PRÁCTICA N° 3 y 4

Extracción y calidad del ADN

1. INTRODUCCIÓN:

La extracción de ADN es una práctica rutinaria en las prácticas de Biología

Molecular y en la que se pueden describir diferentes métodos según los objetivos
específicos de la extracción y/o el tejido a utilizar. La mayor parte de los métodos
que existen para extraer el ADN consisten en lograr primero la lisis o ruptura de la
célula, para luego separar las moléculas de ADN del resto de los constituyentes de la
célula. Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN
de muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales,
tejidos vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. En este trabajo se
analizan las diferencias, ventajas y desventajas de algunos de los métodos existentes
para la extracción del ADN.
La electroforesis se emplea como una técnica de separación de moléculas que se
basa en la migración diferencial de las partículas biológicas cargadas dispuestas en
un soporte inerte, bajo la acción de un campo eléctrico aplicado y es una forma de
ver la calidad cualitativa del ADN.
En general, se considera que el ADN es puro cuando la ratio A260/230 se sitúa en
torno 1.8-2.2. Una ratio menor de 1.8 se relaciona con presencia de contaminantes en
la muestra. Cuanto menor sea esta ratio la presencia de contaminantes en la muestra
será mayor, y para tal efecto se utilizan los espectrofotómetros.

2. OBJETIVOS:
 Conocer el protocolo designado para la extracción de ADN a partir de muestras
biológicas utilizando dos métodos de extracción, Fenol-cloroformo y kit de
extracción de ADN.
 Familiarizarse con los equipos básicos de un laboratorio de Biología Molecular.
 Preparación de geles de agarosa para corrida electroforética de la extracción
realizada en la práctica anterior.
 Verificar que la muestra tenga la calidad suficiente vía espectrofotómetro de
nanodrop para continuar con los procedimientos respectivos.

3. MATERIAL Y MÉTODOS:
NOTA: Las muestras serán solicitadas de acuerdo al kit de extracción con
el cual cuente la cátedra en el momento de la práctica.
3.1. Método Fenol - Cloroformo
1. Se agregará a cada tubo Eppendorf de 1.5 ml, 300 µl de la Solución 1 (50 mM
Tris HCl pH 8.0; 100 mM EDTA pH 8.0; 100 mM NaCl; 1% SDS) y 10 µl de
Proteinasa K; luego se agregará tejido a cada tubo (previamente se secará con
 papel absorbente el exceso de etanol en el tejido), los tubos serán sellados con
parafilm y se agitará vigorosamente e incubará durante la noche con
movimiento, a una temperatura de 37ºC.
2. Luego se agregará 5 µl de ARNasa a cada tubo, se agitará vigorosamente
durante 10 segundos e incubará nuevamente por 90 minutos a una temperatura
de 37ºC.
3. Se agregará 400 µl de fenol a cada tubo, luego se agitará vigorosamente
durante 10 segundos y luego se colocará a un mini incubador a temperatura
ambiente por 20 minutos a 600 rpm.
4. Se agregará 400 µl de Cloroformo a cada tubo, se agitará vigorosamente
durante 10 segundos y luego se colocará a un mini incubador a temperatura
ambiente por 20 minutos a 600 rpm, seguidamente se centrifugará los tubos a
12 000 rpm durante 5 minutos.
5. Luego cuidadosamente se removerá 200 µl de la fase acuosa superior (usando
una punta de micropiteta de boca ancha, es decir cortada la punta) a un tubo
Eppendorf de 1.5 ml nuevo.
6. Se agregará 900 µl de Etanol 92%, se mezclará vigorosamente mediante
inversión de los tubos (6 veces). El ADN deberá precipitar, luego se dejará
reposar durante 3 minutos, seguidamente se centrifugará a 12 000 rpm por 5
minutos y se retira el etanol.
7. Se agregará 1000 µl de etanol 70%, se agitará suavemente y será colocado en
un mini incubador por 30 minutos a temperatura ambiente y cuidadosamente se
extraerá el Etanol.
8. Finalmente se permitirá que el ADN se seque parcialmente a temperatura
ambiente (10 minutos), y se resuspenderá el pellet en agua de PCR. Para esto
se tiene que poner en baño seco a una temperatura de 37 °C por un día, luego
se dejará congelar el ADN a –20ºC.
1.2. Método según Kit de extracción:

Se describirá como ejemplo el protocolo Thermo Scientific GeneJET

Genomic DNA Purification Kit, pero podrá variar según disponibilidad en el
momento de la práctica.

