en nuestro
laboratorio) y Bacillus cereus CECT 193.
2.2. Medios y condiciones de cultivo
Medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, Panreac): ver composición en el Capítulo 1,
Sección 1.1. Este medio fue utilizado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas de
bacterias ácido lácticas.
Medio Glucosa-Sabouraud (Panreac): ver composición en el Capítulo 2, Sección 1.1.

Este medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de la cepa de referencia C.
glabrata CECT 1448.
Medio Mueller-Hinton (Panreac): ver composición en el Capítulo 2, Sección 1.1. Este

medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas testigo Klebsiella sp. y
B. cereus CECT 193. Este medio se utilizó para los ensayos de actividad antimicrobiana.
Todos los medios, tanto sólidos como líquidos, fueron esterilizados mediante
autoclave a 121ºC y 1,1 atmósferas, durante 15 minutos.
C. glabrata CECT 1448 fue cultivada en medio Sabouraud a 30 ºC, Klebsiella sp. fue
cultivada en medio Mueller-Hinton a 37 ºC y B. cereus CECT 193 se cultivó en medio
Mueller-Hinton a 30 ºC.
152
2.3. Reactivos
Se empleó una solución 100 mM de nitrato de plata (AgNO3, Sigma-Aldrich) en agua

destilada esterilizada por filtración a través de membranas de 0,22 µm. Se empleó también una
solución 1N de NaOH (Panreac).
2.4. Obtención del extracto reductor
La obtención del extracto acuoso para preparar las nanopartículas se realizó según
describe Durán et al. (2007) con modificaciones. Se partió de cultivos de bacterias ácido
lácticas en medio MRS a 30 ºC y en anaerobiosis, crecidos hasta alcanzar la fase exponencial
tardía. En este punto las células se recuperaron mediante centrifugación, se estimó su peso
húmedo y se realizó un lavado de las mismas con H2O destilada estéril para, posteriormente,
ajustar la concentración celular a 7 g/L mediante la adición del volumen apropiado de H2O
destilada estéril. Las suspensiones de células (100 ml) fueron posteriormente transferidas a
matraces de 500 mL donde se mantuvieron durante 72 horas a 30 ºC, con una agitación de 200
rpm. Transcurrido este tiempo el sobrenadante fue recuperado por centrifugación (10000 x g /
20 min) y conservado a 4 ºC hasta su utilización.
2.5. Síntesis de nanopartículas de plata
Se realizó un ensayo para verificar la capacidad de producción de nanopartículas de

plata en los extractos obtenidos de cada una de las cepas lácticas bajo estudio. Para ello se
añadió AgNO3 a 5 ml de cada uno de los extractos de las bacterias lácticas a una concentración
final 1 mM.
Realizada esta comprobación, se trató de determinar el efecto que tienen la luz, la

temperatura y la agitación sobre la síntesis de AgNPs. Para ello, se llevaron a cabo tres ensayos
independientes modificando cada una de estas tres variables:
- Luz: Luz / oscuridad.

- Agitación: 200 rpm / estático.
- Temperatura de incubación: 22 ºC / 35 ºC / 45 ºC.
153
Todos los ensayos se realizaron en tubos de vidrio de 3 cm de diámetro a los que se

añadieron 5 mL de extracto celular y AgNO3 (1 mM).
Para llevar a cabo los citados ensayos se elaboraron contenedores con un

compartimento opaco para permitir la determinación de la producción de AgNPs en
condiciones de oscuridad, y un compartimento expuesto a la luz generada por una bombilla de
40 W (OSRAM Spot).
Se fabricaron 6 de estos contenedores que, además, permitieron determinar de forma

simultanea los parámetros luz/oscuridad, agitación/estático y temperatura antes indicados. El
efecto de la agitación se determinó colocando estos recipientes en agitación de 200 rpm,
mientras que el blanco se mantuvo en estático. El efecto de la temperatura se determinó
mediante la incubación de los mismos a las temperaturas indicadas anteriormente. Este ensayo
se muestra de manera esquemática en la Fig. 3.
Figura 3: Esquema del ensayo simultaneo del efecto de las diferentes variables en la producción de
AgNPs a partir de los tres extractos.
Para determinar el efecto de la concentración de NaOH, este compuesto se añadió a

los extractos obtenidos a partir de las bacterias en concentraciones de 0,2, 0,4, 0,8 y 1,2 mM,
tras lo cual fueron esterilizados por filtración a través de membranas con un tamaño de poro
de 0,22 µm. La síntesis se llevó a cabo según se ha indicado, pero utilizando las condiciones
óptimas determinadas en el apartado anterior. Se estableció un control negativo para cada
concentración de NaOH mencionada, en el que el extracto reductor fue sustituido por agua
destilada.
154
2.6. Determinación de la producción de nanopartículas
La formación de AgNPs se verificó tanto de manera visual, por el cambio de

coloración del blanco al marrón/rojo de la muestra, como mediante la determinación
espectrofotométrica del espectro UV-Vis entre 250 y 750 nm (Thermo Scientific Evolution
201). Esta última se llevó a cabo a las 0, 24, 48 y 72 h desde la adición de AgNO3 en los
ensayos de estimación del efecto de la luz, la agitación y la temperatura, y a las 0, 1 y 2 horas
de incubación en el ensayo de determinación del efecto del NaOH.
2.7. Caracterización de nanopartículas de plata
La confirmación de la síntesis de AgNPs en los extractos, así como la determinación

de la forma y tamaño de las mismas, se realizó mediante Microscopía Electrónica de
Transmisión (TEM) (llevada a cabo en el Centro de Apoyo Científico Tecnológico a la
Investigación –CACTI-, Universidad de Vigo). Las observaciones y medidas fueron
realizadas en un microscopio JEOL JEM-1010, operando a un voltaje de 80 kV. Para la
observación de las AgNPs, se depositó 1 µL de suspensión de las mismas sobre una rejilla con
un tamaño de malla de 40 x 40 µm y con recubrimiento de carbono. Esta rejilla fue
posteriormente incubada a 30 ºC durante una noche para proporcionar un secado suave de
dicha suspensión.
Las imágenes TEM fueron analizadas con el programa Image J

(http://imagej.nih.gov/), mediante el cual se realizó la medida de 220 NPs.
La localización celular de las AgNPs utilizadas en los ensayos de actividad

antimicrobiana también se llevó a cabo mediante TEM, procediendo de la siguiente manera:
se tomó 1 mL (107 células/mL) de un cultivo de B. cereus en medio Mueller-Hinton a 30 ºC,
que fue concentrado 2X por centrifugación (15000 x g / 15 min) y resuspendida en H2O MilliQ,
a la que le fueron añadidos 100 µL de suspensión de AgNPs. Tras permanecer una noche en
incubación a 30 ºC se tomó una alícuota de 500 µL a la que se le realizaron dos lavados
(centrifugación a 22000 x g / 2 min y resuspensión en 500 µL de H2O MilliQ) para, finalmente,
añadir 1 µL de una dilución 1:25 de esta suspensión en una rejilla 40 x 40 µm. El secado de la
misma se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.
155
2.8. Determinación de la actividad antimicrobiana de las AgNPs
Para preparar los inóculos para estos ensayos, los microorganismos testigo fueron
cultivados en medio Sabouraud en el caso de C. glabrata y Mueller-Hinton en el caso de las
bacterias. La incubación se llevó a cabo hasta que las células alcanzaron la fase exponencial
(durante 24 - 48 horas), a 30 ºC para las especies C. glabrata CECT 1448 y B. cereus CECT
193, y a 37 ºC en el caso de Klebsiella sp.
2.8.1. Ensayo cualitativo
Se realizó un ensayo cualitativo del efecto antimicrobiano de las AgNPs. Para ello se
empleó el método descrito por Wei et al. (2012) con algunas modificaciones: las cepas testigo
fueron sembradas por extensión (100 µL de una suspensión de 106 células/mL) en placas de
los medios apropiados (Sección 2.2). Estas placas se dividieron en tres segmentos, en cada uno
de los cuales se añadió una gota de 5 µL de suspensión de AgNPs y se incubaron a las
temperaturas mencionadas anteriormente durante el tiempo necesario para la aparición de un
césped denso.
2.8.2. Ensayo cuantitativo
La determinación cuantitativa de la capacidad de las nanopartículas para inhibir el

