MONOGRAFA

CROMATOGRAFA
LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

INTEGRANTES:
VANESA MIRELY VSQUEZ MONZON

RUBN DARO ISLA ANGULO

CROMATOGRAFA
ndice
1. Introduccin. Mtodos de separacin
2. Tipos de Cromatografa
3. Cromatografa liquida clsica y cromatografa liquida de alta
performance
4. Los mtodos cromatogrficos
5. Ventajas y desventajas de la cromatografa lquida de alta presin
6. Instrumental
7. Aplicaciones
8. bibliografa

1. Introduccin. Mtodos de separacin

La cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e identificar los
componentes de una mezcla de compuestos qumicos. La muestra es
distribuida entre dos fases inmiscibles (slida, lquida o gas) , una estacionaria y
otra mvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto
ntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es
selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla
a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo
que se produce la separacin. Si un componente est la mayor parte del tiempo
en la fase mvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se
encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y
su salida es mucho ms lenta.

La separacin se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un slido

poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase estacionaria
propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria lquida. Tambin se
puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un slido
finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio.
Estos tres tipos de cromatografa se basan en los mismos principios

fundamentales, y se conocen respectivamente como cromatografa en columna,

en papel y de capa fina. En sta cromatografa solo se considerara la
cromatografa en columna.

La cromatografa es un proceso de separacin muy

comn en

ingeniera qumica y bioqumica. Es un procedimiento altamente selectivo,

capaz de distinguir y separar componentes con caractersticas fsicas y
qumicas muy similares. Esta tcnica se considera importante tanto a nivel de
produccin como de anlisis.

Desde el siglo pasado las separaciones analticas se llevaban a cabo por

mtodos clsicos como son la precipitacin, destilacin y extraccin. Los
crecientes esfuerzos por conocer ms sobre la composicin y funcin de las
protenas han obligado a los cientficos a buscar tcnicas, cada vez, ms
precisas.
Para elegir una tcnica de separacin, adems de tener en cuenta los
criterios econmicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de
consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades fsicas y
estructurales de las molculas que se pretende separar, o de las caractersticas
de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del anlisis
(sensibilidad, resolucin, tiempo de anlisis, necesidad de una deteccin
especfica).

El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la obtencin,

preparacin y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicacin de la tcnica
analtica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.

Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden englobarse

en dos grandes grupos: tcnicas de separacin y tcnicas espectroscpicas.
Las tcnicas espectroscpicas proporcionan, para cada compuesto analizado,
una informacin compleja, relacionada con sus caractersticas estructurales
especficas, por otro lado las tcnicas de separacin se utilizan para resolver los
componentes de una mezcla y la seal obtenida puede utilizarse con fines
analticos cuantitativos o cualitativos.

Actualmente las separaciones analticas se realizan fundamentalmente por

cromatografa y electroforesis.

La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una

mezcla, sino tambin su identificacin y cuantificacin. Se pueden separar
molculas en funcin de sus cargas, tamaos y masas moleculares. Tambin a
travs de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El anlisis
cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y
volmenes de retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado en la
medida de alturas o reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la
concentracin.

Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar segn la forma en que la

fase mvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. As en la cromatografa
de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a travs de la cual
se hace pasar la fase mvil por presin. En la cromatografa en plano, la fase
estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en
este caso la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por
capilaridad o por gravedad.

Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son

cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos
supercrticos. Como su nombre lo indica, la fase mvil en las tres tcnicas son
lquido, gas y fluido supercrtico respectivamente. En la cromatografa lquida, la
fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la
fase fija. Solo la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse acabo en
columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de
fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna de tal
manera que las paredes de la columna contienen la fase mvil.
La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin(HPLC), por
su sensibilidad, fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su
idoneidad para la separacin de especies no voltiles y su aplicacin a
sustancias de primordial inters en la industria, como son los aminocidos,
protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.