1. 1. Muele hasta 20 mg de tejido de mamífero (use hasta 10 mg de tejido de bazo),

0,6 cm (rata) o clip de cola de 0,5 cm (ratón) en nitrógeno líquido usando un
mortero. Alternativamente, cortar el tejido en trozos pequeños o romperlo con
un homogeneizador.
2. Recoger el material en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (no incluido) y
resuspenderlo en 180 μL de Solución de Digestión. Agregue 20 μL de solución
de Proteinasa K y mezcle a fondo mediante agitación con vortex o pipeteo para
obtener una suspensión uniforme.
3. Incubar la muestra a 56 °C hasta que el tejido esté completamente lisado y no
queden partículas permanecer. Durante la incubación, agite el vial
ocasionalmente o utilice un baño de agua con agitación, plataforma basculante o
thermomixer.
Tiempos de incubación sugeridos:
Cantidad de tiempo de incubación sugerido
5 mg de tejido (excepto el bazo) 1 hora
10 mg de tejido (excepto el bazo) 2 horas
20 mg de tejido (excepto el bazo) 3 horas
5 mg de bazo 2 horas
10 mg de bazo 3 horas
Cola de ratón (0.5 cm), cola de rata (0.6 cm) 6 horas
Nota. El tiempo de lisis varía según el tipo y la cantidad de tejido procesado. En
algunos casos, el tiempo de incubación debe prolongarse de 6 a 8 horas o toda
la noche (para cola de roedor) hasta que se produzca la lisis completa.
4. Agregue 20 μL de solución de ARNasa A, mezcle mediante agitación y luego
incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Agregue 200 μL de solución de lisis. Mezcle bien agitando durante 15 s hasta
obtener una mezcla homogénea.
6. Agregue 400 μL de etanol al 50% y mezcle pipeteando o agitando con vórtex.
7. Transfiera el lisado preparado a una columna de purificación de ADN genómico
GeneJET insertado en un tubo de recolección. Centrifugar la columna durante 1
min a 6000 g. Desechar el tubo de recogida que contiene la solución fluida.
Coloque la columna de purificación de ADN GeneJET Genomic en un nuevo
tubo de recolección de 2 ml (incluido).
Nota. ¡Cierre bien la bolsa con las columnas de purificación de ADN genómico
GeneJET después de cada uso!

8. Añadir 500 μL de Buffer I (con etanol añadido). Centrifugar durante 1 min a

8000 g. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de purificación en la
colección tubo.
9. Agregue 500 μL de Buffer II (con etanol agregado) a la Columna de
Purificación de ADN genómico GeneJET. Centrifugar durante 3 min a velocidad
máxima (≥12000 g).
Opcional. Si se ve solución residual en la columna de purificación, vacíe el tubo de
colección y volver a girar la columna durante 1 min. a máxima velocidad.
Deseche el tubo de recolección que contiene la solución fluida y transfiera la
Columna de purificación de ADN genómico GeneJET en un tubo de
microcentrífuga estéril de 1,5 ml (no incluido).
10. Agregue 200 μL de Buffer de elución al centro de la membrana de la Columna
de purificación de ADN genómico GeneJET para eluir ADN genómico. Incubar
durante 2 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 min a 8000 g.
Nota
• Para obtener el máximo rendimiento de ADN, repita el paso de elución con 200
μL adicionales de tampón de elución.
• Si se requiere ADN más concentrado o se aísla ADN de una pequeña cantidad de
material de partida (p. ej., <5 mg de tejido), el volumen del tampón de elución
 añadido a la columna se puede reducir a 50-100 µl. Tenga en cuenta que
volúmenes más pequeños de tampón de elución darán como resultado
cantidades finales más pequeñas de ADN eluido.

11. Deseche la columna de purificación. Utilice el ADN purificado inmediatamente

en aplicaciones posteriores o almacenar a -20 °C.

1.3. Electroforesis en gel de agarosa

Se evalúa el estado del ADN por medio de electroforesis en geles de agarosa al

1%, usando una solución amortiguadora TBE y TAE al 0.5 X por 40 minutos a
80 voltios (por definir, depende del equipo). La muestra de ADN será cargada en
el gel de agarosa mezclando con ella un intercalante Red Gel + Loading Dye con
la finalidad de permitir su visualización en luz UV, a la vez se hace el empleo de
un marcador de 1000 pb, para determinar el peso de las bandas.

Figura. Equipamiento de la sala de electroforesis. a) cámaras

de poder, b) vórtex y minispin, c) cámara de electroforesis
horizontal, y d) fotodocumentador.

La marca de las cámaras de poder y cámara de electroforesis son Cleaver y el

modelo de la cámara de poder es CS-300V. El agitador (vortex) y minispin son
marca Labnet.

BUFFER DE CORRIDA:
 TBE

Producto: Invitrogen™ Tampón TBE UltraPure™, 10X

 Para la corrida de electroforesis, se utiliza TBE a 0.5X en la cámara de
electroforesis, aplicando la C1.V1=C2.V2, se tiene que diluir 50 ml en 950 ml
de H20 MiliQ.
 TAE

