Parasitologa 2013

Ariani Surez R.

INMUNODIAGNOSTICO

Ante cualquier enfermedad infecciosa llmese por virus, por bacterias, en este caso, por parsitos, el inicio del diagnstico tiene que ser el diagnstico clnico y epidemiolgico, los cuales siguen siendo presuntivos, porque inclusive las manifestaciones clnicas pueden superponerse con cualquier cantidad de patologas; y la parte epidemiolgica es importante ya que conociendo las reas endmicas o las condiciones por las cuales se sospeche que se pueden infectar. Sin embargo hasta no identificar el organismo no podemos afirmar que estamos frente a alguna patologa. Esa identificacin del agente patgeno del que sospechamos se hace de dos maneras: un diagnostico directo (para evidenciar al parasito es el ms fidedigno) - microscopia, cuando se ve la muestra de heces o la muestra de cualquier fluido en el microscopio, donde se pueda evidenciar el parasito, quiz es el ms importante) - amplificacin biolgica, como en el caso de Leishmaniasis, Tripanosoma y toxoplasma, se inocula ese material a animales susceptibles. Entonces en estos animales susceptibles o en los medios de cultivos si colocamos un parasito se va a amplificar, se va a dividir por fisin binaria muchas veces. - Mtodos de coloracin: sin embargo cuando no distinguimos bien el parasito conduce a la fijacin y coloracin de este. un diagnostico indirecto - mtodos por biologa molecular, donde es a partir de una amplificacin del ADN, en el cual nosotros podemos inferir si ese ADN es de toxoplasma, leishmania, tripanosoma, plasmodium spp. Estos mtodos no son de rutina, son ms confirmatorios. - Mtodos inmunolgicos. Vimos que desde Toxocara no podemos hacer un examen directo pero si buscar los anticuerpos contra el toxocara

Recordar tenemos una inmunidad innata y adquirida, con esta ltima es con la que respondemos ante la presencia de un agente patgeno. Los objetivos de la inmunologa: Identificar los riesgos de la enfermedad, como las consecuencias inmunopatologicas (como las consecuencias de Eschistosoma cuando un huevo se queda atascados en los sinusoides delgaditos intrahepaticos y luego se desencadena la reaccin inmunolgica y eso causa todo el problema de hipertensin) Manipular el sistema inmunolgico para disminuir la patologa, como es el caso de la inmunoterapia, que minimiza esos riesgos que causan algunos agentes patgenos (Leishmania, Tripanosoma, etc) 1

Desarrollar vacunas es hacer inmunoprofilaxis. Con una vacuna estamos bloqueando que cuando venga el agente patgeno, nuestro sistema inmunolgico que respondi a una vacuna pueda atacar o minimizar el riesgo y evitar una infeccin. Desarrollo de mtodos inmunodiagnosticos o mtodos inmunolgicos, esto es basndonos en el papel que juegan los linfocitos T de nuestro sistema inmunolgico frente a un agente patgeno (puede ser intracelular como leishmania, tripanosoma, plasmodium. Pero hay que recordar que los helmintos o cualquier parasito extracelular tambin estimula una respuesta inmunolgica) Ante un parasito intracelular la respuesta efectora es la celular, se puede desarrollar respuesta humoral, pero es la respuesta celular la que controlara la infeccin.

A diferencia de toxoplasma, los anticuerpos pueden ayudar a eliminar la infeccin, mas no sucede as en el caso de leishmaniasis porque el parasito es intracelular permaneciendo menos tiempo para ser eliminado. El diagnostico de certeza frente a un proceso infeccioso es buscar ese patgeno mediante mtodos directos o mtodos indirectos, en algunas circunstancias esto no se puede dar y surgen los mtodos inmunodiagnostico para complementar o suplir aquellas deficiencias que tienen los mtodos parasitolgicos. El inmunodiagnostico Un conjunto de pruebas, tcnicas o procedimientos donde vamos a poner en evidencia esa reaccin, o bien el antgeno con el anticuerpo, o el antgeno con la clula. Y finalmente en cualquiera de estos medios biolgicos pudisemos determinar la presencia de alguno de esos componentes para saber si estamos frente una infeccin aguda o frente a una infeccin pasada o si el individuo est respondiendo a equis patgeno. Objetivo general: evaluar la respuesta humoral que viene mediada por los anticuerpos y la respuesta celular mediada por las clulas que se han sensibilizado ante el agente patgeno. Respuesta inmunitaria no es inmediata, se requiere cierto tiempo de entrar en contacto con el agente patgeno, y dependiendo del organismo pudisemos tener una respuesta humoral entre 1 y 3 semanas. La respuesta inmunitaria adaptativa especifica al antgeno, la primera Ig que se produce es la M (fase aguda) y luego la IgG que va a quedar en el tiempo como una seal que estuvimos con ese agente patgeno Elementos que evaluamos en esas pruebas: Los anticuerpos: las clases (IgG) y las subclases (IgG1, IgG2)