crecimiento microbiano se realizó mediante la estimación de la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) realizada utilizando el método de microdilución en caldo (Balouiri et al.,
2016). La capacidad de las mismas para matar a estos mismos microorganismos se determinó
mediante la estimación de la Concentración Mínima Microbicida (CMM).
Para ello se realizaron diluciones seriadas del extracto con NPs a partir de una
concentración correspondiente 50 µg/mL de Ag+, cuando su producción se encontraba en los
valores 0,5 y 1 de absorbancia, en microtubos con los medios de cultivo mencionados
anteriormente.
Para la determinación de la CMI, se inoculó en cada tubo de dilución una

concentración celular de 106 células/mL en caso de las bacterias y 103 células/mL en las
levaduras y la incubación se realizó a las temperaturas mencionadas previamente. La lectura
se llevó a cabo mediante determinación visual de la aparición de turbidez tras 24 horas de
incubación, frente a un control negativo.
156
La CMM se estimó mediante la realización de subcultivos de 100 µL de cada tubo en

el que no se apreció crecimiento microbiano tras la estimación de la CMI, en 1 mL de medio
de cultivo fresco y determinando la presencia/ausencia de crecimiento, según se indicó
anteriormente, tras 24 h de incubación.
Como control negativo se realizó el mismo ensayo para estimar la CMI y CMM del
extracto celular sin AgNPs siguiendo el mismo procedimiento. Todos los ensayos fueron
realizados por duplicado.
157
CAPÍTULO III Resultados y Discusión
La nanotecnología ha experimentado un creciente interés debido principalmente a la

versatilidad de las nanopartículas para su empleo en ámbitos tan dispares como la óptica, la
electrónica o la biomedicina (Mittal et al., 2014). En este último campo, destacan aplicaciones
como el anclaje de moléculas en su superficie, el almacenamiento de moléculas bioactivas en
su interior o las propiedades antimicrobianas y antitumorales de muchas de ellas (Sintubin et
al., 2009; Raveendran et al., 2013).
Debido a las propiedades antimicrobianas de la plata, el empleo las AgNPs ha sido

principalmente orientado al control de agentes patógenos. Su síntesis química, sin embargo, a
menudo implica el empleo de sustancias altamente perjudiciales para la salud y para el medio
ambiente (Thakkar et al., 2010) por lo que el número de referencias a síntesis biológica de
estas nanopartículas, mucho más respetuosa con el medio ambiente y de costes más reducidos,
ha crecido exponencialmente en los últimos años (Singh et al., 2015). En este sentido, se ha
descrito el empleo de bacterias, hongos, plantas, etc. para llevar a cabo esta síntesis, ya sea a
partir del sobrenadante obtenido tras su desarrollo, a partir de su biomasa o a partir de extractos
de los mismos (Poulose et al., 2014).
Las bacterias ácido lácticas han demostrado también capacidad para sintetizar
nanopartículas (Nair y Pradeep, 2002; Sintubin et al., 2009; Korbekandi et al., 2011; Dhoondia
et al., 2012; Priyadarshini et al., 2013; Matei et al., 2015; Sásková et al., 2016), en este caso
centrándose los estudios existentes principalmente en la especie Lactobacillus plantarum y en
cepas aisladas a partir de productos lácteos. En cambio, esta capacidad no había sido estudiada
previamente en cepas malolácticas de origen vínico.
3.1. Obtención de extractos acuosos reductores
Se escogieron para probar su posible capacidad para sintetizar nanopartículas tres

cepas pertenecientes al género Lactobacillus: L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L.
plantarum UVI-6, de entre las aisladas e identificadas en el capítulo 1 de esta Tesis.
Mediante la incubación de las células de estas cepas en agua destilada, según se indica
en Materiales y Métodos, se obtuvieron tres extractos acuosos con potencial capacidad
158
reductora para sintetizar NPs. Esta actividad ha sido atribuida a la presencia de diferentes
biomoléculas liberadas por las células bacterianas al medio, como exopolisacáridos
(Raveendran et al., 2013) o aminoácidos (Saifuddin et al., 2009), entre otras.
Hasta el momento, para llevar a cabo la síntesis de nanopartículas mediante

microorganismos, se han utilizado mayoritariamente los sobrenadantes de los cultivos o las
propias células microbianas (Poulose et al., 2014). El empleo de estas dos formas tiene el
inconveniente de que implica la necesidad de purificar las nanopartículas, agravado en el caso
del uso de células por el hecho de que es necesario romperlas previamente.
El uso de los extractos con potencial actividad reductora, preparados según se describe
en este trabajo tendría la ventaja de que no requeriría de la purificación de las nanopartículas,
sería muy sencillo y muy económico.
3.2. Evaluación de la capacidad de los extractos acuosos para producir AgNPs
En un primer ensayo se trató de determinar si los extractos eran capaces de producir

AgNPs. Tras la adición del AgNO3 a los extractos de L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-
2 y L. plantarum UVI-6 y su posterior incubación, se apreció visualmente la formación de
nanopartículas mediante el cambio en la coloración de los mismos de transparente a naranja-
marrón (Fig. 4). Esta coloración depende de la excitación de las NPs y ésta, a su vez, de su
tamaño, de su forma y de su concentración. Debido a que lo extractos utilizados consisten,
muy probablemente, en mezclas heterogéneas de diferentes moléculas reductoras y sales, lo
habitual es que se formen distintos tipos de nanopartículas con diferentes morfologías y en
concentraciones variables, lo que explica las diferentes coloraciones encontradas entre los
extractos reductores (Nair y Pradeep, 2002; Kalimuthu et al., 2008; Babu et al., 2013;
Priyadarshini et al., 2013; Poulose et al., 2014).
Figura 4: Cambio de coloración de los extractos debido a la formación de AgNPs.
159
La obtención de los espectros UV-Vis verificó la formación de AgNPs, mostrando un

pico de absorbancia con un máximo a 448 nm en el extracto de L. paracasei UVI-2, a 420 nm
en el extracto obtenido a partir de la cepa L. plantarum UVI-6 y a 435 nm en el extracto de L.
hilgardii UVI-18, tras 24 horas de incubación a 30 ºC y en presencia de luz natural (Fig. 5).
Además, se aprecia otro pico de absorbancia a 275 nm. Este pico se ha atribuido a la presencia
de los aminoácidos triptófano y tirosina en el medio, que podrían estar implicados en la síntesis
de AgNPs (Saifuddin et al., 2009) y aparece también en el presente estudio (Fig. 5). Además,
parece apreciarse una relación directa entre el valor de absorbancia de este pico y el
correspondiente a las NPs, si bien esta observación no concuerda con los resultados obtenidos
posteriormente en este trabajo y reflejados en la Fig. 6 (L. hilgardii UVI-18) en la que se
observa también un aumento de este pico al mismo tiempo que del correspondiente a las NPs.
Figura 5: Espectros UV-Vis obtenidos tras 24 horas de incubación a 30 ºC de los extractos procedentes
de las cepas L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6, en presencia de AgNO3.
Por otra parte, se ha constatado que el incremento en los valores de absorbancia está
relacionado con una mayor síntesis de AgNPs (Korbekandi et al., 2012) por lo que en adelante
se empleará este parámetro como indicador de la misma. Atendiendo a ello, los extractos L.
hilgardii UVI-18 y L. paracasei UVI-2 permitirían sintetizar cantidades de nanopartículas
muy superiores (entre 3 y 4 veces) a L. plantarum UVI-6 (Fig. 5).
3.3. Efecto de la luz, agitación, temperatura y NaOH sobre la síntesis de AgNPs
La producción biológica de nanopartículas de plata es dependiente de distintos parámetros

