P13 Aislamiento de DNA Bacteriano

GUIA DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL EPGB 2023 II
Práctica Nº13: AISLAMIENTO DE DNA BACTERIANO

OBJETIVOS
✓ Familiarizar al alumno con la metodología de obtención de los ácidos nucléicos.

✓ Caracterizar los ácidos nucléicos obtenidos de acuerdo a algunas propiedades
fisicoquímicas.
INTRODUCCIÓN
Un primer paso para cualquier estudio que involucre el uso de una molécula de ADN o
ARN es su extracción y purificación a partir de una célula manteniendo intacta su estructura
y evitando su contaminación con otro tipo de moléculas orgánicas de la célula. 1
En el presente trabajo práctico vamos a ensayar una metodología para cumplir con tal
fin, tanto para el caso del ADN como RNA.
Aislamiento de ADN bacteriano
Células bacterianas se lavan con solución salina y luego se lisan con lisozima y SDS.
Las proteínas se eliminan con pronasa agregando cloroformo combinado con alcohol
isoamílico al 4%. Se separa la fase acuosa (que contiene los ácidos nucleicos) por
centrifugación a 10 000 rpm durante 10 minutos. A partir de la fase acuosa se obtiene por
precipitación con etanol 96% frío los ácidos nucleicos. Estos se recogen por enroscamiento
en una varilla para luego disolverlos en solución salina. El ARN presente se digiere con
RNasa pancreática. Seguidamente se agita con igual volumen de cloroformo combinado
con alcohol isoamílico al 4%; se separa la fase acuosa por centrifugación a 10 000 rpm
durante 10 minutos y se separa el ADN por precipitación con etanol al 96% en frío.
MATERIAL
✓ Centrífuga
✓ Espectrofotómetro UV
✓ Extracto de levadura
✓ Peptona de carne
✓ Cloruro de sodio
✓ Glucosa
✓ Lisozima
✓ Sulfato Dodecil de Sodio (SDS)
✓ Pronasa
✓ Cloroformo
✓ Alcohol isoamílico
✓ Etanol absoluto
✓ Ribonucleasa pancreática
✓ Solución Salina Citratada (SSC)
✓ Cepa: Bacillus subtilis PB-19
PROCEDIMIENTO
Día 1: Cultivar la cepa en 200 ml de caldo Luria con glucosa al 0.5% a 37°C durante 15-18
hrs.
SUSANA GUTIERREZ FERNANDO MERINO MIGUEL TALLEDO

Día 2:
1. Centrifugar el cultivo a 4 500 rpm durante 10 min (a 4°C), eliminar el sobrenadante y
resuspender las células en solución salina citrada (SSC). Repetir este paso dos veces.
2. Resuspender las células en 5 ml de SSC, lo cual representa 1/20 del volumen original.
3. Lisar las células con 0.124 ml de lisozima. Este volumen debe alcanzar una
concentración final de 1 mg/ml.
4. Incubar durante 30 min. a 37°C.
5. Agregar 1.2 ml de Sodio Dodecil Sulfato. Este volumen debe alcanzar una
concentración final de 1 mg/ml. Incubar durante 10 min. a temperatura ambiente.
6. Eliminar proteínas agregando 0.1 ml de pronasa diluida en SSC (que alcance una
concentración final 1 mg/ml). Incubar durante 2 horas a 37°C. 2
7. Agregar cloroformo y alcohol isoamílico al 4% en proporción 1:1. Agitar durante 20 min.
8. Separar la fase acuosa que contiene los ácidos nucleicos, mediante centrifugación a 4
500 rpm durante 10 min (T = 4°C).
9. Precipitar la fase acuosa agregando 4 volúmenes de etanol 95% frío.
10. Recoger los ácidos nucleicos por enroscamiento en varilla de vidrio.
11. Disolver los ácidos nucleicos extraídos en 5 ml de SCC.
12. Digerir el ARN presente con ribonucleasa pancreática, a una concentración de 50 mg/-
ml.
13. Incubar durante una hora a 37°C.
14. Agitar con una solución 1:1 de cloroformo y alcohol isoamílico al 4%.
15. Separar la fase acuosa por centrifugación (4 500 rpm por 10 minutos a 4°C).
16. Agregar 4 volúmenes de etanol absoluto frío a la fase acuosa (sobrenadante) y dejar
precipitando.
Día 3:
1. Redisolver el ADN en SSC
2. Purificar el ADN mediante precipitaciones sucesivas con etanol 95% en frío y
redisoluciones en SSC, tal como se indica en el paso 16 del día 2.
Para el aislamiento de plásmidos
1. Se cogen 1,5 mL (2 x 750 μl) de un cultivo estacionario de una bacteria portadora de un

