Técnicas de biología molecular para diagnóstico de consorcios microbianos

bucales

Palabras clave ciencia y salud, odontología, diagnóstico, consorcios microbianos,

bucal
Key words science and health, dentistry, diagnostic, microbial consortia, oral

Son herramientas de gran utilidad para el diagnóstico de los microorganismos

integrantes de la microbiota bucal, que son difíciles de caracterizar por métodos
convencionales.

Las técnicas de biología molecular por amplificación de ácidos nucleicos e

hibridación sin duda representan un instrumento útil para el odontólogo con interés
en la microbiología, porque cuando el microorganismo se encuentra en escasa
cantidad en la muestra clínica, se puede recurrir, mediante métodos químicos o
enzimáticos, a obtener un aumento específico de la cantidad de una secuencia de
ácido nucleico perteneciente a este, para así poder detectarlo después.
De forma genérica, se pueden describir dos grandes grupos de técnicas en
función de lo que se amplifica. El primero, que comprende la mayoría de los
métodos existentes, amplifica la diana, y entre estos métodos hay que destacar la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es la más conocida y la Nucleic
Acid Sequence Based Amplification (NASBA), aunque no debe olvidarse que
existen otras, como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o la Strand
Displacement Amplification (SDA). El segundo grupo comprende aquellos que
amplifican la señal obtenida tras producirse el híbrido, entre los que hay que
destacar el método conocido como ADN ramificado (branched DNA o bDNA), el
cual es un excelente procedimiento para la cuantificación.
Dentro de las técnicas que amplifican la diana, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) requiere de los siguientes elementos y pasos:
1. ADN diana, llamado también ADN molde. Es el material genético que se
desea amplificar. Su cantidad y su calidad son factores determinantes
de la eficacia de la reacción.
2. Agentes cebadores, también conocidos como primers o iniciadores. Son
oligonucleótidos, es decir, secuencias de ADN de 15-30 bases de
longitud complementarias de los extremos 3’ de cada una de las
cadenas de ADN diana.
3. Desoxinucleótidos trifosfatos. (dNTP). Son sustancias que aportan las
bases que componen el ADN (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) y que en
estos procesos deben encontrarse en cantidades iguales.
4. Enzima Taq polimerasa. Formada por una ADN polimerasa obtenida de
la bacteria termófila Thermus aquaticus, que tiene una temperatura
máxima de actuación de 72-90º C y es estable a las temperaturas de
reacción. Su función consiste en alargar la cadena de ADN hibridada
con el cebador mediante la incorporación de los dNTP.
5. Cloruro de magnesio. Compuesto indispensable en la reacción pues
influye en la hibridación de los cebadores con el ADN diana y en la
actividad de la Taq polimerasa.
 6. Tampón de hibridación, el cual asegura la fuerza iónica y el pH óptimos
de la reacción enzimática.
Todos estos componentes forman la mezcla de reacción, la cual se coloca en un
aparato termociclador que permite variar rápida y con exactitud las temperaturas
de cada una de las 3 etapas de la PCR, que se repiten cíclicamente, entre 25 y 40
veces, dependiendo del protocolo, el cual, a su vez, consiste de los siguientes
pasos:
a. Desnaturalización del ADN; a una temperatura de 90-95º C se separan las dos
hebras de ADN, quedando disponibles para hibridar con los cebadores.
b. Hibridación del ADN con los cebadores; se produce a una temperatura que
oscila entre 35 y 65º C, dependiendo de la composición de los cebadores.
c. Extensión o polimerización de la cadena de ADN; en ella la Taq actúa alargando
el nuevo híbrido formado a una temperatura de 72º C a partir del extremo 3’ del
cebador, incorporando los dNTP complementarios del molde de ADN diana.
El producto de este primer ciclo sirve como diana para el siguiente ya que se
somete a una nueva desnaturalización y a las etapas sucesivas; de esta manera,
cada uno de los productos de cada ciclo actúa como diana en el siguiente y el
resultado de esta reacción en cadena es la progresión geométrica del ADN. Al
final del proceso se obtienen entre 106 y 107 copias por cada molde original de
ADN, en un tiempo de 2-3 horas.
Una vez finalizada la PCR es necesario detectar la presencia del producto
amplificado, también llamado amplicón. Para ello se puede recurrir a la
electroforesis y si se requiere mayor sensibilidad, a las técnicas de hibridación con
las sondas. Como se conoce el tamaño del fragmento amplificado, delimitado por
la zona en que se hibridan los cebadores, la electroforesis es un método muy
sencillo y útil para su detección, sobre todo en aquellos casos en que se encuentra
en cantidad elevada. Se realiza en gel de agarosa o poliacrilamida y
posteriormente se aplica una tinción con bromuro de etidio, que fluoresce con
mayor intensidad en presencia de ADN de doble cadena. Para confirmar que se
trata del fragmento de ADN buscado, es conveniente realizar la electroforesis
usando como control un marcador de peso molecular para verificar el tamaño
correcto del amplificado.
Además de la PCR convencional, hoy día se utilizan en microbiología aplicada a
microbiota bucal, otras técnicas basadas en ella que se ajustan según las
características del ácido nucleico diana. Las más empleadas son:
1. RT-PCR. Si el ácido nucleico diana es ARN, tras su extracción éste se debe
convertir en ADN complementario (ADNc), ya que la Taq polimerasa es específica