2.Tipos de cromatografa
En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquido o un gas, y
segn el caso se denominan respectivamentecromatografa lquida y
cromatografa de gases . Esta fase mvil fluye a travs del relleno de la
columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente
retenidos por al fase estacionaria. EL flujo de la fase mvil se mantiene
constante a travs de todo el proceso y de esta manera se logra que cada
componente de la mezcla sea eluido de la columna como un compuesto puro,
disuelto en la fase mvil. A esta tcnica se le llama cromatografa de elusin.
De acuerdo con la naturaleza de las fases involucradas y con los mecanismos

de separacin, es posible distinguir diferentes tipos de cromatografa, como se

indica en la figura 1.

FIG. 1 - Mtodos cromatogrficos. CGS: cromatografa gas-slido; CGL:

cromatografa gas-lquido; CLS: cromatografa lquido-slido; CLL: cromatografa
lquido-lquido;

CFQU:

cromatografa

de

fase

qumicamente

unida;

CII:

cromatografa de intercambio inico; CCF: cromatografa de capa fina; CP:

cromatografa de papel; CE: cromatografa de exclusin; CPG: cromatografa de
permeacin en gel; CFG: cromatografa de filtracin en gel.

Cromatografa de gases y cromatografa lquida de alta presin.

3. Cromatografa liquida clsica y cromatografa liquida de alta

performance
La cromatografa liquida clsica se lleva a cabo en una columna
generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase lquida. Luego de colocar
la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna
por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las
separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo
hasta el tamao de los micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas
presin es para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica
de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
Ver figura 2.

4. Los Mtodos Cromatogrficos

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la
separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

1) cromatografa de reparto o CLL:

Separa los solutos basndose en la solubilidad.

Formada por CLL y CFQU. Estas tcnicas se diferencian en la forma en que
se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte relleno. En el
segundo caso, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del

soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada debido a que la cromatografa

CLL necesita de un recubrimiento peridico de las partculas del soporte debido
a la prdida de la fase estacionaria por disolucin en la fase mvil.
En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas
qumicamente se preparan con slice rgida o composiciones donde la slice es
el elemento bsico. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente
resistentes, porosas y uniformes.

Los rellenos de columna en la CFQU se clasifican como de fase inversa cuando

el recubrimiento enlazado tiene carcter no polar, y de fase normal cuando el
recubrimiento contiene grupos funcionales polares.

Este mecanismo de separacin se basa en la distinta solubilidad que presenta

una molcula de la muestra en la fase mvil y en la fase estacionaria. De ah
que los compuestos mas solubles en la fase estacionaria sean selectivamente
retenidos por ella en tanto que los menos solubles son transportados mas
rpidamente por la fase mvil. Puede utilizarse en la separacin de mezclas
edulcorantes artificiales, antioxidantes, bebidas refrescantes entre otras.

El inconveniente de esta tcnica es las solubilidad de la fase estacionaria en la

fase mvil y el deterioro de la columna. Esto se puede corregir saturando la fase
mvil con las fase estacionaria por medio de una precolumna que contenga un
alto porcentaje de fase estacionaria. O bien, utilizando materiales que
contengan la fase estacionaria qumicamente unida a la superficie de un
soporte (a modo de material de relleno de la columna no suele ser empleada);
esto evita la perdida de fase estacionara y hace innecesario el uso de
precolumnas para saturar la fase mvil.

