Modelo Predictivo

de la Descomposicin por
los hongos Aspergillus niger y Penicillium
spinulosum de Bebidas Envasadas en Fro
Listas para Beber
Alyce Stiles Battey, Siobain Duffy y Donald W. Schaffner

Las bebidas listas para beber son

susceptibles al desarrollo microbiano.
Quienes formulan bebidas listas para beber
pueden utilizar modelos para predecir el
desarrollo de hongos en ellas y acelerar el
desarrollo de nuevos productos.

Introduccin

as bebidas listas para beber tienen una actividad acuosa

elevada (Aw) que permite el desarrollo microbiano.
La combinacin de barreras, como el pH, contenido
de azcar y conservadores qumicos, previenen el desarrollo
de la mayora de los organismos en bebidas listas para beber
(Leistner, 1995). Aspergillus niger y Penicillium spinulosum
son altamente resistentes a conservadores qumicos como
los cidos ascrbico o benzoico, y pueden tolerar ambientes tanto de acidez alta como de baja actividad acuosa (Aw)
(Banwart 1979, De Boer y Nielsen 1995).
Los modelos predictivos validados pueden proporcionar
informacin rpida sobre la estabilidad microbiana del producto, que pueden reducir en tiempo y esfuerzo necesarios para estudios de este tipo.
El campo de la microbiologa predictiva se ha enfocado
en crear ecuaciones de regresin polinomial para modelar el
crecimiento de patgenos en alimentos.
Esta investigacin desarroll un modelo predictivo para un
sistema de bebidas envasadas en fro y listas para beber con el
fin de ayudar al desarrollo de productos. El modelo obtenido

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determinar qu factores tienen mayor influencia en el crecimiento de hongos descomponedores. El modelo se puede
usar para comparar formulaciones (Whiting y Buchanan 1997)
e identificar alternativas con estabilidad similar o mejorada
(Cole et al. 1987, Whiting 1995).

Materiales y Mtodos
Preparacin de Mezclas y Microorganismos
Se obtuvieron esporas aisladas de A. niger y P. spinulosum
del Departamento de Microbiologa de Kraft Foods, Inc.,
Tarrytown, Nueva York, EUA. Los microorganismos se contaron en placa por 1.0 ml de una dilucin decimal en agar
extracto de malta (AEM) (Oxoid Ltd., Basingstoke,
Hampshire, UK) y se incubaron a 25C por 5 das.

Diseo Experimental
Se cre un diseo Box-Behnken con cinco variables a
tres niveles utilizando un software JMP (SAS Institute,
Cary, NC). Se usaron dos puntos al centro del diseo, para
un total de 42 experimentos. Las variables y niveles fueron
pH (2.8, 3.3 y 3.8), acidez titulable (0.20%, 0.40%, y
0.60%), contenido de azcar (8.0, 12.0, y 16.0 grados

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Brix), benzoato de sodio [100, 225, Y 350 ppm (w/v)], y

sorbato de potasio [100, 225, y 350 ppm (w/v)].
Preparacin de Bebidas
Las bebidas se prepararon con botellas de agua (Poland
Springs, Poland, Maine, EUA), jarabe de maz alto en
fructosa (HFCS 42) (Cargill, Edyville, Indiana, EUA), cido
ctrico granular (Cargill), sorbato de potasio (pKa = 4.76)
(Sorbistat-K, Cultor Food Science Inc., Ardsley, Nueva York,
EUA) y benzoato de sodio (pKa=4.18) (Cultor). Se obtuvieron los niveles de pH deseados amortiguando las bebidas
con citrato de potasio (Cultor). Los tubos simularon las condiciones de bebidas envasadas y selladas.
Mtodos Experimentales
Se inocularon muestras duplicadas con la mezcla de hongos (100l 50ml-1) e inmediatamente se sembraron en medio AEM (agar extracto de malta). Las muestras inoculadas
se almacenaron a 25C y se analizaron despus de 1, 2, 4, 6
y 8 semanas, utilizando el mismo tubo cada vez.

Tecnologa

Desarrollo del Modelo

A. niger ni P. spinulosum no crecieron en las muestras a

un pH de 2.8. A un pH de 3.3, los hongos crecieron cuando el total de la concentracin del conservador fue de 325
ppm o menos (un conservador a 100 ppm, y otro a 100 o
225 ppm), a pesar de la acidez titulable o de los grados Brix.
Esto tambin ocurri a un pH de 3.8, en donde los hongos
crecieron en muestras con 325 ppm o menos de los conservadores combinados. No se observ crecimiento de hongos en
ninguna otra combinacin de conservadores a pH 3.3 o 3.8.
Modelo Logstico Simplificado
Se gener un modelo completo de regresin logstica
del segundo orden utilizando trminos lineales, cuadrticos
y de interaccin con el tiempo y tiempo2. La prediccin del
modelo fue de 99.2% de concordancia con los datos.
Se encontr que las 5 variables fueron significativas para
predecir el crecimiento de A. niger y P. spinulosum. Este
modelo simplificado tuvo el 99% de concordancia con los
datos experimentales, y tuvo un coeficiente de determinacin (R2) de 0.814:

