620696814.guia de Trabajos Practicos de Microbiologia

Ctedra de Microbiologa General- FaCENA-UNNE
Universidad Nacional del Nordeste

Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales y Agrimensura
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
MICROBIOLOGIA GENERAL
CARRERA: BIOQUMICA
CTEDRA: MICROBIOLOGA GENERAL
AUTORES: LAURA IRENE PICCOLI

MARA VIVIANA BOJANICH
MARA DE LOS ANGELES LPEZ
MARA DE LOS ANGELES SOSA
MARA CELIA GOMEZ OMIL
AO: 2016
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BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Un accidente ocurre por mltiples causas, pero casi siempre se debe a errores
humanos, con excepcin de las grandes catstrofes debidas a fenmenos atmosfricos.
Una vez ocurrido dicho accidente, su consecuencia puede ser banal, Terminal o grave.
Por lo tanto, resulta de vital importancia que dicho accidente no ocurra y para ello es
necesario conocer los hbitos de trabajo en el laboratorio de microbiologa as como
tambin los peligros potenciales que encierra el manejo de material biolgico y
reactivos qumicos de diferente naturaleza, y aquellos altamente txicos y/o
cancergenos.
Resulta de fundamental importancia considerar en todo momento que, cuando se
manejan agentes infecciosos, existe siempre una posibilidad de infeccin, tanto para el
operador como para otras personas, en caso de negligencia o descuido.
A continuacin se enumeran una serie de precauciones que deben ser
consideradas para reducir el riesgo de adquirir infecciones y permitir el adecuado
trabajo en el laboratorio:
1. Los ojos, la boca, la nariz, las pequeas abrasiones presentes en nuestras
manos constituyen sitios efectivos de entrada para los microorganismos.
En consecuencia, se recomienda no comer, beber, fumar ni tocarse la
cara durante la realizacin del trabajo prctico, as como tambin el
lavado de manos previo y posterior una vez finalizado el mismo.
2. El uso de guardapolvo ser imprescindible para la proteccin del
operador. El mismo deber ser higienizado peridicamente y adems
deber evitar el contacto con ropa de calle.
3. Mientras se maneja material estril, es conveniente no hablar ni circular
por el laboratorio, de manera tal de evitar las corrientes de aire y por
ende disminuir el riesgo de contaminacin.
4. Con el fin de reducir la contaminacin de material estril, las mesadas
debern ser limpiadas con un trapo o papel embebidos en una solucin
desinfectante (por ejemplo, lavandina o etanol 70%) antes y despus de
trabajar.
5. El material contaminado ser descartado en recipientes provistos para
tal efecto. Nunca se volcarn cultivos de microorganismos en las piletas.
6. Los cultivos debern ser rotulados con nombre o nmero identificatorio,
nombre del material y fecha. La incubacin de los mismos es
responsabilidad del operador.
7. Los microscopios pticos sern limpiados y guardados adecuadamente.
Los reactivos se ubicarn en una zona del laboratorio destinada para tal
fin. Se deber revisar si los mecheros quedaron correctamente apagados
una vez finalizado el trabajo.
Cuando por razones ajenas a la voluntad de los operadores ocurre un accidente,
es obligatorio saber las conductas a seguir dado que el devenir de la salud de las
personas involucradas depende del tiempo en que se pone en prctica el auxilio
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correcto. En particular, si un cultivo es volcado o roto su envase, o si alguien resultara

herido en tal episodio, se deber informar de inmediato a la persona responsable a
cargo del trabajo en el laboratorio.
Deseamos transmitir que todas las medidas de bioseguridad no son per se

prohibitivas o represivas, se trata de preservar la salud e integridad de los operadores
interesados en aprender correctamente el manejo de microorganismos.
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Trabajo Prctico N 1 :
PREPARACIN DE MATERIALES Y ESTERILIZACIN
Objetivos:
Que el alumno conozca los diferentes materiales con los que se desarrollan los prcticos
de Microbiologa General
que el alumno se familiarice con los mtodos que existen para la esterilizacin de los
materiales en el laboratorio de bacteriologa.
que aprenda a decidir cual es el mtodo o procedimiento de esterilizacin mas adecuado
segn el material que desea esterilizar.
FUNDAMENTOS TERICOS.
Esterilizacin: Concepto y mtodos.

La esterilizacin es un proceso a travs del cual un objeto o sustancia queda
libre de todo organismo viviente, en trminos de viabilidad, la capacidad que ese
organismo posee para dividirse. Existen varios mtodos prcticos para esterilizar: la
eleccin depende, fundamentalmente, de la naturaleza de los materiales a esterilizar y
de la conveniencia.
Asimismo, se pueden emplear distintos mtodos de desinfeccin mediante
agentes que slo disminuyen el riesgo de contaminacin sin garantizar la eliminacin de
todo organismo viviente, fundamentalmente por la eliminacin de los micoorganismos
patgenos. Es decir, la desinfeccin elimina el potencial infectivo de un material.
A su vez, un antisptico se opone a la sepsis o a la putrefaccin, ya sea por
accin letal de los microorganismos o impidiendo su desarrollo. Este trmino se emplea
con frecuencia para aquellos agentes que se aplican en forma tpica sobre los tejidos
vivos.
La eleccin de un procedimiento o agente apropiado est determinada por la situacin
especfica y por el hecho de que sea necesario destruir a todos los microorganismos
(m.o.) o slo a ciertas especies. La destruccin completa de todos los m.o. presentes
sobre cualquier material o dentro de l, es indispensable en los procedimientos
quirrgicos, en la preparacin de medios de cultivo y material de vidrio utilizado en el
laboratorio de Microbiologa, y en el envasado de alimentos, por ejemplo. En el cuidado
de personas con enfermedades transmisibles, la destruccin del patgeno es necesaria
para prevenir la diseminacin de la infeccin a personas susceptibles. Con este
propsito, una desinfeccin resulta adecuada y, en general, se la emplea en el
procedimiento de limpieza.
La esterilizacin o desinfeccin pueden llevarse a cabo segn dos mtodos:
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1- Mtodos fsicos:
Agentes Aplicacin
Calor hmedo Esterilizacin
Calor seco Esterilizacin
Radiacin ultravioleta Desinfeccin o Esterilizacin
Radiaciones ionizantes (, x) Esterilizacin
Filtracin Esterilizacin
2- Mtodos qumicos:
Agentes Aplicacin
Alquilantes Oxido de etileno Esterilizacin
Formaldehdo Desinfeccin o Esterilizacin
Alcoholes (alifticos y aromticos) Desinfeccin
Oxidantes: halgenos, KMnO4, H2O2 Desinfeccin o antisepsia
Tensioactivos catinicos y aninicos Desinfeccin
Metales pesados Desinfeccin o antisepsia
Soluciones de cidos o lcalis Desinfeccin
METODOS FISICOS
1- Esterilizacin por calor.
a) Calor Hmedo.
Es proporcionado por autoclaves, aparatos especiales capaces de generar vapor
bajo presin. El principio esterilizante del autoclave se basa en la acumulacin de vapor
y no en la presin desarrollada en su interior. El vapor se condensa en los objetos ms
fros y los calienta instantneamente cedindoles su calor latente. La esterilizacin en
autoclave se lleva a cabo desde 15 a 30 min a 121 C, condiciones que corresponden a
una presin aproximada de 1,1 Kg/cm 2 . El tiempo es necesario para que el vapor
penetre y caliente los materiales hasta la temperatura esterilizante que causa
coagulacin y desnaturalizacin de las estructuras proteicas y enzimticas. An cuando
dicha temperatura es alcanzada, las esporas y clulas vegetativas no mueren todas
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instantneamente; en general se requiere alrededor de 12 min a 121C para matar

endosporas.
Precauciones:
1- el vapor debe estar libre de impurezas e idealmente proporcionado a partir de
agua destilada.
2- La carga debe estar acomodada de manera tal que el vapor pueda circular
libremente.
3- Aquellos artculos que se encuentren cerrados hermticamente no estarn
estriles al finalizar la operacin (hay que permitir un intercambio gaseoso
eficiente para garantizar una esterilizacin adecuada).
4- Los frascos con medios lquidos no deben llenarse ms de las 2/3 partes de su
contenido, ya que el lquido se volcar durante el proceso.
5- Transcurrido el tiempo, la presin debe disminuir lentamente para evitar la
ebullicin violenta de las soluciones.
En autoclave se esterilizan soluciones salinas, ropa, guantes, materiales

de ciruga, tapones, gomas.
Para la esterilizacin de ciertos medios de cultivo lquidos que contienen

hidratos de carbono, huevo o suero, o materiales semislidos que son destruidos
con facilidad por el calor, se recurre a un mtodo de esterilizacin fraccionada.
Este procedimiento denominado tindalizacin, consiste en el calentamiento del
material a 80C o 100C durante 30 min, en 3 das consecutivos. El fundamento de
esta metodologa es que las clulas vegetativas y algunas esporas resultan
destruidas durante el primer calentamiento y las esporas ms resistentes germinan
luego y son destruidas durante el segundo o tercer ciclo de calentamiento.
La mayor parte de las bacterias en sus formas vegetativas pueden ser
destruidas por exposiciones breves de 60 a 65C. La aplicacin ms importante de
este rango de temperatura se relaciona con la pasteurizacin de leche y
preparacin de vacunas. La pasteurizacin de la leche consiste en el calentamiento
a una temperatura de 72C durante 1 o 2 min, seguido de un enfriamiento rpido.
Esto no esteriliza la leche, pero s destruye todas las bacterias productoras de
enfermedades que son transmitidas por la leche.
b) Calor Seco.
Los generadores de calor seco son hornos, y la esterilizacin se produce cuando los
objetos fros absorben el calor del aire caliente que los rodea. Esta absorcin es lenta,
por lo que se requiere mayor tiempo para asegurar el proceso (30 min a 121C en
autoclave corresponden a 2 horas a 160C en horno). El calor seco destruye los
microorganismos por oxidacin de sus constituyentes esenciales.
Precauciones:
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1- Debe dejarse suficiente espacio entre los materiales ubicados en el interior

del horno para que el calor se distribuya uniformemente.
2- El tiempo mnimo es de 2 horas a 160-165C, pero en general se deja ms
tiempo ya que resulta muy difcil lograr la distribucin uniforme del calor, en
especial si la cantidad de material cargada en el horno es muy grande.
3- Una vez terminado el tiempo, es necesario permitir que los materiales se
enfren antes de abrir las puertas del horno para evitar bruscas
contracciones que pudieran provocar la ruptura de los materiales.
A travs de este mtodo se esteriliza la mayor parte del material de

vidrio (frascos, pipetas, tubos) as como ceras de parafina, aceites y polvos de
talco.
Incineracin por llama.

