Toma de Muestras para Análisis Toxicológico

TOMA DE MUESTRAS PARA
TOXICOLGICO
ANLISIS
1. TIPO DE MUESTRAS
En funcin de las lesiones observadas y la
productos implicados pueden ser
diferentes tipos de muestra, segn se indica en la tabla siguiente.
sospecha de
recomendables
No obstante, para levar a cabo un diagnstico diferencial en caso de no haber una

sospecha clara y descartar/identificar los diferentes txicos puede ser necesario tomar
todas las muestras posibles, de forma general:
Contenido de esfago y estmago: La mayora de los txicos son
de accin rpida y se llegan a encontrar en alta concentracin en el
tracto digestivo superior. Una vez absorbidos, txicos como
organofosforados y carbamatos son rpidamente degradados y
pueden no ser detectables en el hgado. En al caso de observar
materiales extraos como polvo, pasta, microgranulados que se
sospeche que son el txico, se recomienda introducirlo en un pequeo
tubo para que no se mezcle ms con el resto de alimento y sea ms fcil su deteccin.
Hgado: Por ser un rgano que recibe todo lo absorbido por va digestiva es
recomendable su muestreo. En el caso de no haber contenido en el digestivo o si no se
detecta el txico en el digestivo puede ser til analizar el hgado. Algunos txicos de
accin menos rpida, como rodenticidas anticoagulantes, son acumulados y son
principalmente detectados en el hgado. Los metales pesados como el plomo tambin se
acumulan en el hgado y el rin y estn bien definidas las concentraciones en estos
tejidos asociadas con la intoxicacin letal en animales.
Encfalo (no es necesario extraerlo intacto): Como la mayor parte de los productos
usados como veneno actualmente son plaguicidas anticolinestersicos, es recomendable
determinar la actividad de la acetilcolinesterasa cerebral, que estar normalmente muy
inhibida en el caso de exposicin a
carbamatos
u
organofosforados. Esto permite orientar un
anlisis qumico y
al mismo tiempo permite confirmar un
efecto del txico
que se asocia con la muerte del animal
(inhibicin >60%).
Algunos compuestos organoclorados o el
mercurio pueden
ser acumulados en el encfalo a partir de la
biomagnificacin
en la cadena trfica hasta alcanzar
concentraciones
letales.
Otras muestras adecuadas
dependiendo de las circunstancias
son:
Cebos y vmitos: Material sospechoso
encontrado
cerca
del
cadver.
Evidentemente la concentracin suele
ser ms elevada que en los animales y
la deteccin del txico ms probable.
Sangre: Se restringe la posibilidad de muestreo a animales vivos o recin muertos
(corazn), pero es de utilidad para determinar la exposicin al plomo y as poner
rpidamente un tratamiento con quelantes. Para la determinacin de plomo se debe
tomar la sangre en tubos con heparina de litio. La sangre tambin puede ser muestreada
en tubos con citrato sdico como anticoagulante para la realizacin de pruebas de
coagulacin en el caso de intoxicacin por rodenticidas anticoagulantes antagonistas de la
vitamina K. Tambin se puede utilizar para realizar un hemograma. La sangre de color
marrn puede indicar la intoxicacin por nitratos, y en ese caso podemos determinar el
porcentaje de metahemoglobina en sangre si sta se analiza en pocas horas o se
conserva en nitrgeno lquido.
Plasma: Es posible determinar algunos txicos, pero sobre todo puede ser til para
determinar
la
actividad
de
las
colinesterasas
plasmticas por el mismo motivo dado
para el muestreo
de encfalo. Tambin se puede utilizar
para
hacer
un
perfil bioqumico de rutina.
Rin: En caso de intoxicacin por
herbicidas
dipiridilos (paraquat) el txico se
acumula
en
el
rin. En estas intoxicaciones es posible
observar lesiones
pulmonares importantes (congestin, edema). El rin puede ser tambin una muestra
til en el caso de que el cadver haya sido devorado por depredadores y no queden restos
de tracto digestivo u hgado. El cadmio se acumula a lo largo de la vida del animal en el
rin, pudiendo alcanzar concentraciones muy elevadas.
Grasa: No es un tejido que sirva para determinar exposiciones agudas, pero s es til para
monitorizar la exposicin a compuestos lipfilos persistentes, como son los compuestos
organoclorados. Los plaguicidas ms acumulables de esta familia no estn en uso pero
todava son detectables en los animales. Compuestos halogenados como los bifenilos
policlorados, polibromados y otros son altamente persistentes y tambin es necesario