Las clulas sensibilizadas. Como por ejemplo una CD4, CD8, que e van a estimular ante distintas infecciones Buscar complejos inmunes. Porque a veces no detectamos los anticuerpos porque ellos estn acomplejados (formando complejos inmune circulante) Buscar algunas molculas efectoras (fracciones del complemento, citoquinas, factor de necrosis tumoral, interfern, xido ntrico, dependiendo de la respuesta que tenga el individuo frente a ese agente patgeno) Otras veces buscamos antgenos porque el parasito mientras se est metabolizando o dividiendo va a liberar componentes de excrecin-secrecin al medio, o cuando se muere libera antgeno somatico y de esa manera si lo detectamos nos puede indicar que estamos frente a una infeccion.

Las ventajas de buscar anticuerpos es que estamos evaluando una amplificacin inmunolgica frente a ese agente infeccioso, puede permanecer en el tiempo como una IgG, podemos determinar si estamos frente una infeccin en fase aguda o crnica, podemos diagnosticar algunas enfermedades como las congnitas, porque sabemos que la IgM no va a pasar a travs de la placenta (como la IgG que si lo hace). Pueden contribuir estas pruebas en el banco de sangre, en el caso de los donantes (tanto de sangre como de rganos), la IgG permanece positiva en el tiempo inclusive despus de la cura, en algunas patologas la IgG disminuye o desaparece, y as tambin la deteccin de antgenos son importantes en los donantes de sangre. Mide eficacia teraputica, porque si matamos al parasito el no debera de aparecer circulando en sangre. A veces pudisemos medir carga parasitaria, pero ya cuando las parasitemias estn bajas como es el caso de malaria tiene sus limitaciones. Donde gana importancia los mtodos de inmunodiagnostico? En aquellas condiciones donde el diagnostico parasitolgico es difcil. Como en el caso de Toxocara spp porque el hombre no es el hospedador definitivo, y si no es definitivo no hay eliminacin de los estadios de huevos. Cuando los helmintos tienen una baja fecundidad. Como en el caso de Eschistosoma en el que el nmero de huevos eliminados por las hembras es muy bajo, entonces hay que hacer diagnostico seriado. Cuando los mtodos de diagnstico son invasivos Cuando estn localizados en algunos sitios como sistema nervioso central, ojo. Cuando hay riesgo de diseminacin. En el caso del quiste hidatdico. Cuando las cargas parasitarias son muy bajas. Como es el caso de una fase crnica de la enfermedad de Chagas o toxoplasma. El inmunodiagnostico gana ms importancia cuando hacemos encuestas seroepidemiologicas y queremos conocer si en un rea endmica hubo Chagas.

Aplicaciones del inmunodiagnostico en enfermedades infecciosas Pueden ir desde hacer un diagnstico porque haya sospecha de una enfermedad o la podemos utilizar para confirmar

Cuando se hacen pruebas para HIV se hace un ELISA primero que es un tamiz y se hace un diagnstico, luego un western blot que es una prueba para confirmar el diagnstico. Los mtodos que se utilizan para el diagnstico son tcnicas muy sensibles, deben tener un elevado valor predictivo negativo, y ser tcnicas muy especficas con un elevado valor predictivo positivo. Entonces estas lo que hacen es complementar la informacin que nos dieron las pruebas ms sencillas. Problemas que se pueden presentar en el inmunodiagnostico El material antignico. Las molculas que se utilizan para hacer vacunas son las que estn en la superficie. Sin embargo si el parasito muere podemos usar los tres tipos antgenos somticos, antgenos de la superficie y antgenos del metabolismo. Entonces vemos que los componentes pueden tener importancia inmunopatologicas, inmunoprofilacticas. Todos los componentes que estn en el interior del parasito solo saldrn cuando el muera.

