La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis, quien recibió el

Premio Nobel de Química en 1993 por este logro.

PCR significa reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de laboratorio común
utilizada para hacer muchas copias de una región particular de ADN. Por lo general, el objetivo
de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse.
componentes de la PCR
ADN MOLDE: Es la secuencia de ADN que se desea amplificar. El ADN molde puede provenir de
una amplia variedad de fuentes, como muestras biológicas microorganismos o incluso ADN
extraído de restos fósiles. Es fundamental que la muestra tenga una cantidad mínima de ADN
para que la amplificación sea
exitosa. El tamaño y calidad del ADN molde también influyen en la eficiencia de la PCR.
CEBADORES (PRIMERS): Los cebadores son pequeñas secuencias de nucleótidos (generalmente
de 18 a 25 bases de longitud) que se diseñan específicamente para unirse a las secuencias
complementarias del ADN molde en las regiones que se desean amplificar. Se necesitan dos
cebadores:
Cebador directo
Cebador inverso
ADN POLIMERASA: La ADN polimerasa es la enzima que sintetiza nuevas hebras de ADN a
partir de los nucleótidos (dNTPs) y el molde de ADN. La polimerasa más comúnmente utilizada
en la PCR es la Taq polimerasa, debido a su capacidad para soportar las altas temperaturas
necesarias para el proceso de desnaturalización sin desnaturalizarse a sí misma.
BUFFERS: (solución amortiguadora) El buffer proporciona un ambiente químico adecuado para
la reacción, asegurando que el pH y la concentración de iones sean las óptimas para la
actividad de la polimerasa.
NUCLEÓTIDOS (dNTPs): Los dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato) son los bloques de
construcción del ADN. Existen cuatro tipos de nucleótidos, cada uno correspondiente a una de
las bases nitrogenadas del ADN: dATP (adenina), dGTP (guanina), dCTP (citosina), dTTP
(timina)
TERMOCICLADOR: El termociclador es el equipo que controla los ciclos de temperatura
necesarios para que la PCR ocurra correctamente.
AGUA DESTILADA: El agua destilada se usa para diluir los reactivos y ajustar el volumen final de
la reacción de PCR. Es fundamental que esté libre de contaminantes o ADN que pueda
interferir en la amplificación, ya que incluso trazas de ADN no deseado pueden dar lugar a
resultados erróneos.
ENHANCERS: Los enhancers son aditivos que se agregan a la mezcla de PCR para mejorar la
eficiencia, la especificidad o la fidelidad de la amplificación, especialmente cuando hay
dificultades como una baja eficiencia de amplificación, problemas de desnaturalización o
productos inespecíficos.
ACEITE MINERAL: El aceite mineral es un componente adicional que se usa en algunas
reacciones de PCR para cubrir la mezcla de reacción y crear una capa protectora. Su principal
función es evitar la evaporación de los reactivos durante el ciclo de amplificación,
especialmente cuando se usan termocicladores que no cuentan con un sistema de tapa
caliente, que es común en muchos modelos antiguos de estos dispositivos.
IONES DE MAGNESIO: Los iones de magnesio (Mg2+) son cruciales para la actividad de la ADN
polimerasa. Estos iones se unen tanto a la enzima como a los dNTPs, permitiendo que ocúrra la
síntesis del ADN.

Pasos de la PCR:
La PCR consta de tres etapas fundamentales, que se repiten en ciclos:
1: Desnaturalización
Temperatura: 95 °C.
Proceso: Durante la desnaturalización, el ADN de doble hebra se expone a altas temperaturas,
durante un período breve (normalmente de 20 a 30 segundos). Este
calentamiento es crucial porque provoca la ruptura de los enlaces de hidrógeno que
mantienen unidas las dos hebras de ADN en su estructura de doble hélice. Como resultado, el
ADN se separa en dos cadenas individuales, o hebras monocatenarias. Este paso es esencial, ya
que las hebras separadas sirven como moldes para la posterior amplificación. La eficacia de
esta etapa es fundamental, ya que un inadecuado desnaturalizado puede llevar a una
amplificación deficiente o nula, afectando el resultado final de la PCR.
2:Anclaje (Annealing)
Temperatura: 50-65 °C, dependiendo de los cebadores.
Proceso: Después de la desnaturalización, la temperatura se reduce enn función de las
características específicas de los cebadores utilizados. Esta etapa, es donde los cebadores se
unen a sus secuencias complementarias en las hebras de ADN. Los
cebadores son secuencias cortas de ADN diseñadas para ser específicas para la región de
interés que se desea amplificar. La temperatura debe ser suficientemente baja para permitir el
emparejamiento específico de los cebadores con el ADN molde, pero lo suficientemente alta
para prevenir uniones no específicas que podrían resultar en productos amplificados no
deseados. Un correcto anclaje es crítico, ya que la especificidad de la amplificación depende de
esta unión.
3. Extensión
Temperatura: 72 °C.
Proceso: Durante esta etapa, la ADN polimerasa añade nucleótidos al extremo 3’ del
cebador, utilizando el ADN molde como guía para la síntesis de la nueva hebra. La Taq
polimerasa, es comúnmente utilizada debido a su estabilidad a altas temperaturas y su
capacidad para funcionar eficientemente en condiciones extremas. Esta polimerasa puede
añadir nucleótidos a una velocidad de aproximadamente 1000 bases por minuto, permitiendo
la rápida generación de copias del ADN objetivo. La duración de esta etapa varía según el
tamaño del fragmento de ADN que se amplifica; típicamente, se requieren aproximadamente
30 segundos por cada 1000 pares de bases. Al final de la fase de extensión, se generan nuevas
hebras de ADN complementarias a las hebras originales, completando así un ciclo de
amplificación. Este paso es crucial porque la cantidad de producto amplificado aumenta
exponencialmente con cada ciclo, lo que permite obtener suficiente ADN para su análisis
posterior.
Estos tres pasos se repiten generalmente entre 25 y 40 veces en un termociclador,
permitiendo una amplificación exponencial del ADN de interés, que es fundamental para el
éxito de la PCR.