físico-químicos (Korbekandi et al., 2011; Singh et al., 2015).
160
Debido a ello se estudió el efecto de las siguientes variables sobre la producción de

nanopartículas por parte de los extractos objeto de estudio: Luz/Oscuridad, Agitación/Estático
y las temperaturas 22, 35 y 45 ºC. En este caso las mediciones se realizaron a las 24, 48 y 72
horas de incubación.
Los espectros obtenidos tras la medición de la absorbancia UV-Vis a los tres tiempos
confirmaron la producción de nanopartículas en los tres extractos, aunque los niveles de
síntesis más altos se observaron en todos los casos a las 72 h (Fig. 6).
Del estudio de los espectros UV-Vis, se comprobó que en ningún caso la síntesis de
nanopartículas se da cuando la incubación se lleva a cabo en ausencia de luz (Fig. 6A), a
diferencia de lo que había sido descrito en estudios previos en los que la síntesis se llevaba a
cabo en oscuridad (Zaki et al., 2011; Thiruneelakanda et al., 2013; Matei et al., 2015; Sásková
et al., 2016). En contraposición a esta observación, cuando los extractos fueron sometidos a
luz continua producida por un foco de 40 W, se obtuvieron espectros UV-Vis característicos
de la plata coloidal, con picos entre los 350 y los 460 nm (Zaki et al., 2011) (Fig. 6B).
Si bien el mecanismo exacto continúa pendiente de dilucidar, algunos autores han

propuesto mecanismos mediante los cuales la interacción de la luz con determinadas
biomoléculas liberaría agentes reductores fuertes, como los radicales acetilo, que a su vez
aceleran la reducción de los iones Ag+ en Ag0 (McGilvray et al., 2006; Stamplecoskie y
Scaiano, 2010). Este proceso, origina los núcleos que posteriormente darán lugar a las
nanopartículas, ya sea por agregación o por engrosamiento de los mismos debido a la adhesión
de Ag0 en su superficie (Grzelczak y Liz-Marzán, 2014).
Esto explicaría los resultados obtenidos por numerosos autores, que muestran una
producción de AgNPs mucho más lenta en oscuridad, con rangos que van desde las 24 horas
a los 7 días (Zaki et al., 2011; Thiruneelakanda et al., 2013; Matei et al., 2015; Sásková et al.,
2016) frente a aquellas producidas en presencia de luz ambiental (Ranganath et al., 2012; Wei
et al., 2012). En nuestro caso, la ausencia de producción en condiciones de oscuridad podría
ser explicada por el corto período de tiempo en el que se llevó a cabo la síntesis.
161
Figura 6: Espectros UV-Vis obtenidos a partir de los extractos de las cepas L. hilgardii UVI-18, L.
paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6, tras 72 horas de incubación en presencia de AgNO 3 1 mM a
diferentes temperaturas y en presencia de luz o en oscuridad.
En general, las muestras sometidas a una agitación de 200 rpm mostraron picos de
absorbancia superiores a aquellas incubadas en estático, a excepción del extracto procedente
de la cepa L. hilgardii UVI-18, que dio lugar a un pico de absorbancia superior a 1 al ser
incubado en estático a una temperatura de 22 ºC, por encima de valores obtenidos en agitación
a otras temperaturas. Las temperaturas consideradas óptimas fueron 22 ºC en L. hilgardii UVI-
18 y L. paracasei UVI-2 y de 35 ºC en el extracto procedente de la cepa L. plantarum UVI-6.
No parece existir una correlación entre la producción de AgNPs y el incremento de la

temperatura de reacción, contrariamente a lo descrito por Gurunathan et al. (2009) para la
162
síntesis de AgNPs en Medio Nitrato tras el crecimiento de E. coli. Estos autores mostraron un
incremento de la producción de nanopartículas paralelo al incremento en la temperatura de
reacción, hasta alcanzar su óptimo a 60 ºC. En nuestro caso, la formación de las AgNPs a
temperaturas más moderadas permitiría una importante reducción en los costes de producción
de las mismas.
Considerando los datos en su conjunto se observa una dependencia en la formación de

AgNPs de la temperatura y la agitación, variable, a su vez, según la cepa utilizada, lo que
confirma el efecto de los factores probados y justifica la necesidad de su optimización para
una producción óptima. Así, tras 72 horas de incubación, los mayores valores de absorbancia
se obtuvieron en las condiciones de luz, agitación y 35 ºC para el extracto obtenido de la cepa
L. plantarum UVI-6 y luz, agitación y 22 ºC para los extractos de las cepas L. paracasei UVI-
2 y L. hilgardii UVI-18 (Fig. 6B), siendo el extracto obtenido a partir de esta última cepa el
que permite unos niveles de producción notablemente superiores a los conseguidos con las
otras dos cepas estudiadas.
Tras los ensayos anteriores, y teniendo en cuenta las referencias previas (Guranathan
et al., 2009; Sintubin et al., 2009) que sugieren una mayor producción de AgNPs a valores de
pH del medio alcalinos y a la implicación de los grupos hidroxilo en dicha producción, se
procedió a determinar el efecto de la adición de NaOH sobre la formación de nanopartículas
utilizando los extractos obtenidos en este estudio. Para ello, en este caso, la obtención de los
espectros UV-Vis se realizó tras dos horas de incubación.
En todas las condiciones probadas se puso de manifiesto la formación de

nanopartículas mediante el cambio de color en los extractos (Fig. 7B) lo cual fue confirmado,
nuevamente, mediante la determinación de los espectros UV-Vis (Fig. 7A).
En cualquiera de las concentraciones ensayadas se alcanzaron valores de absorbancia

mayores o iguales a las observadas en ausencia de dicho compuesto, con una importante
reducción del tiempo de síntesis (Fig. 7). Este pasó de las 72 horas iniciales necesarias para
alcanzar un valor de absorbancia de aproximadamente 1 en el extracto L. hilgardii UVI-18, a
dos horas para obtener el mismo valor tras la adición de una concentración 0,8 mM de NaOH.
Los controles que contenían solamente NaOH no permitieron la formación de nanopartículas.
163
Los mayores valores de absorbancia se obtuvieron en los tres extractos con una
concentración de NaOH de 1,2 mM (Fig. 7B). Esta mejora de la síntesis de AgNPs en extracto
celulares alcalinos había sido descrita por Sintubin et al. (2009), quienes obtuvieron su óptimo
de producción de estas nanopartículas en medio básico, a partir de biomasa celular de L.
fermentum.
Figura 7: A: Espectros UV-Vis obtenidos tras la incubación de los extractos L. hilgardii UVI-18, L.
paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6 durante 2 horas, en presencia de AgNO3 (1 mM) y a diferentes
concentraciones de NaOH. B: Cambio de coloración de los extractos por la formación de AgNPs a las
diferentes concentraciones de NaOH.
164
3.4. Determinación de los valores máximos de producción. Estabilidad de las AgNPs
Una vez establecidas las condiciones óptimas de síntesis se procedió a la

determinación de los valores máximos de producción de AgNPs en los extractos L. hilgardii
UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6, utilizando conjuntamente todas las
condiciones optimizadas y determinándolos a intervalos de 1 hora durante 5 horas.
En primer lugar se observó que la síntesis de partículas aumentó con el tiempo de

incubación. Los picos máximos de absorbancia se muestran en la Fig. 8A y fueron obtenidos
tras 5 horas de incubación en presencia de AgNO3 en las especies L. plantarum UVI-6 y L.
paracasei UVI-2. En el primero de los casos, transcurrido este tiempo se alcanzó un valor de
absorbancia de 1,74 en el punto del espectro UV-Vis correspondiente a los 440 nm, mientras
que en el extracto correspondiente a la cepa L. paracasei UVI-2, el valor máximo de
absorbancia alcanzado fue de 2,11 en los 432 nm. En el caso del extracto de L. hilgardii UVI-
18 el valor máximo de absorbancia se obtuvo al cabo de tres horas tras la adición de AgNO3
alcanzando un valor de 1,75 en los 442 nm.
Tal como se indicó más arriba, se realizó un seguimiento periódico de la síntesis de