monitorizarlos.
Hueso: El plomo se acumula en hueso a lo largo de la vida del animal, por lo que es una
muestra til para estudios de monitorizacin.
Pelo, plumas y uas: Algunos elementos como mercurio y arsnico pueden acumularse
en estos anexos, indicando una exposicin crnica o incluso exposiciones agudas letales.
Tierra bajo el cadver: En el caso de haberse recogido, siendo de especial inters en
casos de cadveres completamente descompuestos.
2. CONSERVACIN Y ENVO DE LAS MUESTRAS

Las muestras deben estar exentas de contaminacin qumica externa (polvo, pelos, tierra,
etc.), salvo que, lgicamente, esta sea la muestra a enviar o estos elementos formen
parte de la muestra. Las muestras deben ser congeladas a -20C inmediatamente tras su
recoleccin y enviadas manteniendo estas condiciones hasta su llegada al laboratorio. La
nica excepcin a esta regla se da en la muestra de sangre, la cual se mantendr a
temperatura de refrigeracin (aproximadamente +4C), con el fin de poder realizar
pruebas de coagulacin y el hemograma.
Cada muestra debe ir contenida en un recipiente independiente (tipo envase plstico con
rosca o bolsa de plstico con cierre ziploc), debidamente etiquetado con la referencia del
caso y la naturaleza de la muestra. Las bolsas tienen la ventaja de ocupar menos espacio
y poderse precintar fcilmente con una etiqueta autoadhesiva que incluya la informacin
de la muestra (nmero de caso y tipo de muestra).
El conjunto de muestras de un caso debe ir en una bolsa con precinto numerado tipo
brida. Todos los contenedores deben estar hermticamente cerrados, tanto si son bolsas o
envases de plstico. En el caso de muestras en las que se deban determinar niveles traza
de compuestos orgnicos tipo PCBs o plaguicidas podra usarse papel de aluminio para
envolver la muestra antes de su introduccin en el envase.
No se utilizarn conservantes, salvo indicacin expresa del laboratorio. En caso de adicin
de algn conservante deber incluirse en el informe la informacin pertinente y se deber
enviar al laboratorio una muestra de este. Este deber enviarse en un recipiente
independiente y debidamente etiquetado de manera que no exista posibilidad de

confusin con una muestra.
En caso de compuestos voltiles, tales como amonio o intoxicacin por cianuro, se debe
congelar inmediatamente el contenido ruminal, sangre y suero tras la toma, con el fin de
evitar su prdida por volatilizacin. Todos los envases con cada muestra tomada del caso
deben introducirse en un embalaje, el cual ser precintado de manera que se garantice
que cualquier intento de manipulacin de las muestras en l contenidas deje rastros
inequvocos de tal accin.
Este embalaje deber etiquetarse de la misma forma que los envases contenidos y
siempre haciendo referencia al caso y a las actas que lo acompaan. El envo al
laboratorio de las muestras se har en cajas de porexpn o similar, convenientemente
adecuado con suficientes acumuladores de fro como para garantizar que la muestra no
llega totalmente descongelada.
Cajas
Porexpan
Adems, habr de asegurarse el interior con material de embalaje que impida el golpeo y
la apertura de los recipientes durante el transporte. Es recomendable hacer los envos a
principio de semana para evitar que las muestras se queden sin congelar durante el fin de
semana. Es recomendable incluir muestras fijadas para histopatologa con el fin de
confirmar el diagnstico en caso de duda.
3. INFORMACIN ADJUNTA A LAS MUESTRAS