Cada etapa es crítica para garantizar que el proceso de amplificación se realice de manera
eficiente y específica, asegurando resultados precisos y confiables.
Para determinar si el proceso de PCR ha transcurrido correctamente, se utilizan varios
métodos, siendo los más comunes:
Electroforesis en Gel de Agarosa
La electroforesis en gel de agarosa es una técnica fundamental utilizada para analizar
los productos de amplificación obtenidos a través de la PCR. Después de realizar la PCR, el
producto amplificado se mezcla con un colorante que se une al ADN. Esta mezcla se carga en
un gel de agarosa, que es una matriz porosa que permite la separación de las moléculas de
ADN según su tamaño. Cuando se aplica una corriente eléctrica a través del gel, las moléculas
de ADN, que son cargadas negativamente debido a su grupo fosfato, migran hacia el electrodo
positivo. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápidamente a través de los poros del
gel que las más grandes, lo que permite la separación de las fragmentos de ADN.
Análisis de Control Positivo y Negativo
El uso de controles en la PCR es fundamental para validar los resultados obtenidos. Un control
positivo consiste en una muestra que se sabe que contiene el ADN objetivo que se desea
amplificar, mientras que un control negativo es una muestra que no contiene ADN del
objetivo.
Estos controles se incluyen en la reacción de PCR junto con las muestras experimentales. El
control positivo debería amplificar y mostrar bandas en la electroforesis, confirmando que la
mezcla de reacción y las condiciones experimentales son adecuadas para la amplificación. Por
otro lado, el control negativo no debe mostrar ninguna banda en el gel, lo que indica que no
hubo contaminación en la mezcla de reacción que podría haber generado un falso positivo.

Existen distintos tipos de PCR que se utilizan dependiendo de aquello que se desee analizar:
PCR en Tiempo Real (qPCR): La PCR en Tiempo Real, o qPCR, es una técnica que
permite amplificar y cuantificar ADN en tiempo real durante la reacción. Utiliza colorantes
fluorescentes o sondas específicas que emiten fluorescencia cuando el ADN se amplifica. La
qPCR es altamente sensible y proporciona resultados rápidos, eliminando la necesidad de
análisis posteriores en gel.
PCR Múltiple (Multiplex PCR): La PCR Múltiple permite amplificar varias secuencias de ADN en
una sola reacción, utilizando múltiples pares de cebadores simultáneamente. Esta técnica es
especialmente útil en diagnósticos clínicos para detectar diferentes patógenos en muestras
biológicas. Al ahorrar tiempo y recursos, la PCR múltiple proporciona resultados más
eficientes, aunque requiere una optimización cuidadosa para evitar amplificaciones cruzadas y
asegurar la especificidad de los
cebadores.
RT-PCR (Transcripción Inversa PCR): La RT-PCR se utiliza para estudiar la expresión génica al
convertir ARN en ADN complementario mediante la enzima retrotranscriptasa, seguido de la
amplificación del ADNc mediante PCR. Esta técnica es crucial para cuantificar la cantidad de
ARN en las muestras, lo que permite evaluar los niveles de expresión de genes específicos bajo
diferentes condiciones. Es ampliamente utilizada en investigaciones de virología y en la
detección de enfermedades.
PCR Digital (dPCR): La PCR Digital es una técnica avanzada que permite la cuantificación precisa
del ADN al dividir la muestra en partículas individuales, donde
cada partícula se somete a PCR. Se cuantifican las reacciones positivas y negativas para
determinar la concentración inicial de ADN sin necesidad de una curva estándar. Esta técnica
es especialmente útil para detectar mutaciones raras y analizar muestras
complejas, ofreciendo una precisión que no se logra con las PCR convencionales.
PCR convencional: La PCR convencional es la forma básica de esta técnica, que
amplifica secuencias específicas de ADN a través de ciclos de desnaturalización,
alineación y extensión. Los productos amplificados se analizan típicamente mediante
electroforesis en gel para verificar su tamaño y especificidad. A pesar de ser una técnica simple
y ampliamente utilizada en una variedad de aplicaciones, requiere un análisis posterior en gel,
lo que puede ser un paso adicional.
Ventajas de la PCR
Se dispone, en forma rápida y eficaz, de cantidades suficientes de una determinada
secuencia de DNA para su posterior estudio molecular.
Diagnóstico de patologías genéticas o adquiridas,
Investigación sobre los defectos moleculares todavía no definidos.
Aplicación a la medicina forense y legal.
Detección de patógenos responsables de enfermedades infecciosas.
Como todo, la PCR tiene sus ventajas pero también sus limitaciones:
Contaminación: Debido a la alta sensibilidad, la PCR es susceptible a la contaminación
con ADN ajeno, lo que puede dar lugar a resultados falsos positivos.
Errores de la ADN polimerasa: Aunque las polimerasas como la Taq son eficientes, pueden
introducir errores durante la replicación del ADN.
Cantidad limitada de información: La PCR amplifica secuencias específicas, pero no
brinda información sobre secuencias no amplificadas.
Las enzimas de restricción, descubiertas en bacterias a mediados del siglo XX, actúan como
"tijeras moleculares", cortando el ADN en sitios específicos definidos por secuencias de
reconocimiento.

El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue otorgado a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton
O. Smith. A principios de los años 60, Arber había descubierto las enzimas de restricción,
enzimas que cortan el ADN en posiciones concretas, determinadas por la secuencia de
nucleótidos que reconocen. Smith confirmó los resultados de Arber y demostró que las
enzimas de restricción cortan el ADN en el centro de secuencias simétricas de nucleótidos.
Posteriormente, Nathans fue el primero en utilizar las enzimas de restricción para resolver un
problema genético, la caracterización del genoma del virus SV40.

Las enzimas de restricción se clasifican en tres tipos principales

1. Tipo I: Estas enzimas cortan el ADN lejos del sitio de reconocimiento. Además, requieren
varios cofactores, incluidos ATP y S-adenosilmetionina, para su actividad.

2. Tipo II: Son las más utilizadas en laboratorios debido a su alta especificidad y simplicidad.
Estas enzimas realizan cortes directamente en el sitio de reconocimiento y no requieren
cofactores adicionales. Los sitios de reconocimiento suelen ser secuencias palindrómicas, lo
que significa que la secuencia de nucleótidos es la misma cuando se lee en ambas direcciones.
Ejemplos comunes incluyen EcoRI, HindIII y BamHI.

3. Tipo III: Estas enzimas cortan el ADN cerca del sitio de reconocimiento y requieren ATP para
su actividad.

Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes). Reconocen

secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen a ellas. Cada enzima de
restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de restricción. Cuando encuentra su
secuencia blanco, la enzima de restricción corta las dos cadenas de una molécula de ADN. Por
lo general, el corte es en o cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y
predecible. Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una
secuencia de ADN, veamos a EcoRI, una enzima de restricción de uso común en el laboratorio.
EcoRI corta en el siguiente sitio

Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico que
produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:

Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias (porque también

se cortó con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse por complementariedad de
bases. Por esta razón se dice que las enzimas que dejan extremos de cadena sencilla producen
extremos cohesivos. Los extremos cohesivos son útiles en la clonación porque mantienen dos
fragmentos de ADN juntos para que la ADN ligasa los pueda unir.
No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen
"extremos romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena
sencilla. La enzima de restricción SmaI es un ejemplo de enzima que corta así:

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar
fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle)
porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de
ADN en su posición.