Esta requiere un control cuidadoso de flujo y de la temperatura para poder

identificar un compuesto de terminado en funcin del tiempo de retencin que
es caracterstico, en las condiciones de flujo y temperaturas utilizadas, del
compuesto determinado.
2) Cromatografa de fase qumicamente unida (CFQU):
Esta tcnica surgi como consecuencia de problemas asociados con la CLL.
Dado que su fase estacionaria esta qumicamente unida a la superficie de un
soporte, la fase mvil difcilmente produce deterioro alguno en la columna. Si se
vara la naturaleza de los grupos funcionales de las fase estacionaria es posible
obtener diferentes tipos de selectividad. Dichos grupos pueden ser de
naturaleza polar, como el grupo amino y el grupo nitrilo en el caso de la
cromatografa de fase normal, o bien no polar como el grupo octilo, octadecilo,
fenilo, etc. en el caso de la cromatografa de fase inversa, sta tiene
innumerables aplicaciones.
Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es posible
unir a la superficie de un soporte (partculas de slice), es limitada y como
consecuencia los tamaos de muestra separados en esta columna son
reducidos, por lo comn menor de 1 mg.
Este mecanismo de separacin es complejo, cuyas caractersticas son
similares a la de la CLL y es el ms utilizado.

3) Cromatografa de adsorcin o CLS: se basa en la afinidad de adsorcin

Es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas
transformaciones que la han convertido en un mtodo importante de la HPLC.

Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la
almina, siendo la primera la preferida.

Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas

moleculares inferiores a 5000. Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y
reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se
superponen.

En general la CLS es ms adecuada para muestras que son solubles en

disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones
acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase
inversa. En ste tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos
con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo
es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.
El mecanismo de separacin de sta, se basa en la competencia que existe
entre las molculas de la muestra y de la fase mvil o disolvente por ocupar los
sitios activos en la superficie de un slido (almina y gel de slice).
Este tipo de cromatografa es muy til y se aplica a molculas de baja o media
polaridad.

4) Cromatografa lquida por exclusin o CE : separa solutos segn el peso

molecular
La cromatografa de exclusin, tambin llamada de filtracin en gel o
cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de
las molculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separacin
obtenida depende del tamao de la molcula. El tiempo de

retencin es

proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con

los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separacin por tamao
difiere de las dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones
fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica
reproducible, escalable y rpida.

La fase fija est formada por partculas de slice que contienen una red
uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo
tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas
en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el
volumen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el
volmen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las
grandes. Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente.
Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables: mecnica y
qumicamente; tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y
tamao. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao
mayor resolucin y menor gasto en la columna.

Este tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos,

determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

La columna se rellena de un gel, cuyos poros son de tamao similar al

tamao de las molculas de la muestra. Las molculas pequeas pueden
penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las grandes no. Las
columnas empleadas pueden ser muy largas (varios metros) y esto es
especialmente cierto cuando se desea separar muestras cuyos pesos
moleculares estn distribuidos en intervalos muy amplios.

Estas dos variantes en CE: la cromatografa de filtracin, emplea materiales

blandos; incapaces de resistir presiones mayores de 4 atm. y es muy aplicada
en el estudio de los biopolmeros y en contraste; la cromatografa de
permeacin, emplea materiales de relleno semirgidos o rgidos, y que pueden
resistir presiones muy elevadas. Ambas no implican mecanismos de separacin
diferentes y su divisin se debe a motivos puramente histricos.

Aunque existen excepciones, la eficacia de las columnas de la CE es por lo

general relativamente baja, por lo cual no es frecuente en esta tcnica obtener
la separacin de compuestos individuales, sino ms bien fracciones de un cierto
intervalo de pesos moleculares. El mecanismo de separacin es tal que el
tiempo de retencin es inversamente proporcional al volmen de las molculas
en la fase mvil y por lo tanto proporcional al peso molecular; las molculas
ms pequeas son las que son objeto de una mayor retencin en la columna.

5) Cromatografa por intercambio inico o CII: Separa solutos segn la carga

inica.
Est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que
existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aninicos,
grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del
soluto.

Los

intercambiadores

catinicos

negativamente que atraen cationes del soluto.

contienen

puntos

cargados

Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o

dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones
muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo
a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos
de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los
bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones
moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de
intercambio inico tienen aplicacin de estudios donde intervienen molculas
pequeas (PM = 500) que pueden penetrar en los poros pequeos de la resina.
Los intercambiadores inicos de polestreno son tan grandes que en las
macromolculas muy cargadas, como las protenas, se pueden lanzar
irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio
inico de macromolculas. Los geles de intercambio inico se usan en el caso
de molculas grandes (protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones
exigen condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos
inorgnicos.