Junto con las muestras se enviar al laboratorio correspondiente un sobre con la solicitud
de anlisis toxicolgico por triplicado (ver Anexo) referido a cada caso, en la que se
detalle:
Especie.
Nmero de animales del caso.
N de caso del centro de recuperacin (nica referencia).
Fecha del hallazgo/muerte.
Localidad: Municipio y provincia.
Hallazgos de campo: Hbitat, tipo de cultivos, ganadera, cotos de caza, torres
elctricas, muerte de otros animales, cronologa de aparicin de casos, datos del
radioseguimiento, tratamientos con fitosanitarios o zoosanitarios
Hallazgos de necropsia, de acuerdo con el informe pericial inicial.

Tipo de muestras remitidas. Para las diferentes muestras de un mismo caso se
recomienda asignar diferentes letras. Por ejemplo, si han muerto tres buitres y se ha
tomado muestra de contenido gstrico e hgado le asignaremos el nmero
CRFS001A/07 al contenido gstrico y CRFS001B/07 al hgado del primer buitre,
CRFS001C/07 y CRFS002D/07 a las muestras del segundo
Sospechas de potenciales compuestos o productos txicos que pudieran estar
implicados, basndose en cualquier informacin disponible. En todo caso, es
conveniente citar el grado de certeza que se tiene de la sospecha.
Fecha de envo.
Responsable del envo (escribir nombre y apellidos, DNI, firma y sello del centro).
Persona que efecta el transporte. En caso de empresa indicacin de la misma y
forma de contacto (telfono, fax o correo electrnico).
Fecha de recepcin.
Responsable de la recepcin (Nombre y apellidos, DNI, firma y sello del centro).
El laboratorio devolver una copia firmada y sellada al remitente (Centro de
Recuperacin). Se anotarn las incidencias relacionadas con el envo (errores de
codificacin, mala conservacin). Se adjunta un formulario (Anexo I) que puede ser
utilizado como referencia.
El personal del Centro de Recuperacin de Fauna Silvestre de La Alfranca enviar
igualmente una copia del informe-solicitud al Coordinador Provincial del Plan de Accin
correspondiente.
4. ANLISIS TOXICOLGICO
Recibidas las muestras, el laboratorio inscribir en un libro de registro de entrada, al
menos la fecha de recepcin de las mismas, remitente, referencia del caso del remitente,
referencia del caso en el laboratorio, muestras remitidas y estado de las mismas as como
consideraciones u observaciones sobre el precintados si es preciso.
4.1.
Uso de biomarcadores
Teniendo en cuenta la historia clnica y los hallazgos de la necropsia, se puede realizar la

determinacin de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa (AChE) cerebral mediante
el mtodo de Ellman (Hill y Fleming 1982). Este biomarcador puede ser de utilidad en
muchos de los casos de envenenamiento por anticolinestersicos, que son la mayora en
la actualidad. Los valores obtenidos se pueden comparar con los obtenidos mediante la
reactivacin in vitro del enzima mediante dilucin de la muestra y con la adicin de 2PAM. Este ensayo puede ser llevado a cabo al inicio del estudio de cada caso con el fin de
orientar el anlisis, o a posteriori para confirmar la muerte por exposicin a un
anticolinestersico (inhibicin >50%) complementando los dems anlisis de laboratorio
para el diagnstico final.
4.2.
Deteccin del txico
En el caso de los cebos y de los contenidos gstricos, se realizar un examen visual de la