La ADN ligasa: Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, la ADN ligasa
puede unirlos para formar una molécula sin interrupciones. Mediante el uso de ATP como
fuente de energía, la ligasa cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de
una cadena de ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. Esta reacción
produce un esqueleto de azúcar-fosfato intacto.

Aplicación

1. Clonación molecular: Permiten la inserción de genes de interés en vectores como plásmidos,

que pueden ser introducidos en células huésped para su replicación y expresión.

2. Mapeo genético: Las enzimas de restricción se utilizan para fragmentar el ADN de manera
controlada, lo que facilita la creación de mapas físicos del genoma.

3. Diagnóstico de enfermedades: Se emplean en técnicas que permite detectar variaciones en

el ADN que pueden estar asociadas con enfermedades genéticas.

4. Edición y modificación genética: Las enzimas de restricción son fundamentales en la

preparación de ADN para técnicas de edición genética

El sistema CRISPR-Cas9 fue descubierto en 2012 gracias al trabajo pionero de Jennifer Doudna
y Emmanuelle Charpentier, quienes investigaban un sistema de defensa inmunológico en
bacterias. En 2020 fueron galardonadas con el Premio Nobel de Química por el desarrollo de
esta tecnología. CRISPR, que significa Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats, consiste en secuencias de ADN repetitivas que se encuentran en el genoma de
bacterias y arqueas. Doudna y Charpentier demostraron que, al diseñar una molécula de ARN
guía (gRNA) específica para dirigirse a secuencias de ADN diana, la enzima Cas9 podría ser
utilizada para realizar cortes en el ADN.

El Sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición genética que fue descubierta como
parte del sistema inmunológico de algunas bacterias frente al ataque de los virus. Este sistema
se basa en la replicación y conservación de fragmentos de ADN vírico dentro del ADN de la
bacteria que ha sido infectada. Estos trozos de ADN se encuentran localizados entre
estructuras de ADN que consiguen estabilizar y mantenerlo inactivo mientras no es necesario.
A esta estructura que flanquea el ADN vírico dentro del hospedador se le llamó Sistema
CRISPR.

Cuando la bacteria era infectada de nuevo por el mismo virus, ésta era capaz de crear una
molécula de ARN mensajero a partir del ADN vírico que estaba almacenado en su sistema
CRISPR. El ADN mensajero viajaba hasta el ADN del virus atacante y se unía al fragmento de
ADN al cual era homólogo. Esto hacía que la enzima Cas9 reconociera la unión entre ARN
mensajero y ADN, procediendo al corte del ADN vírico y dejándolo dañado.

El sistema CRISPR tiene tres etapas

1. Adquisición del espaciador: cuando un fago infecta, la bacteria toma un pequeño fragmento
del ADN del virus y lo guarda en su propio ADN

2. Producción de ARN CRISPR: la bacteria convierte estos fragmentos de ADN en ARN, que es
usado para buscar nuevas infecciones.

3. Interferencia: cuando el sistema CRISPR detecta el ADN del fago, lo corta para detener la
infección.

Este sistema fue manipulado para que pasara de ser un sistema de defensa ante el ataque de
ciertos virus a un sistema de edición genética. De esta forma, si se crea un ARN mensajero que
puede unirse al gen que nos interesa modificar, la enzima Cas9 puede ser dirigida hacia esos
genes de interés para cortar y pegar otros genes modificados.

El sistema CRISPR/Cas9 presenta los siguientes componentes:

● CRISP: Sistema usado por las bacterias para su propia defensa frente ataques víricos. Permite
guardar fragmentos de ADN foráneo entre estructuras de ADN que lo flanquean y lo
mantienen estable.

● ARN mensajero: Molécula que se crea a partir del ADN almacenado en el sistema CRISPR y
que es capaz de unirse a la zona complementaria del ADN vírico

● Cas9: Enzima que reconoce la unión del ARN mensajero al ADN vírico. La enzima produce un
corte en el ADN.

El sistema CRISPR-Cas9 opera a través de un proceso que involucra varios pasos:

1. Diseño del ARN guía (gRNA): Se sintetiza un gRNA que contiene una secuencia
complementaria a la región específica del ADN que se desea editar. Este gRNA guiará a la
enzima Cas9 hacia el sitio diana en el genoma.

2. Unión y reconocimiento: El gRNA se une a la enzima Cas9, formando un complejo que se

dirigirá a la secuencia de ADN diana en el genoma. Este complejo busca y se une a la secuencia
complementaria en el ADN.

3. Corte del ADN: Una vez que el gRNA se une al ADN diana, la enzima Cas9 realiza un corte de
doble hebra en el sitio específico. Este corte provoca una ruptura en el ADN que puede ser
reparada por la célula a través de mecanismos de reparación.

4. Reparación del ADN: La célula intenta reparar el corte de ADN de dos maneras:

● Reparación no homóloga (NHEJ): Este es un proceso rápido y generalmente impreciso en el

que la célula une los extremos cortados del ADN, a menudo introduciendo inserciones o
deleciones (indels). Estas indels pueden desactivar el gen original, lo que puede ser útil para
estudios funcionales o para crear modelos de enfermedades.

● Reparación dirigida por homología (HDR): Este mecanismo permite la inserción de una
secuencia específica de ADN utilizando un molde de reparación. Si se proporciona un
fragmento de ADN con la secuencia deseada junto con el gRNA y Cas9, la célula puede usarlo
como plantilla para corregir o insertar el gen deseado en el sitio de corte. Este proceso es más
complejo y menos eficiente que la NHEJ, pero es fundamental para la edición genética precisa

3. COMPARACIÓN
CRISPR tiene el potencial de transformar tratamientos médicos al corregir -enfermedades a
nivel genético, mientras que las enzimas de restricción son fundamentales en el diagnóstico,
pero no en el tratamiento.

Especificidad:

● Enzimas de Restricción: Reconocen secuencias de ADN muy específicas, generalmente de 4 a

8 pares de bases. Esta especificidad puede ser tanto una ventaja como una limitación, ya que
solo pueden realizar cortes en los sitios de reconocimiento presentes en el genoma.

● CRISPR-Cas9: Ofrece una flexibilidad superior, ya que puede ser programado para reconocer
prácticamente cualquier secuencia de ADN a través de la modificación del ARN guía (gRNA).

no todos los seres humanos tienen una secuencia de ADN idéntica; existen variaciones
genéticas que nos distinguen unos de otros. Estas variaciones se conocen como polimorfismos.
Cada individuo hereda una copia de cada gen de ambos padres, lo que da lugar a
combinaciones únicas de alelos (las diferentes versiones de un gen). La frecuencia de un alelo
dentro de una población indica cuán común es ese alelo en la población, lo que puede cambiar
con el tiempo debido a diversos factores. A medida que los alelos se transmiten de generación
en generación, se garantiza la continuidad de la variabilidad genética dentro de una población.

