PCR

La pcr es la técnica más comúnmente empleada en biología molecular para la amplificación

del adn, en la cual se lleva a cabo una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de
veces una secuencia específica de adn durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima adn polimerasa,
la cual de manera natural sintetiza el adn en las células.

Los elementos químicos que se emplean para el procesamiento de una pcr son; Para llevar a
cabo el procesamiento de la reacción es necesario un templado o molde de adn , Además, se
requiere de una enzima que sintetiza el adn, ésta es conocida como Taq adn polimerasa, un
juego de oligonucleótidos conocidos como primers o cebadores que inician la reacción de
síntesis, desoxirribonucleótidos trifosfatados libres (dntps: adenina, timina, citosina,
guanina), el ión Mg+ (magnesio) el cual funciona como un cofactor y generalmente es sulfato
de magnesio, una solución amortiguadora o buffer y H2O (agua). Todos interactúan para
llevar a cabo la reacción a través de una serie de pasos en un termociclador. Los
termocicladores están diseñados para establecer los cambios y condiciones de temperatura y
tiempo necesarios para cada ciclo en la reacción de pcr. En síntesis, la función de la misma es
copiar millones de veces una secuencia específica de adn blanco mediante una serie de pasos:
desnaturalización, hibridación y extensión.

La PCR se lleva a cabo en tres etapas o ciclos:

1. Desnaturalización: en esta etapa las cadenas de adn son calentadas a 95o C durante un
tiempo promedio de 20 a 30 segundos, con el objetivo de separar ambas cadenas. Si la cadena
de adn contiene gran cantidad de uniones g-c será necesario mayor tiempo, ya que la unión de
éstas se hace mediante tres enlaces, uno más que las bases a-t. Al final de esta etapa
tendremos las cadenas separadas, las cuales servirán como molde.

2. Hibridación: en esta etapa participan los primers, los cuales son secuencias de
oligonucleótidos que delimitan la secuencia blanco que se quiere amplificar. Actualmente
existen programas para diseñar primers con alta especificidad para llevar a cabo este proceso.
En la etapa de hibridación los primers se alinean al extremo 3’ de la cadena molde, para lo
cual se necesitan dos secuencias diferentes, una denominada forward, o sentido, y otra
reverse, o antisentido. Para que esto suceda es necesario que el termociclador alcance una
temperatura entre 50-60 ° C, generalmente se necesitan 30 segundos en este ciclo.

3. Extensión: en esta etapa se necesita una enzima con la función de adn polimerasa, la cual
se encargará de la catálisis de la reacción, sintetizando nuevas cadenas de adn a partir de una
cadena molde. La enzima más usada es la Taq adn polimerasa, con capacidad de soportar
temperaturas muy altas. Proviene de una bacteria termófila llamada Thermophilus aquaticus.
En la etapa de extensión la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers a una
temperatura óptima de 72o C, y a una velocidad muy rápida agrega los
desoxirribonucleótidos libres (dntp’s) complementarios, creando así las cadenas completas de
adn. Los dntp’s son las bases nitrogenadas que normalmente se utilizan a una concentración.

TIPOS DE PCR

PCR anidada: Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es
utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se
pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial.
Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La
especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente,
los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una

única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La

desventaja de esta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o
células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es
realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. De esta manera pueden detectarse
cantidades pequeñísimas de genomas. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de
amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación.

PCR múltiple: PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para
ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios
segmentos de DNA. y de una única muestra se detectan muchos patógenos.

RT-PCR:Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es

necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La
transcripción reversa genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN
complementario (ADNc o DNAc en inglés) el cual es estable al calor y puede resistir la
metodología PCR.

Relación con la microbiología y aplicabilidad

Esta técnica permite establecer el diagnóstico de forma mucho más precoz y fiable, a la vez
que permiten la monitorización de la enfermedad, establecer su pronóstico y aumentar la
supervivencia. Detectando así la presencia de microorganismos difíciles de cultivar.

