CUADERNO

MICROBIOLOGA

PRCTICAS
PRODUCTOS

DE

DE LOS

AGROALIMENTARIOS
CURSO 09/10
AREA

MICROBIOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA APLICADA
ESCUELA POLITCNICA SUPERIOR
UNIVERSIDAD DE ALMERA
NDICE
Introduccin
Prcticas
Anlisis de alimentos y aguas
Microbiota aerobia mesfila
Enterobacterias totales
Hongos y levaduras
Microorganismos psicrtrofos
Recuento e identificacin de coliformes totales y fecales

DE

Recuento e identificacin de Salmonella

Deteccin de Staphylococcus aureus en portadores sanos
Elaboracin de Alimentos
La levadura como agente esponjante de la masa panaria
Elaboracin de alimentos por fermentacin cido-lctica: Yogurt
Temporalizacin

Microbiologa de los Productos Agroalimentarios

Guin de prcticas

INTRODUCCIN
Los alimentos, al igual que el agua, no son, en general, productos estriles. En el caso del
agua, sobre todo en el caso del agua potable, adems de presentar una baja carga
microbiana, determinadas especies microbianas deben estar ausentes. En el caso de los
alimentos, la carga microbiana vara dependiendo del tipo de alimento.
La calidad microbiolgica del agua y de los productos alimentarios hace referencia a
dos aspectos fundamentales: la calidad higinico-sanitaria y la calidad comercial. La
primera tiene una gran importancia debido a que su ausencia conlleva un considerable
riesgo para la salud del consumidor, ya que tanto el agua como los alimentos pueden ser
vehculos de microorganismos patgenos. Respecto a la segunda, cabe sealar que hay
microorganismos que aunque carezcan de significado sanitario, pueden ser causa de la
alteracin del agua o alimento, modificando el color, aroma, sabor, consistencia o
aspecto.
TIPOS DE MICROORGANISMOS
Los anlisis microbiolgicos de aguas y alimentos, estn destinados a la bsqueda de
agentes infecciosos o toxignicos o de indicadores de una contaminacin no admisible,
de modo que se asegure la calidad higinico-sanitaria de los mismos. Aunque los
microorganismos ms importantes en cuanto a la salud pblica son aquellos que
desarrollan patologas, tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, Psedomonas
aeruginosa, etc., existe un grupo de microorganismos de especial relevancia higinicosanitaria, los llamados "indicadores". Estos microorganismos no son necesariamente
patgenos, y su presencia se relaciona con la existencia de contaminacin, avisando de
la posible existencia de patgenos y otros microorganismos que pueden alterar el
producto. Estos microorganismos "indicadores" se analizan de forma rutinaria, y de
hecho, en la legislacin se considera su anlisis como un parmetro de calidad
microbiolgica.
El inters de la determinacin de estos grupos indicadores se centra en la
biodiversidad que los diferentes hbitats pueden presentar. Cada entorno se caracteriza
por albergar determinadas asociaciones microbianas, entre las que se pueden incluir
especies patgenas. Dichas especies no siempre resultan detectables de forma sencilla,
por lo que en numerosas ocasiones se determinan de forma indirecta a travs de otras
especies o grupos pertenecientes a la misma asociacin.
ESQUEMA GENERAL:
Los puntos bsicos a desarrollar en el anlisis microbiolgico de un alimento o de agua
son los siguientes:
Toma de la muestra y transporte al laboratorio: Las tcnicas microbiolgicas son
inadecuadas para determinar la calidad microbiolgica de un alimento a menos que se
aplique un programa de muestreo adecuado. La forma ms exacta de conocer la
calidad del alimento sera el anlisis de su totalidad. Esto es inviable y por ello se hace
necesario analizar unidades de muestra (muestras representativas), efectundose su
eleccin de forma aleatoria. Generalmente se acude al uso de tablas de nmero
aleatorios que permiten efectuar un muestreo de forma imparcial y contrastada. La
obtencin y manipulacin correcta de las muestras son factores clave a tener en
cuenta en un muestreo. Los recipientes de recogida deben ser estriles, as como los
utensilios que se utilizan en dicho proceso. El transporte hasta el laboratorio ha ser
rpido y deben utilizarse neveras para conservar el alimento. Todas las muestras