AgNPs tomando los valores de absorbancia correspondientes a la longitud de onda del pico
máximo obtenido en cada uno de los extractos. Dicho seguimiento mostró, además, una
tendencia al desplazamiento del pico de absorbancia a valores ligeramente superiores a medida
que aumenta el tiempo de incubación, en concordancia con lo descrito por Kalimuthu et al.
(2008) debido, probablemente, a los cambios en las morfologías y proporciones de las
nanopartículas, y/o a su agregación.
A diferencia de lo encontrado por el citado autor, quien describió una evolución lineal
en la síntesis de AgNPs a lo largo del tiempo, en nuestro caso, solamente uno de los extractos
mostró esta tendencia (L. plantarum UVI-6), mientras que los extractos de L. paracasei UVI-
2 y L. hilgardii UVI-18 mostraron una evolución de tipo logarítmico en la formación de las
mismas (Fig. 8B).
165
Figura 8: A: Picos máximos de absorbancia obtenidos para cada uno de los extractos en las condiciones
óptimas. B: Evolución de la formación de AgNPs en cada uno de los extractos a lo largo del tiempo.
Otro aspecto importante en los procesos de síntesis de nanopartículas es conseguir

partículas que se mantengan estables en suspensión durante el mayor tiempo posible ya que,
en muchos casos, se ha demostrado que la tendencia de las mismas es a precipitar (Raveendran
et al., 2013). Las AgNPs sintetizadas en las condiciones establecidas en el presente estudio
permanecieron en suspensión durante al menos un mes sin alteración apreciable. Este hecho
podría explicarse asumiendo que las nanopartículas se recubren de moléculas orgánicas
(presentes en el extracto) durante el proceso de formación, cuya carga superficial puede influir
en gran medida en la estabilidad de las partículas evitando su precipitación a través de la
repulsión electrostática entre ellas (Wei et al., 2012; Zhang et al., 2014).
166
Algunos autores habían descrito previamente la utilidad de las bacterias ácido lácticas
para la síntesis biológica de AgNPs (Sintubin et al., 2009; Nair y Pradeep, 2002; Korbekandi
et al., 2011; Matei et al., 2015), sin embargo, en todos los estudios previos el origen de las
cepas eran los productos lácteos siendo esta la primera vez que se describe dicha capacidad
para las bacterias malolácticas de los vinos. Además, este estudio describe también por primera
vez la capacidad de las especies L. paracasei y L. hilgardii para sintetizar AgNPs, siendo
ambas las que mejores resultados mostraron en términos de producción, si se comparan con la
especie más estudiada L. plantarum.
3.5. Caracterización de las AgNPs mediante Microscopía Electrónica de

Transmisión (TEM)
El tamaño y la forma de las nanopartículas en general y de las AgNPs en particular

tienen un papel crucial en su comportamiento físico-químico (Burda et al., 2005). Por esto se
procedió, en primer lugar, a verificar la formación de las AgNPs para a continuación estimar
el tamaño medio y la forma de las mismas mediante Microscopía Electrónica de Transmisión
(TEM).
Debido a que no se observaron grandes diferencias en los picos de absorción máxima

mostrados por los tres extractos se emplearon las muestras obtenidas a partir del extracto de
L. paracasei UVI-2 para su caracterización mediante microscopía electrónica, ya que se trata,
además, de la especie con la que se han obtenido los mejores resultados.
En la Fig. 9 se pueden apreciar la frecuencia de cada uno de los tamaños obtenidos

tras la biosíntesis de AgNPs, tamaño que osciló entre los 3 y los 26 nm de diámetro, y una
media de 10 ± 3,3 nm. Sin embargo, como se puede apreciar en la Fig. 9, la mayor parte de las
AgNPs (un 70%) se encuentran en un rango entre los 4 y los 12 nm, mientras que las de mayor
tamaño suponen solamente un 27 % del total de nanopartículas analizadas. Las nanopartículas
de este tamaño (10 nm e inferiores) han demostrado ser las mejores candidatas para su
aplicación como agente antimicrobiano debido a que son las que presentan una mayor
capacidad para atravesar las envueltas celulares microbianas e inducir la muerte por los
mecanismos anteriormente descritos (Morones et al., 2005). Las micrografías de la muestra se
presentan en la Fig. 10.
167
Figura 9: Distribución de los tamaños obtenidos a partir de una muestra de 220 AgNPs.
Se ha descrito el tamaño de 2 nm como límite inferior de las AgNPs sintetizadas de

manera biológica, mientras que el límite superior parece definido entre los 40 y los 50 nm
(Zaki et al., 2011; Priyadarshini et al., 2013). Nair y Praded (2002) obtuvieron, de manera
intracelular en células de género Lactobacillus, AgNPs en un rango de entre 15 y 500 nm, si
bien las de tamaño más grande parecían ser agregados de las primeras. Más recientemente,
Matei et al. (2015) emplearon el sobrenadante obtenido tras el cultivo de L. plantarum para la
obtención de AgNPs de tamaños comprendidos entre los 15 y los 20 nm. El conjunto de estos
datos parece indicar que el tamaño depende de la especie, tal vez de la cepa, y del método
utilizado para la síntesis. El tamaño de las AgNPs obtenidas a partir de la cepa L. paracasei
UVI-2 utilizada en este estudio se encuentra dentro de los descritos pero más bien desplazado
hacia los límites inferiores, lo que podría resultar de interés a la hora de proponerlas para
aplicaciones que requieran su entrada dentro de las células.
168
Figura 10: Microfotografía TEM de las AgNPs sintetizadas con el extracto L. paracasei UVI-2 en
condiciones óptimas. Las Fig. A, B y C muestran las morfologías circular, hexagonal y triangular
respectivamente.
Con relación a la morfología de las AgNPs sintetizadas, más del 90% presentaron
morfología circular (Fig. 10A), y en menor proporción, formas hexagonales (Fig. 10B) y
triangulares (Fig. 10C), siendo éstas las formas características de las AgNPs sintetizadas por
microorganismos (Wei et al., 2012), y las más activas en cuanto a sus efectos antimicrobianos
(Pal et al., 2007). Si bien en la imagen solo se pueden apreciar NPs como figuras planas,
probablemente se trate de diferentes formas tridimensionales de las mismas.
Como se ha señalado, la forma de las nanopartículas define sus propiedades físico-