APLICACIONES:
Investigación:
a).-En biología molecular para amplificar secuencias de DNA que luego son fácilmente
clonadas y/o secuenciadas.
b).-En biotecnología, para la identificación rápida y temprana de animales y plantas
transgénicos.
c).-En genética general, de poblaciones y evolutiva, se emplea para cartografiar genes
mediante estudios de ligamiento. Asimismo, para amplificar y detectar diferentes genotipos y
estudiar su evolución dentro de las poblaciones.
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
e).-En espectrometría mutacional, toxicología y tratamiento del cáncer, para amplificar y
detectar mutaciones y translocaciones cromosómicas.
h).-En microbiología, botánica y zoología, para la identificación de microorganismos,
plantas y animales, ya que usando los cebadores apropiados pueden amplificar secuencias
específicas que generan patrones de bandas típicos de cada especie e incluso de cada
individuo (fingerprinting).
MEDICINA FORENSE
i).-Por el motivo anterior, en medicina forense y lucha contra el crimen y determinación
precisa de la paternidad, ya que a partir de un pelo, un espermatozoide o restos de huesos es
posible inculpar o exonerar a un presunto asesino o violador.
 RAPD, AFLP y RFLD (Técnicas/marcadores moleculares)

Un marcador molecular es un segmento de ADN que corresponde a un gen o regiones no

codificantes del genoma, estos segmentos de ADN permiten identificar diferentes variantes
(alelos) y se localizan en un sitio determinado en los cromosomas (locus).
Las diferencias que se obtienen en estos fragmentos de ADN se conocen como polimorfismos
y se pueden detectar por hibridación de secuencias de ácidos nucleicos, secuenciación de
nucleótidos, comparación de la longitud de los fragmentos producidos por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y a través de sitios reconocidos por enzimas de restricción.
Los marcadores moleculares se pueden utilizar para clasificar grupos taxonómicos,
poblaciones, familias o individuos, tanto en eucariotas como en procariotas. En estudios
genéticos se han utilizado diversos marcadores moleculares en animales domésticos, en fauna
silvestre, en especies en peligro de extinción, así como en pruebas forenses y de paternidad.
Los más conocidos son RFLPs, minisatélites, AFLPs, RAPDs, microsatélites y SNPs.

Técnica RAPD:
Los marcadores RAPD se utilizaron por primera vez en 1990, en varios organismos
(humanos, distintas especies vegetales y microorganismos). Los polimorfismos RAPD se
heredan de forma mendeliana y pueden emplearse para construir mapas genéticos, además de
para detección de variabilidad. El hecho de que este tipo de marcadores no requieren ningún
conocimiento previo de la secuencia del organismo con el que se está trabajando los convertía
en una alternativa económica y rápida para muchas aplicaciones. Desde su desarrollo, el
análisis con marcadores RAPD se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada con
diferentes objetivos, en humanos, animales, plantas o en microorganismos. Para entender y
aplicar los marcadores RAPD es necesario tener conocimientos previos de Genética y
técnicas de Genética Molecular (PCR y electroforesis).

Técnica AFLP
Los polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados, mejor conocidos como
AFLP por sus siglas del inglés Amplified Fragment Length Polymorphism, pertenecen al
grupo de marcadores moleculares multi-locus que permiten analizar al azar regiones de ADN
distribuidas en todo el genoma sin tener conocimiento previo de éste.

Este método, originalmente descrito en 1995, fue diseñado para analizar ADN de cualquier
origen y complejidad, aunque posteriormente se han desarrollado variantes técnicas más
sencillas para su aplicación en genomas bacterianos.

AFLP es un marcador molecular que combina dos estrategias diferentes: digestión del ADN
con enzimas de restricción y amplificación selectiva mediante PCR selectiva. Básicamente,
se basa en la utilización de adaptadores que “reparan” los fragmentos de ADN obtenidos en
la digestión, con una posterior amplificación mediante iniciadores complementarios de la
secuencia diseñada en los adaptadores. Y se visualizan por las diferencias en la longitud de
los fragmentos separados en electroforesis en geles de poliacrilamida.
La técnica se realiza en varios pasos:
Inicio:
1. Digestión del ADN genómico total
2. La unión de secuencias específicas (llamadas
adaptadores) Dos reacciones de PCR:
3. Amplificación preselectiva
4. Amplificación
selectiva. Finalmente
5. Electroforesis

VENTAJAS
- Son un marcador neutral.
- No requieren información previa del genoma.
- Son altamente reproducibles.
- Utilizan pequeñas cantidades de ADN.
- Pueden ser usados para diferentes tipos de análisis.