Limitaciones El proceso para extraer antgenos pueden alterar esos antgenos a utilizar en las pruebas de diagnostico Si ese material biolgico viene de diferentes reas geogrficas podemos tener diferencias porque los aislados son diferentes en cada rea Cuando mantenemos los parsitos (in vivo o in vitro como el caso de la leishmania o tripanosoma) pueden tener componentes del cultivo o de los animales que los estn albergando y eso puede modificar la especificidad y sensibilidad de las pruebas. Diferentes aislados presentaran diferentes polimorfismos y eso ayuda o contribuye a que las pruebas sean menos sensibles o menos especificas Algunos antgenos son inductores de la exocitosis de histamina y si hacemos una prueba intradrmica puede desencadenarse una reaccin de hipersensiblidad tipo I y nosotros suponer que es sensible a ese agente patgeno y no es as, solo que ellos por si solos pueden estimular a los mastocitos a que descarguen esas histaminas y nos den resultados errneos.

Clasificacin de los mtodos de inmunodiagnostico El fundamento clave es: es la herramienta y la estrategia, el procedimiento que se utilice para poner en evidencia la reaccin antgeno-anticuerpo o antgeno-clula. Recordemos el caso de Napier que es una prueba serolgico mas no inmunolgica(no es inmunolgica porque no hay anticuerpos especficos contra ese antgeno, hay inminoglobulinas pero ellas no se unen a ningn antgeno) - Se puede poner en evidencia ese complejo antgeno anticuerpo en el caso de una precipitacin circun-oval. - Puede ser a travs de mtodos de aglutinacin. Aqu tendremos que utilizar herramientas para que se aglutine algn elemento frente a los anticuerpos especficos que estn en el suero del paciente 4

Indicadores de lisis mediada por anticuerpos, es u mtodo como el de fijacin de complemento, Machado Guerreiro Tambin podemos evidenciar ese complejo antgeno anticuerpo utilizando algunos inmunoreactivos o conjugados que estn acoplados a radioactividad, marcadores fluorescentes (inmunofluorescencia) y marcadores enzimticos (cuando se necesitan enzimas tambin se necesita sustrato). La parte de marcadores con radioactividad ha ido en desuso por el riesgo que se corre de no tener sitio en donde descartar el material.

Otro aspecto que debemos tener en cuenta para el caso del inmunodiagnostico Cuando uno lee una prueba con un 99% de sensibilidad y especificidad es muy buena y los valores predictivos altos Sensibilidad: casos de infeccin en la poblacin estudiada Especificidad: resultado positivo indicando que el paciente est infectado Valores predictivos: positivo (indicar presencia de enfermedad), negativo (ausencia de enfermedad o permite descartarla. Otra prueba importante para nosotros decir si una prueba es buena es determinar el punto de corte. Este se hace con personas negativas, que nunca han tenido toxoplasmosis, se hace u punto de corte de cmo responde esa persona frente a ese antgeno. Mtodos de precipitacin Mtodos donde hay difusin tanto del antgeno como del anticuerpo espontneamente pero son procesos que duran hasta 48 horas y donde se forma las cantidades equitativas de antgenos y anticuerpos se forma un precipitado. Pero cuando esa movilizacin de ese antgeno y anticuerpo en un medio solido es ayudado por la electricidad en o 3 horas tenemos un resultados y podemos decir ese individuo tiene una leishmaniasis visceral. La contrainmunoelectroforesis son ayudadas por la electricidad La prueba de precipitacin circum oval tambin es espontanea porque el antgeno que sale por el huevo de esquistosoma, si ese paciente tiene anticuerpos contra el antgeno soluble del huevo se forman precipitinas alrededor del huevo. Otro modelos de cmo poner en evidencia ese antgeno-anticuerpo son los mtodos de aglutinacin, donde tenemos que tener un medio de transporte del antgeno y frente al suero de una persona esos anticuerpos se acoplan a esos medios, que pueden ser partculas de latex, glbulos rojos de carnero y se hace una malla impidiendo que ese glbulo rojo precipite, pudiendo nosotros decir que ese individuo tenia anticuerpos contra el antgeno que esta absorbido a esas partculas. Si el individuo no tiene esos anticuerpos especficos, quedan las partculas absorbidas con antgenos y van a precipitar en el fondo en este caso de una placa. Si hablamos de una IgM recordemos que es pentavalente (tiene muchos brazos) la aglutinacin va a ser mayor y se va a mantener suspendidas todas esas partculas impidiendo que se vayan