La separacin por intercambio inico se basa en la competencia entre la fase

mvil y la muestra inica por los sitios o grupos activos de una resina
intercambiadora de iones.

Este tipo de separacin se aplica a compuestos de un intervalo de pesos

moleculares muy amplio, y ejemplos caractersticos de stos son los pptidos y
los aminocidos. Las columnas son ms largas que las empleadas en otro tipo
de

cromatografa

se

basa

intercambiadores de iones.

en

la

baja

eficiencia

de

los

materiales

La gran variabilidad de los mtodos cromatogrficos se debe a las diferentes

condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una
sustancia. Todas estas tcnicas tienen en comn la existencia de una fase
estacionaria a travs de la cual fluye una fase mvil, as como la presencia de
un mecanismo de inyeccin de la muestra y un mecanismo de deteccin de los
diferentes componentes separados

tipo

lquidoslido

fase
estacionaria

slido
inerte
como gel de disolventes
slice o almina

intercambio
resina
inico
cambiadora
lquidolquido

gas-lquido

fase mvil

soluciones
acuosas

lquido
adsorbido en un lquido
soporte slido
pelcula
de
lquido
adsorbida sobre gas
un
soporte
slido

4. Ventajas y desventajas de la cromatografa lquida de alta presin

Ventajas

Desventajas

-Velocidad de anlisis

-Instrumentacin costosa

-Alta resolucin

-Difcil anlisis cualitativo

-Resultados cuantitativos

-No existe detector universal

-Buena sensibilidad

y sensible

-Automatizacin

-Elevado costo de operacin

-Amplio espectro de aplicaciones

-Experiencia indispensable

Con esta tcnica es usual obtener separaciones en minutos e inclusive en

algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren columnas de alta eficacia
y sistemas de bombeo de alta presin, ya que separaciones rpidas requieren
flujos rpidos de fase mvil y esto a su vez requiere presiones elevadas.
Su alta resolucin permite obtener y separar mezclas muy complejas; como
algunos fluidos biolgicos como la orina humana. Las muestras naturales son
difciles de manejar, pero con CII y programacin de fase inmvil la resolucin
es notable.

Los mtodos de HPLC proporcionan muy buena informacin de tipo

cualitativo, efectuando anlisis con precisin del 1%.
Los detectores proporcionan buena sensibilidad y segn el tipo de muestra
9

suelen medir hasta los 10

ng (nanogramos), otros ms especializados pueden

detectar cantidades muy pequeas.

Entre las ventajas de esta tcnica, la ms importante es la diversidad de sus

aplicaciones tantos a compuestos orgnicos como inorgnicos, etc.

Las nicas muestras no susceptibles de poderse analizar con facilidad son las
gaseosas.

Mediante los instrumentos cromatogrficos, la identificacin de cada seal de la

muestra a anlisis se realiza comparando los tiempos de retencin con valores
previamente determinados y la cuantificacin se obtiene mediante las reas
integradas de las seales de acuerdo con el mtodo analtico seleccionado.
Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa
inversin para los laboratorios. Otra limitacin es la necesidad de que el
personal que utiliza estos mtodos tenga experiencia para poder obtener
provecho, lo cual requiere de 6 a 12 meses de experiencias para llegar a ser
operador eficiente.

La HPLC no es un buen mtodo de identificacin, en general la cromatografa

es bsicamente una tcnica de separacin de gran resolucin, pero que no nos
identifica el compuesto que da la seal obtenida en el cromatograma.