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Guin de prcticas

deben procesarse lo ms rpido posible a su llegada al laboratorio y siempre debe

trabajarse en las adecuadas condiciones de asepsia.
Procesado de la muestra: En el anlisis de la calidad microbiolgica de un alimento,
interesa obtener informacin representativa acerca de la microbiota presente en el
conjunto del alimento, lo que puede ser especialmente problemtico cundo este es
slido. Es por lo tanto necesario homogeneizar el alimento para poder realizar un
anlisis representativo de la integridad.
Siembra y aislamiento en medios de cultivo: Se realiza para poder estudiar los
microorganismos presentes en la muestra. En este paso se pretende que los
microorganismos que se encuentren en la muestra crezcan en un sustrato elaborado
en el laboratorio. Esto va a facilitar el estudio de dichos microorganismos, entre otras
cosas por permitir su aislamiento, es decir, la separacin de las distintasespecies
presentes en la muestra.
Identificacin o recuento de los microorganismos observados: Este paso depender del
objetivo del anlisis. Si estamos interesados en comprobar la ausencia o presencia de
un determinado microorganismo, se realiza una identificacin. Si se pretende conocer
la carga microbiana general o de un determinado grupo bacteriano, se realiza un
recuento que en ocasiones puede ir seguido de una identificacin.
En el caso de estar interesados en conocer la presencia de determinados grupos de
microorganismos, o ms concretamente. la de algn gnero o especie bacteriana, se
harn, adems, una serie de pruebas destinadas a su identificacin. Estas pruebas suelen
estar englobadas en dos grandes grupos que son lo que se llaman pruebas de
observacin y pruebas bioqumicas. Dentro de las primeras se incluira el estudio de
caractersticas macro y micromorfolgicas. En el segundo grupo se encontraran una serie
de pruebas bioqumicas que se realizan para comprobar la capacidad de metabolizacin
de determinados compuestos o la capacidad de producir determinados metabolitos.
(inmunolgicas, composicin, ADN, etc.).

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Guin de prcticas

PRCTICAS
MUESTREOS Y MANIPULACION DE MUESTRAS ALIMENTARIAS
El tratamiento a aplicar al alimento una vez en el laboratorio depender de sus
caractersticas. En esta prctica veremos una tcnica de tratamiento general, til para la
mayora de los alimentos. Sin embargo, algunos alimentos necesitan un tratamiento
especfico. Es el caso de, las muestras congeladas, que deben adecuarse a las
condiciones ambientales en fro, a una temperatura controlada que evite o dificulte la
multiplicacin de los microorganismos presentes en la misma e induzcan a sobrevalorar
los recuentos de microorganismos en la muestra en origen. Tanto las muestras slidas
como lquidas deben ser homogeneizadas, labor que se lleva a cabo en un "stomacher".
HOMOGENEIZACION DE MUESTRAS
Material
Bolsas estriles.
Balanza.
Matraz con 90ml de caldo nutritivo.
Stomacher.
Esptulas estriles.
Procedimiento:
Pesar 10 g del alimento e introducir en bolsas estriles.
Adicionar los 90 ml de caldo nutritivo estril a las bolsas con alimento.
Introducir en stomacher y homogeneizar durante unos 30".
La suspensin obtenida se puede volver a pasar al matraz estril (donde originalmente
se localizaba el caldo nutritivo) para su mejor manejo. Esta suspensin se utilizar para
realizar todos los anlisis a la muestra.
1.- MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
La cuantificacin de este grupo microbiano permite estimar de forma general la carga
microbiana presente en una muestra, si bien no aporta datos concretos sobre el tipo de
especies predominantes. No obstante, su conocimiento siempre es interesante, ya que su
valor es reflejo de la calidad sanitaria y, adicionalmente, suele proporcionar informacin
con respecto a la existencia de prcticas incorrectas, tales como vertidos o manipulacin
inadecuada. Sin embargo, los datos derivados del recuento de la microbiota aerobia
mesfila no deben ser considerados como parmetros absolutos en cuanto a su valor
indicador, ya que un resultado elevado no ha de ir necesariamente unido a la presencia
de microorganismos patgenos o toxinas ni, por el contrario, un bajo recuento en el
nmero de colonias de estas caractersticas se relaciona siempre con la ausencia de
microbiota patgena.
Por tanto, y considerando las reservas anteriormente comentadas, es necesario
siempre determinar la cantidad de microorganismos aerobios mesfilos y extraer las
conclusiones adecuadas de dicha informacin, sin que ello signifique obviar otros anlisis
de mayor especificidad y vala.

INVESTIGACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS EN ALIMENTOS

Recuento por siembra en agar a sobrefusin.
5

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Guin de prcticas

Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri.
Tubos con Agar PCA (Plate Count Agar) a sobrefusin.
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-4).
Sembrar 1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri vacas.
Verter el Agar PCA a sobrefusin sobre las placas y homogeneizar con la muestra.
Incubar a 37C durante 24 y 48 horas.
Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.
Resultados:
N colonias

Dilucin sembrada

Volumen sembrado

UFC/g

INVESTIGACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS EN AGUA

Recuento por siembra en superficie.
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri con Agar PCA (Plate Count Agar).
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-4).
Sembrar 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri.
Extender el volumen inoculado por toda la superficie.
Incubar a 37C durante 24 y 48 horas.
Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.
Resultados:

