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OFICINA ESPANOLA
DE
PATENTES Y MARCAS

19

k
kInt. Cl. : A61K 31/19

11 N
umero de publicacion:

2 137 963

51

ESPANA

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

12

kNumero de solicitud europea: 93115509.7

kFecha de presentacion : 06.10.1990
kNumero de publicacion de la solicitud: 0 582 318
kFecha de publicacion de la solicitud: 09.02.1994

T3

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54 Ttulo: Utilizaci
on del
acido carn
osico por sus propiedades anticarcin
ogenas y antivricas.

73 Titular/es:

SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A.

Case Postale 353
1800 Vevey, CH

72 Inventor/es: Aeschbach, Robert y

74 Agente: Isern Jara, Jorge

45 Fecha de la publicaci
on de la mencion BOPI:

01.01.2000

45 Fecha de la publicaci
on del folleto de patente:

ES 2 137 963 T3

01.01.2000

Aviso:

Philippossian, Georges

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacion en el Boletn europeo de patentes,
de la mencion de concesion de la patente europea, cualquier persona podra oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicion debera formularse por escrito y estar
motivada; solo se considerara como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposici
on (art 99.1 del Convenio sobre concesion de Patentes Europeas).
Venta de fasc
culos: Oficina Espa
nola de Patentes y Marcas. C/Panam
a, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCION
Utilizacion del acido carn
osico por sus propiedades anticarcin
ogenas y antivricas.
5

La presente invencion, se refiere a la utilizacion del acido carn

osico por sus propiedades anticarcinogenas y antivricas.
El acido carn
osico, es un diterpeno fen
olico que responde a la f
ormula bruta C2O H28 O4 , y que posee
la estructura I

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I
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Este
es un constituyente propio de las especies Salvia y Rosmarinus, en donde este se encuentra localizado principalmente en las hojas. Se encontr
o por primera vez por parte de Linde en Salvia officinalis
[Helv. Chim. Acta 47, 1234 (1962)], y por parte de Wenkert y colegas en Rosmarinus officinalis [J. Org.
Chem. 30, 2931 (1965)]. Posteriormente, se identific
o positivamente en otras diversas especies de salvias,
como por ejemplo en la Salvia canariensis [Sabona y Bruno, J. Nat. Prod. 46, 594 (1983)] o Salvia
willeana [de la Torre y colegas,. Phytochemistry 29, 668 (1990). Se encuentra tambien presente en la
Salvia triloba y en la Salvia sclarea.
El acido carn
osico es un antioxidante potente (Brieskorn y D
omling, Z. Lebensm. Unters. Forsch.
141, 10 (1.969) y, seg
un una serie de trabajos rusos, en donde este tiene el nombre de salvina, un antibi
otico contra Stapphylococcus aureus [CA 86, 117603r; 90, 49011b; 97, 67513r, 69163a, 69164b; 104,
221930w; 111, 130594t) y contra ciertos microorganismos responsables de la caries de los dientes y del
mal aliento [CA 97, 84835q]. El arte anterior de la tecnica, lo cita a proposito de esta u
ltima propiedad
para la preparaci
on de dentfricos y de aguas para los cuidados de la boca [JP 59103665, Lion Corp.].
A pesar de esta abundancia de referencias citadas, el aislamiento a escala preparativa del acido
carnosico a partir del romero o de la salvia, no ha sido jam
as descrito, ni por parte de Linde ni tampoco
por parte de Wenkert, en donde su existencia se prueba de forma indirecta, ni tampoco por parte de los
que la han identificado posteriormente en diversas especies de salvia.
Contrariamente a ello, se han aislado muchos otros diterpenos fen
olicos de estructura vecina a la del
acido carn
osico, de la una y/o de la otra de entre las dos especies de Salvia y de Rosmarinus: De entre
ellas, debe mencionarse el carnosol, [Brieskorn y colegas, Chem. Ber. 95, 3034 (1.962); J. Org. Chem.
29, 2293 (1.964)], y m
as recientemente el rosmanol [Inatani y colegas, Agric. Biol. Chem. 46, 1.661,
(1982)] o el rosmaridifenol [Houlihan y colegas, J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 1036 (1984), habiendose
estos dos u
ltimos patentado como nuevos principios antioxidantes del romero [USP 4450 097, Nakatani
y colegas, Lion Corp., Tokio; USP 4638095, Chang y colegas, Research Corp. N.Y].
Si bien todos estos componentes son dignos de interes como antioxidantes, resulta nada menos que,
comparados al acido carn
osico, estos presentan ciertos aspectos poco favorables: su contenido en el romero o en la salvia es muy inferior al del acido carn
osico.
Se conocen igualmente compuetos fen
olicos que tienen una actividad antioxidante. El artculo de
Journal of Farmaceutical Science, Vol 69, n 12, Diciembre de 1.980, paginas 1455-1457, menciona la
utilizacion como agentes anticancergenos del hidroxianisol butilado y del hidroxitolueno butilado. La
aginas 91-.94, menrevista especializada Journal of Infeccitions Desease, Vol. 138, N 1, Julio de 1978, p
ciona la utilizacion de hidroxitolueno butilado para tratamientos vricos. La patente europea EP 0269545,
menciona la utilizaci
on de la vitamina E para el tratamiento del c
ancer. El artculo de Vestn. Oftalmol.
aginas 65-68, menciona la utilizaci
on del alfa-tocoferol para el tratamiento del
Vol. 104, n 4, 1.988, p
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herpes.