Este mtodo se usa para esterilizar la boca de los frascos y tubos, ansas, tijeras,
pinzas, etc. Las pinzas y tijeras deben sumergirse previamente en alcohol 96%
sostenindolas hacia abajo para evitar que el alcohol impregne los dedos y se incendie
al flamear.
Este tipo de rutina se utiliza cuando se trabaja cerca del mechero en
microbiologa, evitando cualquier contaminacin accidental.
Incineracin: procedimiento de esterilizacin ideal de todos aquellos productos
contaminados en la cual no interesa su destruccin. Se usa para la esterilizacin y
posterior eliminacin de material biolgico potencialmente infeccioso
2- Radiaciones.
a) Radiacin ultravioleta.
Su efectividad como agente letal y mutgeno depende de la longitud de onda. La
longitud de onda ms efectiva como bactericida se encuentra en el espectro de 240 a
280 nm, con un ptimo a 260 nm, que corresponde con la mxima absorcin del DNA.
La radiacin UV conduce a la formacin de uniones covalentes entre residuos de
pirimidina adyacentes entre s ubicados en la misma hebra, dando lugar a la formacin
de dmeros de pirimidina. stos interfieren en el apareamiento normal de las bases y el
resultado final es la inhibicin de la sntesis del DNA. La radiacin UV es efectiva
contra m.o. Gram positivos y Gram negativos.
Este tipo de radiacin presenta algunos inconvenientes para ser usada como agente
esterilizante. Su energa es baja y su capacidad de penetracin es escasa. Por lo tanto
su aplicacin principal consiste en el control de infecciones transmitidas por el aire ,
donde se la emplea para la desinfeccin de reas cerradas como las salas de hospitales,
quirfanos y laboratorios.
b) Radiaciones ionizantes.
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Es tipo de radiacin es de alta penetracin e incluye rayos x y . Su accin letal se

produce en forma indirecta. A medida que las radiaciones ionizantes atraviesan el H 2O
provocan la ionizacin de sus molculas:
H2 O H 2 O+ + e-
H 2 O+ + H2 O H3 O+ + OH-
H2 O + e- OH- + H+
El OH- es un agente oxidante fuerte y el radical H es un poderoso agente reductor. El
OH- es altamente reactivo con macromolculas, en especial de DNA, al que rompe
produciendo una fractura en las cadenas consecutivas. A su vez, la presencia de O 2 con
los radicales libres hace que los mismos formen parte de una cadena de reacciones
autooxidativas destructivas.
Las radiaciones ionizantes son adecuadas para la esterilizacin de material

quirrgico, mdico y de laboratorio descartable y en general en procesos de
esterilizacin en gran escala.
3- Filtracin.
Es el principal mtodo para esterilizar lquidos que contienen
componentes sensibles al calor, tales como vitaminas, protenas sricas, antibiticos
y soluciones salinas definidas.
Consiste en hacer pasar lquidos por un material que posee poros ms pequeos
que las bacterias e incluso ms pequeos que los virus, con lo cual aquellos quedan
libres de microorganismos, segn el tamao de dichos poros.
Los filtros ms usados son:
Filtros de porcelana micro porosa
Filtros de asbesto
Filtros de vidrio molido
Filtros de acetato de celulosa
Para cualquier tipo de filtro, hay dos sistemas de filtracin: 1- al vaco por
succin o 2- mediante presin positiva.
En general, no se debe filtrar demasiado material a travs de un filtro en un
tiempo determinado, o continuar el proceso durante tiempo prolongado. Si el volumen
a filtrar es grande o la tasa de filtracin es lenta, es preferible usar vario filtros.
METODOS QUIMICOS
La reduccin de la cantidad de m.o. se obtiene a travs del empleo de germicidas o

desinfectantes que resultan muy txicos para todos los tipos de clulas.
Algunos de los agentes de naturaleza qumica ms usados:
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Compuestos inorgnicos: suelen tener efectos sobre las bacterias por disolucin de
sus iones o por su efecto oxidante. Ej: cidos y lcalis, agua oxigenada, permanganato
de potasio, etc.
Oxidantes.
Los halgenos, como el yodo en forma de tintura de yodo (0,2% de I 2 en 70% de
etanol), que se combina con protenas que tienen residuos de tirosina, es un antisptico
por su baja toxicidad.
El cloro (hipoclorito de Na) es un agente altamente corrosivo; su actividad se
neutraliza con materia orgnica.
Compuestos orgnicos: son muy variados los compuestos orgnicos que tienen efectos
sobre las bacterias, entre los mas importantes estn: alcoholes, fenoles, detergentes,
colorantes, aldehdos etc.
Agentes alquilantes.
Oxido de etileno (CH2 O --CH 2): es un agente alquilante sobre los grupos NH 2 de
las protenas, por lo que resulta de alta toxicidad. Se emplea en forma gaseosa
para esterilizar superficies expuestas, materiales porosos, instrumentos,
materiales plsticos, filtros.
Aldehdos:
a- formaldehdo (lquido o gaseoso) (HCHO): disponible como solucin al 37%
(formol), empleado como solucin acuosa al 2%. Es un agente alquilante que se
combina con grupos NH 2, -COOH y SH en los cidos nucleicos y protenas.
b- Glutaraldehdo: se emplea en solucin acuosa al 2% y presenta una toxicidad
menor a la del formaldehdo.
Alcoholes alifticos (etanol, isopropanol): Son ms activos cuando estn

diluidos en agua (50-70% de alcohol en agua). Son solventes de lpidos y
desnaturalizan protenas. Su poder desinfectante, y por lo tanto su
toxicidad, aumenta con su peso molecular, limitndose su accin a
aquellos alcoholes solubles en agua.
Alcoholes aromticos: los fenoles se utilizan como desinfectantes de

superficies fundamentalmente, debido a su alta accin txica.
Tensioactivos catinicos: actan afectando las membranas celulares

mediante interacciones de carga con los fosfolpidos. Se utilizan para
limpieza de material contaminado y superficies de trabajo.
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Tensioactivos aninicos: su accin se manifiesta a travs de una

eliminacin mecnica de los m.o., por lo tanto su accin no es
desinfectante. Se utilizan para el lavado del material ya decontaminado.
Metales pesados: sales de Hg, Cu, Ag y otros metales suelen utilizarse
como antispticos.
PARTE EXPERIMENTAL
La limpieza y esterilizacin del material de laboratorio de Microbiologa consta de tres

pasos:
1) Esterilizacin previa
La esterilizacin previa consiste en autoclavar durante 30 minutos a 121C (1 atm) el

material contaminado con muestras, cultivos, o sustancias potencialmente infecciosas.
Ej. Placa de petri, tubos, frascos, etc.
2) Limpieza del material
Se debe realizar una correcta limpieza del material, siguiendo los siguientes pasos:
Dejar el material durante por los menos 10 min en agua con detergente
Cepillar individualmente cada una de las piezas
Enjuagar con abundante agua presin
Una vez lavado el material dejar secar a temperatura ambiente proceder a la

preparacin del material a esterilizar.
3) Esterilizacin final
El material debe prepararse previo a la esterilizacin en autoclave o en estufa.
Temperaturas y tiempos
Autoclave: 20 minutos 121C
Estufa: 1 hora 170C

2 horas 160C
Preparacin del material:
o Material de vidrio
Placas de petri: se envuelven individualmente con papel (Estufa).
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Tubos con o sin tapn de algodn: se arman grupos de 10 tubos, y se

envuelven en papel (Estufa).
Pipetas: en la parte superior de la misma se coloca un tapn de algodn y
luego se envuelven con papel bien ajustado en forma individual (Estufa).
Frascos vacos con tapa a rosca de plstico: Se colocan tapados con la tapa
semi enroscada, con un capuchn de papel de aluminio o envueltos en papel
madera (Autoclave).
o Materiales metlicos: tijeras, esptulas, pinzas, etc. Se envuelven

individualmente, se colocan en cajas metlicas que cierren hermticamente.
(Estufa)
o Tips, tapones de goma, pipetas pasteur de vidrio, hisopos: Se colocan en frascos

de vidrio que en el fondo contengan un trozo de algodn, se cierra el frasco
dejando la tapa media floja. (Autoclave)
o Aceites, vaselina, talco: se colocan en frascos individuales con tapn de algodn

y capuchn de papel. (Estufa)
o Medios de cultivos soluciones: se colocan en frascos individuales con tapn de

algodn y capuchn de papel. (Autoclave)
o Material textil: Se dobla y se empaqueta en papel (Autoclave)
NOTA: todo el material a esterilizar debe estar correctamente rotulado. En el

rotulo se debe indicar el tipo de material y la fecha de esterilizacin.
El material que se ha esterilizado en autoclave se lleva a estufa de 37C hasta que
est completamente seco.
Una vez que ha finalizado el proceso de esterilizacin, el material deber ser guardado
correctamente (cajones, armarios, heladeras, etc.) a fin de evitar contaminaciones y
asegurar la duracin del proceso de esterilizacin. El tiempo promedio que dura la
esterilizacin es de 1 -3 meses, pasado dicho tiempo el material deber ser re
esterilizado por ms que no haya sido utilizado.
Actividades a realizar por el alumno:
1) Envoltura y preparacin de material de vidrio limpio para esterilizacin

2) Manejo de estufa de esterilizacin
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Bibliografa:
Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual de tcnicas de

laboratorio para la enseanza de la microbiologa bsica y aplicada. Ed. Atlante.
2000. Cap. 2, 3-12.
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Trabajo Practico N 2 :
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Objetivos
Que el alumno aprenda a:
- Conocer, diferenciar, clasificar y preparar (pesada, preparacin esterilizacin
y conservacin) los diferentes medios de cultivo utilizados en el laboratorio de
microbiologa.
FUNDAMENTOS TERICOS
Medios de Cultivo
Gran parte de la microbiologa depende de la capacidad de cultivar y mantener

microorganismos en un laboratorio, y esto slo es posible si se dispone de los medios de
cultivo adecuados.
Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes, en los que crecen

y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las
diferentes especies bacterianas, proceder a su identificacin y llevar a cabo estudios
complementarios.
Los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los
microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibiticos, analizar agua y alimentos, en
microbiologa industrial y otras actividades.
Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energa, carbono,
nitrgeno, fsforo, azufre y varios minerales, la composicin precisa de un medio
adecuado depender de la especie que se quiere cultivar, porque las necesidades
nutricionales varan considerablemente. El conocimiento del hbitat normal de un
microorganismo es a menudo til para elegir un medio de cultivo apropiado, porque sus
necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se utiliza
frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos especficos o para
facilitar la identificacin de una especie en particular. En estos casos, la funcin del
medio estar tambin determinada por su composicin.
Agentes gelificantes.
El agar es un polmero sulfatado de azcares, obtenido de algas marinas,

compuesto principalmente por D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y cido D-
glucurnico. Es un buen agente solidificador porque, una vez que se funde en agua
hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura de 40 a 42 c, sin endurecerse, y no
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fundir de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80 a 90C. Es tambin

excelente porque la mayora de los microorganismos no pueden degradarlo. Puede
utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para
la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada
para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce
se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales
txicos.
La gelatina es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el
inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy
limitado porque su punto de fusin es bajo (licua a temperatura ambiente) razn por la
que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la temperatura ptima de
crecimiento para muchos microorganismos.
Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los
ms importantes son aquellos que se basan en:
Consistencia Lquidos
Slidos
Semislido
Complejos
Composicin Sintticos
Semisintticos
Enriquecimiento o Multiplicacin
Selectivos o Inhibidores
Utilizacin o funcin Enriquecidos
Diferenciales
Identificacin
Transporte
1. Segn su consistencia
Medios Lquidos.
Son los que se presentan en este estado, denominndose por ello caldos.
Contienen los nutrientes antes citados, con adicin de algn tampn, capaz de
mantener el pH adecuado. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la
obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin.
Ejemplos: caldo nutritivo, caldo tioglicolato, agua peptonada , etc.
Medios Slidos.
Se prepara aadiendo un agente gelificante a un medio lquido determinado. Los
ms usados son gelatina y agar.
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Este conjunto, convenientemente esterilizado, se vierte en una placa de Petri o en

tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones fsico-qumicas son similares a las de
los medios lquidos. Pero, a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener
colonias aisladas, siempre que la cantidad de inculo est suficientemente diluida. En
este caso se puede observar la existencia de colonias separadas unas de otras, y cada
una constituye un clon (conjunto de bacterias que provienen de una clula madre, con el
mismo patrimonio hereditario y las mismas caractersticas fisiolgicas).
Ej.: agar nutritivo, agar EMB, CLDE y todos los medios de aislamiento primario y
de identificacin.
Medios Semislidos.
Se preparan a partir de medios lquidos, agregando un agente solidificante en
una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la
investigacin de la movilidad de las bacterias.
Ej.: agar cepa, SIM, medios base para utilizacin de aminocidos.
2. Segn su composicin.
Medios complejos.
Son aquellos que contienen ingredientes cuya composicin no es exactamente
definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Adems, no se conoce
exactamente la proporcin de cada uno de sus componentes. Esto tiene ciertos
inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproducibilidad no podr ser
exacta. En la prctica estos medios dan excelentes resultados y son los ms
empleados.
Ejemplo: caldo nutritivo.
Medios Sintticos
Son aquellos que poseen exclusivamente componentes qumicos definidos (se
conocen todos los componentes) disueltos en agua destilada, donde la proporcin de
cada uno de sus componentes es conocida exactamente. Entre ellos se encuentran los
medios mnimos, pues en ellos se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria
determinada, con muy pocos nutrientes. Los medios definidos son ampliamente usados
en investigacin, pues a menudo se quiere conocer qu est metabolizando el
microorganismo experimental.
Ejemplos: medio basal de sales y una fuente de carbono determinada.
Medios Semisintticos.
Cuando alguno de sus componentes no tiene composicin definida. En estos casos,
se aaden factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo,
como por ejemplo, extracto de levaduras, peptona cono fuente de nitrgeno, glucosa
como fuente de carbono.
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3. Segn su utilizacin o funcin.
Medios de Enriquecimiento.
Se basan en la libre competencia por los sustratos. Son siempre lquidos que
favorecen o permiten la multiplicacin de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de
otras. Pueden ser: de enriquecimiento propiamente dichos, que se basan en las
propiedades metablicas del microorganismo, o de enriquecimiento selectivo, en cuyo
caso se agrega un agente de seleccin que puede ser, un colorante, un antibitico, etc.
Este agente de seleccin no favorece el desarrollo del microorganismo a enriquecer,
sino que inhibe a la flora acompaante.
Ejemplos:
agua peptonada alcalina, se utiliza para V cholera (donde el pH alcalino inhibe a
todas las enterobacterias menos al Vibrio)
caldo selenito, acta inhibiendo el desarrollo de casi todas las enterobacterias
menos de Salmonella y Shigella.
caldo tioglicolato
caldo infusin cerebro corazn (BHI)
Medios Selectivos (o Inhibidores)

Pueden ser slidos o lquidos, a los que se les agrega uno o ms agentes de
seleccin. Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares, en los que la
selectividad se consigue alterando las condiciones fsicas del medio o aadiendo
compuestos qumicos, que sean nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa.
Los medios inhibidores pueden considerarse una variante ms restrictiva de los medios
selectivos. Las posibilidades de seleccin son infinitas y existen decenas de medios
selectivos especiales disponibles.
Ejemplos:
- Agar Endo, eosina azul de metileno (EMB o Levine), agar MacConkey. (Las
sales biliares o colorantes como la fucsina bsica y el cristal violeta, componentes de
estos medios, favorecen el crecimiento de bacterias gramnegativas, al inhibir el
crecimiento de bacterias grampositivas).
- Agar salmonella-shigella (SS): medio selectivo para recuperar Salmonella
spp y Shigella spp. (Las sales biliares, el citrato de sodio y el verde brillante son
inhibidores de los grampositivos y de algunos gramnegativos. Las posibles colonias de
Shigella aparecen amarillas y las posibles de Salmonella aparecen negras).
- Agar Tayer Martin: el medio base es agar chocolate con agregado de
antibiticos para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes:
- trimetroprima para inhibir Proteus spp y otros gramnegativos,
- vancomicina para inhibir grampositivos y
- nistatina para inhibir levaduras.
Medios Diferenciales.
Son siempre slidos y se utilizan para diferenciar colonias. Son medios que
diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificacin
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tentativa segn las caractersticas biolgicas del microorganismo. A estos medios se

les agrega, por ejemplo, un indicador de pH que permite diferenciar a microorganismos
que fermentan un determinado hidrato de carbono.
Ejemplos:
- Eosina azul de metileno (EMB- Levine): permite diferenciar bacilos gram
negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las bacterias no
fermentadoras dan colonias transparentes y las fermentadoras rosa o rojas, y
E coli da colonias con brillo verde metlico. Estas coloraciones son producidas
por la presencia del indicador de pH eosina amarilla y del colorante azul de
metileno (ste inhibe el desarrollo de la mayora de los gram positivos y junto a
la eosina sirve como indicador de fermentacin ya que a pH cido los colorantes
precipitan).
- El agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo, contiene lactosa y
colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa aparecen de color
rosa a rojo y son fcilmente distinguibles de las no fermentadoras.
- Agar MacConkey-sorbitol. Es un medio diferencial que permite sospechar en 24
hs la presencia de E coli O157 en materia fecal, dado que esta especie no
fermenta el sorbitol.
- El agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) sirve para diferenciar patgenos
entricos. La mayora de los no patgenos fermentan lactosa, sacarosa o xilosa
y producen colonias amarillas. Shigella spp. no fermenta estos azcares y da
colonias rojas. Salmonella spp y Edwarsiella spp fermentan xilosa pero producen
lisina decarboxilasa produciendo cadaverina que neutraliza los cidos de la
fermentacin y dan colonias rojas con centros oscuros porque producen cido
sulfrico.
- Agar cistena lactosa deficiente en electrolitos (CLDE), contiene lactosa y
permite diferenciar las bacterias fermentadoras de lactosa (colonias amarillas)
de las no fermentadoras (colonias incoloras).
Medios Enriquecidos.
Son medios a los que se le agrega un nutriente extra (adems de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes). Pueden ser lquidos o slidos. En estos
medios no crece un determinado grupo de bacterias sino todas. Este enriquecimiento
se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche,
huevo, bilis, lquido asctico, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible
aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del
mismo, por ejemplo Polivitex, Isovitalex, etc.
Ejemplos: agar sangre, agar chocolate, caldo infusin cerebro-corazn, caldo
tristona-soya.
Medios de Identificacin.
17
Son los medios destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede
servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de
poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos,
el sustrato especfico que vaya a ser metabilozado y el indicador que nos muestre el
resultado.
Ejemplos.: agar citrato de Simons, agar sulfhdrico-indol-movilidad (SIM), agar
manitol salado, agar DNAsa, agar triple azcar hierro (TSI), y en general, cualquier
medio al que se le haya aadido un elemento diferencial, son medios utilizados para
identificacin.
Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios
especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue
simultneamente identificar los grmenes a partir de la placa de cultivo gracias a la
utilizacin de sustratos cromognicos especficos.
Medios de Transporte.
Se usan para transporte de aquellas muestras que no van a procesarse de
inmediato o que deban ser trasladadas de un laboratorio a otro, y que puedan contener
microorganismos fastidiosos para su desarrollo por lo que se debe impedir el
sobrecrecimiento de bacterias que colonizan con frecuencia piel y mucosas. Estos
medios son generalmente semislidos, tamponados y sin sustancias nutritivas.
Ejemplos: Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.
PARTE EXPERIMENTAL
La preparacin de un buen medio de cultivo es fundamental para un buen

diagnstico bacteriolgico. El xito de la preparacin est influenciado por una serie
de factores como:
Exactitud de la pesada y perfecta medicin del volumen de agua

Control de pH
Correcta disolucin del medio de cultivo
Correcta esterilizacin
Correcta conservacin del medio de cultivo
Correcto fraccionamiento.
Para la preparacin de medios se parte de mezclas deshidratadas de los

compuestos que la integran. Habitualmente slo es necesario aadir agua y esterilizar
en autoclave, pero en algunas ocasiones es necesario aadir despus de la
esterilizacin algn componente termolbil que no hubiera resistido el calor.
Los medios deshidratados presentan ventajas:
18
- son muy estables,

- su utilizacin es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes de su
utilizacin,
- una pequea cantidad del producto permite la preparacin de una importante
cantidad de medio, no necesitando un gran volumen de almacenamiento,
- son econmicos.
ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO.
Los alumnos separados por comisiones se encargaran de la preparacin de los medios

de cultivos asignados por el jefe de trabajos prcticos.
Para la preparacin de los medios de cultivos se debern tener en cuenta las

indicaciones del fabricante.
Procedimiento general:
pesar la cantidad de medio de cultivo indicada por el fabricante.

colocar las cantidades pesadas en un frasco adecuado (previamente limpio y
rotulado) que ser el recipiente en el cual se va a esterilizar el medio de cultivo.
disolver el medio de cultivo agregando agua destilada hasta completar el
volumen total y calentar a bao mara hasta disolucin total del medio.
Verificar rpidamente el pH y ajustarlo, si es necesario, al valor indicado por el
fabricante. Es indispensable efectuar esta verificacin, pues el pH del agua
destilada puede variar segn las condiciones de obtencin y almacenamiento. El
ajuste debe hacerse a temperatura ambiente.
Una vez preparados los medios deben esterilizarse. La mayora de los medios de
cultivo se esterilizan en autoclave, durante 15 minutos, a 121C.
Los medios slidos se reparten cuando todava estn fundidos y se dejan
solidificar en su envase definitivo (placa o tubo).
Si los medios de cultivos no son fraccionados en el momento, debern
conservarse a 4C (heladera) por periodos variables. Deben ser etiquetados y
se debe aclarar la fecha de su esterilizacin.
Si hay que aadir sustancias de enriquecimiento termolbiles, se hace despus
de la esterilizacin, y con el medio ms fro pero an fundido. La adicin debe
ser asptica y lenta, para conseguir homogeneidad.
Los medios solidificados en placa deben ser puestos a temperatura ambiente y
despojados de la humedad que pudiesen tener antes de su utilizacin.
Los medios deshidratados son muy higroscpicos, es indispensable que los frascos
permanezcan abiertos solo el tiempo necesario para la obtencin del producto. Su
conservacin debe hacerse en lugar fresco y seco y no deben utilizarse los medios
hidratados ambientalmente.
19
Los medios deben someterse a un control de calidad que abarcar los siguientes
aspectos:
o Control de esterilidad: se efecta incubando algunas placas del lote escogidas al
azar y verificando la ausencia de crecimiento bacteriano.
o Control de composicin: se realiza para comprobar que el medio posee los
componentes que lo caracterizan de manera que permita el crecimiento de
determinados grmenes.
o Control de caducidad: se realiza para utilizar las placas durante el tiempo que
garantice su correcta utilizacin. Por trmino medio las placas preparadas
pueden conservarse entre 15 das y dos meses.
Bibliografa.
1. Microbiologa Clnica. Mdulo 1. Taxonoma y Fisiologa

Microbiana. Recoleccin y transporte de muestras para el diagnstico de
infecciones. AAM- Colegio de Bioqumicos de la Provincia de Entre Ros- Facultad
de Bioqumica y Ciencias Biolgicas Universidad Nacional del Litoral. 1997.
2. Microbiologa Clnica. Mdulo 2. Procesamiento inicial de las
muestras para el diagnstico mocrobiolgico. AAM- Colegio de Bioqumicos de la
Provincia de Entre Ros- Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas Universidad
Nacional del Litoral. 1997
3. Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. Cuarta Edicin. 1999.
4. Fumarola A, Rodrguez-Torres A, Garca-Rodrguez JA, Piedrota-
Angulo G. Microbiologa y Parasitologa Mdica. Segunda Edicin. 1987.
5. Daz Martn GA. Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico.
Medios de cultivo. Apuntes. Segundo curso: Laboratorio de Diagnstico Clnico
Unidad Temtica 14-1, Bloque temtico III. 2004-2005.
6. Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual
de tcnicas de laboratorio para la enseanza de la microbiologa bsica y
aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 7, 47-50.
20
Trabajo Practico N 3:
MANEJO DE MICROSCOPIO COLORACIONES
Objetivos.
Conocer el manejo del microscopio ptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de
microbiologa.
Realizar coloraciones ms utilizadas en el laboratorio de microbiologa a partir de
materiales biolgicos y explicar sus fundamentos.
Reconocer a travs de la observacin microscpica la existencia de
microorganismos en diversos materiales biolgicos.
Aprender el manejo del ansa y las distintas tcnicas de cultivo en medios slidos en
placa y medios de identificacin en tubo.
Contenidos previos que el alumno deber conocer:

Microscopa: tipos de microscopio.
Morfologa y estructura bacteriana.
Fundamento de las coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen.
Conocer la clasificacin y utilidad de los diferentes medios de cultivo.
FUNDAMENTOS TEORICOS
Tamao y formas bacterianas.
Existen tres formas bsicas de bacterias:

