En el presente trabajo se evaluó el efecto de la temperatura, pH y el uso de inhibidores en la actividad catalítica de la enzima alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón de maíz. Las temperaturas empleadas fueron ambiente, 37°C y 50°C a pH 7, mientras que los pH variaron de 4 a 8. Para los inhibidores se utilizó peróxido de hidrogeno en concentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 a 37°C. Las pruebas mostraron que las condiciones ópt
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En el presente trabajo se evaluó el efecto de la temperatura, pH y el uso de inhibidores en la actividad catalítica de la enzima alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón de maíz. Las temperaturas empleadas fueron ambiente, 37°C y 50°C a pH 7, mientras que los pH variaron de 4 a 8. Para los inhibidores se utilizó peróxido de hidrogeno en concentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 a 37°C. Las pruebas mostraron que las condiciones ópt
En el presente trabajo se evaluó el efecto de la temperatura, pH y el uso de inhibidores en la actividad catalítica de la enzima alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón de maíz. Las temperaturas empleadas fueron ambiente, 37°C y 50°C a pH 7, mientras que los pH variaron de 4 a 8. Para los inhibidores se utilizó peróxido de hidrogeno en concentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 a 37°C. Las pruebas mostraron que las condiciones ópt
En el presente trabajo se evaluó el efecto de la temperatura, pH y el uso de inhibidores en la actividad catalítica de la enzima alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón de maíz. Las temperaturas empleadas fueron ambiente, 37°C y 50°C a pH 7, mientras que los pH variaron de 4 a 8. Para los inhibidores se utilizó peróxido de hidrogeno en concentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 a 37°C. Las pruebas mostraron que las condiciones ópt
RESUMEN En el presente trabajo se evaluó el efecto de la temperatura, pH y el uso de inhibidores en la actividad catalítica de la enzima alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón de maíz, las temperaturas empleadas fueron: ambiente, 37°C y 50°C a pH de 7 mientras que para el análisis de pH se utilizó una temperatura constante de 37°C variando los pH de 4 a 8 por otra parte para los inhibidores se utilizó una solución de peróxido de hidrogeno a concentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 a una temperatura constante de 37°C adicionalmente se hicieron pruebas de azúcares reductores utilizando DNS, posteriormente se realizaron pruebas de absorbancia que nos ayudaron a determinar que las condiciones óptimas de esta enzima está cerca de los 37°c y a un pH de 6.
INTRODUCCIÓN En las enzimas su actividad tanto enzimática como catalítica se ve afectada por diferentes factores que deben ser optimizados y controlados para obtener resultados coherentes y reproducibles, entre estos factores se encuentra: la temperatura, presión, pH, fuerza iónica, concentración de sustratos y la presencia de inhibidores (Koolman y Rohm, 2005).
Las enzimas poseen diferentes pH óptimo; hay enzimas animales que realizan su actividad máxima a un pH de 7 que es el pH habitual de la células, pero hay otras como las proteinasas por ejemplo la pepsina que trabajan a condiciones idóneas a un pH de 2 en el ácido estomacal sin olvidar las enzimas que trabajan a un pH óptimo básico superiores a 9.Los cambios en la actividad enzimática por pH se debe a las interacciones existentes entre los residuos de aminoácidos de los centros activos de las enzimas o de los sustratos con los componentes ionizables del medio alterando su conformación y estructura(Whitaker, 2003). Con respecto a temperaturas la actividad enzimática cambia ya que cuando hay un aumento de temperatura se incrementa la
Página 1 de 8 actividad enzimática al inicio sin embargo a medida que pasa el tiempo la actividad va decreciendo por desnaturalización (Koolman y Rohm, 2005).
La interferencia de inhibidores en la actividad enzimática es de gran relevancia ya que
estas se unen a la enzima evitando la formación del complejo enzima sustrato o bloqueando la reacción que lleva la formación del producto. Un inhibidor es básicamente una molécula que se une con la enzima reversible o irreversiblemente ya sea por la unión covalente o no covalente de esta molécula a la enzima, en las reacciones biológicas mayormente se encuentran inhibiciones reversibles ya que es la misma fuerza no covalente con la que se enlazan los sustratos y productos (Horton, 2008).
El objetivo de esta práctica es analizar la influencia de la temperatura, pH y el uso de
inhibidores en la actividad catalítica de la alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón de maíz en cierto tiempo (Coello, 2018).
MATERIALES Y MÉTODOS
Este experimento se realizó siguiendo la metodología descrita en la guía de laboratorio
de Fermentación y Enzimología Alimentaria, práctica 5. El ensayo de efecto de la temperatura en la velocidad enzimática solo se realizó a temperatura ambiente y a 37°C.
La muestra utilizada fue: almidón; y la enzima α-amilasa.
RESULTADOS
Tabla 1. Absorbancia a 540nm del micro placa usada para las soluciones de glucosa.
Tabla 2. Absorbancia a 540nm de las diferentes soluciones de glucosa.
Tabla 3. Absorbancia a 540nm del micro placa usada para las soluciones de glucosa diluida
Página 2 de 8 Tabla 4. Absorbancia a 540nm de las diferentes soluciones de glucosa diluida
Tabla 5. Tabla de concentraciones de glucosa y absorbancia promedio
Tabla 6. Valores de la concentración de glucosa vs absorbancia
Grafica 1. Curva de calibración
EFECTO DE INHIBIDORES Tabla 7. Valores de absorbancia de inhibidor
Página 3 de 8 EFECTO DE LA TEMPERATURA Tabla 8. Valores de absorbancia media de temperaturas
Tabla 9. Velocidad de reacción
Preguntas
Según el rango de temperatura y pH para la actividad de la enzima ¿Cuál cree
usted sería su origen?