Los polimorfismos, al ser variaciones comunes, tienen una frecuencia específica que puede
variar dependiendo de las condiciones del entorno y de factores evolutivos. Por ejemplo, un
polimorfismo puede aumentar su frecuencia en una población si favorece la supervivencia o la
reproducción de los individuos que lo portan. Este proceso es conocido como selección
natural.

Las mutaciones son la causa principal de la variabilidad genética, ya que introducen nuevas
variantes genéticas en el ADN. Dependiendo de si estas mutaciones son beneficiosas, neutras o
perjudiciales, pueden alterar las frecuencias de los alelos en una población. Si una mutación
persiste y se transmite a muchas generaciones, puede convertirse en un polimorfismo estable,
siendo heredada de forma común en la población.

La variabilidad en el genoma humano puede presentarse en diferentes formas. Una de las más
comunes son los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), que son cambios en una sola base
del ADN. Otras variaciones más grandes, como las duplicaciones o inserciones de segmentos
de ADN, también ocurren con frecuencia. Además, algunas variaciones involucran
reordenamientos de secuencias, como inversiones o translocaciones. Aunque estas variaciones
pueden influir en la salud, la mayoría de ellas no son patológicas. De hecho, muchos de estos
polimorfismos no afectan la función de los genes, pero en algunos casos, pueden estar
relacionados con un mayor riesgo de desarrollar enfermedades genéticas.

Se dice que un gen es polimórfico si más de un alelo ocupa el locus de ese gen dentro de una
población. Para que éste se pueda considerar polimórfico, debe estar presente en al menos el
1% de la población humana. Estas variaciones pueden ocurrir en regiones codificantes o no
codificantes del ADN, la mayoría de los polimorfismos son silenciosos, lo que significa que no
alteran la función o la expresión de un gen. Algún polimorfismo es visible y pueden
manifestarse como cambios en una sola base nitrogenada o como variaciones en la cantidad
de secuencias repetitivas.
Los polimorfismos genéticos son variantes del genoma que aparecen por mutaciones en
algunos individuos, se transmiten a la descendencia y adquieren cierta frecuencia en la
población tras múltiples generaciones.

TIPOS DE POLIMORFISMOS:

• SNPs (polimorfismo de un solo nucleótido): Los polimorfismos de nucleótido único (SNP) son
variaciones genéticas comunes en las personas, representando una diferencia en un solo
nucleótido en el ADN. Estos cambios ocurren aproximadamente cada 1,000 nucleótidos. Hay
millones de SNP en el genoma humano y, aunque la mayoría no afecta la salud, algunos
pueden influir en la respuesta a medicamentos y factores ambientales.

• VNTRs (repeticiones en tándem variable): Las repeticiones en tándem de número variable

(VNTR) son secuencias de ADN que varían en número entre individuos. Formadas por unidades
de 10 a 100 pares de bases, las VNTR se hallan en regiones codificantes y no codificantes del
genoma. Su función no es totalmente clara, pero podrían estar vinculadas a la regulación
génica y la estructura de la cromatina.

EXPLICACIÓN:

• Amplificación de los fragmentos: Primero, se amplifican las regiones VNTR utilizando la

técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Esto permite obtener suficientes
fragmentos de ADN para ser analizados.

Separación de los fragmentos: Después de amplificar los fragmentos, estos se separan

mediante electroforesis en gel. En la imagen, los fragmentos de ADN se colocan en un gel con
un campo eléctrico. Los fragmentos más cortos (con menos repeticiones) se mueven más
rápido hacia el polo positivo, mientras que los fragmentos más largos se mueven más lento.

• Interpretación de resultados: Cada línea en el gel representa un alelo de VNTR de un

individuo. En la imagen se observan distintos patrones para cada individuo (1, 2, 3, 4, 5), lo cual
indica que cada uno tiene un número diferente de repeticiones. Esto se usa para diferenciar a
los individuos entre sí.

TIPOS DE APLICACIONES:

• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS: Los polimorfismos pueden ser indicadores de

mutaciones relacionadas con enfermedades hereditarias.

• PRUEBAS DE PATERNIDAD Y PARENTESCO: Los polimorfismos de ADN permiten establecer

relaciones de parentesco entre individuos. Las pruebas de paternidad se basan en la
comparación de polimorfismos entre padres e hijos para confirmar similitudes genéticas y
determinar vínculos biológicos con precisión.

• MEDICINA PERSONALIZADA: permiten identificar cómo un paciente puede responder a

ciertos medicamentos optimizando la efectividad de los fármacos y reduciendo efectos
secundarios.

INVESTIGACIÓN FORENSE: En el campo forense, los polimorfismos en secuencias específicas

del ADN, como los VNTR (repeticiones en tándem de número variable) y STR (repeticiones
cortas en tándem), permiten crear perfiles genéticos únicos para cada individuo.

• BIOTECNOLOGÍA Y AGRICULTURA: ayudan a identificar genes asociados con rasgos

beneficiosos
METODOS PARA ESTUDIAR POLIMORFISMO DE ADN:

La PCR es una técnica que permite amplificar regiones específicas de ADN, ideal para estudiar
variaciones genéticas, o polimorfismos. Funciona mediante ciclos repetidos de:

• Desnaturalización: Calentamiento para separar las cadenas de ADN.

• Alineación: Los cebadores se unen a las secuencias específicas.

• Extensión: La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas a partir de los cebadores.

Después de varios ciclos, se obtiene una gran cantidad del fragmento deseado, que puede
analizarse, por ejemplo, mediante electroforesis en gel para identificar y comparar
polimorfismos.

• La electroforesis en gel separa moléculas, como ADN, según su tamaño. La muestra se coloca
en un gel y se aplica una corriente eléctrica: las moléculas más pequeñas migran más lejos que
las grandes. Tras la separación, se usan colorantes para visualizar y analizar las bandas,
permitiendo identificar variaciones genéticas

Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena, con capacidad de albergar
un fragmento de ADN de otro origen.
Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican
fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que
sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que
transporta. También tiene que tener
secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
Para insertar un fragmento de ADN a un vector, se utiliza una enzima de restricción que se
mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima, posteriormente, se adiciona
la enzima Fosfatasa Alcalina, la cual es la encargada de evitar la recircularización del vector, ya
que adiciona un extremo 3' Fosfato que evita la unión de ambos extremos así como la
complementariedad y formación de un enlace fosfodiéster. Inmediatamente se adiciona el
ADN que pretende insertarse en el vector, donde uno de los extremos se une por
complementariedad y se utiliza una ligasa para generar la unión y su recircularización.
Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.
El vector habitualmente ayuda en la replicación o expresión de la secuencia de ADN insertado
en el interior de la célula huésped.
Todo vector de clonación debe contener:
● Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de ADN, el cual le
da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al ADN cromosómico.
● Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le confieren
características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.), que permiten la
identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, clonas que contienen el
fragmento de ADN de interés.
● Polilinker o Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias de los genes
que codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de restricción, es decir,
múltiples sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción, que permiten la inserción
de los fragmentos de ADN que se desea clonar en un sistema.