Las cuentas en placa se transformaron en respuestas de

crecimiento de moho positivas o negativas durante 1, 2, 4,
6 y 8 semanas; en donde una respuesta de 1 significaba
que se detect el crecimiento de hongos y 0 significaba
que no se observaron colonias. Se realiz un anlisis de
regresin logstica de los datos utilizando el software JMP.

logit (P) =

La ecuacin completa para el modelo de logstica en

segundo grado en donde se incluyen trminos lineales y
cuadrticos del tiempo es:

donde P es la probabilidad de crecimiento, PS es la concentracin de sorbato de potasio, AT es la acidez titulable y SB es la

concentracin de benzoato de sodio.

en donde P es la probabilidad de no crecimiento, son los

parmetros estimados para cada trmino, y Xs representa
las cinco variables individuales en el modelo.
Se utiliz regresin por pasos hacia atrs para desarrollar
un modelo simplificado y predecir el crecimiento detectable
de hongos.

Resultados
Los hongos crecieron en trece condiciones de las bebidas. Las muestras duplicadas mostraron la misma respuesta
de crecimiento en cada caso.

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130.367597 + 6.34482382 (Tiempo)

0.5499497(Tiempo2) 50.809871(pH)
- 100.73612 (AT) 3.9819013 (grados Brix)
0.1155358 (PS) + 0.03875187 (SB)
+ 31.6499345 (pH * AT) + 1.3004905
( pH * grados Brix) + 0.04898558(pH * PS) (2)

Varios trminos de interaccin fueron estadsticamente significativos. Conforme el pH aumenta, la AT se vuelve ms importante para controlar el desarrollo de hongos
descomponedores, tal como se observa en la Fig.1. Existe
una relacin sinergstica similar entre el pH y el sorbato de
potasio que se muestra en la Fig. 2. La misma concentracin
de sorbato de potasio (225ppm) que mantiene la probabilidad
de crecimiento de hongos abajo del 5% a pH 3.2; no es efectivo a pH 3.8, donde la probabilidad de crecimiento es cercana
al 90%. La acidez titulable, concentracin de azcar y de
sorbato de potasio fueron mucho ms efectivos para inhibir el
crecimiento de hongos a valores bajos de pH, en donde elevar
las concentraciones de stos no disminuy significativamente
la probabilidad de crecimiento de Aspergillus y Penicillium en
bebidas listas para beber. La eficacia de ambos conservadores
a pH 3.3 se muestran en la Fig. 3. Se requieren bajas concentraciones de sorbato de potasio para alcanzar la misma probabilidad de crecimiento de hongos que el benzoato de sodio,

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indicando que en este estudio el cido srbico inhibe ms que

el cido benzoico.

Discusin
Explicacin de los parmetros e interacciones en el modelo
simplificado
Se encontr que el pH de las bebidas tiene un efecto
importante en el crecimiento de hongos. A valores bajos
de pH, se piensa que el cido ctrico sin disociar permea la
pared celular alterando el pH interno de los microorganismos,
causando la desnaturalizacin e inactivacin de las enzimas
(Brown y Booth 1991).

Figura 1. El efecto de la acidez titulable (TA) y pH sobre

la probabilidad de crecimiento de Aspergillus niger y
Penicillium spinulosum en un modelo para bebidas listas
para tomarse con 12 grados Brix, 225 ppm de benzoato
de sodio, y 225 ppm de sorbato de potasio.

Tecnologa

La acidez titulable de los modelos para bebidas tienen

un efecto significativo (P = 0.0004) en el crecimiento de
hongos descomponedores; conforme la acidez titulable en
la bebida aumentaba, la probabilidad de crecimiento disminua un poco. Esto se puede deber a las propiedades
quelantes del cido ctrico y citrato de potasio (Davidson
1997, Young y Foegeding 1993).
Las propiedades quelantes del cido ctrico son ms efectivas cuando el pH (y niveles correspondientes de citrato
de potasio) de la bebida son ms altos (Praphailong y Flete
1997), como se muestra en los resultados a un pH 3.8 (Fig
1). Estos resultados muestran que la acidez titulable es
ms importante para la formulacin de bebidas listas para
tomarse a niveles ms altos de pH (3.8), y menos importante a niveles bajos de pH (2.8).

Figura 2. La influencia del pH y sorbato de potasio en la

probabilidad de crecimiento de Aspergillus niger y
Penicillium spinulosum en un modelo para bebidas listas
para beber con una concentracin de 225 ppm de benzoato
de sodio, 0.4% de acidez titulable, y 12 grados Brix.

