Q PCR

RT PCR ou qPRC (Real time polymerase chain reaction)
Teoria
Es una variante de la reaccin en cadena de polimerasa que te permite detectar la
cantidad de ADN formado en cada ciclo a travs de la fluorescencia.
Se amplia y cuantifica de forma absoluta el producto de la amplificacin de acido
desoxirribonucleico (ADN). Se identifican los fragmentos amplificados a travs de la
temperatura de fusin (Tm, melting temperature) que es visible gracias a la deteccin
a travs de un termociclador con una sustancia fluorescente que se liga al fragmento
de inters.
Utilidad: permite el estudio de la expresin gentica de una muestra, la deteccin de
patgenos, una carga viral,
Se puede medir de forma absoluta la expresin gnica pero tambin se puede
cuantificar de forma relativa un gen respecto a otro (un normalizador que se usa
debido a su expresin casi constante).
o Cuantificacin relativa: para cuantificar uno respecto a un normalizador o
house-keeping genes:
Dividir la medicin del gen de inters por la expresin del gen
normalizador.
Se suele usar la B-actina como normalizador, o -2 microglobulin.
El inters de esta cuantificacin es que la unidad en la que se
expresa la cuantificacin es irrelevante.
Productos que se utilizan:
o 1) Un molde de ADN: tu muestra
o 2) Un par de primers: secuencia sintetica de oligonucletidos (secuencia
corta de ADN o ARN con 50 pares o menos, est compuesta por varios
nucletidos) que sirve como punto de partida para la replicacin del ADN. Es
a travs de ella que el ADN polimerasa aade nucletidos para sintetizar
nuevas cadenas de ADN. Suelen ser de aproximadamente 20 bases de
longitud que empieza con un grupo 3hidroxi libre y temrina con un grupo -
5.
o 3) Desoxirribonucleotido (dNTPS): monmero que constituye el ADN. Tiene
una base nitrogenada, un grupo fosfato y una pentosa. Tiene cuatro bases:
A, T, G y C.
o 4) Un buffer
o 5) Un ADN Polimerasa termoestable. Es una enzima capaz de replicar acidos
nucleicos. Son cruciales en la divisin celular y en la transcripcin del ADN.
o 6) Sustancia marcada de fluoroforo o fluorocromo: grupo funcional de una
molcula que absorbe la energa de una onda de longitud especfica que
puede ser detectada con un termocliclador. Algunos comunes son el Alexa
Fluor y el DyLight fluor
Uso de un termociclador (Thermal Cycler machine):
o Aparato que tiene sensores para medir la fluorescencia tras exitar el
fluoroforo a la longitud de onda adecuada.
o Permite medir la tasa de generacin de uno o ms productos especficos.
o Tiene la capacidad de calentar y enfriar las muestras rpidamente de modo
que se pueda explotar las cualidades fisioqumicas de los acidos
ribonucleicos y las enzimas de ADN polimerasa.
Fases de un termocliclador: ciclos de cambio de temperatura que se repiten unas 25-
40 veces
o 1) Etapa 1 (melting): en torno a los 95C,. Permite la separacin de los
acidos nucleicos de doble cadena. Denaturalizacin del ADN.
o 2) Etapa 2 (annealing): 60-65C. Permite el alineamiento de los primers a la
muestra de ADN.
o 3) Etapa 3 (elongation): de 68 a 72C. Facilita la polimeracin por parte del
ADN polimerasa. Lo hace aadiendo cadenas de dNTPs a la cadena de
fosfato.
o Las temperaturas de cada ciclo dependen en gran medida de: la enzima
utilizada para la sntesis de ADN, los desoxirribonucleotidos en la reaccin y
la temperatura de unin de los primers.
Tm o Melting Temperature: es la temperatura de fusin. Es especfica para el
fragmento amplificado que se est buscando. Los resultados que se ven del
termocliclador son a travs de la curva de disociacin de las muestras de ADN
analizadas.
SYBR Green: fluoroforo ms comnmente utilizado que se intercala en la double
Brand del ADN. Se usa conjunto a los dos primers que se unen a la regin que nos
interesa. El SYBR Green contiene:
o 1) Buffer
o 2) dNTPs
o 3) DNA polymerase termostable
o 4) SYBR Green Dye
Fluorescencia y cuantificacin del ADN:
o La fluorescencia crece exponencialmente con el incremento de las cadenas
de ADN.
o Nivel umbral: tras unos pocos ciclos la fluorescencia sobrepasa un nivel
umbral por encima del background y comienza a aumentar
exponencialmente.
o Plateau phase: la seal de fluorescencia se para a un momento determinado
debido a la saturacin del detector de fluorescencia del thermo cycler.
Ventajas con respecto al PCR convencional
o Es mas rpido y tiene menos variabilidad debido a la alta sensibilidad que
tiene el uso de la fluorescencia.