Diferencia entre Vectores de Clonación y Vectores de Expresión

● Vectores de clonación: Su principal objetivo es almacenar secuencias y obtener grandes
cantidades del ADN insertado o moléculas recombinantes.
● Vectores de expresión: Están diseñados para producir un transcrito (ARN) o la proteína
resultante del transcrito. Estos vectores incluyen elementos que permiten la expresión del gen
insertado, lo que significa que no solo se clona el ADN, sino que también se produce una
proteína funcional a partir del mismo.
TIPOS DE VECTORES
Plásmidos
Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se
transmiten con independencia del cromosoma bacteriano. De manera natural constituyen el
material genético móvil de las bacterias, donde funcionan como medio de transporte de genes
a otras bacterias, como la resistencia a antibióticos. Los plásmidos permanecen de manera
episomal en la bacteria, esto es, sin incorporarse en su genoma, y en ella puede haber
múltiples copias del mismo plásmido. Cuando una bacteria se reproduce, estos plásmidos se
transmiten a las células descendientes por distribución equitativa del citoplasma bacteriano
durante la división celular. La replicación y transcripción plasmídica depende de la maquinaria
enzimática de la célula huésped. Los plásmidos han sido manipulados genéticamente en el
laboratorio con la finalidad de preservar sólo las características deseables, eliminar el ADN
innecesario y añadirle otras que no poseen de forma natural. Los plásmidos usados como
vector en general están formados por de 2 a 5 kb de ADN, lo que facilita el análisis de los
insertos incorporados a él.
Son uno de los vectores más utilizados en la clonación debido a sus características favorables:
● Replicación autónoma: Poseen un origen de replicación que permite su multiplicación
independiente del cromosoma bacteriano.
● Sitios de clonación: Contienen secuencias específicas que permiten la inserción de
fragmentos de ADN, facilitando la clonación.
● Marcadores seleccionables: Generalmente incluyen genes que confieren resistencia a
antibióticos, lo que permite seleccionar las células que han incorporado el plásmido
modificado.
Bacteriófagos
Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y se comportan como parásitos
intracelulares obligados que se multiplican haciendo uso de la maquinaria de las bacterias.
los bacteriófagos se replican de forma autónoma, portan información genética y pueden
conferirle a la bacteria nuevas propiedades o desarrollar procesos patológicos. Para convertirlo
en un vector, el bacteriófago silvestre (virus natural) es modificado genéticamente. Dichas
modificaciones consisten en la adición de sitios de restricción específicos y la eliminación de
aquellos genes que no se requieren para la replicación, lo que permite la incorporación de
fragmentos de ADN de mayor longitud que los plásmidos (de hasta 23 kb).
El bacteriófago lambda es el fago más utilizado como vector de clonación, y su genoma
consiste de una molécula lineal de aproximadamente 45000 pb, cuyos extremos son 12
nucleótidos, que contienen secuencias complementarias entre sí, denominados sitios cos, que
utiliza para “circularizar” su genoma a través de la acción de una ligasa de la célula huésped.
● Mecanismo: Se corta el ADN del fago y se reemplaza una parte con el ADN que se desea
clonar. Luego, el fago recombinante se introduce en las bacterias, donde se replica junto con el
ADN bacteriano.
● Capacidad: Los vectores basados en fagos pueden transportar fragmentos de
ADN de hasta 20 kb, lo que los hace útiles para clonar secuencias más grandes que los
plásmidos
Cósmidos
Algunos estudios de análisis de ADN genómico requieren de la clonación de
fragmentos de ADN grandes. En estos casos, es recomendable utilizar los cósmidos
ya que pueden aceptar insertos de hasta 45 kb. Los cósmidos son vectores híbridos
del ADN de un plásmido (proporciona la resistencia a los antibióticos) y los sitios cos
del bacteriófago (le permiten empaquetar el ADN) que combinan características de plásmidos
y bacteriófagos.
● Estructura: Tienen la secuencia "cos" del fago lambda, que es necesaria para el
empaquetamiento del ADN en la cápside del fago, además de contener elementos plasmídicos
para la replicación.
● Capacidad: Los cósmidos pueden transportar fragmentos de ADN más grandes que los
plásmidos, generalmente hasta 50 kb
BAC (Cromosomas Artificiales Bacterianos)
Fragmentos de ADN de mayor tamaño (cientos de kilobases) pueden clonarse en
cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura (YAC), que se replican como
un cromosoma independiente dentro de bacterias o levaduras, respectivamente.
Este tipo de vectores son particularmente útiles para estudios de mapeo de cromosomas, por
su capacidad para almacenar fragmentos de gran tamaño.
Un BAC es un constructo derivado del plásmido F (functional fertility plasmid) capaz de regular
la distribución equitativa de plásmidos después de la división bacteriana. Usualmente, acepta
insertos de 150 a 350 Kb, pero se han clonado segmentos de hasta 700 kb. Un sistema similar
denominado PAC, derivado del plásmido bacterial P1, tiene capacidad de insertar hasta 300 kb.
Clonación molecular
Generalmente, la célula hospedadora del vector es una bacteria (E. coli), pero
también puede ser una célula eucariota. La introducción de un vector en una célula
eucariota se denomina transfección , y si el vector es un virus, se llama transducción . El
propósito de la introducción del ADN recombinante es la transformación celular, es decir, que
el material genético se incorpora de manera extracromosómica y se replica, transcribe y
traduce utilizando la maquinaria enzimática de la célula huésped. La clonación de cualquier
fragmento de ADN involucra:
1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.
Este paso involucra la digestión con enzimas de restricción para liberar el fragmento
de interés de la molécula de ADN completa. Las enzimas que cortan el ADN son un
punto crítico que determina la facilidad y eficacia de la metodología. Para facilitar la
clonación, se prefiere el uso de enzimas de restricción cuyos sitios de corte estén
presentes en el sitio de clonación múltiple del vector, evitando así la necesidad de
una posible modificación posrestricción del inserto. Asimismo, el inserto debe cortarse con las
mismas enzimas o con otras que dejen los mismos extremos, de manera que la
complementariedad de los extremos generados en el inserto coincide con los extremos del
vector. Es importante tener en cuenta que la incorporación de un inserto con extremos romos
implica una eficiencia del 50% en la clonación, ya que en la mitad de las ocasiones el inserto va
en la dirección apropiada (5' -3'), pero en el otro 50% será en el sentido opuesto (3'-5'). El
inserto, producto de la digestión enzimática, se purifica y se separa de la molécula de ADN de