DESVENTAJAS
- El número de pasos es mayor en comparación con otros marcadores
- Costo alto.
- No permite distinguir heterocigotos de los homocigotos.
- Las bandas pueden ser homoplasias.
Técnica RFLD:
El análisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs) fue el
primer marcador de ADN utilizado por biólogos poblacionales. Este método expresa
diferencias específicas del ADN que fueron reconocidas por enzimas de restricción
particulares (endonucleasas). Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce
y corta solamente una secuencia específica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y
cuando éstas no estén protegidas (metiladas). Por consiguiente cualquier ADN que no esté
metilado puede ser reconocido y cortado en fragmentos de longitud definida; y cualquier
mutación dentro de esos sitios, podría cambiar el patrón del fragmento y permitir que se
detecte un RFLP al comparar dos o más genomas. Para detectar RFLPs hay dos técnicas:
southern blots e hibridación, y PCR.
Procedimiento:
1. Extracción del DNA
2. Digestión del DNA extraído se lleva a cabo la digestión del DNA, durante el tiempo
suficiente para que se realice la digestión completa, con la enzima de restricción
apropiada. Es conveniente comprobar mediante electroforesis, utilizando parte del
producto de la digestión, en ocasiones una mala digestión puede ser consecuencia de
una mala calidad del DNA.
3. Separación mediante electroforesis Una vez comprobada la digestión, el proceso
continúa cargando en un gel de agarosa todo el producto restante y llevando a cabo
una separación de los fragmentos resultantes de la digestión.
4. Transferencia: La transferencia del contenido del gel a la membrana se realiza
mediante la técnica “Southern blot”. Se trata de disponer del DNA en una superficie
sólida que pueda ser sometida a hibridación. Los fragmentos de DNA, separados en el
gel por su tamaño, migran verticalmente, sin variar su posición relativa, hasta una
membrana.
5. Hibridación: El paso siguiente es la hibridación con una sonda marcada. El marcaje
de la sonda puede realizarse también por distintos métodos, siendo los más frecuentes
el marcaje con radioactividad o con digoxigeninas. En cualquier caso, la sonda debe
desnaturalizarse, para, a continuación, llevar a cabo la incubación de la membrana.
6. Detección: La forma de visualización de los resultados dependerá del sistema de
marcaje, si la sonda se ha marcado con radioactividad, la visualización se puede
realizar por exposición de una película fotográfica. Si el marcaje se ha realizado con
digoxigeninas, la detección se puede realizar añadiendo un sustrato que proporcione,
bien una señal de color.

ENFOQUE MICROBIOLÓGICO
En microbiología este tipo de técnicas permiten la identificación de porciones de ácidos
nucleicos (DNA o RNA) que son específicos de cada microorganismo, en diferentes
materiales clínicos. Es de gran ayuda para poder detectar microorganismos de difícil
crecimiento en cultivos o desarrollos tardíos y donde las técnicas serológicas de detección de
antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) carecen de suficiente sensibilidad y especificidad
diagnóstica. Esta circunstancia se ajusta principalmente a la detección de virus, es por ello,
que el desarrollo de técnicas moleculares comenzó en esta área.
Además el papel como microbiólogo es identificar los microorganismos y sus aplicaciones o
implicaciones en la cotidianidad, del mismo modo un microbiólogo puede encargarse de la
preparación de los cultivos necesarios para el realizamiento de los procesos moleculares, a
través de seleccionar el organismos de interés y la extracción de DNA.

CIENCIAS ÓMICAS

Están asociadas al desarrollo de algoritmos basados en modelos matemáticos y estadísticos,

que almacenan, recuperan y comparten datos de alto rendimiento, para la comparación de
secuencias, la construcción de árboles filogenéticos/evolutivos, el reconocimiento de patrones
específicos en el genoma, etc. Las ciencias ómicas, incluyen la genómica, transcriptómica,
metagenómica y epigenética, proteómica, metabolómica, quienes traen consigo un enorme
desarrollo en el campo del análisis de la funcionalidad celular y en aplicaciones
biotecnológicas.