muestra para detectar la presencia de formulados granulados u otro signo de presencia
de fitosanitarios. Mediante un mtodo general de extraccin, purificacin y determinacin
se pueden identificar la mayora de los txicos, pero en el caso de que existan evidencias
de txicos concretos, o cuando se han descartado diversas posibilidades, puede ser
necesario llevar a cabo mtodos analticos ms concretos. De forma genrica, y para
garantizar la correcta identificacin del txico, los compuestos orgnicos deben ser
analizados mediante detector de masas acoplado a cromatografa de gases o lquidos.
Cuando esto no pueda ser llevado a cabo por no disponer de esta tcnica analtica se
procurar confirmar el resultado, mediante dos tcnicas analticas distintas. (Aragon)
Determinacin
de
diferentes
tipos
de
sustancias
neurotxicas
(organofosforados, carbamatos, organoclorados, alfacloralosa, barbitricos):
A partir de los cebos o contenidos gstricos se realiza una extraccin con diclorometano
que, dependiendo del tipo de muestra, se puede analizar sin ms purificacin tras
evaporar mediante rotavapor o flujo de nitrgeno y resuspender en 0,5 ml de acetato de
etilo. En el caso del hgado u otro tejido parenquimatoso se homogeniza el tejido con
sulfato sdico anhidro y se extrae de la misma forma que el contenido gstrico con
diclorometano. En los extractos obtenidos que requieran una purificacin previa, esta se
puede llevar a cabo mediante cromatografa de permeacin en gel a travs de una fase
de Bio-Beads S-X3 (Bio- Rad) con acetato de etilo y ciclohexano (1:1) como fase mvil. De
forma alternativa, y si se tiene algn indicio del tipo de txico que se busca, es posible
utilizar columnas preparativas de extraccin en fase slida (SPE). En algunos casos, el
extracto obtenido mediante la GPC tambin debe ser purificado adicionalmente mediante
tcnicas alternativas (ej.: SPE, Quechers, etc) antes de llevar a cabo su anlisis. Los
extractos purificados de cada muestra se pueden analizar mediante cromatografas de
lquidos y gases, pero siempre deberan confirmarse los resultados mediante
espectrometra de masas, tanto por comparacin de espectros de patrones o con las
bases de datos comerciales. Algunas tcnicas menos especficas y sensibles, como
cromatografa en capa fina pueden ser de utilidad para hacer un primer estudio de las
muestras, en especial para el anlisis rpido de microgrnulos y muestras con alta
concentracin de txico.
Determinacin de estricnina: Aunque puede ser detectable con el mismo
procedimiento descrito en el apartado anterior, es recomendable llevar a cabo una
extraccin ms especfica con diclorometano y con una posterior purificacin mediante
extraccin liquido-lquido. Los extractos obtenidos se analizaran como en el apartado
anterior.
Rodenticidas anticoagulantes: El hgado o el cebo se homogeniza con sulfato sdico

anhidro, se extrae con diclorometano u otras mezclas de solventes, se realiza una
purificacin mediante SPE (puede variar en funcin del tipo rodenticidas a analizar,
indandiona o cumarina) y finalmente se analiza por cromatografa de lquidos acoplada a
espectrometra de masas.
Metales y metaloides: Se realiza una digestin de la muestra liofilizada de cebo o hgado
con cido ntrico y perxido de hidrgeno (u otras mezclas de cidos) en microondas o en
tubos de vidrio (o cuarzo) abiertos y se analiza por tcnicas especficas (espectrometra
de absorcin atmica, ICP, voltamperometra).
BIBLIOGRAFA
Aragon, G. d. (s.f.). Plan de Accin para la erradicacin del uso ilegal de venenos en el
medio natural en Aragn. Obtenido de
http://www.aragon.es/estaticos/GobiernoAragon/Departamentos/AgriculturaGanaderi
aMedioAmbiente/MedioAmbiente/Areas/02_Biodiversidad/VENENOS/PROTOCOLO_AN
ATOMO_PATOLOGICO_FORENSE.pdf

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policlorados, polibromados y otros son altamente persistentes y tambin es necesario

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