al fondo indicando que esa muestra es positiva y el individuo tiene anticuerpos contra esa antgeno. En el caso de la fijacin de complemento que tambin requiere un indicador adicional, este mtodo est fundamentado en la deteccin antgeno-anticuerpo donde participa el complemento. Si el individuo tiene anticuerpos contra antgenos de Tripanosoma cruzi se unir al complemento que se pone adicional al anticuerpo y se forma el anticuerpo que es del paciente. Si no fija complemento no hay hemolisis. Recordemos que un anticuerpo contra un glbulo rojo si fija complemento hay hemolisis. Si no hay hemolisis significa que todo el complemento se uni al anticuerpo que tena el paciente frente al antgeno especfico. Mientras que si un resultado es negativo significa que todo el complemento es vez de unirse al anticuerpo del paciente frente al antgeno de T.cruzi, se uni al glbulo rojo y hubo una lisis de este glbulo rojo. Hemolisis prueba negativa porque todo se fue al indicador No hay hemolisis positiva porque todo ese complemento se uni con el anticuerpo especfico. El otro mtodo es acoplar a marcadores fluorescentes como son fluorescena o rodamina. Cuando se hace la reaccin que se hace sobre el propio parasito, si la prueba esta positiva ese conjugado debe reconocer a las Ig del individuo que se pegaron a un tripomastigote, a un epimastigote que es el que ms se utiliza, a un plasmodium o a un promatisgote de leishmania. Entonces esto lo que hace es una especie de paraguas, de amplificar la seal, el inconveniente es que necesitamos microscopios especializados con lentes especializados que nos detecten la emisin de estas longitudes de ondas, esto es una limitante de las pruebas. Si lo vemos en microcopia de luz no vamos a ver la participacin del anticuerpo viendo simplemente el glbulo rojo parasitado. En el caso de promastigotes de leishmania significa que los anticuerpos de ese paciente son positivos o estas contra antgeno de la leishmania. En el caso de un tripomastigote tambin veramos la relacin de fluorescencia indicando que hay cero positividad ante la presencia de ese tripomastigote. Si nosotros queremos ver mediante fluorescencia anticuerpos antiDNA, tenemos un anticuerpo que est marcado con una fluorescena y se va a detectar el ADN. ELISA: son mtodos que utilizan inmunoreactivos acoplados a enzimas, tenemos un antgeno de base el anticuerpo del suero del paciente y luego los inmunoreactivos o conjugados que van a estar acoplados a enzimas, fluorescena, etc. Nosotros podemos ver unas muestras y decir que son positivas, pero cuan positivas son? Si eso se mide n densidades pticas, mientras mayor sea el valor de la densidad ptica la cantidad de anticuerpo que hay ah es mayor. Se tarda 2 das aproximadamente. Hay otros mtodos que estn basados tambin en el uso de enzimas y el fundamento es el mismo tratar de colocar el anticuerpo, utilizar un antgeno que sea especifico, el anticuerpo del paciente y un conjugado que este marcado con una enzima, se coloca el sustrato y en este caso hay una luminiscencia en lugar del producto colorimtrico que veamos en el caso de la ELISA. Y lo vamos a ver en una tiras de nitrocelulosa que son las que actan como pruebas de 6

reaccin. Es bueno acoplar estos mtodos a densitmetros que puedan discernir cuan positivo puede ser una muestra con respecto a otra. El Western Blot es una prueba ms especfica, son ms laboriosas y se necesitan ms de un da para dar un resultado. El fundamento es el mismo, la expresin del mltiples antgenos especficos que se van a expresar porque se utilizan por separacin elctrica o cargas y tendremos el antgeno que sea ms especfico que se acopla al anticuerpo del paciente.