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Las hojas secas del romero o de la salvia (especie de Salvia officinalis), contiene entre el 1,5 y el 2,5 %
de acido carn
osico y u
nicamente aproximadamente 0,3-0,4 % de carnosol. El rosmanol y el rosmaridifenol,
de encuentran presentes en concentraciones indetectables. Desde el punto de vista de la economa de un
procedimiento de obtenci
on, el acido carn
osico presenta por lo tanto una ventaja indiscutible. Seg
un las
indicaciones proporcionadas en la patente estadounidense US 4450097, por ejemplo, se puede calcular
que el rendimiento en rosmanol aislado a partir del romero, es de u
nicamente el 0,01 %.
Tal y como se ha mostrado por parte de Wencker y colegas, el carnosol es un ente oxidante del acido
carnosico. Esta oxidaci
on, tiene lugar en presencia de oxgeno, tanto despues de la recoleccion del romero
o de la salvia, en las hojas que se dejan secar en el aire (se puede adem
as mostrar que las hojas frescas
cortadas del romero no contienen carnosol), como tambien en el momento en que las hojas se someten
a operaciones de extraccion con los disolventes, o que los extractos en s mismos se someten a operaciones clasicas de fraccionamiento, de enriquecimiento y de purificaci
on. Cabe francamente pensar que,
el rosmanol, que se ha identificado en una fracci
on del romero sometido a un tratamiento alcalino, es
tambien un producto ulterior de la oxidacion del acido carn
osico, tal y como Wenker y colegas sugeran
ya , y tal y como se podra tambien suponer, del rosmaridifenol. El acido carn
osico, es por lo tanto el
u
nico diterpeno fen
olico presente en estado nativo en el romero y la salvia y, con justa razon, tiene el
u
nicamente el derecho a la denominacion del producto natural.
Ciertas vas de obtencion del acido carn
osico mediante sntesis qumica, han sido tambien propuestas
en la bibliografa especializada, por parte de W.L. Meyer y colegas, [Tetrahedron Letters 1.966, 4261;
1.968, 2.963; J. Org. Chem. 41, 1.005 (1.976)]. Mientras tanto, se trata de varias vas de sntesis largas
y complejas, inaplicables por razones economicas a un procedimiento industrial. Adem
as de ello, estas
sntesis conducen a mezclas racemicas de precursores del acido carn
osico y no a los enantiomeros puros.
Debe tambien mencionarse el hecho de que, estos trabajos, se paran con la preparacion de precursores
del acido carn
osico y omiten el describir el entorno de las etapas finales de preparaci
on. Otro modo
de obtenci
on del acido carn
osico, se ha descrito tambien en la bibliografa especializada por parte de
Brieskorn y Domling [Arch. Pharm. 302, 641 (1.969)], consistente en la reducci
on cataltica del carnosol.
Aqu tambien, una aplicaci
on a gran escala de este procedimiento, no podra considerarse, a causa de la
no disponibilidad del carnosol.
Un procedimiento de obtenci
on del acido carn
osico a partir del romero o de la salvia, objeto de la
solicitud principal de la patente, se caracteriza por el hecho de que se procede a extraer la especia o
substancia arom
atica cono un disolvente no polar o una mezcla de disolventes de fuerte polaridad, se
somete el extracto obtenido a un tratamiento de adsorci
on selectiva sobre un soporte solido, se desorbe
el acido carn
osico con un disolvente polar, o se mezclan los disolventes de fuerte polaridad y se evapora
el disolvente.

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El acido carn
osico, como toda molecula del tipo catecol (orto-difenol), es un compuesto reactivo, muy
sensible a la oxidacion, y por lo tanto muy sensible tambien con respecto a todas las operaciones usualmente practicadas, para el aislamiento de las substancias naturales (extraccion, partici
on lquido-lquido,
fraccionamiento cromatogr
afico, etc.). Como contraposicion, se ha encontrado que, bajo su forma purificada y cristalizada, el acido carn
osico es estable y puede manipularse sin precauciones excesivas, pero
que esta obtenci
on en forma cristalizada, no puede realizarse m
as que a partir de una preparaci
on de
material vegetal ya enriquecido en acido carn
osico.
El procedimiento correspondientes a la solicitud principal de esta invenci
on, permite el preservar la
integridad qumica del acido carn
osico, debido al hecho de que este no comporta mas que dos etapas
de tratamiento, economizando estas etapas el producto de base y siendo selectivas con respecto al acido
carnosico.
El procedimiento de obtenci
on del acido carn
osico, explota dos propiedades fsico-qumicas del acido
carnosico. Por una parte, la molecula comporta funciones reputadas polares, como la fracci
on de acido
carboxlico y fenol. Por otra parte, el resto de su estructuras, esencialmente hidrocarbonada, le confieren
un caracter relativamente apolar, en comparacion con todos los otros compuestos fenolicos, como los
flavonoides o los acidos hidrobenzoicos o hidroxicin
amicos, los cuales estan abundantemente provistos
de los vegetales como la salvia o el romero. De esta forma, el procedimiento comporta u
nicamente dos
operaciones:
1. Extracci
on del material vegetal (salvia o romero) en un disolvente esencialmente apolar, por lo
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cual el acido carn
osico y los compuestos apolares del material vegetal, pasan al extracto.

