Este documento describe un protocolo tradicional para extraer ADN de plantas y alimentos vegetales utilizando el bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). El protocolo involucra una serie de pasos como la incubación de la muestra con CTAB, RNAsa A y proteinasa K, extracción con fenol-cloroformo, precipitación del ADN con isopropanol y lavado con etanol al 70% para purificar el ADN y obtenerlo en forma de botón seco que luego es rehidratado en buffer TE o agua destilada. Este método CTAB permite
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Este documento describe un protocolo tradicional para extraer ADN de plantas y alimentos vegetales utilizando el bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). El protocolo involucra una serie de pasos como la incubación de la muestra con CTAB, RNAsa A y proteinasa K, extracción con fenol-cloroformo, precipitación del ADN con isopropanol y lavado con etanol al 70% para purificar el ADN y obtenerlo en forma de botón seco que luego es rehidratado en buffer TE o agua destilada. Este método CTAB permite
Este documento describe un protocolo tradicional para extraer ADN de plantas y alimentos vegetales utilizando el bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). El protocolo involucra una serie de pasos como la incubación de la muestra con CTAB, RNAsa A y proteinasa K, extracción con fenol-cloroformo, precipitación del ADN con isopropanol y lavado con etanol al 70% para purificar el ADN y obtenerlo en forma de botón seco que luego es rehidratado en buffer TE o agua destilada. Este método CTAB permite
Este documento describe un protocolo tradicional para extraer ADN de plantas y alimentos vegetales utilizando el bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). El protocolo involucra una serie de pasos como la incubación de la muestra con CTAB, RNAsa A y proteinasa K, extracción con fenol-cloroformo, precipitación del ADN con isopropanol y lavado con etanol al 70% para purificar el ADN y obtenerlo en forma de botón seco que luego es rehidratado en buffer TE o agua destilada. Este método CTAB permite
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Anexo 1.
Protocolo tradicional CTAB (Bromuro de Cetil
trimetil amonio) Uno de los metodos que se utilizan para extraer ADN de plantas y alimentos derivados de vegetales utiliza CTAB que es la sustancia adecuada para procesar tejidos con una alta concentracion de polisacaridos y polifenoles. Este protocolo fue desarrollado por Murray y Thompson en 1980 y publicado hasta 1987 por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al. 1987). Se ha utilizado de manera efectiva en diversas especies de plantas (Doyle y Doyle 1987, Tel-Zuri et al. 1999, Aras et al. 2003) bacterias (Honore´-Bouakline et al. 2003), hongos, liquenes (Crespo et al. 1999) e insectos (Fraga et al. 2004). En la actualidad algunos laboratorios, que procesan un alto numero de muestras, se sigue utilizando ya que permite obtener ADN de alta calidad eliminando los inhibidores que afectan la PCR; ademas de ser un metodo economico y facil de estandarizar.
Miniextraccion CTAB, partiendo de 100 mg de tejido
Equipo • Bano de incubacion o termoblock • Microcentrifuga que pueda ser programada a 14,000 rpm • Vortex • Balanza analitica • Potenciometro • Agitador termo-magnetico • Campana de extraccion • Ultracongelador • Concentrador de vacio • Espectrofotometro • Camara de electroforesis Material • Termo o cuba para nitrogeno liquido • Morteros y pistilos • Espatulas • Tijeras o bisturi • Tubos de microcentrifuga de 1.5 ml esteriles 22 Herramientas moleculares aplicadas en ecologia • Micropipetas de 2, 10, 200 y 1 000 uL • Puntas para micropipeta de 10, 200 y 1 000 uL con filtro • Gradilla para tubos de 1.5 o 2 ml • Espatulas • Guantes • Hielo • Termometro • Marcadores para etiquetar tubos • Bata de laboratorio • Toallas de papel • Contenedores de desechos liquidos • Contenedores de puntas utilizadas Reactivos • 2-s-Mercaptoethanol (CAS No 60-24-2) • Acetato de amonio (CAS No 631-61-8) • Acido borico (CAS No 10043-35-3) • Acido clorhidrico (CAS No 7647-01-0) • Agarosa (CAS No 9012-36-6) • Agua destilada esteril libre de DNasas y RNasas • Alcohol isoamilico (CAS No 123-51-3) • Cloroformo (CAS No 67-66-3) • Cloruro de sodio (CAS No 7647-14-5) • CTAB, Bromuro de hexadecil trimetil amonio (CAS No 57-09-0) • EDTA Acido etileno diamino