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Guin de prcticas

N colonias

Dilucin sembrada

Volumen sembrado

UFC/g

2.- HONGOS Y LEVADURAS

A pesar de su estudio conjunto, bajo este epgrafe se encuadran especies microbianas de
muy diferentes caractersticas. Se considera como moho determinado tipo de hongo
multicelular filamentoso, dotado de micelio verdadero y microscpico, mientras que las
levaduras son aquellos hongos con clulas independientes que crecen formando
agregados y que pueden presentar diferentes aspectos celulares, desde globosas hasta
cilndricas, pasando por formas alargadas u ovoides. Las levaduras, en medio slidos
generan colonias semejantes a las que se aprecian en las bacterias.
Otra diferencia entre ambos grupos reside en su identificacin. Las levaduras, al igual
que las bacterias, pueden ser sometidas a diferentes pruebas bioqumicas que permiten
su diferenciacin. Sin embargo, los mohos raramente pueden ser clasificados de acuerdo
a este criterio, siendo ms habitual su clasificacin de acuerdo a caracteres morfolgicos
observados por microscopa.
INVESTIGACION DE HONGOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
Recuento por siembra en superficie.
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri con Agar Rosa de Bengala.
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-3).
Sembrar 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri.
Extender el volumen inoculado por toda la superficie.
Incubar a 25C durante 4 das y realizar lectura.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 20 y 80.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.

Resultados:
N colonias

Dilucin sembrada

Volumen sembrado

UFC/g

3.- MICROBIOTA PSICROTROFA

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Guin de prcticas

Bajo este nombre genrico se agrupan todas aquellas especies con capacidad para crecer
a temperaturas de refrigeracin, comprendidas entre 4 y 20C. De forma estricta, los
microorganismos psicrotrfos presentan una temperatura ptima de desarrollo entre 10 y
20C, aunque pueden llegar a crecer a valores inferiores a 5C. Seran, por tanto,
especies tolerantes. En oposicin, existen microorganismos que no slo toleran, sino que
demandan valores trmicos en torno a 0C para mostrar un correcto grado de
crecimiento. Son los denominados psicrfilos.
Especies Gram negativas
Especies Gram positivas

Achromobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Hafnia,

Proteus,
Alcaligenes,
Aeromonas,
Klebsiella,
Enterobacter,
Escherichia,
Serratia,
Acinetobacter
Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptococcus,
Staphylococcus, Micrococcus

Adems de las relacionadas en los anteriores cuadros, diferentes especies de

reconocido carcter patgeno, tales como Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes
y Clostridium botulinum estn capacitadas para desarrollase a bajas temperaturas.
INVESTIGACION DE MICROORGANISMOS PSICROTROFOS
Recuento por siembra en superficie.
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri con Agar PCA.
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-3).
Sembrar 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri.
Extender el volumen inoculado por toda la superficie.
Incubar a 20C durante 5 das y realizar lectura.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.

Resultados:
N colonias

Dilucin sembrada

Volumen sembrado

UFC/g

4.- ENTEROBACTERIAS TOTALES EN ALIMENTOS

La familia Enterobacteriaceae est integrada por bacilos Gram negativos cuyas
caractersticas generales se describen en la Tabla I:

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Guin de prcticas

Esta familia incluye 29 gneros y ms de 100 especies, de las que aproximadamente

23 tienen significacin desde el punto de vista higinico y sanitario. Dichas especies
pertenecen a 14 gneros que se diferencian en dos grupos segn su capacidad para
fermentar la lactosa (Tabla 2).
El anlisis de enterobacterias se utiliza en alimentos para sealar la calidad sanitaria
de alimentos procesados (pasteurizados, cocidos, alimentos infantiles, etc.). Niveles altos
en estos productos indican elaboracin poco higinica, contaminacin posterior a su
fabricacin o ambas cosas. Por tanto, una concentracin de este grupo microbiano por
encima de los valores de referencia siempre implica un riesgo alimentario y alerta
respecto a la posible incidencia de anomalas.
En general se recomienda la numeracin de Enterobacteriaceae cuando se altera el
equilibrio de la microbiota de un alimento por distintas causas: propiedades intrnsecas
del alimento (pH y aw bajos), conservacin en condiciones desfavorables para no
esporulados (refrigeracin, congelacin), tratamiento trmico (pasteurizacin), etc.
Tabla 1. Caractersticas generales de los miembros
de la familia Enterobacteriaceae
Bacilos Gram negativos
Aerobios o anaerobios facultativos
No esporulados
Mviles o inmviles
Fermentan la glucosa
Reducen NO3- a NO2- a
Citocromo-oxidasa negativos
Catalasa positivo b
Crecen en medios con sales biliares
a
b