Esfricas (cocos)
Bastoncitos o cilndricas (bacilos)
Helicoidales (espirilos)
Segn el plano de divisin de la clula, los cocos pueden aparecer: de a pares
(diplococos), en cadena (estreptococos), en ttradas y racimos (estafilococos).
Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o tener una longitud de 2 a 10
veces su dimetro. Sus extremos pueden ser redondeados, cuadrados o agudizados.
Los bastones bacterianos curvos pueden ser pequeos microorganismos en forma
de coma (vibrios) o levemente helicoidales en una sola curvatura, o espiroquetas largas
y sinuosas.
La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de 1 a 5 m. La longitud
de una bacteria puede variar considerablemente segn el estadio de crecimiento y el
medio de cultivo utilizado.
Tcnicas de tincin.
21
La morfologa bacteriana se puede observar de dos maneras:

En estado vivo
Muertas y coloreadas.
Las bacterias en estado vivo son, en general, incoloras y carentes de suficiente
contraste con el agua en la que se encuentran en suspensin como para ser claramente
vistas.
Por lo tanto se hace necesario el uso de sustancias qumicas coloreadas,
llamadas colorantes, que poseen afinidad por algn componente celular, dando su color
a las clulas. Al teir el microorganismo con los colorantes se aumenta el contraste y
se hacen ms visibles, En bacteriologa, la mayora de los colorantes son sales en las
que uno de los iones es coloreado.
Los colorantes se clasifican en:
Bsicos o catinicos: el in coloreado es el positivo (catin). Estos
colorantes se combinan con los constituyentes celulares cargados
negativamente (cidos nucleicos, polisacridos). Ejemplos: azul de
metileno, cristal violeta, safranina.
cidos o aninicos: el in coloreado es el negativo (anin). Estos
colorantes se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente (protenas). Ejemplos: eosina, fucsina cida, rojo Congo.
Sustancias liposolubles: estos colorantes se combinan con los materiales
lipdicos de la clula, se usan para revelar la localizacin de gotas o
depsitos de grasa. Ejemplo: negro Sudn.
Algunos colorantes tien mejor slo despus de que la clula haya sido
tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s misma. Esta
sustancia se denomina mordiente. Ejemplo: cido tnico.
Clasificacin de las tinciones.
Existen dos tipos de tinciones:

1. Positivas: Cuando lo que se colorea es el microorganismo a observar. A su
vez pueden ser:
Simples: cuando se utiliza un nico colorante para incrementar el contraste de
las clulas para la microscopa. Ejemplo: azul de metileno, especialmente til para
detectar bacterias en muestras naturales, ya que la mayor parte del material no
celular no se tie.
Diferenciales: cundo se utilizan dos o ms colorantes y sirve para diferenciar
a las bacterias entre s por alguna propiedad particular, es decir no todas las
clulas se tien igual. Ejemplo: tincin de Gram. tincin de Acido-alcohol
resistencia.
Estructurales: cuando se utilizan dos o ms colorantes para poner de
manifiesto una determinada estructura de la bacteria. Ejemplo: cpsulas, esporas,
flagelos.
22
2. Negativas: Cuando lo que se colorea es el fondo y queda el microorganismo

sin teir. Se observa el perfil de la clula. La sustancia utilizada es un material
opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente
rodea las clulas, ejemplo la tinta china (suspensin de carbono coloidal).En el
microscopio aparecen las clulas (bacterias, hongos) transparentes y perfiladas
sobre fondo oscuro. La ventaja de este tipo de tincin, es que la clula no
recibe tratamiento fsico o qumico. Es muy apropiada para organismos
capsulados.
La fijacin del extendido antes del teido y la subsiguiente exposicin a una
serie de reactivos, como en las tinciones positivas, ocasiona alguna deformacin
en la clula, lo que es menos probable que ocurra en una tincin negativa.
Fijacin.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el citoplasma antes de
teirlas (fijacin). Para bacterias la fijacin por calor es lo ms corriente, aunque
tambin pueden fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y
alcoholes.
ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO
1. Observacin microscpica:
Reconocimiento de las partes del Microscopio ptico (MO).

Manejo del MO utilizando una muestra sin colorear.
Manejo del MO utilizando una muestra previa coloracin.
2. Tcnica de examen microscpico directo de muestra sin colorear (en fresco).
Utilidad: Se realiza para la observacin de bacterias, hongos y parsitos (morfologa

y movilidad) y clulas (epiteliales, leucocitos y hemates), de manera de evaluar la
calidad de la muestra.
Tcnica: Sobre un portaobjetos suspender, en una gota de solucin salina, una pequea
cantidad de la muestra. Colocar un cubreobjetos y examinar al MO con objetivos de
10x y 40x.
3. Coloracin de Gram:
Utilidad: Es una tincin diferencial usada para demostrar las propiedades tintoriales
de las bacterias, lo cual depende de la naturaleza qumica de la pared celular. Tiene
importancia taxonmica. El anlisis de los extendidos coloreados revela al mismo
tiempo morfologa y la reaccin al Gram de las bacterias.
23
Colorantes: Cristal violeta

Yodo de Gram: cristales de yodo-yoduro de potasio
Decolorante: Acetona-Alcohol etlico
Safranina.
Tcnica: *Se hace un frotis delgado del material a estudiar y se deja secar al aire.
*Se fija el material en el portaobjeto pasndolo 3 o 4 veces a travs de la
llama de un mechero, de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento
de tincin.
*Se coloca el frotis sobre un soporte para tincin y se cubre la superficie
con solucin de cristal violeta.
*Despus de un minuto de exposicin al cristal violeta, se lava totalmente
con agua destilada.
*Se cubre el frotis con solucin de yodo de gram durante un minuto. Se lava
nuevamente con agua.
*Se sostiene el frotis entre los dedos pulgar e ndice y se cubre la
superficie con unas gotas de decolorante de alcohol y acetona hasta que no se
desprenda ms color violeta. Habitualmente esto tarda 10 segundos ms o menos.
*Se lava con agua corriente y se coloca otra vez el preparado sobre el
soporte para tincin. Se cubre la superficie con la safranina durante un minuto. Se lava
con agua corriente.
*Se deja secar al aire en posicin vertical.
* Se examina el frotis teido con aceite de inmersin con objetivo de 100x
del MO. Las bacterias grampositivas se tien de color azul oscuro y las gramnegativas
se ven de color rojo-rosado.
4. Coloracin de Ziehl-Neelsen.
Utilidad: esta coloracin se usa para colorear a las bacterias llamadas cido-alcohol
resistentes, ya que por la naturaleza qumica de su pared necesitan de calor o
detergentes para que el primer colorante penetre, como as tambin resisten la
decoloracin con solventes orgnicos fuertes.
Colorantes: Carbolfucsina: cristales de fenol, alcohol, fucsina bsica.

Decolorante: alcohol-cido (HCl cc+ alcohol)
Azul de metileno.
Tcnica: * Cubrir un frotis seco, fijado por calor, con un pequeo rectngulo de papel
de filtro.
*Aplicar 5-7 gotas de carbolfucsina para mojar completamente el papel de
filtro.
24
*Calentar el portaobjeto cubierto con la coloracin hasta que se evapore,

pero sin dejar secar. Puede calentarse con un mechero o un hisopo de algodn
embebido en alcohol.
*Quitar el papel con una pinza, enjuagar y dejar secar.
*Decolorar con cido-alcohol hasta que no aparezca colorante en el lavado
(Aproximadamente 2 minutos).
*Agregar el azul de metileno (1 a 2 minutos).
*Enjuagar, escurrir y secar al aire.
* Examinar con objetivo de inmersim en aceite de 100x en MO. Los bacilos
cido alcohol resistentes (BAAR) se tien de rojo y el fondo de celeste.
Existen tambin otras coloraciones para los BAAR que las mencionaremos, ellas son: la
tcnica en fro de Kinyoun y la del fluorocromo.
Otras tinciones usadas en bacteriologa son:

Azul de metileno: positiva simple
Giemsa
tincin de endosporas: positiva estructural
tincin de cpsulas: negativa
Bibliografa:
Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual de tcnicas

de laboratorio para la enseanza de la microbiologa bsica y aplicada. Ed.
Atlante. 2000. Cap. 5, 25-32.
Koneman y col. Diagnstico microbiologco. Ed. Panamericana
25
TCNICAS DE SIEMBRA PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN.
Siembra para aislamiento primario.

La siembra para aislamiento puede hacerse en un medio especial y su eleccin est
orientada por el Gram o por el tipo de muestra, o bien, puede usarse un medio
general.
Las tcnicas son mltiples, todos tienen por objeto diseminar en la mayor
superficie posible los microorganismos presentes en la muestra, de modo que cada
uno de los tipos presentes pueda desarrollarse en colonias aisladas.
Tener siempre presente que los medios de cultivo para aislamiento son slidos.
Tcnicas de inoculacin: en placa de Petri.

La inoculacin de las muestras en medios de agar en placas de Petri puede
realizarse por varios mtodos.
La inoculacin primaria puede hacerse con ansa, hisopo u otros dispositivos
adecuados. Luego del inculo primario, debe diseminarse el material por los 4
cuadrantes de la placa usando ansa en aro o recta.
Entre los mtodos ms usados podemos mencionar:
Estra: el inculo se disemina con un movimiento hacia atrs y hacia adelamte en
cada cuadrante, girando la placa 90. El ansa debe quemarse (esterilizarse a
llama directa al rojo vivo) entre cada diseminacin hacia un cuadrante. El
propsito de esta tcnica consiste en diluir el inculo en forma suficiente para
que sea posible obtener colonias aisladas, y as las mismas puedan ser
estudiadas en los medios diferenciales.
Agotamiento: el inculo se "estra" con ansa hasta el otro extremo de la placa
con movimientos seguidos de un lado al otro. Esta forma de estriar se usa
generalmente para material en el que se sospecha no hay mezcla de bacterias o
flora normal agregada.
Inoculacin para recuento semicuantitativo de colonias: Deben usarse ansas
calibradas para contener 0,01- 0,001 ml de lquido, se sumergen en la muestra
de orina no centrifugada. Luego se lleva todo el volumen a la superficie del agar
haciendo una sola estra a travs del centro de la placa. Despus, el inculo se
disemina en ngulos rectos respecto de la estra primaria, luego la placa se gira
90 y se disemina el inculo hasta cubrir toda la superficie.
Tcnicas de inoculacin en tubos para identificacin .