5. Instrumental:
La HPLC utiliza un instrumental con ventajas significativas:

En este mtodo se usan columnas de dimetros muy reducido, rellenas de

materiales especiales pulverulentos, cuyas partculas tienen un tamao entre

30-40

m y con frecuencia hasta de 5 6

m , con una distribucin de 2

m . Este tipo de columna es muy eficaz, pero ofrece una gran resistencia al flujo
de la fase mvil, o sea una gran cada de presin. Por lo que se emplean
sistemas de bombeo de alta presin que hagan fluir la fase mvil a velocidad a
travs de la columna. La cantidad de fase estacionaria dentro de la columna es
pequea, por lo tanto la muestra debe ser pequea en 1 y 10 mg.

Si la presin de entrada a la columna no es muy elevada, la muestra se

introduce en la cmara de inyeccin mediante una jeringa de alta presin, a
presiones ms elevadas se utilizan las vlvulas de inyeccin. La columna a
pesar de su repetido uso, presenta un escaso deterioro, auque en algunos
casos es necesario regenerarla.

Un detector colocado a la salida de la columna, proporciona un registro continuo

de la composicin del lquido que sale, lo que permite

obtener un

cromatograma y que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de

la muestra.

6. Aplicaciones:
La cromatografa lquida de alta presin a pesar de ser una tcnica
relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la
literatura qumica. En la mayora de los casos, stas consisten en
determinaciones de sustancias cuyo anlisis por otra tcnica cromatogrfica
resulta muy difcil. Estos resultados comprenden:

Compuestos inicos, como aminocidos, sales inorgnicas, cidos

orgnicos, etc.

Compuestos de alto peso molecular, como polmeros, hidrocarburos

polinucleares, productos naturales, etc.

Compuestos termolbiles y no voltiles, como vitaminas, pesticidas,

esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos
farmacuticos.

En los problemas relacionados con la contaminacin ambiental, la HPLC se

utiliza para la contaminacin de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas,
hervicidas, etc.). Tambin es posible la determinacin de hidrocarburos
aromticos polinucleares que son contaminantes atmosfricos muy importantes

En cromatografa lquida el anlisis de compuestos vitamnicos es posible en

corto tiempo.

El bioqumico con frecuencia en un campo de investigacin es el que plantea el

problema de analizar compuestos voltiles y de alto peso molcula. Por
ejemplo, se han efectuado determinaciones de constituyentes de cidos
nucleicos (nucletidos, nuclesidos) por cromatografa de intercambio inico.
En el campo bioqumico la determinacin de esteroides en cromatografa lquida
ha sido el de deteccin, ya que slo el detector de luz ultravioleta es lo bastante
sensible para poner de manifiesto estos compuestos a bajas concentraciones,
pero no todos los esteroides absorben en la regin ultravioleta. Esto ha dado
lugar a la formacin de compuestos derivados de los esteroides que absorben
en el ultravioleta a fin de hacer posible el anlisis.

El anlisis de medicamentos es tambin una aplicacin muy interesante, la

determinacin de los componentes activos de una tableta analgsica. Tambin
el anlisis de barbitricos, anticonceptivos, etc.

En caso de que el compuesto analizar sean de alto peso molecular, se usa

cromatografa de permeacin o de exclusin. Es posible combinar dos o ms
tcnicas cromatogrficas para efectuar separaciones difciles. La de permeacin
es til en el estudio de polmeros, facilitando la determinacin de la distribucin
de pesos moleculares, y en la investigacin de productos naturales para
efectuar separaciones de acuerdo con el peso molecular.

En separaciones segn el tipo qumico su finalidad no es la separacin de

compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en
las mezcla.

9. Bibliografa
* Harold M. McNair y Benjamn Esquivel H. Departamet of Chemistry y Virginia
Polytechnic Institute and State University Blacksburg, Virginia Estados Unidos, 2
edicin 1980.

* Principios de Anlisis Instrumental 5 Edicin. Skoog Holler Nieman.

* Informacin de internet (www.quiored.com.ar, www.tecnoedu.com, Red

Latinoamericana de Qumica por: Rubn Daro Cortez)