donde proviene, mediante electroforesis en gel de agarosa. La banda correspondiente al
inserto
(que se verifica por el tamaño que presenta) se escinde del gel y se extrae y purifica
mediante técnicas convencionales.
2. Preparación del vector para la clonación.
Consiste en:
a) Corte con las mismas enzimas de restricción con que se digirió el inserto, obteniendo un
ADN lineal. La estrategia de clonación debe diseñarse para que el corte genere extremos con
secuencias complementarias a los extremos
del inserto a clonar.
b) Desfosforilación del vector para impedir la autoligación. Esto se realiza utilizando fosfatasa
alcalina bovina de origen intestinal (CIP) o fosfatasa bacteriana (BAP), que elimina los grupos
fosfato 5' de una cadena de ADN.
c) Purificación del vector, que consiste en eliminar las partículas de agarosa, los restos de
enzimas inactivadas y las sales provenientes de la reacción de digestión. Generalmente, se
realiza utilizando columnas de resinas con alta afinidad al ADN en presencia de altas
concentraciones de sales caotrópicas.
Esto permite una elución de la muestra en volúmenes pequeños de agua o buffer con
baja concentración de ventas. También existe la posibilidad de purificar mediante la
técnica fenol modificado, para obtener ADN plasmídico (evitando la extracción del ADN
genómico) pero consume mucho tiempo y, en general, se obtiene un ADN plasmídico de
menor calidad. Otra estrategia de ligación consiste en el uso del fragmento largo de la
polimerasa (fragmento Klenow), que "rellena" los extremos cohesivos generados por cualquier
enzima y los convierte en romos. Sin embargo, los extremos romos en el vector no dirigen la
inserción, por lo que la eficacia de la clonación disminuye.
3. Ligación del inserto y el vector.
La ligación de un segmento de ADN exógeno a un vector implica la formación de enlaces
fosfodiéster entre los residuos fosfato que se localizan en los extremos 5' de la cadena de ADN
y los residuos hidroxilo 3'. Esta unión es catalizada in vitro por una enzima ligasa. Las más
utilizadas son la ligasa de E. coli y la ligasa de bacteriófagos T4.
4. Preparación de células competentes.
Para que los vectores puedan replicarse, deben estar dentro de una célula, que debe
prepararse para ser permeable a la entrada del vector recombinante, un proceso denominado
generación de células competentes. Las células competentes generalmente son procariotas, y
la bacteria más utilizada para este procedimiento es E. coli, que carece de un mecanismo
natural para la incorporación de ADN exógeno.
El estado de competencia puede inducirse mediante diferentes métodos y la elección del
método dependerá del procedimiento de transformación seleccionado. Uno de los más
utilizados consiste en tratar las bacterias con una solución de CaCl2. Se desconoce el
mecanismo exacto por el cual este compuesto induce la competencia; Sin embargo, una
explicación sostiene que la membrana bacteriana es permeable a los iones cloro, pero no a los
iones calcio, de manera que los iones Ca²⁺ se rodean de moléculas de agua para entrar a la
célula, lo que provoca que la célula se abulte, facilitando la formación de poros y la entrada del
ADN. Este procedimiento se prefiere para células que se transformarán usando precipitados de
CaCl2. Para lograr el estado de competencia por cualquiera de las técnicas, es necesario que
las células se encuentren en la fase logarítmica de crecimiento lo que corresponde a una
densidad celular de 5 × 10⁷ cel/ml. Otro método para conferir competencia a las bacterias
consiste en someterlas a lavados consecutivos de 4 a 5 veces con una solución de glicerol al
10%, para obtener células libres de iones y proteger la membrana celular del daño que puede
causar la electroporación, a través de la cual se transformará. Independientemente del
procedimiento empleado para inducir el estado de competencia, las células pueden
almacenarse de forma indefinida sin perder su competencia en una solución acuosa con
glicerol al 10%, para impedir que, al descongelarse, se lisen.
5. Transformación celular.
La transformación bacteriana consiste en la adquisición de ADN exógeno, que
confiere un nuevo fenotipo a la célula huésped. Entre los métodos más comunes se
encuentran la transformación química y la transformación por electroporación. Es importante
destacar que el término transformación se refiere a la introducción de
material genético a través de vectores en las bacterias; el término transducción describe la
introducción del ácido nucleico exógeno en una célula mediante un vector
viral, y el término transfección implica la introducción del material genético en las
células utilizando agentes químicos o físicos.
a) Transformación química: En este procedimiento, las células y el ADN
plasmídico se incuban en una solución hipotónica de CaCl2, que forma un complejo
con el ADN que facilita su entrada por endocitosis en una célula competente.
Además, se aplica un breve choque térmico a 42 °C por 90 segundos, lo que incrementa la
permeabilidad de la membrana celular. La eficiencia de este método es de 1 × 10⁴ a 1 × 10⁶
células transformadas/μg de plásmido, y varía dependiendo de la longitud del plásmido y la
cepa de bacterias utilizadas. Es un método sencillo que proporciona una buena eficiencia de
transformación para muchos procedimientos de rutina.
b) Transformación por electroporación: consiste en la aplicación de breves pulsos eléctricos de
alto voltaje a las células receptoras para formar poros en la membrana plasmática en células
eucariotas y/o en la pared celular de las bacterias. Los componentes de la membrana se
desestabilizan, permitiendo la entrada del vector al citoplasma de la célula. Esta es la técnica
de transformación más efectiva, que permite alcanzar eficiencias de hasta 1 × 10⁷ células
transformadas/μg de ADN. La electroporación se utiliza para transformar bacterias, pero
también para transfectar células eucariotas.
6. Identificación de las colonias celulares que contienen el vector recombinante
Los métodos más comunes son la selección en medios de cultivo, utilizando marcadores de
resistencia a antibióticos o marcadores de selección alternativos. En el caso de E. coli, se
utilizan plásmidos que contienen un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar las
colonias que han adquirido el plásmido. Además, la
identificación de las colonias recombinantes puede realizarse a través del análisis del ADN
Genotecas
Una biblioteca genómica o genoteca es una colección de fragmentos de ADN provenientes del
genoma de un organismo, clonados en vectores para facilitar su
estudio. Se pueden construir genotecas de ADN o de ADNc.
Genotecas de ADNc
Los bancos de ADNc se construyen a partir de secuencias de ARNm mediante una reacción in
vitro que sintetiza una primera cadena de ADNc utilizando una ADN polimerasa con actividad
de transcriptasa inversa. El ARNm que no se copia a ADNc se elimina con la adición de la