plásmido con un gen de resistencia a un antibiótico. Este cultivo se creció durante toda la
noche a 37°C en medio con antibiótico.
2. Se dispensan en un tubo eppendorf (previamente marcado) y se centrifuga a

temperatura ambiente, durante 3 min a 12.000 g.
3. Se retira el sobrenadante (2 x 750 μl) con mucho cuidado (punta azul dentro de punta
amarilla) y se descarta.
4. Se da un pulso de centrífuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante que aún quede

(punta amarilla dentro de punta blanca) y se tira. Nos quedamos con el precipitado de las
bacterias.

Lisis alcalina
5. Se resuspende (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 μl de una

solución isotónica (GTE: Glucosa, Tris y EDTA) a 4°C. Se deja a temperatura ambiente
durante 5 min.
6. Se añaden al mismo tubo, 200 μl de la solución de lisis (NaOH, SDS) que está a
temperatura ambiente y recién preparada. Se agita suavemente con la mano por inversión
del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 min a 4°C.
Neutralización
3
7. Se añaden al mismo tubo, 150 μl de la solución de neutralización (acetato potásico 3M,
pH 4,8). Se agita con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 min a
4°C.
Extracción de los plásmidos
1. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugación (15 min a

12.000 g y 4°C), formándose un sedimento blanco de aspecto lechoso. El tubo
se traslada con cuidado a la mesa de trabajo.
2. Se retira (2 x 200 μl) con cuidado el sobrenadante con el DNA plasmídico y se
dispensa en un tubo limpio (previamente marcado).
3. Se añade 1 ml de etanol absoluto (4°C) al tubo en el que hemos puesto la
solución con el DNA plasmídico. Se mezcla con la mano por inversión del tubo
(unas 10 veces). Se incuba 15 min a 4°C.
4. Se precipitan los plásmidos por centrifugación (15 min a 12.000 g y 4°C), se
retira (2 x 750 μl) cuidadosamente el sobrenadante (punta azul dentro de
punta amarilla) y se tira.
5. Se añaden al mismo tubo, 900 μl de etanol al 70% (4°C). Se mezcla
suavemente con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces).
6. Se vuelven a precipitar los plásmidos por centrifugación (10 min a 12.000 g y
4°C), se retira cuidadosamente el sobrenadante (punta azul dentro de punta
amarilla) y se tira.
7. Se da un pulso de centrífuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante que
aún quede (punta amarilla dentro de punta blanca) y se tira. Nos quedamos
con el precipitado de los plásmidos.
8. Se disuelve el precipitado de los plásmidos (aspirando y soltando el líquido
varias veces con ayuda de la micropipeta) en 50 μl de tampón TE (pH 8,0),
con ribonucleasa A.
9. Se incuba a temperatura ambiente 5 min. Mantener la muestra a 4°C
Determinación de ácidos nucleicos por absorción de luz ultravioleta
Todos los ácidos nucleicos tienen una fuerte banda de absorción en la región de luz
ultravioleta con un máximo a 260 nm y un mínimo aproximadamente a 230 nm. Su pico
de absorción es usualmente designado en términos de su valor Ep definido como la
densidad óptica en 1 cm de profundidad de una solución que contiene un átomo gramo de
fósforo de ácido nucleico por litro.
Es conveniente, sin embargo tener presente que la conversión de los valores de densidad
óptica a cantidades de ácidos nucleicos está sujeta a error que puede derivarse de la varia-
ción en la composición de bases, en el efecto hipercrómico y la contaminación con
productos de la degradación proteica.

Un esquema simplificado de la extracción de ADN bacteriano total


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