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2. Adsorci
on selectiva del acido carn
osico contenido en el extracto sobre un soporte s
olido elegido por
su afinidad y su selectividad al lugar de las funciones polares del acido carn
osico, adsorcion seguida de
desorbcion del acido carn
osico del soporte, con la ayuda de un disolvente polar.
En la primera operaci
on, se extraen hojas de romero o de salvia mediante un disolvente esencialmente
apolar, de forma que el extracto obtenido contenga, junto a todos los otros compuestos apolares o muy
poco polares, hojas de estas plantas, como los componentes del aceite esencial, los lpidos, las ceras,
pigmentos cloroflicos, y ciertos triterpenos, el acido carn
osico, como practicamente el u
nico compuesto
del tipo fen
olico que pasa al extracto. La tasa de extraccion del acido carn
osico, se sit
ua en un valor
comprendido entre el 70 y el 100 % y, su contenido en el extracto, se encuentra comprendido entre el 13
y el 25 %.
En la segunda operacion, el extracto precedente se trata con una materia s
olida adsorbente que tiene la
afinidad para los compuestos que comportan funciones polares o que presentan una selectividad particular
en el lugar de los compuestos fen
olicos, como por ejemplo el gel de slice, el oxido de aluminio, para citar
materias primas adsorbentes inorganicas, o la poliamida, la polivinilpirrolidona, para citar ejemplos de
materias adsorbentes org
anicas. Durante el transcurso de este tratamiento, el acido carn
osico se adsorbe
con una gran afinidad o selectividad sobre el adsorbente, permaneciendo los otros constituyentes del extracto esencialmente en la fase lquida. Descartada esta, el acido carn
osico se desorbe del adsorbente por
contacto con un disolvente polar, que despues de evaporacion proporciona un residuo que contiene entre
el 65 y el 95 % de acido carn
osico, concluyendose la reaccion, en caso necesario, mediante recristalizacion.
El rendimiento del acido carn
osico del procedimiento de obtencion correspondiente a la invencion, calculado con relaci
on al contenido de este acido en la materia vegetal de partida, se encuentra comprendido
entre el 60 y el 90 %.

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La materia vegetal de partida, y el tama

no de las partculas vegetales, juegan un papel en el rendimeiento de extraccion del acido carn
osico. En principio, se preferir
a utilizar romero o salvia finamente
molidos, se moltura finamente, obteniendose con ello generalmente los mejores rendimientos. Si bien
ser
a mas ventajoso el partir de la especia entera o substancia aromatica, los residuos obtenidos despues
de hidrodestilaci
on del aceite esencial, podr
an eventualmente y dado el caso hacer tambien su funci
on,
pero conviene saber que, sald
andose esta operacion mediante perdidas importantes de acido carn
osico en
forma de producto de oxidaci
on, el procedimiento de obtenci
on del acido carn
osico, sera economicamente
menos favorable. Se podr
a tambien utilizar, como materia prima, los residuos obtenidos despues de la
extraccion del aceite esencial con un disolvente en fase supercrtica, como el CO2 supercrtico, por ejemplo. En este caso, los residuos seran de mejor calidad desde el punto de vista de su contenido en acido
carnosico, puesto que esta tecnica de obtencion de aceite esencial, permite economizar de mejor forma
los compuestos preciados de materia vegetal.

45

De una forma general, el acido carn

osico, se extrae de una forma mas f
acil de la salvia que del romero.
La explicacion, reside ciertamente en el hecho de que, las hojas de salvia, son menos fibrosas que las hojas
del romero. El romero, es mientras tanto una planta mucho m
as extendida que la salvia, y constituye
por lo tanto una materia de partida menos onerosa y m
as facilmente disponible en grandes cantidades.

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Sea cual fuere el tipo de extracci

on o la materia vegetal puestas en ejecucion importar
a, por las razones anteriormente descritas, mas arriba en este documento de solicitud de patente, el que el disolvente
de extraccion sea lo mas apolar que sea posible. Se tratar
a de disolventes corrientemente utilizados como
disolventes de extracci
on, es decir, de puntos de ebullici
on relativamente bajos, como los hidrocarburos saturados, ramificados o no, como por ejemplo hexano, pentano, heptano, 2-metil-butano, 2-metil-hexano y
ciclohexano, o las mezclas de hidrocarburos saturados (eteres del petroleo), o los hidrocarburos arom
aticos
como el tolueno, o incluso mezclas binarias de uno de los disolventes precedentes, en fuerte exceso, con
un disolvente clorado (por ejemplo cloruro de metileno, cloroformo, cloroetilenos) u oxigenado como un
eter, (por ejemplo, acetato de etilo), o una cetona (por ejemplo acetona), o un ester (por ejemplo acetato
de etilo), o un alcohol (por ejemplo etanol, metanol, etc.). Se puede utilizar por ejemplo una mezcla de
eteres de petroleo, de tolueno o de hexano, con el diclorometano o el etanol, en proporciones 99/1 a 90/10.
En el caso de la salvia, por ejemplo, ser
a posible el extraer cuantitativamente el acido carn
osico con un
disolvente del tipo hidrocarburo saturado. Con todas las otras combinaciones, materia vegetal/variantes
de extraccion, debera hacerse recurso a un disolvente de polaridad igualmente aumentada, si se desea
obtener una buena tasa de extracci
on del acido carn
osico.

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La etapa de extraccion de la especia, puede realizarse ya sea mediante agotamiento de la materia

vegetal, con el disolvente, por ejemplo en un extractor del tipo Soxhtlet (Variante I), ya sea mediante
carga, es decir, por inmersi
on de la materia vegetal en el disolvente (Variante II), ya sea por percolacion o
filtrado en caliente, ya sea por extraccion en columna impulsada, o bien ya sea por cualquier otra tecnica
conocida de extraccion solida por disolvente. Mientras tanto, son las dos primeras variantes las que se
ejemplificaran m
as abajo, en este documento de solicitud de patente. La variante I, proporciona mejores