Genómica: campo de la genética que intenta comprender el contenido, la organización, la

función y la evolución de la información molecular del ADN contenida en el genoma
completo. La genómica se subdivide en cuatro principales áreas, dependiendo del ámbito de
estudio que implican:

- La genómica estructural: relacionada con el estudio de la naturaleza física del

genoma y la localización de los genes dentro de éste.
- La genómica funcional: busca poder entender la relación entre los genes de un
organismo y sus características físicas (el fenotipo).
- La genómica comparativa: se encarga de analizar las diferencias y similitudes a
nivel estructural entre los genomas de múltiples organismos.
- La genómica de poblaciones: investiga de qué manera los procesos evolutivos
afectan el genoma.

Proteómica: estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función.

Existen tres ramas en la proteómica que tratan de caracterizar el proteoma estudiando
distintos aspectos del mismo:

- La proteómica de expresión: se encarga del estudio de la abundancia relativa de las

proteínas y de sus modificaciones postranscripcionales.
- La proteómica estructural: se encarga de la caracterización de la estructura
tridimensional de las proteínas.
 - La proteómica funcional: se encarga de la localización y distribución subcelular de
proteínas y de las interacciones que se producen entre las proteínas y otras moléculas
con el fin de determinar su función.

Metagenómica: también llamada genómica ambiental o genómica de comunidades, estudia

los genomas de comunidades enteras de microbios, sin la necesidad de aislarlos previamente.
La metagenómica permite obtener información relacionada con:
- Diversidad filogenética: identificación de los microorganismos, su cuantificación, su
distribución, sus relaciones filogenéticas y su dinámica.
- Metagenómica funcional: búsqueda de actividades enzimáticas o nuevas rutas
metabólicas.
- Metagenómica comparativa: permite relacionar especies con funciones específicas o
funciones específicas con determinados hábitats.
- La evolución de los genes.

Epigenómica: estudio de la conexión entre el medio ambiente y la expresión de nuestros

genes, permite identificar secuencias y modificaciones epigenéticas del genoma. Entendiendo
así, los procesos que alteran la expresión de genes sin cambiar la secuencia del ADN.
Metabolómica: estudio de perfiles metabólicos como producto de muestras biológicas.
Existen dos enfoques complementarios que se utilizan para las investigaciones
metabolómicas:
- Diseño de perfiles metabólicos: métodos de análisis cuantitativos se utilizan para
medir metabolitos de una clase determinada.
- Metabolitos de rastro digital: las huellas metabólicas se comparan para determinar
si los metabolitos han cambiado debido a la enfermedad o la exposición a las toxinas.

TRANSCRIPTÓMICA: Ciencia que estudia el patrón de expresión génica en un organismo

o en células específicas bajo circunstancias concretas, específicamente, el conjunto de ARN
(ARNr, ARNt, ARNm, ARNi, miARN) que existe en una célula, tejido u órgano. La
expresión génica es un proceso celular que intermedia la transferencia de las instrucciones
genéticas contenidas en el ADN para dar lugar a la síntesis de los productos génicos finales,
como proteínas y ARN no codificanes funcionales, por lo tanto el conjunto de todos los
transcritos expresados en una célula, tejido u organismo en un momento dado se denomina
transcriptoma. Se caracteriza por el monitoreo y análisis de expresión simultáneo de muchos
genes utilizando macro- o micro-matrices de ADN (microarrays o chips de ADN)

MICROARRAY: Chip de ADN o microarray han sido desarrolladas como una herramienta
más para el análisis y obtención masiva de información biológica. Son colecciones de
pequeños puntos o muestras de ADN dispuestos sobre una superficie sólida lo cual le permite
hibridar muestras de ADN o ARN permitiendo el estudio simultáneo de un gran número de
los genes de un organismo. Dentro de las aplicaciones de los microarrays se encuentran tres
áreas consolidadas: tecnologías que emplean oligonucleótidos, análisis del nivel de expresión
génica, genotipificación .