Excepto algunas especies de Erwinia y Yersinia

Excepto Shigella dysenteriae O grupo 1 y Xenorhabdus

Dentro de este grupo no es necesario identificar especies concretas, puesto que

todas ellas muestran similar significacin. La analtica se realiza mediante cuantificacin
de UFC en medios adecuados en los que se detecta la caracterstica fermentacin de la
lactosa. Estos medios, adems, contienen sales biliares que permiten la seleccin de las
enterobacterias frente a otros grupos microbianos presentes en el alimento,
principalmente Gram positivos. Las especies que responden a esta caracterstica,
integrantes habituales de la microbiota tpica de alimentos, muestran un alto grado de
incapacidad para crecer en presencia de este tipo de sustancias, as como de otros
compuestos, tales como el cristal violeta, que igualmente son adicionados a los medios
de cultivo destinados a la investigacin de enterobacterias. El medio de cultivo ms
utilizado para el recuento de enterobacterias en alimentos es el VRBG (agar biliadoglucosa-rojo neutro-cristal violeta).
INVESTIGACION DE ENTEROBACTERIAS EN ALIMENTOS
Recuento por siembra en placa.
Material
Pipetas de 1ml estriles.
Asa de cultivo.

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Placas Petri estriles.

Medios de cultivo: Agar biliado rojo violeta glucosa (V.R.B.G.) o Agar MacConkey.
Reactivo para la prueba citocromo-oxidasa.
Procedimiento:
Deteccin y recuento
Realizar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-4).
Depositar 1ml de cada dilucin en placas Petri estriles.
Verter 15ml de V.R.B.G. atemperado a 45-47C.
Mezclar cuidadosamente, dejar solidificar e incubar a 37C durante 18-24 horas.
Anlisis Presuntivo:
Contar colonias teidas de color rojo-violeta con halo prpura de precipitado de sales
biliares o todas las colonias, en caso de utilizar MacConkey. Estos medios permiten a la
vez diferenciar entre los dos grupos principales de enterobacterias:
Lactosa positivas: En este grupo se incluyen los coliformes, que estudiaremos con
ms detalle en la prctica siguiente.

Lactosa negativas: Grupo en el que se incluye la mayora de enterobacterias

patgenas (ej. Salmonella, Shigella, Yersinia).
Anlisis confirmativo:
Tomar colonias de distinta morfologa rodeadas de halo prpura (o de los principales
tipos) y realizar la prueba de la citocromo oxidasa (ver Anexo F). Esta prueba permite
discernir si las colonias crecidas son enterobacterias u otra bacteria que puede crecer en
dicho medio pero no es una enterobacteria, Pseudomonas. Esta bacteria es oxidasa
positiva y las enterobacterias son oxidasa negativas.
Resultados
Recuento: Nmero de enterobacterias totales. Se multiplica las colonias contadas en
medio VRBG y confirmadas, por el factor de dilucin en placa.
Confirmativo: Las enterobacterias son citocromo-oxidasa negativas.
UFC enterobacterias/g de alimento:

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Tabla 2. Principales aspectos relacionados con los gneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae
Lactosa
No
fermentan
lactosa

Gnero
Salmonella
Shigella
Edwarsiella
Hafnia
Proteus
Providencia
Yersinia
Morganella
Erwinia 1

Fermentan
lactosa

Hbitats
Vertebrados de sangre caliente y fra
Intestino del hombre
Intestino de animales sangre caliente y fra
Aguas residuales, suelo, agua, heces y alimentos
U.Tracto intestinal, agua residual, suelo, animales en descomposicin,
alimentos
Agua, alimentos, animales, intestino del hombre y animales sanos
Intestino hombre y animales de sangre caliente y fria
Agua, tracto intestinal del hombre

Patogenicidad
Gastroenteritis
Disentera bacilar o shigelosis
Discutido6
no patgeno
Infecciones spticas
Dudoso7

Patgeno oportunista

Escherichia

U. Tracto intestinal de animales de sangre caliente y hombre

Biotipos y serotipos producen

gastroenteritis

Enterobacte
r
Klebsiella 2
Citrobacter 3
Serratia 4

Suelo, agua, agua residual, tracto intestinal hombre y animales

Agua, suelo, aguas residuales, tracto respiratorio e intestinal
Intestino, suelo, aguas fecales y alimentos
U. Alimentos

Trastornos gastroentricos
Gastroenteritis, alergias
Discutido
Patgeno oportunista

U: Muy distribuido en la naturaleza

1
Fermenta excepcionalmente la lactosa
2
Excepto Kb.pneumoniae sb rhinoscleromatis
3
Fermentan la lactosa un 75 % de las cepas
4
Fermantacin de lactosa variable
5
E. Torda se ha encontrado en heces normales y diarreicas
6
Aislado en heces diarricas, infecciones tractourinario