tasas de extraccion del acido carn

osico que la variante II. Esta
es de todos modos mas comoda de aplicar,
cuando deben extraerse cantidades importantes de materia vegetal.
La extraccion por agotamiento con disolvente, se realiza en un extractor del tipo Soxhlet, compuesto
por un dispositivo de reflujo (bal
on + refrigerante), que contiene el disolvente de extracci
on y entre las
dos partes del cual se intercala un extractor de sif
on equipado con un cartucho poroso que contiene la
materia vegetal a extraer. Los vapores del disolvente calentado a la ebullicion en el bal
on, avanzan a lo
largo del extractor en un conducto que se encuentra dispuesto a tal efecto, y se condensan en lquido una
vez que hayan llegado al refrigerante, El disolvente condensado, recae en el cartucho de extracci
on que
este llena. Una vez que el nivel de lquido en el extractor haya llegado a la altura del conducto de sifonaje,
el extractor se vaca de su contenido en lquido, que vuelve al balon, llevandose con el una cierta cantidad
de materia vegetal disuelta. El conjunto del proceso, puede definirse como un ciclo de extracci
on.
Seg
un este modo de extraccion, los disolventes preferidos son, para la salvia, los hidrocarburos ligeros
acclicos, por ejemplo, el eter de petr
oleo, de una forma preferente a intervalo de ebullici
on de 40-60C
y, para el romero, los mismos disolventes o una combinaci
on binaria de uno de estos con un disolvente
clorado, por ejemplo, el diclorometano, en proporciones volumetricas de 99/1 hasta 9/1. El n
umero de
ciclos de extraccion aplicados a la materia a extraer, son del orden de 5-20.

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35

Si se procede a extraer por cargas, la materia vegetal y el disolvente de extracci

on, se ponen en contacto en un reactor convencional y, la mezcla, se agita con un agitador de palas durante toda la operacion.
Las proporciones disolvente/materia vegetal, de una forma preferente, se encuentran en una relaci
on volumen/peso de 5/1 en el caso del romero, y de 10/1 en el caso de la salvia (la cantidad m
as importante de
disolvente en el caso de la salvia, se gobierna mediante la masa volumetrica mucho mas reducida de esta
en comparacion con la del romero). Generalmente, se procede a 2 o 3 extracciones sucesivas de la materia
vegetal, despues de haber separado entre cada operacion la fase lquida y la fase s
olida mediante filtraci
on
o centrifugacion. La duraci
on de cada extraccion, es del orden de 1/2 a 2 horas, generalmente de 1 hora.
Los disolventes preferidos, en esta forma de extraccion, para las dos materias vegetales romero y salvia,
son los hidrocarburos aromaticos, de una forma preferente el tolueno, o una combinaci
on binaria de un
hidrocarburo ligero acclico, por ejemplo el eter de petr
oleo o el hexano, con un disolvente oxigenado, de
una forma preferente el etanol o el metanol, en proporciones volumetricas de 99/1, hasta 9/1.
La primera etapa de extraccion, se efect
ua a una temperatura comprendida entre 20 y 50 C.

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En la segunda etapa, el extracto vegetal obtenido en el momento de la etapa precedente, se trata con
una materia adsorbente solida. El acido carn
osico del extracto, se adsorbe selectivamente sobre la materia
solida y, a continuaci
on, la fase lquida separada, se recupera en estado concentrado por desorbci
on, con
un disolvente polar puro, tal como la acetona, el metanol, el etanol, o el acetato de etilo, en donde se
mezcla uno de estos en proporciones importantes con un disolvente apolar o poco polar.
En principio, el extracto lquido, podr
a tratarse mediante cualquier materia s
olida adsorbente que
tenga afinidad o selectividad por este tipo de compuestos. Una lista no exhaustiva de las materias adsorbentes que pueden utilizarse a dicho efecto, se ha proporcionado ya anteriormente. Estas materias,
son esencialmente aquellas que se utilizan corrientemente en las tecnicas de separacion por cromatografa
lquida.
De entre las materias adsorbentes economicamente interesantes, la poliamida o todo polmero similar,
como la polivinilpirrolidona, son materia de eleccion para la adsorci
on del acido carn
osico. Estas materias, muestran en efecto una afinidad verdaderamente remarcable en el lugar de los compuestos fen
olicos
(vease a ttulo comparativo, por ejemplo The Flavonoids, Harbone y colegas, Edic. Champman and
Hall, 1.975, captulo 1, p
agina 11). Adem
as de ello, se trata de soportes inertes qumicamente, que no
tienen riesgo de alterar de una forma sensible los compuestos con los cuales se han presto en contacto.
Pr
acticamente, el extracto vegetal lquido de la primera etapa del procedimiento, puede ponerse en
contacto tal cual con la materia adsorbente. Eventualmente, el extracto se habr
a filtrado previamente con
objeto de desembarazarse de peque
nas cantidades de materias solidas precipitadas que hubieran podido
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eventualmente formarse durante la extracci

on o posteriormente a esta. Pr
acticamente, mientras tanto,
ser
a preferible el concentrar el extracto lquido antes de su puesta en contacto con el agente adsorbente,
de forma que favorezca el paso del acido carn
osico del estado disuelto al estado adsorbido. En numerosos
casos, cuando la operacion de concentracion se traduce por la formaci
on de un precipitado s
olido, se
preferira mas bien capturar completamente el disolvente del extracto y recoger el residuo en un segundo
disolvente elegido por su aptitud para disolver f
acilmente y completamente el acido carn
osico del extracto.
En la practica, se encontrar
a que los disolventes del tipo hidrocarburo arom
atico o clorados, hacen bien
su funci
on para esta operacion, siendo los preferidos el touleno y el diclorometano.
La puesta en contacto de extracto lquido con la materia adsorbente, puede realizarse por inmersi
on o
par pasada del extracto a traves de una columna llenada con la materia adsorbente. Esta segunda tecnica,
es mas eficaz y se opera entonces de la forma siguiente: el extracto lquido, se carga en la c
uspide de una
columna rellenada con la materia adsorbente acondicionada con el mismo disolvente que el del extracto.
Una vez el extracto se encuentra ya en contacto con la materia adsorbente, se lava la columna con disolvente fresco hasta que todas las materias del extracto se hayan eliminado, excepto el acido carn
osico, que
permanece adsorbido sobre el soporte. El acido carn
osico, se desorbe entonces de la materia adsorbente
haciendo pasar un disolvente medianamente polar a polar a traves de la columna, por ejemplo una mezcla
de diclorometano o de tolueno con etanol o metanol. Se captura el disolvente del eludo y, el residuo,
puede todava purificarse ulteriormente por recristalizaci
on para alcanzar el grado de pureza deseado en
acido carn
osico.
La presente invencion, se refiere a la utilizacion del acido carn
osico para la fabricacion de una composicion o de una dieta destinada a prevenir o tratar el c
ancer.