Mtodos de diagnstico rpido Detectamos anticuerpos y antgenos. Recordando que cuando detectamos antgenos nos dice que estamos frente a una infeccin activa y el resultado son en tiras muy sencillas dando resultados que no requieren ms de una hora para dar un diagnstico. En malaria estos mtodos rpidos han sido muy exitosos. Se basan en que durante el desarrollo del parasito, desde que entra el merozoito en glbulos rojos se transforma en anillo y se forma un esquizonte y se rompe para que esos merozoitos invadan otros glbulos rojos, aqu vamos a tener antgenos somticos que solamente se van a a exponer cuando se rompan. Hay antgenos de la superficie del merozoito y hay antgenos que estn liberados por el propio metabolismo del parasito (antgenos de excrecin-secrecin) que si bien tienen importancia inmunopatologica tambien ganan importancia para hacer diagnstico. En el caso de malaria hay algunas protenas como la lactato deshidrogenasa que es propia de la va glicolitica del parasito y que solo se va a poner en evidencia si el parasito est vivo. Esta la HRP2 (protena rica en histidina), que es una protena de excrecin-secrecin que la va a liberar el parasito durante todo su desarrollo. Sale del glbulo rojo a travs de un sistema donde se transportan todas esas protenas y sale al medio externo. Estn han sido las protenas ms seleccionadas para las pruebas rpidas. Entonces si nosotros detectamos algunas de esas protenas en un individuo que viene con fiebre, que tiene escalofros, que viene de Bolvar o estado Amazonas, hacemos un aprueba rpida y mientras se colorea el mtodo parasitolgico podemos saber si estamos frente a una infeccin por malaria. Son pruebas muy sencillas, se puede hacer en el lbulo de la oreja o del dedo y tomar una lmina. Entonces colocar esas gotitas en unas de las laminitas que ya vienen en el empaque esa sangre se va a desplazar por capilaridad, y en esas pruebas reactivas vienen a varios niveles anticuerpos monoclonales que van a capturar el antgeno circulante. Si ese paciente tiene antgeno de plasmodium es capturado por los anticuerpos monoclonales especficos. Son pruebas costosas pero valiosas. Todo lo que est dentro de un glbulo rojo es un parasito hasta que se demuestre lo contrario 7

Todas las tiras deben tener un control, si este control no da hay que descartar y tomar otra tira reactiva. Luego tenemos la opcin de la lactato deshidrogenasa (recordemos que si es de la va glicolitica es mucho ms importante porque si el parasito est vivo esta la lactato ah, si el parasito ya no existe porque se le ha dado tratamiento o porque no este infectado no debe aparecer). En esa tira reactiva los anticuerpos monoclonales detectara la lactato deshidrogenasa especfica para falciparum. Es decir que para nosotros una prueba que sea comn a una especie al gnero tiene ciertas limitaciones porque nosotros en el pas tenemos las tres especies (malaria, falciparum y vivax). Si nos da positivo nosotros corroboramos con el extendido y la gota gruesa porque ninguna de ellas nos dice si estamos frente a una infeccin mixta o frente a una infeccin con falciparum y el tratamiento es diferente dependiendo de cul sea. HRP-2 especfica para falciparum y NO est en vivax

Si el individuo no ha tomado ningn medicamento antimalarico y la prueba da positiva para HPR2 podemos decir que el individuo tiene falciparum. Pero si la persona sigue con tratamiento y sigue con HRP2 no podemos seguir dndole tratamiento porque eso ya fue tratado, eso quiere decir que la HRP tarda ms tiempo en ser eliminada dependiendo de la carga parasitaria, en cambio si la lactato deshidrogenasa nos da positivo como es de la va glicolitica nos asegura que estamos frente a una infeccin activa. Otras pruebas rpidas en el caso de Leishmaniasis visceral, ya no detecta antgenos, sino anticuerpos, pero el anticuerpo que se detecta contra esta protena que es RK39 es muy especfica, entonces si nos da positivo nos asegura que este individuo tiene anticuerpos contra leishmania chagasi/infantum. Ya aquellas pruebas de 10 minutos asociadas a respuesta de hipersensibilidad tipo I y media la IgE. Las pruebas que tardan ms de 5 horas (como en el caso de la leishmanina) evalan respuesta celular. Las pruebas intradrmicas estn en desuso, porque nos estn sensibilizando cada vez que hacemos la prueba. Mantiendose la leishmanina como un criterio epidemiolgico pero realmente para diagnostico no. Esto ha llevado a sustituir la toxoplasmina por la ELISA avidez. Otro criterios que se han utilizado para evaluar la respuesta celular es la estimulacin linfoblastica y es tomar los linfocitos de las personas enfrentarlos in vitro frente a equis antgeno y ver si el individuo est respondiendo es decir no est inmunosuprimido. Cuando se empez a evaluar la leishmaniasis difusa (que si se le hace una lesihmanina da negativa) nunca va a recuperar la reactividad celular porque hay una inmunosupresin especifica de los antgenos de la especie responsable.

Las siguientes tablas el que esta en rojo es el mejor o el principal que cada caso.

10