químicas (Burda et al., 2005), lo que a su vez influye sobre la interacción de las mismas con
las moléculas con las que pueden entrar en contacto, incluyendo los componentes celulares de
bacterias, hongos y organismos superiores, en el caso de su aplicación sobre células vivas. Así,
Pal et al. (2007) demostraron la dependencia entre la forma de la nanopartícula y la interacción
que esta tiene sobre la bacteria Gram negativa E. coli. En dicho estudio se muestra que la
morfología triangular, seguida de la circular poseen un gran efecto biocida. Dada la presencia
de estas morfologías entre las AgNPs obtenidas con la cepa L. paracasei UVI-2 cabría esperar
por parte de las mismas un importante efecto antimicrobiano.
169
3.6. Capacidad de las AgNPs sintetizadas para penetrar las células y efecto
antimicrobiano
Muchas de las aplicaciones de las nanopartículas, por ejemplo su empleo como

antimicrobianos, requieren de su entrada dentro de las células. Por ello se procedió también a
comprobar si las AgNPs sintetizadas en las condiciones establecidas en este estudio tenían la
capacidad de penetrar en las células, en concreto en las microbianas. Para ello, un cultivo de
la especie Bacillus cereus fue tratado durante 24 h con las AgNPs obtenidas a partir de la cepa
L. paracasei UVI-2 según se explica en la sección de metodología. Las células tratadas fueron
analizadas mediante TEM y los resultados se muestran en la Fig. 11A.
Figura 11: A: Imagen TEM de las AgNPs en el interior de una célula de B. cereus; B: Desestructuración
de la pared celular bacteriana (señalada con flechas azules) tras el tratamiento con AgNPs; C: Imagen
amplificada de las NPs en el interior celular. Las flechas rojas señalan las nanopartículas.
Las imágenes muestran la capacidad de las AgNPs para desestructurar las envueltas
celulares externas (Fig. 11, inserto B) y penetrar al interior de la célula (Fig. 11, inserto C). En
base a ello, las nanopartículas sintetizadas en este trabajo podrían ejercer una actividad
antimicrobiana mediante cualquiera de los mecanismos propuestos hasta ahora y descritos en
170
la introducción de este capítulo (Morones et al., 2005; Pal et al., 2007; Mirzajani et al. 2011;
Singh et al., 2015). El empleo de las AgNPs como microbicidas está recibiendo un creciente
interés, especialmente desde la irrupción y diseminación de los agentes patógenos resistentes
a antibióticos ya que han sido propuestas como una alternativa en estas situaciones al haber
demostrado actividad antimicrobiana frente a bacterias de importancia clínica y, en menor
medida, frente a hongos (Morones et al., 2005; Rudramurthy et al., 2016; Tashi et al., 2016).
Teniendo en cuenta la capacidad mostrada por las nanopartículas sintetizadas en este

estudio para desestructurar y penetrar en el interior de las células microbianas, se procedió
seguidamente a probar su actividad antimicrobiana como un estudio preliminar de su potencial
aplicación en el control de microorganismos indeseados.
Dentro de las bacterias, las especies más utilizadas para probar el efecto
antimicrobiano de las AgNPs han sido Escherichia coli (como Gram-negativa) y
Staphylococcus aureus (como Gram-positiva). Para testar el efecto antimicrobiano de las
AgNPs sintetizadas en este trabajo se ha escogido, como bacteria Gram-negativa, una cepa de
Klebsiella sp. debido a la creciente atención que las autoridades sanitarias tienen que prestar a
las cepas de esta bacteria que se han convertido en resistentes a todos los antibióticos (Arana
et al., 2016; Utt y Wells, 2016) y, como Gram-positiva, una cepa de Bacillus cereus
responsable de intoxicaciones alimentarias e infecciones graves asociadas a pacientes
inmunodeprimidos, resistente también a numerosos antibióticos, entre ellos las cefalosporinas
de 3ª generación (Kervick et al., 1990). Además, para evaluar la actividad antimicrobiana de
las nanopartículas frente a los hongos, se ha incluido en el estudio la levadura Candida
glabrata, considerada un patógeno emergente con un alto número de cepas resistentes a los
antifúngicos triazólicos (Tapia, 2008).
En primer lugar, se realizó un ensayo cualitativo utilizando las especies B. cereus y C.

glabrata como representantes de agentes patógenos procariotas y eucariotas respectivamente,
para lo cual se llevaron a cabo ensayos de inhibición en placa (Fig. 12).
Estos ensayos mostraron una inhibición completa del crecimiento de B. cereus en las
zonas en las que se inoculó la suspensión de AgNPs, siendo esta inhibición equivalente con
los tres extractos (Fig. 12A). En el caso de la inoculación sobre un cultivo de C. glabrata (Fig.
12B), la inhibición del crecimiento no fue completa, aunque sí se produce un menor desarrollo
171
del cultivo en aquellas zonas en las que hay presencia de nanopartículas. En todos los casos se
comprobó que la inhibición no era producida por compuestos sintetizados por las propias
bacterias ácido lácticas empleadas y que pudieran estar presentes en el extracto, reproduciendo
con el extracto celular sin AgNPs el ensayo descrito, lo que arrojó resultados de negativos.
A B. cereus B C. glabrata
Figura 12: Efecto antimicrobiano de las AgNPs sobre B. cereus y C. glabrata.
En segundo lugar, se estimaron la CMI y la CMM para todos los microorganismos

escogidos. En el ensayo se probaron dos muestras de nanopartículas con distintas
absorbancias, 0.5 y 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1, en la que se observa que las
AgNPs obtenidas a partir de las tres cepas de bacterias lácticas estudiadas muestran actividad
antimicrobiana frente a todas las cepas testigo probadas, siendo más efectivas frente a las
bacterias que contra la levadura. Además, se observa también que, atendiendo a la CMI, el
extracto obtenido a partir de L. hilgardii UVI-18 se mostró más efectivo, aunque estas
diferencias no son tan claras cuando se analiza la CMM. Las diferencias en la efectividad
antimicrobiana encontradas entre los tres extractos utilizados podría deberse a las diferencias
en las concentraciones de cada una de las morfologías de las AgNPs, tal como se describió
con anterioridad. A esto podrían sumarse las diferencias en las moléculas adheridas en la
superficie de las nanopartículas, lo que influiría en su carga, y con ello en su capacidad de
atracción y unión a las paredes celulares, si bien el mecanismo de acción antimicrobiana de
las AgNPs aún no ha sido completamente esclarecido (Singh et al., 2015; Gupta et al., 2016).
172
Tabla 1: Actividad antimicrobiana de las AgNPs, expresada como CMI y CMM, (en µg/mL de Ag+).
CMI CMM
L. hilgardii L. paracasei L. plantarum L. hilgardii L. paracasei L. plantarum

UVI-18 UVI-2 UVI-6 UVI-18 UVI-2 UVI-6
C. glabrata 1,56 3,125 1,56 6,25 6,25 6,25

Abs. 0,5
Klebsiella sp. ≤ 0,78 1,56 1,56 3,125 3,125 3,125
B. cereus 1,56 1,56 1,56 6,25 1,56 1,56
C. glabrata 1,56 3,125 3,125 6,25 6,25 6,25