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Ciertos compuestos qumicos, poseen propiedades que, de una forma directa o indirecta, reducen o
suprimen la actividad mut
agena inducida por otros productos qumicos. De hecho, se ha mostrado el
hecho de que, los radicales libres, son capaces de inducir un gran n
umero de lesiones diferentes sobre el
ADN, y que estan tambien implicados en el proceso del cancer, del envejecimiento y de las enfermedades
cardiovasculares. El acido carn
osico, tiene una accion inhibitoria de la degradaci
on del ADN, causada
por los radicales libres, lo cual permite el considerar su utilizacion para la prevenci
on y el tratamiento de
las enfermedades cancerosas o cardiovasculares.
Las composiciones dieteticas o farmaceuticas, pueden presentarse bajo diferentes formas adaptadas al
modo de administracion, por ejemplo por va oral, enteral o parenteral. Se pueden por ejemplo preparar
capsulas, grageas o jarabes. En el caso de una administraci
on enteral o parenteral, las composiciones se
presentan en forma de soluciones o de emulsiones estabilizadas fsicamente y qumicamente.
Pueden administrarse dosis fisiologicas para la prevencion o eventualmente para el tratamiento de
ciertas formas de cancer y de enfermedades cardiovasculares.

40

El acido carn
osico, puede por lo dem
as utilizarse para la fabricaci
on de una composici
on destinada al
tratamiento del herpes, que es una afecci
on vrica. Esta composicion, puede presentarse bajo diferentes
formas adaptadas al modo de administraci
on, por ejemplo por va oral, o por aplicacion t
opica. Se administran dosis fisiologicas para el tratamiento de esta afecci
on.
45

La continuacion de la descripcion, se har

a ahora en referencia a los ejemplos.
Ejemplos 1 a 21
50

55

La tabla 1 que se proporciona a continuaci

on, ilustra los resultados obtenidos a partir de una serie
de ensayos de extracci
on de romero y de salvia seg
un las variantes de extraccion I y II, procediendo a
utilizar los disolventes descritos anteriormente, mas arriba, en este documento de solicitud de patente.
Se observa que, cuando m
as aumenta la polaridad del disolvente (columna 5), mejor es la tasa de extraccion del acido carn
osico (columna 8), pero al mismo tiempo, su concentracion en el extracto es menos
importante (columna 7) y por lo tanto, m
as considerable es su lastre en el extracto, encontrandose este
lastre compuesto por otros compuestos fenolicos distintios del acido carn
osico y por lo tanto susceptibles
de interferir negativamente con este en la segunda etapa del procedimiento.

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TABLA 1

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15

20

25

30

1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ejemp. Materia Contenido Variante
Disolvente
Rendimiento
Tasa
Tasa
IQ de la
prima
AC %
extracci
on de extracci
on extracci
on en el AC % extracci
on extracci
on
extracto
AC %
(max 100)
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

romero
romero
romero
salvia
romero
romero
romero
romero
romero
romero
romero
romero
romero
salvia
salvia
salvia
salvia
salvia
salvia
salvia
salvia

1,85
1,85
1,85
2,50
1,80
1,80
1,90
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80
1,80

I
I
I
I
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II

P
P/D 9/1
P/D 9/1
P
P
T
P/E 98/2
P/E 99/1
P/E 98/2
P/E 95/5
P/A 98/2
P/A 95/5
P/A 9/1
P
P/E 99/1
P/E 98/2
P/E 95/5
T
P/A 98/2
P/A 95/5
P/A 9/1

9,1
10,1
11,2
10,0
5,8
9,6
8,2
7,2
8,2
11,4
6,4
7,6
10,0
6,0
9,0
9,0
13,4
10,2
6,8
8,4
11,6

16
16
15
25
13
14
16
15
15
13
13
14
12
16
15
15
11
16
14
16
13

79
87
91
100
42
75
73
60
68
82
46
59
67
53
75
75
82
91
53
75
84

68
76
74
100
30
58
65
50
57
59
33
46
44
47
63
63
50
82
41
66
61

Explicaciones de las abreviaciones

35

AC: Acido
carn
osico
IQ: Indice de calidad
Disolventes:

40

P = Eter
petroleo
D = Diclorometano
45

50

E = Etanol
T = Tolueno

A = Acetona

Se pueden definir, a partir de los datos medidos en la tabla, un ndice de calidad (IQ) del extracto,
ndice este determinado a partir de criterios de eficacia y de selectividad del disolvente de extracci
on.
La eficacia (E) del disolvente, se mide mediante la tasa de extraccion del acido carn
osico (columna 8).
Cuanto m
as eficaz es el disolvente, mejor sera el rendimiento en acido carn
osico recuperado al final del
procedimiento. La selectividad (S) del disolvente de extraccion, se mide mediante el contenido de acido
carnoso en el extracto (columna 7); cuanto m
as selectivo sea el disolvente, mejor sera la pureza del acido
carnosico aislado al final del procedimiento. El ndice de calidad (IQ), puede entonces definirse como
el producto de los factores E y S, producto ponderado por la tasa de acido carn
osico (T) en la materia
vegetal de partida (columna 3).
IQ = (E x S) / T