Los medios en tubos pueden ser lquidos, semislidos o slidos.
El agar semislido es adecuado para pruebas de movilidad, y se siembra con
ansa en punta por puncin. Es importante que el ansa de inoculacin sea
retirada por el mismo camino que se us para atravesar el medio, y evitar
errores de interpretacin posteriores.
26
Los medios lquidos deben inocularse inclinando el tobo aproximadamente 30 y

con el ansa de inoculacin se toca la superficie interna del vidrio por encima
del punto donde la superficie del medio forma un ngulo agudo. Cuando el tubo
se vuelve a colocar en posicin recta, el rea de inoculacin queda sumergida
en el medio.
Los agares slidos son puestos a solidificar inclinados para formar el "pico de
flauta". Estos se inoculan primero atravesando el fondo del agar y luego se
retira y se estra a travs del agar en la superficie (el pico de flauta).
Bibliografa:
Koneman y col. Diagnstico microbiologco. Ed. Panamericana.
Basualdo,JA y col. Microbiologa Biomdica. Ed. Atlante.
27
Cocos Gram Positivos
Objetivos:
Que el alumno sea capaz de

1. aprender el procesamiento bsico de las muestras que pueden contener cocos
Gram (+)
2. llegar a la tipificacin de un coco G (+) aplicando sus conocimientos sobre
caractersticas morfolgicas, nutricionales y fisiolgicas que permiten
diferenciarlos por familias, gneros y especies.
Fundamentos Tericos:
Las bacterias gram positivas tienen en su pared un alto contenido de peptidoglicano,

debido a esto, stos microorganismos retienen el colorante cristal violeta y se los ve
como esferas azul oscuro o violetas en las preparaciones con tincin de gram.
Los cocos Gram (+) aerobios y anaerobios facultativos son los microorganismos que con
mayor frecuencia se asocian con infecciones humanas, pueden ser recuperados de casi
todas las muestras clnicas que contengan una poblacin mixta de bacterias.
Se pueden aislar en medios no selectivos, especialmente en agar sangre pero no
desarrollan en medios selectivos como EMB, Mac Conkey, etc que contienen cristal
violeta colorante que inhibe a estos microorganismos, por lo tanto la presencia de
colonias en agar sangre con ausencia de colonias en el EMB, constituye un dato inicial
de que el microorganismo en cuestin es Gram (+).
Los cocos gram (+) aerobios o anaerobios facultativos pertenecen a dos grandes
familias:
Flia Micrococcaceae: compuesta por varios gneros ( Staphylococcus,

Micrococcus, Stomatococcus, Planococcus y Macrococcus) de los cuales el ms
patgeno y de importancia clnica es el gnero Staphylococcus.
Gnero Streptococcus: compuesto una serie de grupos y/o gneros (grupo A, B,

C, D, G, F, Enterococcus y S. pneumoniae), todos causantes de diversas
patologas.
28
TRABAJO DE MESADA
Procedimiento para la preparacin de AS:
Al agar base (agar base columbia o triptena soya, preparado segn instrucciones del
fabricante) se lo disuelve a bao mara y una vez que su temperatura desciende hasta
aproximadamente los 50 C , se adicionan 5% de sangre estril desfribinada (humana o
de carnero), se homogeniza y luego se plaquea y se deja solidificar.
A partir de las muestras otorgadas por la ctedra, los alumnos realizaran un fresco,
coloracin de Gram y siembra de las mismas en el medio de cultivo correspondiente.
29
Muestra
Fresco Gram
cultivo
Identificacin
de Gnero y especie
Antibiograma
Informe de Laboratorio
A partir de las placas de cultivo provenientes de diversos materiales clnicos los

alumnos realizaran las pruebas necesarias para poder llegar a la tipificacin de los
microorganismos en cuestin haciendo uso de los siguientes algoritmos:
CG (+)
Catalasa
(+) (-)
Flia Micrococcaceae Gnero Streptococcus
Dentro de la Flia Micrococcaceae los gneros pueden separarse mediante las

siguientes pruebas:
T.S.I
30
No fermentadores de glucosa Fermentadores de

glucosa
Gnero Micrococus Gnero Staphilococcus
Con las colonias pertenecientes al gnero Staphylococcus se seguirn los pasos

indicados en el siguiente cuadro:
Stapyilococcus spp
Prueba de la coagulasa/DNASA
( -) Negativo (+) positivo

Staphylococcus coagulasa Staphylococcus aureus
Sensibilidad a la Novobiocina
Sensible Resistente
Stapyilococcus spp. Stapyilococcus saprophyticus
Existen dos pruebas importantes para identificar Stapyilococcus aureus aparte de la

prueba de la coagulasa, una es la prueba de Chapman o manitol salado (fermentacin de
manitol) y la otra es la prueba de la DNAsa (ver anexo).
Fermentacin del manitol (Chapman): el medio es agar manitol salado, contiene

manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y peptonas.
La alta concentracin de sal inhibe otros microorganismos excepto enterococos (por lo
tanto usar la placa para identificacin, no para aislamiento).La placa original es de color
rosado y cuando se fermenta el manitol el medio se vuelve amarillo.
31
Staphilococus aureus puede ser identificado por la presencia de un halo amarillo

alrededor de las colonias aisladas, lo que indica la produccin de cido a partir de
manitol.
Gnero Streptococcus.
Adems de las caractersticas tintoriales, crecimiento en medio lquido y tipo de

hemlisis, existen varios procedimientos para su identificacin (ver cuadro):
CG (+)
Catalasa (-)
Hemlisis
beta alfa gama

S grupo A S pneumoniae S grupo B
S grupo B S grupo D S grupo D
S grupo C, G y F S grupo B Enterococcus
Enterococcus Enterococcus S. viridans
S. viridans
32
CG (+) CATALASA (-) B HEMOLITICAS
PYR
(+) (-)
Bacitracina/ Bilis esculina CAMP/Hidrlisis del Hipurato
S/(-) R/(+) (+) (-)
S pyogenes Enterococcus S agalactiae VP
(+) (-)
S grupo milleri S grupo C y G
CG (+) CATALASA (-) ALFA O GAMA HEMOLTICA
Optoquina / Solub en Bilis
S/ (+) R/ (-)
S pneumoniae BE
(-) (+)
PYR PYR
(-) (+) (+)
S viridans Abiothrophia Enterococo

S agalactiae
33
Bacilos Gram Negativos
Objetivos:
Que el alumno sea capaz de:
3. aprender el procesamiento bsico de las muestras que pueden contener bacilos
Gram (-)
4. llegar a la tipificacin aplicando sus conocimientos sobre caractersticas
morfolgicas, nutricionales y tintoriales que permiten diferenciarlos por
familias, gneros y especies.
Fundamentos tericos:
Los bacilos Gram negativos estn comprendidos en gran nmero de familias, algunas de
ellas son: Familia Vibrionaceae, Familia Enterobacteriaceae, Familia
Pseudomonadaceae, etc.
A fines prcticos se dividen a los bacilos gram negativos en 2 grandes grupos:

o Bacilos gram negativos fermentadores de la glucosa
o Bacilos gram negativos no fermentadores de la glucosa.
Dentro de los bacilos G (-) fermentadores de la glucosa se encuentra la familia

Enterobactereaceae. sta est constituida por aproximadamente 30 gneros con 115
especies, son de distribucin mundial y se encuentran en la tierra, el agua, las plantas
de todo tipo, animales y en el hombre; en ste ltimo se pueden hallar como
colonizantes habituales del tracto gastrointestinal o bien ser causantes patogenicidad.
Las caractersticas tpicas de la familia son:

Bacilos gram negativos aerobios o anaerobios facultativos
Fermentan la glucosa formacin de cido con o sin gas.
Son oxidasa negativos
Pueden ser mviles con flagelos peritricos o inmviles.
No esporulados.
Reducen los nitratos a nitritos
La mayora crece bien a 37C.
Principales gneros y especies tipo de la familia Enterobariaceae:

GENERO ESCHERICHIA: Escherichia coli
GENERO SHIGELLA: Shigella dysenteriae, Shigella sonney
34
GENERO SALMONELLA: Salmonella. enterica

GENERO CITROBACTER: Citrobacter freundii
GENERO KLEBSIELLA: Klebsiella pneumoniae
GENERO ENTEROBACTER: Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes
GENERO SERRATIA: Serratia marcescens
GENERO PROTEUS: Proteus mirabilis
GENERO YERSINIA. Yersinia enterocoliticas, Yersinia pestis
GENERO MORGANELLA: Morganella morganii
GENERO PROVIDENCIA: Providencia rettgeri, Providencia stuartii
Otros gneros de inters:

GENERO VIBRIO: Vibrio cholerae
GENERO AEROMONAS: Aeromona hydrophila
GENERO HAEMOPHILUS: Haemophilus influenzae
GENERO PLESIOMONAS
Dentro de los bacilos G (-) no fermentadores podemos mencionar un gran nmero de

organismos como son: la familia Pseudomonadaceae, y los organismos llamados del grupo
Burkholderia, Stenotrophomonas, Acinetobacter (coco gram negativo), etc.
Son un grupo de microorganismos aerobios. No son exigentes y desarrollan fcilmente
en los medios de cultivo de uso ordinario en el laboratorio como EMB.
Sus caractersticas son:
No esporulados,
No fermentan la glucosa con produccin de cido.
La mayora son oxidasa positivos
En algunos casos se puede percibir olor frutal intenso caracterstico de
Pseudomona aureginosa u olor amoniacal caracterstico de S. maltophilia.
Algunos de estos microorganismos son mviles por flagelos, que de acuerdo a su
ubicacin en la bacteria ayudan a su clasificacin: polares en pseudomonas,
peritricos en Alcalgenes, inmviles en Acinetobacter y Moraxella.
TRABAJO DE MESADA:
A partir de las muestras otorgadas por la ctedra (que podran ser heces, orina,
sangre, pus, exudados que estarn en un medio de transporte adecuado) los alumnos
realizarn:
El fresco,
La coloracin de Gram,
La siembra de las mismas en los medios de cultivo correspondientes.
Medios diferenciales:
35
Levine o EMB (Azul de metileno eosina). Contiene: Lactosa (indicador de la fuente de

carbono que utiliza el microorganismo), eosina (inhibe los cocos Gram positivos y es
indicador) y Azul de metileno (indicador)
Mc Conkey: Contiene: Lactosa (indicador de la fuente de carbono que utiliza el
microorganismo), sales biliares (inhibe los cocos Gram positivos), cristal violeta y rojo
neutro como indicadores
CLDE (Citrato lactosa deficiente en electrolitos): Se utiliza para urocultivo porque
permite el crecimiento tanto de cocos como de bacilos, es un medio que posee lactosa y
es deficiente en electrolitos que impide el swarming del proteus. Las colonias lactosas
(+) toman un color amarillo y las colonias lactosa (-) presentan el color original del
medio de cultivo que es azul verdoso.
Medios selectivos:
SS (Samonella-Shigella): Contiene: rojo neutro (indicador), lactosa (fuente de hidratos

de carbono), sulfato ferroso (para evidenciar a los productores de SH 2), verde
brillante (acta como antisptico) y sales biliares (que favorece el desarrollo de
Salmonella y Shigella)
TCBS (agar tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa) Es un medio de cultivo que es
selectivo para Vibrio cholerae y tiene como nico hidrato de carbono la sacarosa.
Medios de enriquecimiento:
Caldo Peptonado: se utiliza para V. cholerae

Caldo Selenito: se utiliza para el enriquecimiento de Salmonella y Shigella
Caldo Tetrationato: se usa para Salmonella
Cultivo: se debe realizar segn la muestra:

A) Cultivar en caldo de enriquecimiento: de acuerdo a lo que se sospeche, si es
materia fecal sembrar en caldo selenito (sospecha de Salmonella o Shigella) o
si se sospecha Vibrio cholerae sembrar en caldo peptonado. En ambos casos la
temperatura de incubacin es de 37C y entre 18 y 24 horas se debe hacer el
repique a medios slidos de aislamiento primario.
B) Cultivar en medio de aislamiento primario: se deben sembrar por estras los
distintos medios, teniendo en cuenta el material a sembrar y si se sospecha la
presencia de un microorganismo en especial. Ej. Si en una muestra se sospecha
la presencia de Salmonella entonces sembrar un E.M.B. y un S.S.
Luego de 24hs. de sembrada la placa de aislamiento primario, se debe observar la placa

para realizar lo que se conoce como estudio de colonias:
- Se mira si creci un solo tipo de microorganismos, o al contrario, si crecieron varios;

y de acuerdo a la experiencia se seleccionan las colonias que parezcan representativas
36
para realizar las pruebas de identificacin. Tambin se observa la formacin de

pigmentos, si las colonias son mucosas, o si se percibe algn olor particular como olor a
frutas u olor amoniacal.
- Color de las colonias en las placas: como las placas de E.M.B. y de S.S. tienen
lactosa y un indicador, el color de la colonia permite diferenciar las que son lactosa (+)
de las lactosas (-)
Placa de Levine (E.M.B.)
- Colonias fermentadoras de la lactosa:

- Con brillo metlico: E. coli, Citrobacter freundii
- Colonias opacas mucosas y de color rosado: Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Klebsiella spp.
- Colonias no fermentadoras de la lactosa:

- Son trasparentes: Proteus, Providencia, Morganella, Serratia, Pseudomonas,
Salmonella, Shigella. Inclusive la E. coli podra aparecer transparente porque
existe un porcentaje que es lactosa (-)
Placa de S.S.
- Colonias fermentadoras de la lactosa: podran aparecer colonias rosadas o

rosadas con centro negro, por la produccin de SH 2.
- Colonias no fermentadoras de la lactosa:

- Incoloras: Shigella, Pseudomonas, Providencia, Yersinia.
- Incoloras con centro negro: Salmonella, Edwarsiella, Proteus.
Identificacin Bioqumica:
Se realizan a partir de la placa de aislamiento primario y sobre colonias aisladas las

siguientes pruebas:
Prueba de O-F
Oxidasa
Fermentacin de los azucares: T.S.I.
Produccin de ureasa.
Utilizacin de citrato
S.I.M: evidencia la formacin de SH2, indol y movilidad.
O.N.P.G.
Aminocidos: Lisina, Arginina, Ornitina
Voges Proskauer (VP)
Rojo de metilo (RM)
37
Fenilalanina (Phe)
Prueba de oxidacin-fermentacin (O-F)
Se realizan utilizando un ansa en punta, con ella se toca una colonia y se siembra por
puncin y/o estra de acuerdo a lo que corresponda para cada medio.
Luego de 12 a 24hs, de acuerdo al tiempo que necesite cada prueba para desarrollar,
observar los medios ya sembrados e interpretar las diferentes pruebas como negativo
o positivo. Luego con la ayuda de las tablas se procede a identificacin de la bacteria.
Procedimiento bsico de trabajo
Recepcin de la muestra
Coloracin de Gram
Fresco
Cultivo en los medios adecuados:
medios de aislamiento primario y
de enriquecimiento (si hiciera falta)
24hs
Estudio de colonias
Pruebas de identificacin
12-24hs.
Interpretacin de las pruebas e identificacin
del microorganismo con el uso
de las tablas de identificacin
SEGUIMIENTO BSICO PARA BACILOS GRAM (-)
Lo primero que se observa es el OF
OF
Fermentadores Oxidativo o Inertes
(ambos tubos viran al amarillo) (vira solamente el tubo expuesto al 02, o
no vira ninguno, respectivamente)
Bacilos Gram (-) fermentadores de la Bacilos Gram (-) no fermentadores de la
glucosa glucosa
Pseudomonas
Enterobacterias Acinetobacter
Vibrio Moraxella
38
Aeromonas Alcalgenes
Burkholderia
Stenotrophomonas
BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES DE LA GLUCOSA:
Una vez realizada la prueba de O-F y haber obtenido un perfil fermentativo, sabemos
que estamos ante la presencia de un bacilo Gram (-) fermentador de la glucosa,
entonces lo primero que se hace es una oxidasa:
Oxidasa
(-) (+)
Enterobacterias Vibrio
Aeromonas
Luego, una vez que sabemos que es una enterobacteria, con la placa de aislamiento
primario, y de acuerdo a si la bacteria es lactosa (+) o (-), se van separando las
diferentes bacterias
Levine (E.M.B.)
Lactosa (+) Colonias Lactosa (-) Colonias
rosadas transparentes
E.coli Proteus
Enterobacter Providencia
Citrobacter Morganella
Klebsiella Serratia
(E.coli)
A partir de ac lo que se hace es mirar el TSI y de los resultados obtenidos en l, se

hacen las diferentes pruebas de identificacin para llegar al gnero que corresponde al
microorganismo en estudio.
TSI: acido/acido
(completamente amarillo)
Los gneros que presentan este TSI son:
Citrato Urea Sulfhdrico Indol Movilidad Fal
39
ESCHERICHIA - - - + + -
SPP.
ENTEROBACTER + - - - + -
SPP.
KLEBSIELLA SPP. + +d - v - -
TSI: cido/cido + (SH2)

(medio amarillo con precipitado negro en la base del tubo)
Citrato Urea Sulfhdrico Indol Movilidad FaL

CITROBACTER + - + - V -
SPP.
TSI: alcalino/acido +(SH2)

(pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro en la base del tubo)

SALLMONELLA + - + - + -
SPP.
+ + + +/- + +
PROTEUS SPP.
TSI: alcalino/cido
(pico rojo, fondo amarillo)
40
SHIGELLA SPP. - - - V - -
+ - - - + -
SERRATIA SPP.
Si se quiere llegar hasta la tipificacin total del microorganismo se deben hacer otras
pruebas y con los resultados de stas se van a la tabla anexa al final de la gua y se
llega hasta la especie.
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES DE LA GLUCOSA:
Para un bacilo Gram (-) no fermentador de la glucosa tenemos dos opciones:
OF
OXIDATIVO INACTIVO
(Tubo con vaselina sin cambio y (Ambos tubos sin cambios)
tubo sin vaselina amarillo)
Oxidasa Oxidasa
(-) (+) (-) (+)
A. baumannii P. aeruginosa Acinetobacter Alcaligenes
Stenotrophomonas P.fluorescens calcoaceticus
Pseudomona putida
Burkholderia
cepacia
Luego se realizan las pruebas de:

SIM: sulfuro indol movilidad
Urea
DNAsa
Aminocidos: lisina Ornitina Arginina
ONPG
Tambin se puede sembrar en medios fluorescentes y de pigmentados: son
medios de cultivo que permite ver fluorescencia con luz UV (se usa para
Pseudomona aeruginosa) y la produccin de pigmentos por parte del
microorganismo.
Reduccin de nitratos a nitritos.
Y se interpretan con las tablas correspondientes a bacilos Gram (-) no fermentadores
41
42
Tabla resumida con las enterobacterias ms comunes y las pruebas ms frecuentemente

utilizadas.
Escherichia Enterobacter Enterobacter Citrobacter Klebsiell Salmonell Shigell Serrati

coli cloacae aerogenes a a a a
+/- + + +d o- + - - +/-
Lactosa
- - - + - + - -
Prod. de
SH2
- +/- - +d +d - - -d
Ureasa
SIM - - - +/- - + - -
+ - - - +/- - +/- -
Sulfuro +/- + + + - + - +
Indol
Mov.
- + + + + +d - +
Citrato
+ + +d - + +d +
O + - + - + + - +
- + + - + - - -
VP
+ - - + - + + +
RM
ONPG +/-
- - - - - - - -
fenilalanina
(+d= positivo dbil)
43
Trabajo Practico N 7 :
MTODOS DE DETERMINACIN DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
OBJETIVOS
Enumerar las indicaciones para la realizacin de una prueba de susceptibilidad
antimicrobiana.
Definir antibiograma por difusin con discos.
Indicar los elementos necesarios para la realizacin de la prueba.
Describir el procedimiento para la realizacin y lectura de un antibiograma.
Explicar las limitaciones del mtodo de difusin por discos.
Principios generales:
Las pruebas de sensibilidad evalan la capacidad de un antimicrobiano para inhibir in

vitro el desarrollo bacteriano.
Si bien algunas bacterias poseen sensibilidades o resistencias predecibles, en otras es
necesario estudiar la susceptibilidad antibacteriana desde el laboratorio. Para ello se
cuenta con diferentes metodologas:
1. Tcnicas cualitativas: Antibiograma por difusin en agar o tcnica de Kirby-
Bauer.
2. Tcnicas cuantitativas: CIM- CBM.
3. Pruebas especiales: incluyen, entre otras, la deteccin de betalactamasas,
estudio del poder bactericida del suero (PBS) y otros ensayos para la deteccin
de resistencia a los antimicrobianos (produccin de enzimas inactivantes,
alteraciones en el sitio de accin y modificaciones en el ingreso o el eflujo de
las drogas).
1. MTODO DE DIFUSIN EN AGAR
Fundamento: Esta tcnica consiste en enfrentar a la bacteria a discos de papel

impregnados con el antibitico y leyendo los halos de inhibicin del crecimiento luego
de 18 a 24hs de incubacin. El dimetro obtenido depender no solo de la sensibilidad
del microorganismo y la carga del disco, sino tambin del espesor de la capa del agar,
su pH y composicin, de la capacidad de difusin de la droga en ese medio, la
temperatura, la velocidad de duplicacin bacteriana y el tamao y fase de crecimiento
del inculo.
44
Para realizar pruebas de sensibilidad e identificacin se debe partir de un cultivo

primario en medio slido, no se deben realizar pruebas sobre mezclas de diferentes
tipos de microorganismos, ni sobre el material clnico sin procesar.
Antibitico: Se debern probar los antibiticos tiles, teniendo en cuenta el germen

aislado y la patologa correspondiente a la muestra que se estudia. Los antibiticos
debern ser referidos por su nombre genrico.
Discos: Para evitar su deterioro se deben conservar entre 20C y 4 C. Los discos que
contengan drogas fcilmente degradables (por ejemplo Beta lactmicos) deben
conservarse a -20 C para mantener su potencia, conservando en refrigerador
solamente los discos que se utilizan en la semana. Los discos deben ser sacados del
refrigerador o freezer 1 o 2 hs antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la
temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensacin que
podra ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fros. Debe respetarse
estrictamente la fecha de vencimiento de los discos y guardarlos en recipiente con una
sustancia desecante.
Medio de cultivo: El CLSI recomienda Mller Hinton agar pH 7.2-7.4 que debe ser
controlado a temperatura ambiente y luego de solidificado.
Este medio muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,
contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetroprima y tetraciclina, es
adecuado para el desarrollo de la mayora de las bacterias patgenas. Para cepas que
no crecen bien se debe agregar sangre ovina al 5%. Para evaluar el contenido de
timidina debe probarse cada lote de medio de cultivo con Enterococcus faecalis
ATCC 29212, ya que el exceso de la misma hace variar los halos de sulfamidas y
trimetoprina, lo que puede dar como resultado una falsa resistencia.
Hay que evaluar tambin el contenido de cationes divalentes (Ca2+ y Mg2+), ya que en
exceso reducir la zona de inhibicin mientras que las bajas concentraciones
producirn el efecto contrario.
Preparacin de las placas:
Se preparan placas de 9-10 cm de dimetro con 25 a 30 ml de agar Mulller Hinton, las
cuales alcanzan un espesor aproximado de 4 mm. Estas placas se pueden conservar
hasta 7 das en heladera (2-82 c.) y antes de usarlas se deben secar colocando la placa
a 35 C 30 min.
Procedimiento:
Inculo: para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de
bario como estndar de turbidez (0,5 de la escala de Mc Farland).
1. Mtodo de crecimiento previo: Tomar 4 5 colonias bien aisladas de igual
morfologa. Preparar una suspensin en 4 o 5 ml de caldo triptena soja, e
incubar a 35 C hasta igualar la turbidez del estndar (2 a 6 hs). El ajuste es
45
por comparacin visual, mirando los tubos contra fondo blanco con una lnea
negra como contraste.
2. Mtodo de suspensin directa: A partir de un cultivo de 18-24 hs, tomar varias
colonias y ajustar el inculo a una turbidez equivalente al 0,5 de Mc Farland en
solucin fisiolgica.
Inoculacin de las placas: Dentro de los 15 min. de ajustada la turbidez, sembrar las
placas de MH con hisopo estril, sumergiendo el mismo en el tubo que contiene el
inculo. Luego, presionar el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el
exceso de inculo. Hisopar las placas rotando en tres direcciones y pasndola por
ltimo por la periferia del agar para asegurar una distribucin uniforme.
Dejar que el inculo se absorba a la superficie del medio de cultivo (3 a 5 min y no ms
de 15 min) antes de la aplicacin de los discos.
Colocacin de los discos:
Colocar los discos en forma asptica presionando para asegurar un correcto contacto
con el agar. Se deben colocar de manera que se encuentren a una distancia de 15 mm
del borde de la placa y a una distancia de 24 mm de un centro al otro. Colocar no ms
de 6 discos por placa. Invertir las placas, e incubar 16 - 18 hs. a 35 C.
Lectura: Si la distribucin fue correcta las zonas de inhibicin son circulares y el
desarrollo confluente. Medir el dimetro de los halos de inhibicin con calibre o regla.
Interpretar el tamao de la zona de inhibicin de acuerdo a las Tablas y
recomendaciones del CLSI, y los organismos se informaran como sensibles, intermedios
y resistentes frente al antibitico ensayado.
Cepas control: Cada vez que se ensaya un nuevo lote de Mller Hinton o de discos se
efectuarn controles con las siguientes cepas:
Staphylococcus aureus ATCC 25923

Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Enterococcus faecalis ATCC 29212
Suspensin
bacteriana
Fig. 7: Esquema de la tcnica de antibiograma por difusin en agar
46
2. MTODO POR DILUCIN EN MEDIO LQUIDO
2. MTODO POR MACRODILUCIN EN TUBO
Fundamento: Permiten determinar la mnima concentracin del antimicrobiano que

inhibe el desarrollo bacteriano (CIM) o mata a las bacterias (CBM). Se realiza
enfrentando una suspensin bacteriana con diferentes concentraciones del antibitico
en caldo de cultivo. Luego de la incubacin se observa la presencia o ausencia de
inhibicin del crecimiento. Se considera CIM a la mnima concentracin de
antimicrobiano en la cual no se observa turbidez.
La tcnica de macrodilucin en caldo sirve como mtodo de referencia.
Medio de cultivo: Caldo Mller Hinton pH 7.2-7.4.