Los grados Brix de las bebidas tambin tienen un efecto

en el crecimiento de hongos. Conforme el contenido de
azcar aumenta, es menos probable el crecimiento de stos. Esto es consistente con Gibson et al. (1994) quien
observ la dependencia del crecimiento de hongos con la
actividad del agua (Aw).
El sorbato de potasio tuvo un impacto importante en el
crecimiento de hongos (P = 0.0173). Niveles ms altos de
sorbato de potasio disminuye la probabilidad del crecimiento de hongos. El cido srbico inhibi ambos hongos
Aspergillus niger y Penicillium spinulosum (Davidson 1997).
El benzoato de sodio tambin tiene un impacto inhibitorio importante en el crecimiento de hongos (P<0.0001).
Los resultados indican, sin embargo, que el sorbato de potasio
es ms efectivo para inhibir el crecimiento de hongos que el
benzoato de sodio (Fig. 3).
Existe una pequea, pero significante interaccin entre
el pH y el sorbato de potasio (P=0.0014), pero no existe
tal interaccin entre el pH y el benzoato de sodio. Esto

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enfatiza la eficacia del sorbato de potasio en la inhibicin de

Aspergillus y Penicillium cuando se compara al benzoato de
sodio, y tambin la importancia de la concentracin del
sorbato de potasio a valores altos de pH, cuando el pH por
si mismo no es capaz de controlar el crecimiento de hongos
descomponedores.
Los cidos orgnicos, como el cido srbico y el cido
benzoico, son ms efectivos para inhibir microorganismos
en sus formas no disociadas, las cuales aumentan su concentracin conforme el pH disminuye (Davidson 1997). Disminuir el pH de las bebidas, por tanto, permite a quienes las

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Figura 3. El efecto del sorbato de potasio y benzoato de

sodio en la probabilidad de crecimiento de Aspergillus
niger y Penicillium spinulosum en un modelo para bebidas listas para beber a pH 3.3, 0.25% de acidez titulable,
y 12 grados Brix.

(Praphailong y Flete 1997). Esto concuerda con la bien

documentada correlacin del pH y los efectos antimicrobianos
del cido srbico y cido benzoico (Lueck 1980, Sofos y
Busta 1993).
La interaccin entre el pH y grados Brix fue tambin
importante en el modelo (P = 0.0020). En varios estudios,
el pH ha mostrado ser ms efectivo para inhibir el crecimiento a concentraciones ms altas de soluto (Baird-Parker y
kooiman 1980, Brown y Booth 1991).
Implicaciones
El crecimiento de hongos causa descomposicin en las
bebidas, lo cual puede ser detectado por el consumidor debido a la presencia de sabores no deseados o crecimiento visible.

desarrollan utilizar menos sorbato de potasio y/o benzoato

de sodio para alcanzar la misma probabilidad de crecimiento
de hongos en el producto terminado.
En cambio, aumentar los niveles de conservadores proporciona estabilidad microbiana a mayores niveles de pH

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Se encontr que el pH, la acidez titulable, el contenido de

azcar, niveles de sorbato de potasio y benzoato de sodio tienen un impacto en el crecimiento de hongos en bebidas listas
para tomarse. Cada una de estas variables se pueden ajustar
para equilibrar la estabilidad microbiana con otros atributos de
calidad (Baird-Parker y Kooiman 1980); mientras que el pH
tiene un impacto inhibitorio muy relevante en el crecimiento
de hongos descomponedores, existen dificultades asociadas
con la formulacin aceptable de bebidas a niveles de pH muy

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bajos. El contenido de azcar de las bebidas se puede equilibrar con la acidez titulable para alcanzar las relaciones Brix/acidez deseadas, pero el impacto microbiano de la acidez titulable
y grados Brix de las bebidas se debe considerar cuando se
formulan bebidas listas para beber.

Tecnologa

En este estudio aparentemente el sorbato de potasio

fue ms efectivo que el benzoato de sodio para controlar
Aspergillus y Penicillium. Esto puede ser una ventaja para
quienes desarrollan productos y que aprovechan las diferencias entre los conservadores. El sorbato de potasio tiende a ser ms costoso que el benzoato de sodio (De Boer y
Nielsen 1995) y es ms propenso a la oxidacin y degradacin (Sofos 1989), pero no deja el regusto a quemado
asociado con el cido benzoico (De Boer y Nielsen 1995).
Se han desarrollado otros modelos para predecir el crecimiento de bacterias descomponedoras ( Acinetobacter
calcoaceticuas y Gluconobacter oxidans) (Battey y Schaffner
2001) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Candida lipoytica,
y Zygosaccharomyces bailii) (Battey 1999, Battey et al. 2001)
en bebidas envasadas en fro y listas para beber, y todos estos
modelos se pueden tomar en consideracin cuando se formulan bebidas microbiolgicamente estables.
Los formuladores de bebidas pueden evaluar qu organismo posee el mayor riesgo de descomposicin en sus productos y seleccionar un modelo apropiado para guiar el desarrollo del producto o puede combinar uno o ms de estos
modelos para crear una bebida ms estable.
Claramente un pH bajo y mayor concentracin de conservadores produce la inhibicin de toda la microflora
descomponedora evaluada, y estos factores pueden servir
de gua para futuras formulaciones de bebidas.
Este modelo debe aumentar la productividad reduciendo la necesidad de procedimientos de anlisis microbiolgicos,
aunque un modelo predictivo nunca es un sustituto de los
anlisis y de la experiencia de un microbilogo capacitado
(Ross y McMeekin 1994).

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