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prcticas

Guin de

5.- COLIFORMES
Los coliformes son bacilos gram negativos, no esporgenos pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa en 48 horas (son las enterobacterias
fermentadoras de la lactosa) con produccin de cido y gas en presencia de sales
biliares.
En este grupo se incluyen cuatro gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y
Klebsiella, adems de algunas cepas de Serratia (ver Tabla 3).
Tabla 3. Caracteristicas del grupo coliforme
Prueba
Glucosa
Gas glucosa
Lactosa
Indol
Rojo metilo
Voges-Proskauer
Citrato
Urea
Movilidad

Escherichi
a
+
+
+
+
+
+/-

Klebsiella

Enterobacte
r

Citrobact
er

+
+
+
d
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+/+

+
+
d
+
+
d
+

d= dudoso

El hbitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, aunque

tambin se pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas
superficiales y vegetales). As, su procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. Los
coliformes son resistentes a condiciones medioambientales adversas, soportan la
desecacin, pero no condiciones de congelacin o refrigeracin. Esta ltima caracterstica
hace que su investigacin en alimentos congelados no tenga ninguna relevancia.
Solamente son tiles como indicadores de la calidad en ciertos tipos de productos
terminados o indicativos de la fase de conservacin y almacenamiento.
En el grupo coliforme destacan por su mayor significacin sanitaria los coliformes
fecales, entendiendo como tales aquellos capaces de desarrollarse entre 44 y 46C
(habitualmente 44,5 o 45,5C) con produccin de cido y gas a partir de lactosa.
INVESTIGACION DE COLIFORMES EN ALIMENTOS
Recuento por NMP
Material
Tubos de ensayo 16x160mm.
Gradillas.
Pipetas estriles de 10 y 1ml.
Estufa de cultivo.
Tubos con 10 ml caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL) y campana Durham.
Agar EMB (eosina azul de metileno).

Procedimiento:

12

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prcticas

Guin de

La deteccin de este grupo se fundamenta en su capacidad para fermentar la lactosa con

produccin de gas en presencia de sales biliares. La cuantificacin se realiza mediante la
tcnica del nmero mas probable (NMP).
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10-1 a 10-3).
Preparar tres series de tres tubos cada una con 10ml de BGBL y campana Durham.
Adicionar 1ml de cada una de las diluciones a cada uno de los tres tubos de cada serie:
A tres tubos de la primera serie se adiciona 1ml de dilucin 1:10.
A tres tubos de la segunda serie se adiciona 1ml de dilucin 1:100.
A tres tubos de la tercera serie se adiciona 1ml de dilucin 1:1000.
Incubar a 37C durante 24 y 48 horas.
Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura e interpretacin:
Observacin de la generacin de gas depositado en la campana Durham (al menos en
1/10 parte de su volumen) y de la aparicin de coloracin amarilla en el medio de cultivo
como consecuencia de la fermentacin de la lactosa.
Confirmacin:
Sembrar por estra (aislamiento) con asa de platino los tubos positivos en agar EMB.
Incubar a 35C durante 24-48 horas.
La aparicin de colonias con brillo verde metlico o negras confirma la presencia de
coliformes.
Anotar el nmero de tubos confirmados en cada serie y recurrir a la tabla del NMP
donde se obtiene el recuento por gramo o mililitro de alimento.
Tabla 2. NMP
Nmero de tubos positivos en cada
dilucin
-1
Dilucin 10
Dilucin 10-2 Dilucin 10-3
0
0
0
0
01
0
1
0
1
0
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
2
0
2
0
0
2
0
1
2
1
0
2
1
1
2
2
0
2
2
1
3
0
0
3
0
1
3
0
2
3
1
0
3
1
1

NMP por gramo o mililitro

<3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
70

13

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prcticas

3
3
3
3
3
3
3

2
2
2
3
3
3
3

Guin de

0
1
2
0
1
2
3

90
150
210
200
500
1100
>2400

* Para calcular el NMP de diluciones mayores de las que figuran en la tabla, multiplicar el NMP por
el factor adecuado. Ejemplo: Si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10- 3, 10-4 y
10-5 multiplicar por 100.

Deteccin y recuento de coliformes fecales:

Tomar con pipeta 1 ml de los tubos positivos y transferir a tubos con 10ml de medio
BGBL con campana Durham.
Incubar a 44C/24h.
Anotar tubos positivos (amarillos y con gas en campana).
Determinar NMP de coliformes fecales.
Resultados:
Dilucin 10-1

Dilucin 10-2

Dilucin 10-3

N tubos positivos
(coliformes)
N tubos confirmados
(coliformes)
N tubos positivos
(coliformes fecales)
NMP coliformes/g:
NMP coliformes fecales/g:
INVESTIGACION DE COLIFORMES EN AGUA
Recuento por filtracin
Material
Sistema de filtracin.
Filtros de 0,45 m.
Pinzas
Placas petri con Agar EMB (eosina azul de metileno).