55

60

Para facilitar la comparaci

on entre los diferentes ejemplos de la tabla I, el ndice de calidad (columna
9), se ha relativizado a una escala de 100, considerando arbitrariamente como optimos los datos tecnicos
del ejemplo 4.
El examen de la tabla, permite el realizar las observaciones siguientes:
1) El ndice de calidad, es la expresion de un compromiso entre selectividad y eficacia. El disolvente
ideal, sera aquel que extraera la integridad de materia activa buscada y u
nicamente esta. El compromiso
7

ES 2 137 963 T3
a realizar, consiste en encontrar el equilibrio entre el rendimiento del procedimiento de obtencion de la
materia activa, y la economa de este procedimiento.

2) En puestas en ejecucion comparables de variante de extraccion y de disolvente, el acido carn

osico
se extrae mas facilmente de la salvia que del romero.
3) A puesta en ejecuci
on comparable del disolvente y sea cual fuere la materia vegetal, la variante de
extraccion I es mas eficaz que la variante II.

10

15

4) La puesta en ejecuci
on de mezclas binarias de disolventes de extracci
on a proporci
on creciente del
mas polar de entre ellos, permite el definir una concentraci
on optima de este u
ltimo que se sit
ua alrededor
del 5 % en el caso de los ejemplos proporcionados en la tabla (ejemplos 7-9, 10-12, 15-17, 18-19).
La continuacion de la descripcion, proporciona ejemplos concretos de extracci
on de acido carn
osico
seg
un los ejemplos 4, 1, 2, 7 y 18, de la tabla 1 precedente.
Salvia, extracci
on variante I, seg
un el ejemplo 4

20

En un extractor del tipo Soxhlet, provisto de un cartucho de celulosa, se emplazan 297 g de salvia
officinale molida que contiene 2,5 % de acido carn
osico. Se procede a extraer, durante un transcurso de
tiempo de 48 horas, al abrigo el aire, (atm
osfera de nitr
ogeno) con eter de petr
oleo (2,5 L; PE 40-60C).
Una vez la extraccion terminada, se captura el disolvente con la ayuda del evaporador rotativo y se
recogen 30 g de extracto de aceite coloreado (rendimiento 10 %), con un contenido de 7,4 g (rendimiento
100 %) de acido carn
osico.

25

30

35

Se disuelve el extracto en diclorometano (150 ml) y, despues de haber filtrado esta soluci
on para
eliminar una reducida proporci
on de materia soluble, se vierte esta sobre una columna rellena de poliamida y preparada a partir de una suspensi
on de 150 g de este material en 1 l de diclorometano. Se
eluye este mismo disolvente para eliminar las materias del extracto no retenidos sobre la poliamida y que
corresponde a una fraccion fuertemente coloreada (fracci
on 1, 700 ml, 18 g de residuo sin disolvente).
Se contin
ua la elucion con una mezcla 8/2 (volumen/volumen) de diclorometano/metanol. La zona de
transicion entre los dos disolventes, se manifiesta sobre la columna mediante la presencia de una zona
amarilla en forma de anillo, que corresponde al acido carn
osico. Se recoge una fraccion intermediaria
(Fracci
on 2, 700 ml, 2 g de residuo sin disolvente), y a continuacion la zona del anillo (Fracci
on 3, 100
ml, 6,1 ml, 6,1 g de residuo, despues de haber capturado el disolvente).
El residuo semi-cristalino de la fracci
on 3, despues de trituraci
on del eter de petr
oleo, proporciona
osico. Rendimiento:
6,0 g de un s
olido amarillo claro (F 170-195C), que contiene un 95 % de acido carn
82 %.

40

Romero, extracci
on variante I seg
un el ejemplo 1

45

50

55

En el recipiente de extraccion de un extractor de Souxhlet, se emplaza un bajo de tejido delgado que

contiene 383 g de romero molido cuyo contenido en acido carn
osico, es del 1,85 % en peso. La altura de
la masa vegetal en el extractor, mide 30 cm. Se emplaza el extractor bajo atmosfera inerte y se extrae
on de
con eter de petr
oleo (2,5 l; PE 40-60C) por 4 ciclos, en total, de llenado y sifonaje de una duraci
75 minutos cada uno. Se captura el disolvente con el evaporador rotativo y se recogen 35 g de extracto
oleaginoso oscuro (Rendimiento 9,1 %), que contiene 5,6 g (Rendimiento 79 %) de acido carn
osico).
Se disuelve el extracto en 240 ml de diclorometano y se vierte la soluci
on sobre una columna de poliamida. Se eluye tal y como se ha descrito precedentemente, procediendo a recoger 3 fracciones: Fr. 1:
700 ml; Fr. 2: 550 ml; Fr. 3: 500 ml.
Se capaturan el disolvente de la u
ltima fracci
on y se obtienen 7,3 g de una masa s
olida de tonalidad
amarillo oscuro, que contiene 5,6 g (77 %) de acido carn
osico, es decir, la totalidad de la fracci
on extrada
de este acido. Rendimiento: 79 %.
Romero, extracci
on variante I, seg
un el ejemplo 2

60

Se procede de la misma forma que en el ejemplo precedente, excepto en lo referente al hecho de que
se extrae, con una mezcla de eter de petr
oleo/diclorometano 9/1 (v/v). El extracto, pesa 38 g (Rendimiento 10,1 %) y contiene 6,2 g (Rendimiento 87 %) de acido carn
osico. Una parte del extracto (4 g),
8