Material necesario
PARA PREPARAR EL ADN: hacerlo en el lab con el termociclador
1) Muestras dADN
2) Marcadores
3) Tubos eppendorf
4) Guantes, pipetas, tips,
5) Agua destilada
PARA PREPARAR EL MIX: lab de al lado
1) Primers
6) SYBER Green: contiene un buffer, los dNTPs, el ADN polymerase y la particula
fluorescente.
2) Microplaca
3) Pipeta automtica / tips para la pipeta
4) Agua
5) Papel aluminio
PARA AADIR EL ADN: lab del termociclador
1) Muestras de ADN
2) Placa que contiene el mix
3) Pipeta que no se mueve

Protocole
1) Faire un plan de la plaque et le dessiner sur la plaque des points de repres.
a. Echantillon par triplicat
b. N de genes analiser
c. Dillutions dADN : D8, D16, D32, D64 et D128
2) Preparer les dillutions dADNc (1/10) sous une hotte diffrente de celle o on
fait la plaque.
a. 1) LADN
i. Pour chaque chantillon de chaque groupe on a : ADNc x 3
(triplicat) x n des animaux.
ii. Il faut 0.4l/puit donc on multiplie 0.4 x el numero anterior
iii. Puis aprrs on divise le numero par 10 et le reste cest de
leau.
b. 2) DILLUTIONS
i. 1 l de tous les echantillons dADN
ii. Raliser les dilutions suivants tel que Il faut tenir en compte
quon utilise tjs lanterieur.
1. D8 : 8.5 ADN + 59.5 H20
2. D16 : 32 + 32
3. D32 : 39 + 39
4. D64 : 26 + 26
5. D128 : 17 + 17
3) Preparer le mix SYBER Green + primers. Dissolution total de 6 l par puit qui
contient :
a. 0.4l H20
b. 0.3l primer 1
c. 0.3l Primer Comp
d. 5l SYBRG
4) Pour preparer le mix calculer le nombre des files et colonnes par gen dintret.
Ex. si il y a 8 echantillon et 3 groupes exp. on a un total de 72 + 10 dillutions +
quelques-unes comme erreur.
a. On prepare autant des mix comme des genes.
5) Mettre 0.6 l /puits sur la plaque avec une pipette automatique. La plaque doit
tre desinne avec les limites de chaque gen.
6) Couvrir la plaque avec un film daluminium.
7) Ajouter lADN :
a. 1) Centrifuger les echantillons dADN quelques secondes
b. 2) Mettre 0.4 l de lADN correspondant dans la plaque :
i. Precautions : utiliser chaque fois un tip differente, up-down
avec la pippete.
8) Centrifuger la plaque 1.5min 1500rpm.
9) Light Cycle software !

USER :gpb
PASS : PassworD13+

Analizar los datos
En advanced relative quantification v
Ver efficiency :
90 - 100%
1.84 - 2.14
Ver CP: debe ser menor a 30. Es inversamente proporcional a la concentracin.
Son los nmeros de ciclos necesarios para ver una fluctuacin suficiente sobre el
background.
En Melt curve: debe haber una sola curva.
Los datos pueden ser exportados para analizarse en Excel

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