Procedimiento:
La deteccin de este grupo se fundamenta en su capacidad para fermentar la lactosa en
presencia de sales biliares. La cuantificacin se realiza mediante la tcnica del nmero
mas probable (NMP).
Deteccin y Recuento

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prcticas

Guin de

Filtrar 100 ml de muestra sobre un filtro de 0,45 m en un ambiente asptico.

.Retirar el filtro con unas pinzas y depositarlo sobre una placa con Agar EMB.
Incubar a 37C durante 24 y 48 horas.
Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura e interpretacin:
Observacin de las colonias aparecidas sobre el filtro. Todas aquellas de tonalidad azul
oscura con brillo verde metlico son consideradas fermentadoras de lactosa y, por tanto,
coliformes.
Resultados
Recuento: Nmero de coliformes. Se divide el nmero de colonias obtenidas por el
volumen analizado.
UFC coliformes/ml:

6.- DETECCION DE Salmonella EN ALIMENTOS

El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varias especies
patgenas para el hombre y los animales. Son bacilos Gram negativos anaerobios
facultativos, mviles por flagelos peritricos.
En el hombre causan dos cuadros clnicos: fiebre tifoidea y gastroenteritis. Esta
ltima es considerada como una intoxicacin alimentaria y se manifiesta tras 12-36 horas
de ingerir el alimento con vmitos, nuseas, dolores abdominales, fiebre y diarrea que
persisten durante 1 a 7. El reservorio son las personas portadoras (infectadas) y animales
enfermos (aves principalmente). La transmisin se realiza a travs de los alimentos,
destacando la carne y productos crnicos (carnes picadas, salchichas), la leche y los
huevos (cremas, pasteles, helados). La refrigeracin de los alimentos y una correcta
manipulacin y coccin limitan la contaminacin.
Cuando un alimento est contaminado con salmonelas suele contener tambin gran
cantidad de enterobacterias muy similares. Por ello es necesario realizar un
enriquecimiento de la muestra en medios selectivos que propician el crecimiento de
Salmonella frente a otras bacterias presentes. Por otra parte, como se suele exigir la
ausencia de este microorganismos en el alimento, la analtica debe ir enfocada a
demostrar que efectivamente no se encuentra en el alimento.
INVESTIGACION DE Salmonella EN ALIMENTOS
Material
Pipetas de 1ml estriles.
Asa de cultivo.
Placas Petri estriles.
Medios de cultivo:
Medio de preenriquecimiento: Caldo nutritivo.
Medio de enriquecimiento: Caldo selenito-cistina.
Medio para deteccin: Agar Hektoen.
Reactivo para la prueba citocromo-oxidasa.
Procedimiento:

15

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prcticas

Guin de

Toma de muestras y homogeneizacin: Tomar 25 g de alimento, mezclar con 225ml de

caldo nutritivo y homogeneizar (si el alimento es cido debe ajustarse el pH a 6-7).
Preenriquecimiento: Incubar el homogeneizado 16-20h a 37C.
Enriquecimiento: Inocular 1ml del cultivo de preenriquecimiento en un tubo con 10 ml
de caldo selenito-cistina. Incubar durante 24-48h.
Deteccin: A partir del tubo de enriquecimiento inocular placas con agar Hektoen
(tcnica de aislamiento). Incubar las placas 48 h a 37C.
Lectura:
Las colonias de Salmonella en agar Hektoen aparecen verde azuladas con o sin centro
negro.
Anlisis confirmativo (opcional): Se realizar una u otra prueba.
Tomar colonias sospechosas e inocularlas en sistema API 20.
Tomar colonias y realizar la prueba de Kligler.
Resultados
Se expresan como presencia o ausencia en 25 g de alimento.
7.- DETECCION DE Staphylococcus EN PORTADORES SANOS
Staphylococcus aureus es un microorganismo de forma coccea que se agrupa en
adoptando una disposicin de racimos irregulares. Son anaerobios facultativos, aunque
crecen mejor en aerobiosis. Muestran un buen desarrollo a concentraciones de NaCl
superiores al 10%, caracterstica que se aprovecha para su aislamiento.
S. aureus produce intoxicacin alimentaria de carcter toxignico. Estos
microorganismos producen enterotoxinas que actan a nivel del tubo digestivo
produciendo nuseas, vmitos y diarreas. Estos sntomas aparecen a las pocas horas de
ingerido el alimento contaminado.
La principal fuente de contaminacin de los alimentos se encuentra en los
manipuladores. Este microorganismo se localiza en la nariz, piel, pelo o en lesiones. El
50% de las personas sanas albergan S. aureus en su nasofaringe y al menos un 20%
pueden producir toxinas. Estas personas contaminan el alimento mediante secreciones
nasales, saliva, escoriaciones, partculas de heridas infectadas o al tocar con la mano
contaminada el alimento. Los principales alimentos implicados en la intoxicacin
estafiloccica son leche, carne y productos crnicos, pescados, huevos, pasteles y
ensaladillas.