ES 2 137 963 T3
no es soluble en el diclorometano, y debe tenerse cuidado en filtrar esta materia solida antes de pasar el
extracto sobre la columna de poliamida. El residuo de la fracci
on 3 de la elucion, pesa 7,7 g y contiene
5,3 g (59 %) de acido carn
osico. Rendimiento: 74 %)
5

10

15

20

Romero, extracci
on variante II, seg
un el ejemplo 7
En un reactor de 20 litros de capacidad, se introducen 2,5 g de romero molido con un contenido del
1,8 % en acido carn
osico y 12,5 l de una mezcla 98/2 (volumen/volumen) de hexano/etanol. Se procede a
agitar el conjunto mediante agitador a palas, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a temperatura
ambiente y bajo atm
osfera de nitr
ogeno. Se separa la fase lquida de la fase s
olida mediante un filtro
bajo la accion de vaco (B
uchner). Se pone de lado la soluci
on del extracto y se somete la masa vegetal
a una segunda extracci
on semejante a la primera. Despues de filtraci
on, se re
unen las dos soluciones del
extracto y se retira el disolvente con la ayuda del evaporador rotativo. Se obtienen de esta forma 206
g (Rendimiento 8,2 %) de extracto oleaginoso de una tonalidad oscura, que contiene 33 g (Rendimiento
73 %) de acido carn
osico.
Se disuelven en el extracto 1,6 litros de diclorometano y se vierte la soluci
on en una columna de
poliamida. Se procede a eluir como en el ejemplo 1, recogiendo 3 fracciones: Fr. 1: 3,36 l; Fr. 2: 3,23

l; Fr. 3: 1,65 l. Esta

u
ltima fracci
on, proporciona, despues de la evaporacion del disolvente, un residuo semioleaginoso (41,5 g), que se tritura en el eter de petr
oleo hasta que se obtiene una consistencia
solida. El producto de tonalidad amarilla de esta forma obtenido, pesa 37 g y contiene un 73 % de acido
carnosico. Rendimiento: 27 g (60 %).
Salvia, extracci
on variante II seg
un el ejemplo 18

25

30

35

40

45

Se procede a agitar mediante un agitador de palas, durante un transcurso de tiempo de 1 hora a

temperatura ambiente y bajo atm
osfera de nitr
ogeno, una mezcla de 50 g de salvia molida (Tasa de acido
carnosico 1,8 %) y de 600 ml de tolueno. Despues de la separacion de las dos fases solida y lquida por
filtraci
on, se somete la masa vegetal a una segunda operacion de extraccion. Se re
unen las dos soluciones
del extracto y se caza el disolvente con el evaporador rotativo. Se obtienen 5,1 g (10,2 %) del extracto
oleaginoso que contiene 0,82 g (Rendimiento 91 %) de acido carn
osico.
Se redisuelve el extracto en 50 ml de tolueno y se procede a filtrar la soluci
on obtenida para eliminar
algunas materias no solubles. El producto de filtraci
on se vierte sobre una columna de poliamida (30 g;
30 x 2 cm), acondicionada en tolueno. Se procede a eluir de la misma forma que el ejemplo 1, con tolueno
y, a continuaci
on, con una mezcla tolueno/etanol 8/2, y se recogen 3 fracciones: Fr. 1: 200 ml (3,3 g de

materia vegetal); Fr. 2: 160 ml; 0,2 g; Fr. 3: 50 ml; 1,1 g. Esta
u
ltima fracci
on, contiene 0,78 g (71 %)
de acido carn
osico. Rendimiento: 87 %.
Purificaci
on del a
cido carn
osico
30 g del producto de tonalidad amarilla obtenido en el ejemplo 7, y con un contenido del 73 % de
acido carn
osico, se recristalizan dos veces en ciclohexano, en presencia de carbon activo. Se obtienen 16,4
g de acido carn
osico en forma de cristales incoloros con una pureza superior al 95 %, (Punto de fusi
on
193-199C). En lugar de ciclohexano, el producto puede tambien recristalizarse en el benceno o en el
tolueno.
Las propiedades fisiol
ogicas anticarcin
ogenas y antivricas del acido carn
osico, se ilustran en los ensayos siguientes:

50

Actividad anticarcin
ogena del
acido carn
osico

55

60

La actividad antimut
agena del acido carn
osico, se ha evaluado en un test de ensayo de Ames en cual se
utiliza la cepa de Salmonella typhimurium TA 102, que se conoce por responder facilmente a las especies
oxigenadas activas. Esta cepa, se pone en presencia de peroxido de tert.-butilo (tBOOH) conocido por
generar radicales peroxilados y en donde la accion biologica esta considerada como particularmente interesante, debido al hecho de que esta genera los radicales oxgeno en el interior de las celulas. El tBOOH,
produce un cierto n
umero de alteraciones puntuales sobre el ADN de las bacterias y se mide por inhibicion de estas alteraciones producidas por el antioxidante que se incorpora en el medio de cultivo. Los
antioxidantes siguientes, se han sometido a test de ensayo en una gama de dosis activas: acido carn
osico,

carnosol, y acido ascorbico. Este u

ltimo, cuya actividad anticarcin
ogena es bien conocida, ha servido de

ES 2 137 963 T3
control positivo. Con el fin de disociar el efecto antimut
ageno cierto de un efecto bactericida, se ha
utilizado un test de ensayo de preincubaci
on y, los resultados obtenidos, se expresan bajo la forma de la
relacion: N
umero de colonias revertientes inducidas / N
umero de colonias supervivientes [Aeschbacher y
colegas, Food Safety, 8, 167 - 177 (1.987)].
5