tetracetico di sodico (CAS No 6381-92-6) • Etanol grado biologia molecular (CAS No 64-17-5) • Fenol (CAS No 108-95-2) • Marcador de peso molecular de 1 Kb • Nitrogeno liquido (CAS No 7727-37-9) • Proteinasa K (CAS No 39450-01-6) • RNAsa A (CAS No 9001-99-4) • TBE (Tris base, EDTA, acido borico) • Tris base (CAS No 77-86-1) • Tris-Hidrochloride (CAS No 1185-53-1) Extraccion y purificacion de ADN 23 Soluciones requeridas Antes de empezar Preparar con anticipacion todas las soluciones que se utilizaran y mantenerlas a la temperatura solicitada. Esterilizar morteros y pistilos, tubos para microcentrifuga y puntas para micropipetas. Rotular los tubos y tener a la mano marcadores de punto fino indelebles. En lo posible, utilice agua libre de DNasas y RNasas para preparar las soluciones. Encender el o los termobanos para que se encuentren a la temperatura requrida. Buffer Tris-HCl 100 mM pH 8 Dentro de la campana de extraccion, disolver en 65 ml de agua desionizada 0.605 g de Tris-HCl. Agregar HCl al 0.1 N, agitando constantemente hasta ajustar el pH a 8. Aforar a un volumen de 100 ml con agua desionizada. Mantener a temperatura ambiente. Buffer de extraccion CTAB 2X 1.4 M de NaCl (8.181 g) 20 mM de EDTA (0.744 g), 2 % P/V de CTAB (2 g). Disolver lo anterior en 75 ml de buffer Tris-HCl 100 mM pH 8 en un agitador termomagnetico hasta que las sustancias se disuelvan completamente. Agregar 300 μl de 2-β-mercaptoetanol en la campana de extraccion ya que este compuesto es muy volatil y toxico. Finalmente, aforar a un volumen de 100 ml con la solucion de Tris-HCl previamente utilizada. Mantener a temperatura ambiente y antes de iniciar el proceso caliente a 55 °C. Solucion Fenol: Cloroformo: isoamilico 25:24:1 Mezclar en la campana de extraccion 50 ml de fenol, 48 ml de cloroformo y 2 ml de alcohol isoamilico. Mantener almacenado a -20°C. 24 Herramientas moleculares aplicadas en ecologia Acetato de amonio 10 M Disolver en 5 ml de agua desionizada, 7.71 g de acetato de amonio y aforar a 10 ml con agua desionizada. Mantener a temperatura ambiente. Etanol al 70 % Por cada 70 ml de etanol absoluto, agregar 30 ml de agua desionizada y mezclar. Mantener la solucion a -20°C.
Metodo Protocolo CTAB 1. Mezclar 100 mg de tejido previamente pulverizado con nitrogeno liquido con 1 ml de CTAB 2X, precalentado a 55 oC, en un tubo para microcentrifuga de 1.5 ml. 2. Mezclar por inversion e incubar 5 min. a temperatura ambiente. 3. Incubar 5 min. en hielo. 4. Agregar 20 μl de RNAsa A, mezclar por inversion e incubar por 20 min. a 37 oC. Durante la incubacion invertir los tubos dos o tres veces. 5. Agregar 10 μl de proteinasa K, mezclar por inversion e incubar a 60 oC por 20 min. Durante la incubacion invertir los tubos dos o tres veces. 6. Incubar 5 min en hielo. 7. Agregar 600 μl de fenol:cloroformo:isoamilico (25:24:1) y agitar por inversion. 8. Centrifugar a 10,000 rpm a 8 oC, por 12 min. 9. Recuperar con cuidado 200 μl del sobrenadante y ponerlo en un tubo para microcentrifuga nuevo de 1.5 ml. Nota: Si el sobrenadante se encuentra turbio, sera necesario repetir los pasos del siete al nueve. 10. Agregar 50 μl de acetato de amonio 10 M y mezclar por inversion varias veces. 11. Agregar 500 μl de isopropanol frio (a -20 oC) y mezclar por inversion varias veces. 12. Mantener la mezcla a -20oC durante 2 hrs, para favorecer la precipitacion de ADN. 13. Centrifugar a 10,500 rpm a 8 oC, por 5 min. Extraccion y purificacion de ADN 25 14. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. 15. Agregar 1 ml de etanol al 70 % frio (a -20 oC). 16. Mezclar por inversion hasta observar que el boton se desprende del microtubo. 17. Dejar reposar 5 min. a temperatura ambiente. 18. Centrifugar a 10,000 rpm a 8 oC, por 5 min. 19. Eliminar el sobrenadante cuidando no desprender el boton de ADN. 20. Colocar los tubos para microcentrifuga de 1.5 ml en el concentrador de vacio a 500 atm a 55oC por 10 min para secar el ADN. Si no se cuenta con un concentrador de vacio se pueden dejar los tubos abiertos hasta que se evapore el etanol; cubrirlos con una toalla de papel para que no se contaminen. 21. Revisar que el boton de ADN se encuentra completamente seco; en caso de no estarlo repetir el paso 20 durante el tiempo que sea necesario 22. Rehidratar el ADN en 200 μl de buffer TE 1X o agua inyectable. Si el boton de ADN es pequeno se puede hidratar con 50 o 100 μl.