INVESTIGACION DE Staphylococcus EN PORTADORES SANOS

En esta prctica se pondr de manifiesto la presencia de S. aureus en portadores sanos.
Material
Torunda de algodn.
Asa de cultivo.
Placas con medio de Chapman (manitol, 7,5% NaCl, rojo fenol).
Procedimiento:
Tomar en condiciones aspticas muestra de la fosa nasal del posible portador.

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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios

prcticas

Guin de

Realizar un aislamiento en placa con medio de Chapman.

Lectura:
S. aureus forma colonias de color amarillento en el medio de Chapman.
Anlisis confirmativo:
Tomar colonias sospechosas y realizar prueba de la DNAsa.
Resultados
Se expresan como presencia o ausencia de S. aureus DNAsa positivos.

8.- LA LEVADURA COMO AGENTE ESPONJANTE DE LA MASA PANARIA

Una amplia mayora de los productos de panadera se obtienen como consecuencia de los
procesos fermentativos que llevan a cabo diferentes bacterias cido lcticas
(Lactobacillus plantarum, Lb. brevis y Lb. fermenti)y, principalmente, levaduras. Ambos
grupos microbianos proceden de la microbiota tpica que se puede encontrar en los
cereales, materia prima bsica de estos productos, y que muestran capacidad para
persistir durante el proceso de panificacin. Las primeras fermentan los azcares
liberados durante la hidrlisis del almidn, generando cido lctico, cido actico, etanol
y CO2, en proporciones dependientes del tipo de especie predominante. Las levaduras
fermentan igualmente los azcares hasta formar etanol y CO 2. Los cidos son
responsables del sabor, mientras que el gas producido dota la masa de la porosidad y
ligereza adecuadas.

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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios

prcticas

Guin de

Las levaduras pueden llegar a generar hasta 350 ml de CO 2 por cada 100 g de masa,
hasta un 60% ms del volumen que se consigue con las levaduras sintticas, en las que
el bicarbonato sdico supone una parte importante. La especie predominante es
Saccharomyces cerevisiae, pero no resulta infrecuente la participacin de otras especies
del gnero. El proceso de produccin de la masa panaria se lleva a cabo e diferentes
etapas, en cada una de las cuales tiene lugar el crecimiento microbiano sobre una mezcla
adecuada de agua y harina. En la fase inicial de cada una de las etapas se desarrollan
preferentemente las levaduras, modificando la porosidad de la masa, y posteriormente
crecen los lactobacilos, que influyen de forma mayoritaria sobre la concentracin de
cidos. Durante el proceso se observa un incremento de la temperatura de 22-24C hasta
28-30C.
La masa obtenida se moldea en la forma adecuada y se cuece. Las condiciones de
temperatura y tiempo aplicadas dependen del tipo de pan y de su peso. No obstante, la
zona externa siempre alcanza valores trmicos superiores, hasta el punto de que se
produce la caramelizacin de algunos azcares, lo que favorece la formacin de la
corteza. El resto de la masa experimenta prdida de agua y formacin de compuestos
que contribuyen al aroma y sabor definitivos del pan. Las protenas presentes se
coagulan, proporcionando una mayor consistencia a la masa y, en general, se incrementa
la digestibilidad del producto.
ACCIN ESPONJANTE DE LAS LEVADURAS DE PANADERA
A partir de una mezcla adecuada de harina y agua, con adicin o no externa de azcares
suplementarios, y mediante inoculacin con una suspensin de levadura, es posible
determinar cuantitativamente la esponjosidad de la masa panaria mediante el
incremento que experimenta el volumen de dicha masa.
Material
Vasos de precipitado de 250 ml (4).
Matras Erlenmeyer de 250 ml.
Pipeta de 10 ml.
Harina de trigo.
Glucosa.
Balanza.
Estufa.

Procedimiento:
Numerar los vasos de precipitado del 1 al 4.
Aadir a cada uno 25 g de harina de trigo.
Aadir 3 g de glucosa a los vasos 1, 2 y 3.
Aadir 22,5 ml de agua al vaso 1 y 15 ml al 2.
Preparar la suspensin de levadura por adicin de 10 g en 120 ml de agua templada.
Aadir 7,5 ml de la suspensin al vaso 1, 15 ml al vaso 2, y 30 ml a los vasos 3 y 4 y
mezclar adecuadamente.
Incubar a 30C durante 90 minutos e ir observando el incremento de volumen.
9.- ELABORACIN DE ALIMENTOS POR FERMENTACIN ACIDOLCTICA: YOGUR.
La obtencin de alimentos derivados de los procesos de acidificacin realizados por
determinados grupos bacterianos es una prctica habitual desde tiempos inmemoriales.