enzima ARNasa H. La segunda cadena de ADNc,
complementaria a la obtenida de la retrotranscripción, se sintetiza en una reacción de PCR o
empleando una ADNc polimerasa que utilice la cadena sencilla del ADNc como templado.
Posteriormente, este ADNc de doble cadena se clona en un vector.
Genotecas de ADNg
Para construir bancos de ADNg es necesario aislar el ADNg del organismo de interés.
Este ADNg se corta con enzimas de restricción para generar fragmentos con extremos
complementarios a los del vector de clonación. Una vez que se ha construido la genoteca, se
rastrea el clon o clones que portan el ADN con el gen de interés. Los métodos más frecuentes
de identificación de clones recombinantes son la hibridación usando alguna sonda marcada, el
uso de anticuerpos frente a la proteína de interés o la selección de clones por la actividad
biológica de la proteína.
Producción de proteínas recombinantes
La clonación molecular ha permitido determinar la función de múltiples proteínas y generar
proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se producen en bacterias, levaduras, células de insecto y células
de mamífero. Para maximizar la expresión de las proteínas se emplean promotores fuertes que
aseguren la expresión por arriba del 10% del total de las proteínas celulares, aunque esto
impone una carga metabólica a las células, disminuyendo la velocidad de su crecimiento, por lo
que ciertas proteínas recombinantes pueden resultar tóxicas para las células que las producen.
También puede alterarse la secuencia del gen de interés sustituyendo codones para los que
hay ARNt poco frecuentes y reemplazándolos por aquellos que codifican para el mismo
aminoácido, pero que se usan más en el organismo huésped. Asimismo, la producción de
proteínas recombinantes en plantas presenta la ventaja de que su disponibilidad de biomasa
es prácticamente ilimitada y los costos de producción son bajos, ya que una vez establecido el
cultivo no se requiere personal especializado, y no presenta riesgos de contaminación con
patógenos animales, endotoxinas bacterianas o secuencias de ADN oncogénicas. Una ventaja
adicional es que las plantas permiten el almacenamiento estable de la proteína recombinante
en semillas y tubérculos, lo que facilita su conservación, transporte y distribución, abaratando
los costos respecto a otros sistemas de producción. Así, ya existen biorreactores vegetales que
producen vacunas comestibles en tubérculos u hojas de lechuga.
Desarrollo de Vacunas
Los vectores permiten la creación de vacunas recombinantes al insertar genes que
codifican antígenos específicos. Esto genera respuestas inmunitarias sin necesidad
de utilizar el patógeno completo, lo que aumenta la seguridad de las vacunas.
Agricultura y Organismos Genéticamente Modificados (OGMs)
los vectores de clonación se utilizan para desarrollar cultivos resistentes a plagas. También se
emplean para mejorar características agrícolas.
Investigación Genética
Los vectores son herramientas clave en la investigación genética, permitiendo el estudio de
funciones génicas mediante la clonación de genes específicos en organismos modelo.
La secuenciación del ADN es una técnica que permite determinar el orden exacto de
los nucleótidos en una molécula de ADN. Estos nucleótidos, que incluyen adenina
(A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), son la base del código genético que dirige la
estructura y función de los organismos vivos.
HISTORIA Y ANTECEDENTES
La historia de la secuenciación del ADN comenzó con el descubrimiento de la
estructura del ADN por James Watson y Francis Crick en 1953.
Su modelo de doble hélice reveló cómo las bases nitrogenadas, se emparejan y
cómo se almacena la información genética. Durante la década de 1960, los científicos
intentaron secuenciar moléculas de ARN
más cortas y simples debido a las limitaciones tecnológicas de la época. El ARN es
similar al ADN, pero con algunas diferencias clave en su estructura y función.
Aunque el ADN era más largo y complejo, los avances en la secuenciación de ARN
ribosómico fueron significativos. Los métodos químicos desarrollados en ese momento
permitieron descomponer el ADN en fragmentos, pero eran imprecisos y complicados.
Otros métodos, como la
degradación enzimática, también se probaron, pero no fueron lo suficientemente
efectivos para secuenciar moléculas de ADN largas.
Robert Holley logro descifrar la secuencia completa de un ARN de transferencia
(ARNt) en 1965. Este ARNt constaba de 77 nucleótidos. Aunque este logro fue
significativo, el ARN es más corto y fácil de manejar que el ADN, lo que hacía que la
secuenciación del ADN completo siguiera siendo un desafío.
En 1950, Pehr Edman desarrolló el método de degradación de Edman, que permitía
secuenciar proteínas al identificar los aminoácidos individuales en las cadenas de
proteínas, sentó las bases conceptuales para la secuenciación de biomoléculas en
general. Este método demostró que era posible descifrar la secuencia de biomoléculas
complejas y allanó el camino para los avances posteriores en la secuenciación del
ADN. En la década de 1970, se desarrollaron métodos más avanzados para
secuenciar ADN, como el método de Maxam-Gilbert y el método de Sanger. Estos
métodos permitieron secuenciar moléculas de ADN más largas y con mayor precisión.
El método de Sanger, se convirtió en el estándar para la secuenciación del ADN y se
utilizó durante décadas para secuenciar genomas completos.
MÉTODO DE SANGER
El método de Sanger, conocido también como secuenciación por terminación de
cadena, fue desarrollado por Frederick Sanger y sus colegas en 1977.
Este método se basa en la síntesis de ADN in vitro utilizando una enzima llamada ADN
polimerasa, que es capaz de sintetizar cadenas de ADN complementarias a una
cadena de ADN molde.
La técnica comienza con la preparación de una muestra de ADN que se desea
secuenciar. Este ADN se corta en fragmentos pequeños y se purifica para eliminar
cualquier impureza. Luego, se sintetizan oligonucleótidos, que son cortos fragmentos
de ADN que se unen específicamente a la secuencia de ADN de interés.
A continuación, se realiza una reacción de amplificación utilizando actualmente la
PCR, pero en su momento, otras técnicas que le permitieron obtener cantidades
suficientes de ADN para la secuenciación. Durante esta reacción, se incorporan
dideoxinucleótidos de terminación de cadena
(ddNTPs) en la cadena de ADN en crecimiento. Estos dideoxinucleótidos son análogos
de los nucleótidos naturales, pero carecen de un grupo hidroxilo en el carbono 3', lo
que impide la formación de enlaces fosfodiéster entre ellos.
La incorporación de ddNTPs en la cadena de ADN en crecimiento provoca la
terminación de la síntesis de ADN en puntos específicos. Esto resulta en una serie
de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno de los cuales termina en
un dideoxinucleótido. La longitud de estos fragmentos depende de la posición en la