de ADN. Para este fin, la enzima retrotranscriptasa se utiliza para transcribir el
ARN a ADN monocatenario y luego la Taq polimerasa lo convierte en ADN
bicatenario. Existe una nueva enzima termoestable, la rTth ADN polimerasa que
tiene a la vez actividad retrotranscriptasa y ADN polimerasa.
2. Nested-PCR. Se trata de dos reacciones de PCR consecutivas utilizadas para
aumentar la sensibilidad de la amplificación; en una primera reacción se emplean
cebadores externos y en la segunda cebadores internos que amplifican un
fragmento interno al amplificado en la primera PCR, pudiéndose aumentar de esta
forma la sensibilidad de la reacción, por lo que se utiliza en casos que se
sospecha tienen un bajo número de copias.
3. Múltiple PCR. Permite la identificación de fragmentos pertenecientes a un
mismo gen o a distintos genes. Para ello, se utilizan tantas parejas de cebadores
como productos se deseen amplificar, hasta un máximo de nueve.
4. PCR in situ. El tejido se pone en contacto con la mezcla de reacción en
termocicladores adaptados a los preparados histológicos. Los cebadores están
marcados con algún sistema indicador y luego se revela directamente el producto
amplificado.
Por otra parte, al igual que la PCR, la Nucleic Acid Sequence Based Amplification
(NASBA), se trata de un método de amplificación de la diana, aunque a diferencia
de éste, la NASBA es una reacción que tiene lugar de forma isotérmica (a una sola
temperatura), por lo que no es necesario emplear un termociclador; además, en
este método la diana es el ARN. Para conseguir la amplificación del ARN se utiliza
una estrategia enzimática que no vuelve necesaria la desnaturalización, ya que la
diana se encuentra en forma de cadena sencilla. En concreto, se utiliza una
cascada de reacciones en las que intervienen: a) una retrotranscriptasa (AMV-RT),
una ADN polimerasa que puede utilizar como molde una molécula de ARN,
aunque también es capaz de copiar a partir del ADN. b) una ARNasaH, que es
una enzima que degrada al ARN, pero sólo cuando éste está hibridado con ADN, y
c) una T7ARNpolimerasa, que sintetiza entre 10 y 100 copias de ARN a partir de
una doble cadena de ADN.
Al igual que en la PCR, se emplea una pareja de cebadores, pero uno de ellos
lleva incorporada la secuencia de bases del promotor T7, necesario para que
pueda actuar la T7ARNpolimerasa. Además, como en la PCR, es necesario incluir
dNTP y un tampón adecuado para que se produzca la reacción. Ésta se inicia con
la unión del cebador, que lleva incorporado un 5’ el promotor T7, a la hebra de
ARN que se quiere amplificar. En este momento actúa la AMV-RT realizando la
transcripción inversa sintetizando entonces el ADN complementario (ADNc). El
producto que se forma es un híbrido de ADNc y ARN y entonces puede actuar la
ARNasa degradando la molécula de ARN. Sobre la cadena, ahora libre, de ADNc
se puede hibridar el segundo cebador y es entonces cuando la AMV-RT, con su
función de polimerasa, es capaz de sintetizar la cadena complementaria de ADN.
Este es el momento en que en el extremo 5’ del ADNc comienza a copiarse por
acción del promotor T7 a la forma de cadena doble, mientras que la
T7ARNpolimerasa comienza a sintetizar entre 10 y 100 copias de ARN en sentido
negativo al ARN original. La unión del cebador correspondiente a las cadenas de
ARN sintetizadas determina el comienzo de una fase cíclica de repetición de los
pasos expuestos que conduce a la síntesis de entre 108 – 109 copias de ARN, por
lo que tiene una excelente sensibilidad. Se emplea en odontología principalmente
para la detección de la carga viral del VIH en lesiones bucales y para el registro
diagnóstico de la viremia por citomegalovirus.
Finalmente, en la técnica de ADN ramificado, a diferencia de lo descrito para PCR
y NASBA, se amplifica la señal y no la diana. Esta señal es la obtenida tras la
hibridación de los tres tipos de sondas, de captura, de anclaje y de marcaje. Una
vez liberada, la diana se inmoviliza gracias a su hibridación con las sondas de
captura que se hallan fijadas sobre la superficie del pocillo de una microplaca.
Tras conseguir esta primera reacción de hibridación, se recurre a la incorporación
a este híbrido de un segundo tipo de sondas denominadas de anclaje. Se produce
por tanto, una segunda reacción de hibridación entre la diana, que había sido
capturada y las sondas de anclaje. Éstas son moléculas de ADN capaces de
hibridarse con la diana y tienen la peculiaridad de disponer de un verdadero
esqueleto que soporta a su vez múltiples brazos o ramificaciones de ADN, que
permiten la hibridación de un tercer tipo de sondas, las de marcaje. La tercera
reacción de hibridación consiste entonces en la unión de numerosas sondas de
marcaje a los múltiples lugares o ramificaciones de unión, que les proporcionan las
sondas de anclaje. Una vez producida esta tercera reacción de hibridación y tras
añadir el sustrato para detectar la reacción, la señal obtenida se habrá amplificado
con respecto a la que se hubiera producido empleando una única sonda de
marcaje, esto es, mediante la hibridación convencional, ya que utilizando esta
cascada de reacciones de hibridación se consigue incorporar mayor cantidad de
moléculas marcadoras que es, en esencia, de lo que depende la intensidad de la
señal producida.
Este método es excelente para la cuantificación de ácidos nucleicos y se usa
comercialmente para la determinación de la carga de VIH, y de la carga de los
virus de la hepatitis B (VHB) y hepatitis C (VHC).