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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios

prcticas

Guin de

Generalmente, estos productos estn destinados al consumo humano (derivados lcteos,

col fermentada), aunque existen algunas excepciones tales como la produccin de
alimentos destinados al ganado.
Los microorganismos con capacidad para realizar este tipo de transformaciones se
conocen genricamente como bacterias lcticas. Este tipo bacteriano est constituido un
grupo homogneo de especies Gram positivas con metabolismo anaerobio, aunque
aerotolerantes, que fermentan los sustratos carbonados, fundamentalmente azcares,
con formacin de cido lctico y que, por sus caractersticas, suelen encontrarse en la
leche, en plantas y en la mucosa intestinal de animales y seres humanos.
Pero a pesar de su notable homogeneidad, existen diferencias entre las distintas
especies lcticas que permiten establecer dos grandes grupos en funcin a la existencia
de otros productos finales, adems del cido lctico, como consecuencia de su actividad
metablica. As, se habla de bacterias homofermentativas en referencia a aquellas
bacterias que originan nicamente este cido como consecuencia de la fermentacin
(concentraciones superiores al 90%) o heterofermentativas en relacin a las especies en
las que se obtiene una mezcla de cido lctico, cido actico, etanol y dixido de
carbono, no superando el primero de ellos el 50% del total.
La elaboracin de derivados lcteos supone un importante porcentaje del global de la
industria alimenticia, dando lugar a la produccin de nata, mantequilla, leche cuajada o
yogur. Este ltimo producto procede originariamente de Los Balcanes, lugar en el que
inicialmente se preparaba a partir de leche de oveja o cabra, aunque actualmente se
obtiene de forma mayoritaria utilizando leche de vaca. La leche es sometida a un proceso
de pasteurizacin a 858C, tras el cual, y previo enfriamiento hasta 50C, es inoculada con
un cultivo mixto de Lactobacillus bulgaricus (proporciona el aroma) y Streptococcus
termophilus (confiere al yogur su sabor fresco y cido). Ambas bacterias presentan sus
mximos niveles de actividad a 40C, inhibindose su desarrollo a valores inferiores a
15C. La leche inoculada es transferida a los envases de comercializacin e incubada a
40C durante 9-12 horas, tiempo en el que se coagula y se alcanza un contenido en cido
lctico entre el 1 y el 1,5%. Inmediatamente despus se enfra y se mantiene en estas
condiciones de temperatura hasta su consumo, evitando as una excesiva acidificacin.

DESARROLLO PRCTICO
Material

Leche fresca entera

Yogur
Vaso de precipitado
Placa Petri
Varilla de vidrio

Procedimiento

Pasteurizar la leche fresca a 85C durante 5 minutos.

Dejar enfriar hasta 50 C.
Inocular con una pequea cucharada de yogur y mezclar bien con la varilla de vidrio.
Tapar con la placa de Petri e incubar a 40C durante 9-12 horas.
Enfriar en refrigerador y conservar.

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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios

prcticas

Guin de

Realizar una tincin de Gram a partir del yogur elaborado o del comercial.

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Microbiologa
Guin de prcticas

de

los

Productos

Agroalimentarios

Temporalizacin

Introduccin

Sesin 1
Introduccin al
laboratorio de
Microbiologa

Sesin 2

Sesin 3

Sesin 4

Sesin 5

Sesin 6

Preparacin de
muestras
Microbiota
mesfila aerobia
Hongos y
levaduras
Microorganismos
psicrtrofos

Siembra (AL y AG)

Lectura

Tinciones

Tinciones

Siembra

Lectura

Siembra

Lectura

Siembra

Lectura
enterobacterias
Prueba
confirmativa

Coliformes

Siembra (AL y AG)

Lectura coliformes
Confirmativa
coliformes

Lectura
confirmativa
Siembra C.
fecales

Lectura C. fecales

Salmonella

Preenriquecimient
o

Enriquecimiento

Siembra Hektoen

Lectura
Prueba
confirmativa

Enterobacterias

S. aureus
Obtencin de
yogurt
Masa panaria

Lectura
Siembra (Chapman) Siembra en agarDNAsa
Realizacin
completa

Lectura Kligler

Lectura DNAsa

Realizacin
completa

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Microbiologa
Guin de prcticas

de

los

Productos

Agroalimentarios

http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totales-fecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml

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