ANTIMICROBIANO: Debe utilizarse droga pura con potencia biolgica conocida
(potencia valorada) respetando la fecha de vencimiento. Los antibiticos debern
conservarse a 20C con desecador. La cantidad a pesar se calcula de a cuerdo a la
siguiente frmula:
Pesada (mg) = Volumen (ml) x Concentracin ATM (g/ml)
Potencia (g/mg)
Las soluciones de antibiticos deben conservarse a 20 C, los tiempos de conservacin
varan de acuerdo al antibitico.
Inculo: Se usa como inoculo un cultivo fresco, generalmente de menos de 16 hs. de
incubacin (fase logartmica, variable segn el germen), que se lleva a la turbidez
equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc. Farland y equivale a 1.5 x 10 8 UFC/ml). Este
se diluye 1/200 en caldo Mller Hinton para llevarlo aproximadamente a una
concentracin de 5 x 105 UFC/ml y debe utilizarse dentro de los 15 min de preparado.
Se agrega 1 ml de este inoculo a cada uno de los tubos con antibitico. Se debe medir
siempre el N de bacterias viables del inoculo (efectuando recuento de colonias).
Metodologa: Se preparan diluciones seriadas del antibitico en un rango adecuado al
antibitico y cepa a estudiar. Esto es: colocar 11 tubos con 1 ml de caldo Muller-
Hinton, al tubo N 1 se le agrega 1 ml de la dilucin de ATM concentrada,
homogeneizar. De ste, se toma 1 ml de y se pasa al tubo N 2 y as sucesivamente
hasta llegar al tubo N 9. El tubo N 10 que no lleva antibitico es el control de de-
sarrollo y el 11 el control de esterilidad del medio de cultivo.
Los tubos se incuban a 35 C 16-20 horas. Al final del perodo de incubacin los tubos
se examinan visualmente controlando la turbidez. La turbidez indica que el crecimiento
bacteriano no fue inhibido por la concentracin de antibitico contenida en el tubo.
47
CBM.
Para determinar CBM se transfiere una anzada (5 ul) de los tubos lmpidos a una placa
que no contenga antibitico y se incuba 24 hs. La CBM es la menor concentracin que
impide el desarrollo del 99,9 % de las bacterias presentes en el inoculo original (esto
equivale al 0,1 % de sobrevivientes).
BIBLIOGRAFA
1. Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turk M. Antibiotic susceptibility testing
by a standardized disk method. Am J. Clin. Pthol 1966; 45:493-496.
2. NCCLS. Methods for determing bactericidal activity of antimicrobial agents.
NCCLS document M26-P, vol 7- N2.
3. Garca Rodriguez JA et al. Mtodos bsicos para el estudio de la sensibilidad a
los antimicrobianos. Recomendaciones de la Sociedad Espaola de
Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Vol 11. 2000.
4. Servicio de antimicrobianos. INEI. ANLIS Dr Carlos G Malbrn. NCCLS
Document M2-A8. Enero 2003. Material facilitado en el "IV Curso Regional
para el Diagnstico de la Resistencia a los Antimicrobianos. Octubre 2005.
5. Koneman y col. Diagnstico microbiolgico. Ed. Panamericana.
6. Basualdo,JA y col. Microbiologa Biomdica. Ed. Atlante.
Siembra
Caldo + bacterias
+ antibitico
(ug/ml)
Lectura
CIM = 4
ug/ml
48
MICOLOGIA
49
Trabajo Practico N 8: GENERALIDADES
Objetivos:
Aplicar los conceptos bsicos fundamentales de la micologa.
Conocer los aspectos morfolgicos y ecolgicos bsicos de los hongos.
Caractersticas macroscpicas de las colonias
Los hongos presentan una gran diversidad de colonias que van desde aquellas similares a las
bacterianas, producidas por el crecimiento de levaduras, hasta colonias muy algodonosas que
cubren toda la superficie del cultivo, producidas por hongos filamentosos.
La colonia de muchos hongos filamentosos puede variar considerablemente debido a la
constitucin nutritiva de los medios de cultivo, a la temperatura y al tiempo de incubacin. Por tal
motivo es fundamental conocer la composicin del medio de cultivo y las condiciones de
incubacin del agente aislado.
El agar Sabouraud es el medio de cultivo ms utilizado para el aislamiento de hongos,
incubndose a 37 cuando se sospecha de levaduras y a 28 cuando se buscan hongos
filamentosos. El estudio de las caractersticas macromorfologicas de las colonias de los hongos
junto con las caractersticas microscpicas del cultivo permiten diferenciar e identificar los
diferentes gneros y especies.
En la observacin y anlisis macroscpico de la colonia se deben considerar:
Forma: circular, irregular, filamentosa, rizoidal.
Elevacin: plana y extendida, elevada y limitada, convexa o umbilicada.
Textura: algodonosa, pulverulenta, granular, vellosa, aterciopelada, mucosa, cremosa,
etc.
Aspecto: brillante o hmeda, opaca o seca.
Superficie de la colonia: lisa, plegada, sectorizada, cerebriforme, con surcos radiales.
Color: blanco, canela, salmn, negro, etc.
Margen o Bordes: liso (entero o neto), regulares, irregulares (ondulado, lobado)
Pigmento: puede estar presente o no. Si est presente, se deber definir el color,
observndose el reverso de la colonia.
50
ACTIVIDAD N 1: Observar y describir las caractersticas macroscpicas de las

colonias fngicas.
Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Colonia 4
Tipo de Hongo
Forma
Aspecto
Textura
Elevacin
Superficie
Pigmento
Margen o Borde
51
ACTIVIDAD N 2:
Observe, dibuje y seale las principales estructuras microscpicas de los hongos.
Caractersticas microscpicas de los hongos Esquema

Blastoconidio: elemento unicelular globoso a elipsoide
que se origina por gemacin a partir de una clula madre.
Pseudohifa: Conjunto de clulas levaduriformes que no se han

separado despus de la nueva gemacin.
Hifa cenoctica o no tabicada: estructura tubular de paredes

paralelas que constituyen un filamento contnuo.
Hifa septada o tabicada: estructura tubular de paredes

paralelas, dividida en compartimentos por septos.
Pueden ser hialinas o dematiaceas.
Clamidoconidio o clamidospora: clulas globosas u ovoides,

de pared doble y gruesa, que se localizan a nivel terminal e intercalar.
Son estructuras de resistencia, producidas como respuesta a
condiciones adversas del medio.
Artroconidio (arthron: articulacin, artculos): son clulas

rectangulares de paredes gruesas que se forman por
fragmentacin de hifas septadas.
52
Reproduccin de los hongos
En los hongos podemos reconocer dos tipos de talo; el vegetativo y el reproductor,

con funciones claramente definidas:
El talo vegetativo se desarrolla en la superficie del sustrato y su funcin principal
es absorber nutrientes, crecer y sustentar al talo reproductor.
El talo reproductor crece proyectndose en direccin vertical, perpendicular al talo
vegetativo y desarrollan las clulas especializadas en la reproduccin de la especie.
Se entiende por reproduccin a la formacin de nuevos individuos que tienen todas

las caractersticas tpicas de la especie. En hongos puede haber dos tipos de
reproduccin: sexual y asexual.
La reproduccin asexual tan bien llamada anamorfa, imperfecta o vegetativa no
incluye la unin de los ncleos compatibles, clulas sexuales u rganos sexuales.
Le reproduccin sexual tan bien llamada telemorfa o perfecta, en cambio, esta
caracterizada por la unin de los ncleos sexuales.
Por lo tanto, los propgulos de dispersin pueden ser de tipo sexual,
denominndose esporas, en tanto que a los del tipo asexual se las denomina
conidias.
La reproduccin asexual es ms importante para la propagacin de la especie ya
que origina la produccin de numerosos individuos, particularmente porque el ciclo
asexual se repite varias veces al ao; en tanto el sexual, en muchos hongos se
presenta una sola vez.
Los conidios se forman a partir de la clula conidigena (clula que por si misma o a
partir de la cual se originan directamente los conidios) que se encuentran
organizadas en estructuras de reproduccin, las cuales pueden ser interna o
externa.
Estructuras de
Estructuras de reproduccin ASEXUAL
reproduccin SEXUAL
INTERNA EXTERNA INTERNA
esporangiforo, conidiforo, filide, ascocarpos, ascos y
esporangio, columela, conidios ascosporas
esporangioconidio
53
Trabajo Prctico N 9: Agentes productores de MICOSIS SUPERFICIALES
OBJETIVOS: Conocer la macro y la micromorfologa de las especies de hongos productores

de micosis superficiales ms frecuentemente aisladas en nuestro medio.
FICHA 1: DERMATOFITOS. EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO

DERMATOFITOSIS:
Se observan filamentos hialinos tabicados y ramificados de 6 a 10
m de dimetro, a veces artrosporados
ECTOTRIX:
Las artrosporas se encuentran fuera del pelo.
El gnero_____________ se caracteriza por
presentar disposicin
ENDOTRIX:
Las conidias se encuentran dentro del pelo.
Esta disposicin es
caracterstica del gnero
_______________.
Malassezia spp:
Se observan filamentos cortos de bordes romos,

tabicados de 2 a 3 m de diam. y elementos
levaduriformes de 3 a 8 m en acmulos
FICHA N 2: DERMATOFITOS, ANLISIS MICROSCPICO DE LOS CULTIVOS:
Ejemplos Microsporum Trichophyton
Caractersticas
macroscpicas
Caractersticas
Microscpicas
Esquema
54
Agentes productores de MICOSIS SUBCUTANEAS
Agentes productores de CROMOMICOSIS
Agentes etiolgicos: La cromomicosis puede ser producida por un extenso grupo de

hongos dematiceos. En nuestra zona los agentes ms frecuentes son: Fonsecaea
pedrosoi y Phialophora verrucosa.
ESPECIES Caractersticas microscpicas

RAQUIS FIALIDE CLADOSPORIO
SIMPODIA fialoconidio cadenas acrpetas
L s de blastoconidias
(acroteca)
Phialophora
spp
Cladophialophora
spp
Rhinocladiella
aquaspersa
Fonsecaea
spp
cidas
entre
aterc
hong
color
Todo
aspe
atic
iopel
oscu
vello
negr
negr
(hon
pare
dem
enta
pres
esto
muy
sien
colo
ro o
ndo
os),
ado.
eos
gos
gris
son
sus
nias
cto
do
de
un
so
s,
os
o
s
FICHA 3: AGENTES PRODUCTORES DE CROMOMICOSIS
Phialophora Fonsecaea Rhinocladiella

spp spp aquaspersa
FASE
PARASITARIA
CARACTER
ISTICAS
MICROSCO
PICAS
FASE
SAPROFTICA
55
FICHA 4: Agentes Productores de eumicetoma
Fusarium spp. Madurella grisea
Caractersticas
Microscpicas
Esquema
FICHA 5: Agente Productor de esporotricosis

Agente Sporothrix schenkii
etiologico
28C
Caractersticas
macroscpicas
37C
de la colonia
Fase
Parasitaria
Coloracin:
Caractersticas Fase
Microscpicas Saproftica
Coloracin:
56
57
FICHA 6: AGENTES Paracoccidioides brasiliensis. Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis.