que se incorporó el dideoxinucleótido.
Luego, se separan los fragmentos de ADN según su longitud utilizando electroforesis
en gel. La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas según su
tamaño y carga eléctrica. En este caso, los fragmentos de ADN se separan según su
longitud.
Finalmente, se visualizan los fragmentos de ADN utilizando un marcador fluorescente
o radioactivo. La secuencia de ADN se puede leer directamente del gel, ya que la
posición de cada fragmento de ADN en el gel corresponde a la posición del
dideoxinucleótido en la cadena de ADN.
Como síntesis, podemos concluir que este proceso consta de varios pasos clave:
- Preparación de la muestra: Se amplifica el ADN de interés, actualmente a
través de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), pero antes de su
aparición, el método de Sanger utilizaba varias técnicas para obtener cantidades
suficientes de ADN para la secuenciación, como la clonación de
bacterias, la amplificación con fagos (virus), purificación de ADN, etc.
- Mezcla de reactivos: Se elabora una mezcla que incluye el ADN molde, una
ADN polimerasa, los cuatro desoxinucleótidos (dNTPs) y una pequeña cantidad de
dideoxinucleótidos (ddNTPs) que están marcados con un colorante fluorescente.
- Extensión y terminación: La ADN polimerasa inicia la síntesis de una nueva
cadena de ADN. Cuando se incorpora un ddNTP, la síntesis se detiene, lo
que genera fragmentos de diferentes longitudes.
- Electroforesis: Los fragmentos se separan por tamaño mediante
electroforesis en gel. Cada fragmento termina con un ddNTP que tiene un
color específico, lo que permite identificar la base final.
- Lectura de la secuencia: A través de un detector, se pueden identificar los
fragmentos y determinar la secuencia de nucleótidos.
SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN (NGS)
El término secuenciación de nueva generación (NGS) hace referencia a las
tecnologías diseñadas para analizar gran cantidad de ADN de forma masiva y
paralela.
En el pasado, los médicos solicitaban la secuenciación de los genes de forma
secuencial, lo que repercutia seriamente en el costo y el tiempo necesario para llegar a
un diagnóstico, cuando, de hecho, era posible hacerlo.
Los equipos de NGS aumentaron en millones de veces la capacidad de análisis del
genoma humano y redujeron el costo y el tiempo de secuenciación.
Desde los años 80 hasta mediados de la década 2000 cuando surgió NGS, el
método Sanger era el más utilizado y consistía en la secuencia fragmentos de ADN
de forma individual, mientras que NGS es una técnica de secuenciación a gran escala
en la que se secuencian simultáneamente millones fragmentos en una sola ejecución.
El ADN de los pacientes que se va a procesar conjuntamente se “marca” con un
identificador propio (“index“) para que sea posible diferenciarlos en la fase de análisis.
Las innovaciones técnicas de NGS también han permitido reducir los
costos de la secuenciación.
Tras la preparación en el laboratorio, la muestra del paciente se somete a la
secuenciación. Los equipos de NGS secuencian la muestra de ADN, generando
millones de fragmentos cortos (llamados reads). Para saber exactamente dónde se
encuentran estas secuencias en el genoma de la muestra analizada, los reads se
comparan con el genoma de referencia construido por el Proyecto Genoma Humano.
Las alteraciones detectadas en la muestra del paciente en relación con el genoma de
referencia se denominan “variantes“.
La enorme cantidad de datos generados por NGS requirió el desarrollo de un área
bautizada como bioinformática. El objetivo de la bioinformática es transformar la
inmensa cantidad de datos generados en la secuenciación en un archivo único y
compacto que contenga la información más relevante para interpretación y análisis
A pesar de sus ventajas, la NGS también tiene varias limitaciones que es importante
considerar.
Limitaciones técnicas
- Error de secuenciación: La NGS no es perfecta y puede cometer errores al
secuenciar el ADN. Estos errores pueden ser debidos a la química de la
reacción de secuenciación, la calidad del ADN o la instrumentación utilizada.
Limitaciones informáticas
- Análisis de datos: La NGS genera grandes cantidades de datos que requieren
análisis informático intensivo. Esto puede ser un desafío para los investigadores sin
experiencia en bioinformática.
- Limitaciones biológicas
- Complejidad del genoma: La NGS puede tener dificultades para secuenciar regiones
del genoma con alta complejidad, como los centrómeros o los telómeros.
- Variación genética: puede tener dificultades para detectar variaciones genéticas raras
o de baja frecuencia.
OTRAS TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN DEL ADN
Illumina: Utiliza secuenciación por síntesis, altamente precisa y común en estudios
genómicos.
- Ion Torrent: Detecta iones liberados durante la incorporación de nucleótidos en el
ADN.
- Secuenciación de nanoporos (Oxford Nanopore): Pasa ADN a través de un poro para
leer su secuencia en tiempo real.
- PacBio (Single Molecule Real-Time, SMRT): Lee moléculas de ADN en tiempo real
sin amplificación previa.
- Secuenciación por ligación: Utiliza ligasas para detectar las secuencias de bases en
fragmentos cortos de ADN.
¿PROYECTO DEL GENOMA HUMANO?
El Proyecto del Genoma Humano, que está relacionado con el ADN y sus
posibilidades de ser estudiado a través de su esquema completo de nucleótidos, es
considerado un gran proyecto que se diseñó para obtener los nucleótidos que forman
las estructuras del ADN humano y esos mismos nucleótidos. en secuencia.
La secuenciación de ADN es el proceso de determinar el orden de los cuatro
nucleótidos que son los “escalones” de la estructura de doble hélice de una molécula
de ADN particular.
El objetivo de la secuenciación de ADN en el contexto del II fue identificar, de manera
precisa, las diferentes estructuras que existían en los varios genomas que constituían
el ADN de un ser humano individual, que era aproximadamente de 3000 millones de
pares de bases. Esta secuencia es vital ya que incluye toda la información genética
necesaria para el ensamblaje y mantenimiento del cuerpo humano.
Aspectos clave sobre el análisis de la secuencia de ADN del pgH:
Secuenciación profunda: El objetivo importante era encontrar la secuencia
completa de ADN del genoma humano y estudiar el papel que juegan los genes en
el crecimiento y funcionamiento del cuerpo humano. A través de la secuenciación de
ADN, los científicos lograron mapear todos los genes del ser humano.
Tecnologías de secuenciación: El proyecto impulsó el desarrollo así como la mejora
de las técnicas de secuenciación. Inicialmente, se emplearon técnicas como la
secuenciación de Sanger. Esta técnica, aunque precisa, era lenta. A medida que
avanzaba el proyecto, se desarrollaron nuevos métodos que eran rápidos y más
eficientes en la secuenciación de grandes cantidades.