15

Descripcion del test de ensayo: El medio de incubaci

on, se prepara procediendo a mezclar 1 ml de
un Maron
suspension bacteriana (5 x 109 bac./ml) de Salmonella typhimurium TA 102, preparada seg
y Ames [Mutation Research, 113, 175 - 215 (1.983)], 50 l de tamp
on salino, 0,95 mo de HCl 0,15 M,
y 2,8 ml de medio de Davis-Mingioli, suplementado con 24 g de histidina y 10 lg de biotina por ml.
Se a
nade a continuacion 0,5 ml de una soluci
on de tBOOH (concentraci
on final 2,5 mM) y 0,5 ml de
solucion de antioxidante en agua para el acido ascorbico y en los trigliceridos de cadena media para los
antioxidantes no hidrosolubles, acido carn
osico y carnosol. El medio, se incuba a una temperatura de
on, despues de adicion de 9 ml de caldo
37C, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a continuaci
on. El medio,
nutritivo al 0,8 %, otra vez durante un transcurso de tiempo de 37 C para fijar la mutaci
se centrifuga a continuaci
on y las bacterias, se lavan resuspendidas en 3,5 ml de tamp
on salino.

20

La cuenta de las colonias de revertientes y de supervivientes, se efect

ua sobre placas de agar nutritivo
en ausencia, respectivamente, en presencia de histidina, y se incuban durante un transcurso de tiempo de
on bacteriana
3 das a una temperatura de 37C, sobre las cuales se ha depositado 0,1 ml de la suspensi
precedente. Se opera la cuenta autom
aticamente sobre un contador Fisher count-Ail 800.

25

La tabla 2, expresa los resultados obtenidos bajo la forma de las concentraciones estimadas de antioxidantes sometidos a test de ensayo capaces de reducir a la mitad el efecto mutageno inducido por el
tBOOH a la concentracion de 2,5 mM, en ausencia de antioxidantes (concentraci
on inhibidora 50 = CI
50).

10

TABLA 2
Entrada

Compuesto

CI50
(mg)

CI50
(mM)

Actividad
relativa
comparacion de
los CI50 (mM)

Acido
carn
osico

0,3

0,15

100

Carnosol

17,8

9,5

Acido
ascorbico

2,8

2,7

30

35

40

45

Resalta claramente de los datos de la tabla que, mientras que la actividad anticarcin
ogena del carnosol
es un poco m
as reducida, pero de un orden de dimensi
on comparable al acido ascorbico (testigo positivo),
la actividad del acido carn
osico es superior por un factor de aproximadamente 15 al del acido ascorbico,
y de 50 con respecto al del carnosol.
Actividad antivrica del a
cido carn
osico

50

55

La actividad antivrica del acido carn

osico, se ha sometido a test de ensayo a diferentes concentraciones
(5; 2,5, 1,25, 0,62 g/ml) contra lotes infecciosos de Herpes simple del tipo 1 (HSV1) y tipo 2 (HSV2),
y de Polivirus de tipo 3 (Polio 3), cultivados sobre la lnea celular VERO. Despues de un transcurso
de tiempo de 2 horas de incubaci
on, las valoraciones obtenidas se comparan a las de los testigos sin
inhibidor (Test de ensayo 1), Se inoculan a continuaci
on alcuotos de diferentes sobrenadantes de tests
de ensayo, sobre celulas nuevas. Despues de un transcurso de tiempo de 4 das de incubaci
on, el recuento
de partculas vricas permitira esta vez el apreciar la produccion vrica en presencia del inhibidor (Test
de ensayo 2). La tabla 3, presenta los resultados de estos dos tests de ensayo.

60

10

ES 2 137 963 T3
TABLA 3

10

15

20

Concentracion
cido carn
a
osico

N
umero de partculas vricas/0,025 ml de sobrenadante
Test de ensayo 1
Test de ensayo 2

(l/ml)

HSV1

HSV2

POLIO 3

HSV1

HSV2

POLIO 3

5
2,5
1,25
0,62
0 (testigo)

10
10
103
104
105

10
10
10
10
104

1012
1012
1012
1012
1012

102
105
2.5x105
6 x 106
2 x 108

<10
2 x 102
105
8 x 105
107

2 x 1023
2 x 1023
1023
1022
1023

Los resultados del test de ensayo 1, muestran que la cepa de virus Polio 3, no se inhibe por parte del
cido carn
a
osico. Por el contrario, la accion anti-HSV1 y anti-HSV2 es del todo significativa, debido al
hecho de que se observan reducciones de la valoracion del ttulo, que van hasta de 3 a 4 factores de diez.
Existe por lo tanto una especificidad de acci
on del acido carn
osico. Los resultados del test de ensayo I, se
confirman por parte de los del test de ensayo 2: Se constata que la producci
on de Polio 3, puede considerarse como equivalente sea cual sea la concentracion de acido carn
osico. Por el contrario, la produccion
de HSV1 y HSV2, est
a muy afectada. Esto confirma la especificidad de acci
on del producto, y tambien
la ausencia de toxicidad celular puesto que, a la concentraci
on m
as fuerte (5 m/ml), la producci
on de
Polio 3 no se modifica.

25

30

35

40

45

50

55

60

11

ES 2 137 963 T3
REIVINDICACIONES
1. Utilizacion del acido carn
osico para la fabricacion de una composici
on o de una dieta alimenticia
destinada a prevenir o tratar el c
ancer.
5

2. Utilizacion del acido carn

osico para la fabricaci
on de una composici
on destinada al tratamiento del
herpes.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposici
on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicaci
on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
Espa
na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir
an ning
un efecto en Espa
na en
la medida en que confieran protecci
on a productos qumicos y farmaceuticos como
tales.
Esta informaci
on no prejuzga que la patente este o no includa en la mencionada
reserva.

12