ETIOLGICOS DE MICOSIS
SISTEMICAS
28C
Caractersticas macroscpicas
37C
Fase Parasitaria
Coloracin:
Caractersticas Microscpicas
Fase Saprofitica
Coloracin:
Esquemas
58
FICHA 7: AGENTE
ETIOLGICO DE Cryptococcus Candida spp.
Esquema
MICOSIS neoformans
OPORTUNISTAS
Caractersticas
macroscpicas
Fase Parasitaria
Coloracin:
Caractersticas
microscpicas Fase Saprofitita
Coloracin:
59
FICHA 8: AGENTES
Aspergillus Aspergillus Aspergillus
ETIOLOGICO DE
fumigatus flavus niger
HIALOHIFOMICOSIS
Caractersticas
macroscpicas
de la colonia
Fase Parasitaria
Coloracin:
Fase Saprofitita
Coloracin:
Caractersticas
Microscpicas
Esquema
60
FICHA 9: AGENTES
PRODUCTORES DE Alternaria Curvularia
FEOHIFOMICOSIS
Caractersticas
macroscpicas
Fase Parasitaria
Coloracin:
Caractersticas
Microscpicas Fase Saprofitita
Coloracin:
61
FICHA 10: AGENTES

PRODUCTORES DE Rhizopus Mucor Absidia
CIGOMICOSIS
Caractersticas
macroscpicas
Fase Parasitaria
Coloracin:
Caractersticas
Fase Saprofitita
Microscpicas
Coloracin:
Esquemas
62
SEMINARIOS
63
ESTERILIZACION
1. Qu es ESTERILIZACION. Qu es DESINFECCION.
2. Confeccione un cuadro con los AGENTES FISICOS utilizados en la destruccin de
microorganismos.
3. Accin del CALOR sobre los microorganismos. Cmo acta el CALOR HUMEDO y
cmo el CALOR SECO.
4. En qu consiste un AUTOCLAVE. Cul es el principio de su funcionamiento y para
qu se emplea.
5. Qu es una ESTUFA DE ESTERILIZACION y cul es su utilidad.
6. Mencione los tiempos y temperaturas para autoclave y estufa con material
contaminado y material limpio respectivamente.
7. Qu efectos tienen las RADIACIONES UV sobre los microorganismos y cul es su
aplicacin. Cules son las RADIACIONES IONIZANTES y cul es su modo de
accin.
8. Cmo se logra la esterilizacin a travs de la FILTRACION.
9. Diferencia entre BACTERICIDA y BACTERIOSTATICO.
10. Defina DESINFECTANTE y ANTISEPTICO
11. Confeccione un cuadro con los AGENTES QUIMICOS, mecanismo de accin y
empleo.
12. Que es el xido de etileno y para que se emplea. Como se lo utiliza
13. Cules son los mtodos seguros de esterilizacin.
14. Explique cules son los CONTROLES DE ESTERILIZACION y cul es el ms
efectivo.
64
BIOSEGURIDAD
1. Concepto de bioseguridad.
2. Clasifique los residuos de laboratorio. Como se eliminan los residuos
patognicos.
3. Como se limpia el material no descartable.
4. Concentracin de hipoclorito de sodio usada para limpieza de pisos y mesadas y
para descartar material contaminado.
5. Como se debe proceder en caso de derrame de material biolgico.
6. Como proceder ante un accidente corto-punzante.
7. Explique brevemente como se realiza el transporte de material biolgico.
8. Control de fuego, tipos de matafuegos y utilizacin.
9. Describa los pasos para el correcto lavado de manos
10. Cuantos y cuales son los niveles de bioseguridad para los laboratorios.
11. Haga un listado de las 10 recomendaciones generales de bioseguridad que
considere las ms importantes en el laboratorio.
65
RELACIN HUSPED-BACTERIA
1. Segn sus condiciones de vida, existen dos grandes grupos de agentes
bacterianos, cules? Defina cada uno.
2. Cules son los modelos de relacin husped-bacteria?
3. Describa la flora microbiana normal de piel, oido externo, conjuntiva, vas
respiratorias, boca, tubo digestivo y tracto genitourinario.
4. Importancia de la flora microbiana normal.
5. Defina Infeccin, colonizacin, Infeccin inaparente y enfermedad infecciosa.
6. Defina los postulados de Koch. Poder patgeno. Virulencia.
7. Agentes Patgenos y oportunistas. Parsito extracelular e intracelular
(facultativo y obligado). Importancia.
8. Factores determinantes de la accin patgena. Describa brevemente.
9. Colonizacin y Adherencia. Describa brevemente.
10. Segn las modalidades de infeccin y segn la capacidad de penetracin, cmo
se clasifican las bacterias?
11. Penetracin, multiplicacin e invasin.
12. Factores que interfieren en las defensas del husped en las fases de
adherencia, de digestin intracelular e invasin.
13. Patogenia. Vas de difusin (contigidad, va linftica, sangunea y nerviosa)
14. Qu son las toxinas? Tipos.
15. Modelos de infeccin. Tipos.
16. Mecanismos de defensa inespecficos y especficos.
17. Defensas externas. Factores mecnicos y fsico-qumicos.
18. Defensas internas. Factores celulares. Inflamacin y fagocitosis.
19. Fases de la fagocitosis. Describa brevemente.
20. Defensas internas. Factores humorales.
66
MECANISMOS DE PATOGENICIDAD
1. Enumere los factores ms relevantes determinantes de patogenicidad
bacteriana.
2. Cul es el rol de las fimbrias, que tipos de fimbrias conoce, qu son las
adhesinas?
3. Cual es el rol del hierro y los siderforos?
4. Defina EXOTOXINA
5. Defina ENDOTOXINA y esquematice su estructura.
6. Establezca las similitudes y diferencias entre endo y exotoxinas.
7. Toxinas. Confeccione un cuadro consignando Tipo, Estructura, Mecanismo de
accin, tejido blanco, y microorganismo que la produce, para cada una de las
toxinas que conoce.
8. Que mecanismos emplean las bacterias para evadir la respuesta inmune del
husped?
9. Importancia de la cpsula.
10. Que es la variacin antignica.
67
MICOTOXINAS
1. Qu son las micotoxinas.
2. Cmo y por qu se forman.
3. Cules son los factores que determinan la contaminacin. Comentar cada uno.
4. Cules son los principales gneros productores de micotoxinas
5. Defina: Hongos del campo y Hongos de almacenamiento. De ejemplos de los
principales gneros.
6. Aflatoxinas. Cul es el principal hongo productor. Cules son sus principales
derivados. Estabilidad. Actividad biolgica.
7. Zearalenona. Cules son los principales hongos productores. Cules son sus
principales sustratos. Actividad biolgica
8. Tricotecenos. Cuales son sus principales sustratos. Actividad biolgica (ATA).
9. Ochratoxinas. Cuales son sus principales sustratos. Actividad biolgica
10. Fumonisinas. Cuales son sus principales sustratos. Actividad biolgica
11. Mtodos de detoxificacin
12. Cuales son las tcnicas de laboratorio que se utilizan para la determinacin de
micotoxinas
13. Reglamentacin y Prevencin.
68
FICHA DE ESTUDIO DE MICROORGANISMOS
1. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS, TINTORIALES Y CULTURALES

MORFOLOGIA (forma, tamao, agrupacin)
GRAM
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
CONDICIONES DE CULTIVO:
- MEDIO
- ATMOSFERA
- TEMPERATURA
- TIEMPO
2. METABOLISMO
3. HABITAT
4. FACTORES DE PATOGENICIDAD:
A) ENZIMAS
B) TOXINAS
C) ADESINAS
D) CAPSULA
E) ETC.
5. PATOGENIA
6. RESPUESTA INMUNE
7. DIAGNOSTICO
A) DIRECTO
B) CULTIVO
C) INDIRECTO (RESPUESTA INMUNE )
8. EVASION DE LA RESPUESTA INMUNE.
69

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Ctedra de Microbiologa General- FaCENA-UNNE

Universidad Nacional del Nordeste

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

CTEDRA: MICROBIOLOGA GENERAL

AUTORES: LAURA IRENE PICCOLI

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

correcto. En particular, si un cultivo es volcado o roto su envase, o si alguien resultara

Deseamos transmitir que todas las medidas de bioseguridad no son per se

PREPARACIN DE MATERIALES Y ESTERILIZACIN

Esterilizacin: Concepto y mtodos.

La esterilizacin o desinfeccin pueden llevarse a cabo segn dos mtodos:

Calor hmedo Esterilizacin

Calor seco Esterilizacin

Radiacin ultravioleta Desinfeccin o Esterilizacin

Radiaciones ionizantes (, x) Esterilizacin

Alquilantes Oxido de etileno Esterilizacin

Formaldehdo Desinfeccin o Esterilizacin

Alcoholes (alifticos y aromticos) Desinfeccin

Oxidantes: halgenos, KMnO4, H2O2 Desinfeccin o antisepsia

Tensioactivos catinicos y aninicos Desinfeccin

Metales pesados Desinfeccin o antisepsia

Soluciones de cidos o lcalis Desinfeccin

1- Esterilizacin por calor.

instantneamente; en general se requiere alrededor de 12 min a 121C para matar

En autoclave se esterilizan soluciones salinas, ropa, guantes, materiales

Para la esterilizacin de ciertos medios de cultivo lquidos que contienen

1- Debe dejarse suficiente espacio entre los materiales ubicados en el interior

A travs de este mtodo se esteriliza la mayor parte del material de

Incineracin por llama.

Es tipo de radiacin es de alta penetracin e incluye rayos x y . Su accin letal se

Las radiaciones ionizantes son adecuadas para la esterilizacin de material

La reduccin de la cantidad de m.o. se obtiene a travs del empleo de germicidas o

Algunos de los agentes de naturaleza qumica ms usados:

Alcoholes alifticos (etanol, isopropanol): Son ms activos cuando estn

Alcoholes aromticos: los fenoles se utilizan como desinfectantes de

Tensioactivos catinicos: actan afectando las membranas celulares

Tensioactivos aninicos: su accin se manifiesta a travs de una

La limpieza y esterilizacin del material de laboratorio de Microbiologa consta de tres

La esterilizacin previa consiste en autoclavar durante 30 minutos a 121C (1 atm) el

2) Limpieza del material

Enjuagar con abundante agua presin

Una vez lavado el material dejar secar a temperatura ambiente proceder a la

El material debe prepararse previo a la esterilizacin en autoclave o en estufa.

Autoclave: 20 minutos 121C

Estufa: 1 hora 170C

Tubos con o sin tapn de algodn: se arman grupos de 10 tubos, y se

o Materiales metlicos: tijeras, esptulas, pinzas, etc. Se envuelven

o Tips, tapones de goma, pipetas pasteur de vidrio, hisopos: Se colocan en frascos

o Aceites, vaselina, talco: se colocan en frascos individuales con tapn de algodn

o Medios de cultivos soluciones: se colocan en frascos individuales con tapn de

o Material textil: Se dobla y se empaqueta en papel (Autoclave)

NOTA: todo el material a esterilizar debe estar correctamente rotulado. En el

Actividades a realizar por el alumno:

1) Envoltura y preparacin de material de vidrio limpio para esterilizacin

Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual de tcnicas de

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Gran parte de la microbiologa depende de la capacidad de cultivar y mantener

Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes, en los que crecen