Abs. 1
Klebsiella sp. ≤ 0,78 ≤ 0,78 1,56 6,25 1,56 1,56
B. cereus ≤ 0,78 1,56 1,56 3,125 3,125 1,56
Con respecto a la concentración de AgNPs en la muestra, no se observó una clara

mayor efectividad con la muestra más concentrada (Absorbancia = 1), dándose incluso la
situación contraria, lo que podría ser atribuido a una mayor agregación de las NPs en la muestra
más concentrada dando lugar a tamaños mayores, lo que reduciría su actividad antimicrobiana
(Singh et al., 2015; Rudramurthy et al., 2016).
Algunos autores (Kim et al., 2007; Jain et al., 2010) han descrito un mayor efecto
antimicrobiano de las AgNPs sobre las bacterias Gram-negativas en comparación con las
Gram-positivas y lo han atribuido a la mayor dificultad para desestructurar y atravesar las
paredes celulares de estas últimas. Sin embargo, otros investigadores (Suresh et al., 2010; Wei
et al., 2012; y Rahisuddin et al., 2015), han descrito el efecto contrario, en concreto utilizando
nanopartículas de síntesis biológica. En el caso de las NPs sintetizadas en este trabajo, la
eficacia parece más bien dependiente del extracto (tipo de nanopartículas presentes) utilizado
y la cepa a la que se enfrenta, como había sido descrito previamente (Rodríguez-Arguelles et
al., 2015) para AgNPs sintetizadas en diferentes tipos de quitosano.
Los distintos estudios existentes hasta el momento, utilizan diferentes métodos

(bioensayos en placa, métodos de microdilución) así como distintas cepas testigo para
determinar la actividad antimicrobiana de las nanopartículas, la cual expresan en diferentes
unidades (ppm, μg/mL, molaridad). Al no existir una metodología de trabajo unificada resulta
difícil poder comparar los resultados obtenidos en diferentes trabajos.
Con respecto a las AgNPs sintetizadas en este estudio, las CMI obtenidas para
Klebsiella sp. y B. cereus (≤ 0,78 – 1,56 μg/mL) son muy inferiores a las encontradas por
173
Pourmand et al. (2013) para K. pneumoniae (10 μg/mL) y por Buszewski et al. (2016) para B.
subtilis (6,25 μg/mL). Esto mismo ocurre cuando se comparan con las diferentes CMI
recogidas en Durán et al. (2016) o en Rudramurthy et al. (2016) para distintas cepas de
diferentes especies de bacterias y levaduras, lo que pone de manifiesto para las AgNPs
obtenidas a partir de las bacterias lácticas estudiadas en este trabajo una potente actividad
antimicrobiana destacando, además, que es la primera vez que se describe para las especies L.
paracasei y L. hilgardii.
En resumen, el presente estudio demuestra que las bacterias ácido lácticas procedentes
del vino pueden ser empleadas para la síntesis de AgNPs, utilizando un método sencillo,
económico, no tóxico y respetuoso con el medio ambiente, siendo la primera vez que se usan
con esta finalidad las especies L. paracasei y L. hilgardii.
Tabla 2: Síntesis de AgNPs por diferentes especies bacterianas.
Tiempo
Sistema [AgNO3 ] [Células] Tamaño Producción
Referencia Especie Forma(b) de
Reductor (a) (mM) (g/L) (nm) (Abs.)
síntesis
Medio de
Chaudhari et al. 2012 Lactobacillus spp. 1 - 39-41 C 3 días 3
cultivo (LC)
Dhoondia et al. 2012 L. mindensis Biomasa 0,5 - 2-20 C/T 7 días 2,7
E. coli Medio de
Guranathan et al., 2014 42-89 C 24 horas 2,3
cultivo (LC)
Korbekandi et al. 2011 L. casei Biomasa 6 5 10-25 - 50 horas 4
L. plantarum Medio de
Matei et al. 2015 1 - 15-20 C/H 24 horas -
cultivo (LC
Ranganath et al. 2012 Lactobacillus spp. Biomasa 1 - 2-20 C 12 horas 0,7
B. subtilis Medio de
Saifudin et al., 2009 5-50 C/ T 5 días 0,9
cultivo (LC)
Sásková et al. 2016 L. casei Biomasa 4 - 12-27 - 21 días -
L. farciminis
L. parabuchneri
L. plantarum
Sintubin et al. 2009 Biomasa 5,8 5 5-15 - 1 min -
L. fermentum
L. brevis
L. rhamnosus
L. plantarum Extracto
Thiruneelakandan et al. 2013 1 4 - - 24 horas 0,8
acuoso
Acinetobacter sp.
Stenotrophomonas
maltofilica Medio de
Zaki et al., 2011 3,5 - 15-50 C 6 días 4
E. coli cultivo (LC)
B. megaterium
Zhang et al. 2014 L. fermentum Biomasa 9 10 3-10 C 24 horas 2,3
L. paracasei 3-26 C/H/T 5 horas 2,11
Extracto
Este estudio L. plantarum 1 7 - - 5 horas 1,74
acuoso
L. hilgardii - - 3 horas 1,75
(a) LC: libre de células

(b) C: Circulares; H: Hexagonales; T: Triangulares
174
Los datos obtenidos utilizando el método de síntesis puesto a punto en este trabajo
muestran una excelente relación entre los niveles de producción y los cortos tiempos de
producción utilizados, si se comparan con otros estudios que también utilizan cepas
bacterianas (Tabla 2), originando NPs de tamaño adecuado para ser utilizadas en diferentes
aplicaciones biológicas. Pero además, este método, a diferencia de la mayoría de los descritos
(Tabla 2), parte de un extracto reductor libre de células y componentes de medio de cultivo,
preparado en agua, evitando así la necesidad de recuperar las nanopartículas del interior de las
células o adheridas a ellas. Por otra parte, la evaluación de su actividad biológica, mostró que
presentan una potente actividad antimicrobiana, en particular frente a microorganismos
patógenos, cuando se compara con la mayoría de las otras AgNPs descritas.
Con respecto a las perspectivas de futuro, sería interesante probar la actividad

antimicrobiana de estas nanopartículas frente a otros microorganismos, bien utilizadas de
manera individual o combinadas con otras drogas para potenciar su actividad, así como evaluar
otras posibles aplicaciones biomédicas y ambientales. Igualmente, sería de interés probar la
capacidad de los extractos reductores obtenidos a partir de las bacterias lácticas de los vinos
para sintetizar otras nanopartículas metálicas. Por otra parte, sería también de gran
importancia, llegar a identificar y caracterizar el/los componentes de carácter reductor
presentes en el extracto utilizado para llevar a cabo la síntesis.
175
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
- La combinación de las técnicas de secuenciación del ARNr 16S, ARDRA, análisis de la

región intergénica 16S/23S y el gen recA, se mostró adecuada para la identificación de las
bacterias del ácido láctico asociadas a mosto y vino de la variedad Albariño cultivada en la
región vinícola de Val do Salnés (D.O. Rías Baixas).
- El estudio de la diversidad de bacterias lácticas aisladas a partir de mosto y vino de la variedad

Albariño cultivada en la región estudiada permitió agruparlas en cuatro géneros y seis especies:
L. hilgardii, L. paracasei, L. plantarum, L. lactis, P. damnosus y O. oeni, predominando, a
diferencia de lo que ocurre en la mayor parte de las regiones vinícolas, el género Lactobacillus
y no el género Oenococcus y mostrando una distribución biogeográfica característica.
- Ocho de las cepas aisladas presentaron capacidad para consumir ácido málico en distinto
grado, sin incrementar significativamente la acidez volátil, en las condiciones y características
de los vinos de la región objeto de estudio, resultando esta una característica dependiente de
la cepa y no de la especie.
- El análisis de las cepas que mostraron actividad maloláctica puso de manifiesto que carecen
de capacidad aminogénica que pueda comprometer la seguridad del producto elaborado, que
no producen fenoles volátiles que puedan impactar negativamente en el aroma del vino y que
sintetizan, en distintas concentraciones, beta-glucosidasas que pueden contribuir a potenciar y
diferenciar el perfil aromático del vino, confiriéndole tipicidad regional.
- Atendiendo a los criterios aplicados en este estudio, se seleccionan como más adecuadas para
conducir la FML en los vinos de la variedad Albariño de la región de Val do Salnés, las cepas
L. paracasei UVI-2 y L. hilgardii UVI-23 que, además, se proponen como potenciales nuevos
estárteres malolácticos autóctonos.
- Las cepas malolácticas (pertenecientes a las especies L. plantarum, L. hilgardii, L. paracasei