Las α-amilasas tienen uno o dos iones de Ca 2+ intrínsecos, cerca del centro activo formado por los dos dominios, A y B. El Ca 2+ es necesario para el plegamiento y la estabilidad de la enzima; los sitios de unión al calcio secundarios son responsables de la estabilización de la enzima contra la desnaturalización térmica y del surfactante (Sivaramakrishnan et al., 2006). El efecto del pH en la enzima se debe a la concentración de iones de hidronio del medio, esto influye en la estructura tridimesional de la enzima y en la afinidad de la enzima al sustrato (Badui, 2006). Los valores de pH suelen estar entre 6 y 8, y están
Página 4 de 8 asociados con las propiedades específicas de la preparación enzimática (Yankov et al., 1986).
¿Qué otra sustancia puede actuar como inhibidor para la alfa-amilasa?
Se pueden utilizar como inhibidores glicoproteínas con bajo peso molecular que se encuentran en semillas de leguminosas y gramíneas por ejemplo, la phaseolamin un inhibidor proveniente del fríjol riñón (Phaseolus vulgaris); también los polifenoles encontrados en fresas tienen efecto inhibidor. (Padilla et al., 2006).
¿Qué espera observar en las curvas de temperatura, pH y concentración de
inhibidor si se continúan aumentando o disminuyendo los valores en el eje de las X? Explique.
Özbek & Yüceer (2001) indican que en las curvas de temperatura cuando se aumenten los valores de pH habrá menor actividad enzimática y un menor grado de hidrolisis, también pasará lo mismo para la curva de temperatura. Al disminuir los valores de pH en la curva se encontrará como pH óptimo 6.5 para la enzima; y en la curva de temperatura la óptima llegaría a 55 °C. En las curvas de inhibidor cuando se aumenten los valores del eje x, la actividad enzimática disminuirá.
¿Cuál es el principio del método colorimétrico con DNS para la medición de
azúcares reductores?
El principio del método se basa en la disminución del valor en la tinción del complejo azul de almidón-yodo (Xiao et al., 2006). El ácido dinitrosalicico (DNS), se utiliza para determinar azúcares reductores, está compuesto por ácido dinitrosalicílico, sal de Rochelle, fenol, bisulfito de sodio e hidróxido de sodio. La sal de Rochelle se introduce para evitar que el reactivo disuelva el oxígeno; el fenol, para aumentar la cantidad de color producido y para equilibrar el efecto del fenol encontrado en la muestra; el bisulfito, para estabilizar el color obtenido en presencia del fenol; y el álcali para que el DNS tenga una acción reductora sobre la glucosa (Miller, 1959).
CONCLUSIONES Una de las enzimas usadas para la ruptura de los enlaces glucosídicos del almidón, es la α-amilasa, siendo esta la más usada en la industria de alimentos en cuanto a la obtención de azúcares reductores, en la que posee propiedades muy favorables; como estabilidad térmica, alto grado de especificidad en su punto de unión, estabilidad enzimática gracias al cofactor de Ca. Los factores que influyen en la velocidad de reacción de la enzima para generar productos es la Temperatura y pH. Se determinó que presenta una temperatura optima correspondió a la del ambiente (25ºC) ya que se puede observar el nivel de absorbancias es el más alto, debido a que disperso menos
Página 5 de 8 luz. La desactivación de la enzima α-amilasa se dio en temperatura superiores a 37ºC. El pH optimo que influye que la enzima pueda degradar al carbohidrato es 6. La velocidad de reacción sin inhibidor es de 0.011 (g/l )/min y con inhibidor fue de 0.008 (g/l )/min.
RECOMENDACIONES
En esta práctica se recomienda tomar las precauciones necesarias para evitar la
pérdida de muestras cuando se realiza el baño maría, usando papel parafilm de manera muy ajustada debido a que al aumentar la temperatura aumenta también la presión en los tubos eppendorf y por ende perdida de muestra, ocasionando que pueda dar una lectura errónea en el espectrofotómetro.
BIBLIOGRAFÍA
Badui, S. (2006). Química de los alimentos. México D.F, México: PEARSON
EDUCACIÓN.
Coello, D. (2018). Guía Práctica de Curso - Laboratorio de Fermentación y
Enzimología Alimentaria. Guayaquill: ESPOL.
Horton, H., Morán, L., Scrimgeur, K., Perry, Marc. & Rawn, J. (2008). Principios de bioquimica. México S.A, México: PEARSON EDUCACIÓN.
Koolman, J. & Rohm, K.(2005).Bioquimica texto y atlas. Madrid, Madrid: MÉDICA
PANAMERICANA.
Miller, G. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Analytical Chemistry, 31, 426–428.
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Sivaramakrishnan, S., Gangadharan, D., Nampoothiri, K., Soccol, C. & Pandey, A.
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Yankov, D., Dobreva, E., Beschkov, V. & Emanuilova, E. (1986). Study of optimum conditions and kinetics of starch hydrolysis by means of thermostable α- amylase. Enzyme and Microbial Technology, 8(11), 665-667.