QRT (técnica): qRT- PCR (quantitive Real Time-Polymerasa Chain Reaction) o Reacción
cuantitativa en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real por sus siglas en inglés, permite
analizar la expresión génica, compararla en distintas condiciones, cuantificar la expresión
génica y confirmar la expresión diferencial de genes. La qRT-PCR- implica varias etapas:
1a ETAPA: OBTENCIÓN, AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DEL RNAm contenido
en la célula, mediante extracción con solventes orgánicos (por ejemplo, derivados del fenol).
2a ETAPA: RETROTRANSCIPCIÓN. El mRNA servirá como plantilla para la acción de
la retrotranscriptasa, que sintetiza moléculas de DNA.
3a ETAPA: AMPLIFICACIÓN DEL cDNA: mediante la utilización de oligonucleótidos
específicos (PRIMERS FORWARD Y REVERSE) que actuarán como cebadores de la acción
de la polimerasa, se amplificará el cDNA de aquellos genes cuya expresión nos interese
analizar.

Papel que juega el microbiólogo en la técnica y qué aporta: el microbiólogo por medio de
esta técnica puede identificar múltiples dianas de ácidos nucleicos microbianos contenidos en
muestras clínicas que en un corto tiempo se reconocerían un buen número de
microorganismos, principalmente los más encontrados en microbiología clínica. También,
entre las dianas posibles pueden incluirse las referidas a los mecanismos frecuentes de
resistencia a los antimicrobianos, asociados a grupos o especies microbianas. A su vez,
optimiza a nivel de especificidad, sensibilidad y rapidez, la detección de agentes infecciosos
y de sus genes de virulencia y de resistencia, lo cual le permitirá al microbiólogo aportar a
programas adecuados de prevención y tratamiento de estas enfermedades.
 GENOTECA

Genoteca o biblioteca génica

¿Qué es?
Es una colección de clones que contienen el genoma de un organismo
En primer lugar, se obtiene el ADN genómico. Luego este se puede fraccionar en miles de
fragmentos que representan ese genoma, luego este fragmento se clonó dentro de un vector
adecuado, puede ser un plásmido, un cósmido, un fago y por último se introduce cada
molécula recombinante en una célula huésped. Al final se tiene una genoteca.

● Se utilizan para rastrear la localización y secuencia de un gen en particular.

● Se crean con el objetivo de tener una fuente de ADN para secuenciar, conservar el
genoma y/o realizar análisis moleculares

Existen 2 clases: Genotecas genómicas de ADN y Genotecas de ADN complementario

Genotecas genómicas de ADN → moléculas de vector que contienen insertos de DNA

genómico

Una genoteca genómica contiene fragmentos de ADN genómicos generados mediante la

digestión parcial con cantidades limitantes de una endonucleasa de restricción, la cual
efectúa cortes en determinados sitios del genoma. Esta colección de fragmentos generados de
aproximadamente 20 kb (tamaños son superpuestos), posteriormente son clonados en un
vector apropiado. Un vector es una molécula de ADN donde se inserta el fragmento de
interés. Los vectores de clonación están diseñados de forma tal que permiten la
recombinación de ADN foráneo en un sitio de restricción del vector, sin afectar su
replicación. Tras ligar el vector y el fragmento de ADN (inserto), se introduce en una célula
hospedera, donde se replicará el ADN recombinante para generar múltiples copias idénticas
del fragmento de interés

Genotecas de ADN complementario → moléculas de vector que contiene insertos de cDNA

Las genotecas de ADNc se obtienen a partir de ARNm (secuencia codificante de un gen), por
lo que comprenden solamente los genes que están siendo expresados en un tejido o célula
durante un periodo determinado. Para este propósito, se obtiene inicialmente el ARN total o
se separa el ARNm y se utiliza como plantilla para sintetizar moléculas de ADNc usando la
enzima transcriptasa reversa (inversa)
.

Las genotecas de ADNc ayudan a desarrollar nuevas moléculas para el diagnóstico y

perfeccionamiento de tratamientos.

Sondas:
Las sondas se utilizan para identificar qué banda en un gel o qué clona en una genoteca
contiene el ADN diana, mediante un proceso conocido como detección molecular.

La clonación genética en beneficio a la salud:

● producir una nueva vacuna

● Producir medicamentos
● Mejorar el tratamiento de enfermedades
● Mejorar la calidad de los alimentos
 VIDEOS PARA ESTUDIO:

Electroforesis
https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38
https://youtu.be/i4l-rVZ3--8

PCR
https://youtu.be/mpRy8CSAISs

Tipos PCR
https://youtu.be/inFedK-lVZM

Endonucleasas de restricción
https://youtu.be/TLwWghLxm6g
https://youtu.be/B3Q82T-_TSQ