y L. lactis) estudiadas en este trabajo mostraron actividad antimicrobiana frente a bacterias
Gram positivas pertenecientes a los géneros Bacillus y Staphylococcus. Todas las cepas testigo
fueron inhibidas por al menos una cepa láctica apreciándose variabilidad intraespecífica tanto
en el grado de inhibición como en el espectro de actividad. La mayor especificidad fue
mostrada por las cepas de L. hilgardii que inhibieron solamente al género Bacillus. En cambio,
la mayor efectividad, considerando tanto el grado de inhibición como el número de especies
inhibidas, fue mostrado por las cepas de L. paracasei y L. lactis.
179
CONCLUSIONES
- Todas las cepas malolácticas analizadas presentaron capacidad para inhibir in vitro, en mayor
o menor grado, el crecimiento de F. oxysporum. En cuatro de las cepas probadas se observó
un incremento significativo en el grado de inhibición del hongo tras un periodo previo de
crecimiento de la bacteria de 48 h. Además, se encontró una variabilidad significativa en el
grado de inhibición de F. oxysporum entre algunas de las cepas bacterianas probadas,
alcanzándose con la cepa más efectiva (L. paracasei UVI-7) una inhibición del crecimiento
del hongo del 76%.
- El estudio de la capacidad de las bacterias malolácticas probadas para llevar a cabo el

biocontrol de la infección por F. oxysporum en plantas de Lycopersicum esculentum mostró
que la cepa L. plantarum UVI-10 puede reducir significativamente el efecto causado por el
hongo sobre la planta. Por otra parte, el análisis de la capacidad fitoestimulante de dichas
bacterias puso de manifiesto que la cepa UVI-10 puede también estimular significativamente
el desarrollo vegetal en la citada planta.
- El antagonismo microbiano y efecto bioprotector y fitoestimulante mostrados por las

bacterias malolácticas, unido a la variabilidad observada entre cepas, en relación con su mayor
o menor efectividad y especificidad de acción, las convierte en microrganismos de potencial
interés como biopreservativos, agentes de biocontrol y agentes biofertilizantes.
- La biomasa de las cepas vínicas L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum

UVI-6 permitió la obtención de un extracto acuoso reductor con capacidad para sintetizar
nanopartículas de plata, describiéndose por primera vez esta capacidad en las especies L.
hilgardii y L. paracasei. La síntesis resultó estimulada mediante la adición de NaOH y la
aplicación de una fuente lumínica de 40 W. La caracterización mediante TEM, utilizando las
nanopartículas obtenidas con el extracto de la cepa UVI-2, puso de manifiesto que tenían un
tamaño medio de 10 nm (oscilando entre 3-26) y una morfología mayoritariamente esférica
aunque aparecen también formas triangulares y poliédricas. Las nanopartículas presentaron
capacidad para penetrar en el interior de las células bacterianas y una potente actividad
antimicrobiana.
- Atendiendo a los niveles de producción en relación al tiempo de síntesis, así como al tipo y
tamaños de partículas obtenidas y la actividad antimicrobiana mostrada, el método puesto a
punto en este estudio puede considerarse muy competitivo y ventajoso en relación a otros
métodos descritos previamente.
180
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CURRICULUM VITAE
MAYO 2017

1. INFORMACIÓN PERSONAL
Nombre y Apellidos: Jacobo López Seijas
Fecha de nacimiento: 22 de Mayo de 1982
2. FORMACIÓN ACADÉMICA
- Licenciado en Biología. Facultad de Biología. Universidad de Vigo. 25/02/2010.
- Máster en Biotecnología Avanzada. Facultad de Ciencias. Universidades de Vigo y A

Coruña. 21/06/2012.
3. EXPERIENCIA INVESTIGADORA
3.1. Participación en proyectos de investigación
1. Título: Estudio: Variabilidad espacial en base a la calidad de la uva y microbiota

asociada de tipo no Saccharomyces para las variedades Tinto Fino y Cabernet
Sauvignon (IDI-20150484). Centro para el Desarrollo Tecnológico Industrial
(CDTI), Ministerio de Economía y Competitividad. Investigador Principal:
Carmen Sieiro Vázquez. 2015-2017.
2. Título: Nuevos biocatalizadores con actividad quitinolítica y evaluación de sus

potenciales aplicaciones (10PXIB310278PR). Xunta de Galicia. Investigador
Principal: Carmen Sieiro Vázquez. 2010-2013.
3. Título: Estudio de la microbiota maloláctica asociada al Val do Salnés

(PGIDIT06RAG018E). Xunta de Galicia. Investigador Principal: Carmen Sieiro
Vázquez. 2007-2010.
3.2. Publicaciones científicas
1. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. 2016. Optimizing the

expression of a heterologous chitinase: A study of different promoters.
Bioengineered 38: 1-5. ISSN: 2165-5987.
2. García-Fraga B, Da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. 2015. Optimized expression

conditions for enhancing production of two recombinant chitinolytic enzymes
from different prokaryote domains. Bioprocess and Biosystems Engineering
38: 2477-2486. ISSN: 1615-7605.
3. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. 2015. A novel family 19

chitinase from the marine-derived Pseudoalteromonas tunicata CCUG 44952T:
heterologous expression, characterization and antifungal activity. Biochemical
Engineering Journal 93: 84-93. ISSN: 1369-703X.
4. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. 2014. Characterization and

optimization of heterologous expression in Escherichia coli of the chitinase
encoded by the chiA gene of Bacillus halodurans C-125. Process Biochemistry
49: 1622-1629. ISSN: 1359-5113.
5. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. 2014. Functional expression

and characterization of a chitinase from the marine archaeon Halobacterium
salinarum CECT 395 in Escherichia coli. Applied Microbiology and
Biotechnology 98: 2133-2143. ISSN: 0175-7598.
6. Sieiro C, García-Fraga B, López-Seijas J, da Silva AF, Villa TG. 2012. Microbial

pectic enzymes in the food and wine industry. In: Food Industrial Processes –
Methods and Equipment. Valdez B (ed). InTech, Croatia. Pp. 201-218.
3.3. Comunicaciones en congresos nacionales e internacionales
1. López-Seijas J, Fernández Sestelo AB, García-Fraga B, da Silva AF, Carballeira L,

Sieiro C. Ecology of malolactic bacteria associated with Albariño musts and wines
from the Salnés region, in Northwestern Spain. Microbiotec. 1-3 Diciembre 2011.
Braga, Portugal.
2. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. Estudio de la quitinasa

codificada por el gen chiA1 de la arquea marina Halobacterium salinarum. IV
Congreso de Microbiología Industrial. 14-16 Noviembre 2012. Salamanca,
España.
3. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. Optimización de la
producción de una quitinasa de Lactococcus lactis subsp. lactis. IV Congreso de
Microbiología Industrial. 14-16 Noviembre 2012. Salamanca, España.
4. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. Purification and

characterization of a chitinase from the marine archaea Halobacterium salinarum.
Microbiotec. 1-3 Diciembre 2011. Braga, Portugal.
5. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. Clonation and

characterization of a chitinase from Lactococcus lactis subsp. lactis. Microbiotec.
1-3 Diciembre 2011. Braga, Portugal.
3.4. Estancias en centros de investigación
1. Centro: Universidad Técnica de Viena.

Ciudad: Viena. Country: Austria
Fecha: 28/01/2013 - 03/05/2013. Duración: 14 semanas
Tema: Desarrollo y validación de un método para la detección de ácidos
benzoicos fluorados en agua mediante cromatografía de gases con
espectrometría de masas (GC/MS).
3.5. Becas disfrutadas
1. Beca-contrato pre-doctoral. Desde el 01/02/2014 al 31/01/2016. Universidad de

Vigo.
2. Beca de formación en el extranjero del Programa Leonardo Da Vinci, otorgada

por la Excma. Diputación Provincial de Lugo en colaboración con el Organismo
Autónomo de Programas Educativos Europeos (APEE). 2013. 14 semanas.
4. EXPERIENCIA DOCENTE
4.1. Docencia universitaria reglada
A. Año académico: 2013/2014:
1. Asignatura: Técnicas Básicas de Laboratorio. Titulación: Grado en

Biología. Universidad de Vigo. 16 horas.
2. Asignatura: Principios de Microbiología Marina. Titulación: Grado en

Ciencias del Mar. Universidad de Vigo. 29 horas.
3. Asignatura: Parasitología y Microbiología Marina. Titulación: Grado en

B. Año académico: 2014/2015:
1. Asignatura: Microbiología I. Titulación: Grado en Biología. Universidad de

Vigo. 13 horas.
2. Asignatura: Técnicas Básicas de Laboratorio. Titulación: Grado en

Biología. Universidad de Vigo. 35 horas.
3. Asignatura: Parasitología y Microbiología Marina. Titulación: Grado en

C. Año académico: 2015/2016:
1. Asignatura: Microbiología I. Titulación: Grado en Biología. Universidad de

Vigo. 58,7 horas.
2. Asignatura: Contaminación. Titulación: Grado en Biología. Universidad de

Vigo. 1,3 horas.
4.2. Codirección de Trabajos Fin de Grado y Master
1. Título: Estudio de la diversidad de levaduras no-Saccharomyces asociadas a la

variedad tempranillo en la Ribera del Duero. Grado en Biología. Autora: Mª
Ángeles Pichardo Gallardo. Universidad de Vigo. 2017.
2. Título: Caracterización de una nueva levadura con capacidad de degradar
colorantes. Master en Biotecnología Avanzada. Autor: Rubén Simón Cortés.
Universidad de A Coruña. 2015.
5. OTROS MÉRITOS
1. Formación investigadora
a. Seminario “IDEA PUZZLE” sobre gestión de tesis de doctorado, impartido

por la Universidad de Vigo. Octubre de 2016.
b. Curso “Creación de Empresas basadas en el conocimiento universitario”

impartido por la Universidad de Vigo. Mayo de 2015. 8 horas.
c. Curso “Scientific Writing Part A (IMRad) and Part B (Language)”

impartido por la University of Vigo (16-17 de Julio de 2014). 10 horas.
d. Curso “Gestión de proyectos con MS Project 2010” impartido por la

Universidad Nacional de Educación a Distancia (UNED). (Marzo y Abril
de 2012). 26 horas.
e. Curso “La fisiología vegetal para estudiantes” impartido por la Sociedad

Española de Fisiología Vegetal (Zaragoza, 8-11 Septiembre de 2009).
2. Otros cursos
a. Curso de Prevención de Riesgos Laborales (Adecco Formación, S.A.).

Octubre de 2005.
b. Prácticas pre-profesionales en el Servicio de Medio Ambiente y Energías

Renovables. Excma. Diputación Provincial de Lugo. Septiembre de 2012.
c. Idiomas:
i. Rumano nivel principiante (Universidad Alexandru Ioan Cuza –

Rumanía).
ii. Alemán nivel elemental 2 (Asociación Amadeus, Viena).
iii. Gallego/español (idiomas nativos).

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Jacobo López Seijas “TESE DE DOUTORAMENTO” Biodiversidad de bacterias ácido lácticas asociada a la variedad

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Dirigida por la doctora: Carmen Sieiro Vázquez

A la Dra. Carmen Sieiro Vázquez, por darme la oportunidad de realizar el doctorado

A Sandra Álvarez, técnico del departamento de Biología Funcional y Ciencias de la

Al área de Parasitología y, de manera especial, a los Dres. Jose M. García y Raúl

A mi familia, por vuestras incansables palabras de ánimo, vuestro cariño y vuestro

1. Las bacterias malolácticas: consideraciones generales .................................................................... 3

 Capítulo I: Aislamiento, identificación y caracterización de bacterias malolácticas en vino

1. Introducción ................................................................................................................................. 109

 Capítulo III: Biosíntesis de nanopartículas de plata, optimización y efecto microbicida

1. Introducción ................................................................................................................................. 145

 Conclusiones ................................................................................................................................ 179

 Referencias ................................................................................................................................... 183

1. Las bacterias lácticas: consideraciones generales

Ya en 1901, con la determinación de los Lactobacillus (L.) como bacterias Gram-

2. Taxonomía, filogenia y hábitat de las bacterias lácticas

En 1907 Felix Löhnis estableció 4 grupos diferenciados de bacterias ácido lácticas: el

o bacilos), el modo de fermentación de la glucosa, el crecimiento a ciertas temperaturas y el

Las características fenotípicas empleadas por Orla-Jensen permanecen en vigor y son

En este sentido, el manual Bergey’s estima, en su edición de 1986, 5 géneros de

Bacterias por entonces pertenecientes al género Lactococcus serían posteriormente

Figura 1: A: Bifidobacterium adolescentes con forma de Y. B: L. casei (http://microbewiki.

El género Bifidobacterium (Fig. 1) fue originalmente identificado como una especie

lácticas. Sin embargo, la presencia de la enzima fructosa 6-fosfato fosfoquetolasa, y la

Actualmente se consideran bacterias ácido lácticas aquellos cocos o bacilos Gram-

Bifidobacterium, que pertenece al filo Actinobacteria), alguno de los cuales (Lactobacillus)

Su capacidad de adaptación a una amplia variedad de condiciones ambientales ha

El género Leuconostoc está formado por 12 especies bacterianas, de las cuales

colaboradores, se confirmó su separación filogenética del género Leuconostoc, y con ello su

Su importancia deriva de su implicación en la industria vitivinícola, que

Inicialmente considerado una sarcina al aislarlo en cerveza deteriorada, el género

El género Lactobacillus es quizás el más conocido debido a la adición de algunas de

Filogenéticamente relacionado con el género Lactococcus se encuentra el género

3. Fisiología de las bacterias ácido lácticas

Se trata de microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes, al necesitar

3.1 Metabolismo de azúcares

Existen dos rutas metabólicas de asimilación de azúcares (hexosas) en las bacterias

El metabolismo homoláctico emplea la ruta de Embden-Meyerjorf para obtener un

El metabolismo heteroláctico emplea la ruta de las pentosas-fosfato (Fig. 3B). Tras la

Dadas las diferentes vías posibles, el resultado final de este metabolismo no es la

Las pentosas son incorporadas en la célula a través de permeasas donde son

3.2 Metabolismo de ácidos orgánicos

3.2.1 Metabolismo del ácido málico

El metabolismo de ácidos orgánicos en general, y del ácido málico en particular ha

El ácido málico tiene su origen en la uva, y más concretamente en la semilla, cuya

En climas fríos, en cambio, la maduración de la uva no se completa, haciendo que

3.2.2 Metabolismo del ácido cítrico

El ácido cítrico tiene también un papel crucial al tratarse de un intermediario en la ruta

3.2.3 Metabolismo del ácido tartárico

3.3 Metabolismo de proteínas y compuestos nitrogenados

3.4 Metabolismo de lípidos

La presencia de una excesiva concentración de ácidos grasos volátiles en vinos, como

4. Las bacterias lácticas y el ser humano

A pesar de que las bacterias lácticas se encuentran principalmente asociadas a