Producto: UltraPure 10X TAE Buffer

Para la corrida de electroforesis, se utiliza TAE a 0.5X en la cámara de

electroforesis, aplicando la C1.V1=C2.V2, se tiene que diluir 50 ml en 950 ml
de H20 MiliQ.
PREPARACIÓN DE GEL DE AGAROSA
Para Gel de agarosa al 1%, se utiliza 0.8 g de agarosa y se disuelve en 80 ml de
Buffer 0.5 X (TAE o TBE). Se calienta en el microondas hasta disolverse
completamente (tener cuidado en su ebullición y perdida del gel).
Preparación de Loading Dye + Red Gel
Se utiliza:
 500 ul Gel Loading Buffer Dye 6X
 500 ul de H20 PCR
 5 ul de GELRED NUCLEIC ACID GEL STAIN, 10,000X
Preparación de Ladder
Se utiliza:
 200 ul Loading Dye + Red Gel (preparado anteriormente).
 200 ul Ladder (GeneRuler 50bp, DNA Ladder, ready-to-use).
 400 ul H2O PCR.
El GeneRuler utilizado depende del amplicón amplificado.
1.4. Calidad de ADN en Spectrofotómetro nano

Seguir instrucciones de acuerdo a especificaciones del equipo.

4. RESULTADOS:
5. DESARROLLO:
Responda las siguientes preguntas
 1. Completa el siguiente cuadro:
EQUIPO DESCRIPCI IMAGEN
ÓN
NANODROP Equipo el
cual usando
ondas de luz
y basándose
en la turbidez
de la solución
a analizar
determina la
masa
presente de
una sustancia.
VORTEX DIGITAL Equipo de
laboratorio el
cual se
encarga de
realizar
vibraciones
en la base a
un tubo ya
sea ependorf
o tubo de
ensayo.

CENTRÍFUGA Como el
REFRIGERADA mismo
nombre lo
dice, es una
centrifuga la
cual mantiene
a la muestra
en una
temperatura
constante y
sobre todo
refrigerada.
MINICENTRÍFUGA Centrifuga
pequeña, pero
que incluso
tiene más
velocidades
en las
revoluciones
por minuto,
normalmente
es para tubos
 ependorf.

TERMOCICLADOR Es un equipo
el cual se usa
para
amplificar un
segmento de
ADN, usa
temperatura e
intervalos de
tiempo en su
funcionamien
to.

FOTODOCUMENTA Dispositivo el
DOR cual se usa
para
fotografiar el
desplazamien
to de la
molécula
problema en
el gel de
agarosa.

CABINA DE Equipo el
EXTRACCIÓN cual en un
área
determinada
se encarga de
mantenerla
aislada del
aire del
alrededor,
para tener asi
un ambiente
o espacio
pulcro y libre
 de
contaminante
s.
ELECTROFORESIS Equipo
electrónico el
cual usando
una corriente
eléctrica
promueve el
desplazamien
to de una
molécula en
un gel
poroso.

TANQUE Instrumento
CRIOGÉNICO el cual
permite
almacenar
nitrógeno
liquido.

MICROPIPETAS Pipetas
especializada
s para
succionar o
medir
volúmenes
pequeños.

2. De manera general: ¿Cuántas fases puedes identificar en el proceso de

extracción del ADN? (explica brevemente por qué)
Las fases que pude identificar son las siguientes:
-Elegir con qué tipo de muestra se quiere trabajar (o con que parte del animal
dependiendo la especie), pues dependiendo de tejido se elige los diferentes kits
existentes, así como la metodología a seguir.
-Una vez se halla elegido la muestra (es caso de ser tejido) se procede a triturarlo, en
caso sea sangre o saliva este procedimiento se obvia.
-Lisis de membranas, en este procedimiento rompemos las membranas tanto internas
como externas para así acceder al ADN.
-Una vez el ADN queda expuesto se lo limpia de proteínas asociadas a él, para así
tener un ADN puro.
-Finalmente se realiza lavados consecutivos (filtrado) para obtener únicamente el
ADN.
-También se puede realizar un control de calidad del ADN, para así determinar su
pureza y sobre todo la eficacia del método usado, así como la integridad de los
reactivos.
3. ¿Por qué es importante el uso de hielo seco o nitrógeno líquido en la extracción
de ADN?
El uso de nitrógeno líquido tiene dos finalidades, uno rompimiento de los tejidos y
membranas mas fácilmente y otra mantener estable al ADN, pues se le baja
enormemente su energía cinética evitando posibles degradaciones.
4. ¿Cuál es la importancia del uso de Proteinasa K?
La solución de proteinasa K es la encargada de la digestión de proteínas que se
encuentren asociadas al ADN, así que su uso nos permite obtener una ADN puro.
5. ¿Qué problemas usuales se pueden encontrar en el revelado de un gel?
Puede ser que por descuidos se deje activado la bandeja de agarosa y la energía
activada, asi que el ADN se puede desplazar hasta el otro extremo. Otro problema es
el intercalante, si no se lo agrega se no se puede realizar la lectura correspondiente,
otro inconveniente es al momento de agregar la muestra en los espacios del gel, pues
se puede verter afuera y el problema mas grave, contaminación de muestra o
reactivos.
6. ¿Cómo se puede evidenciar la contaminación en una muestra?
Esta evidencia se puede determinar en dos momentos, uno es la lectura en gel de
agarosa donde usando un control positivo y uno negativo se puede determinar la
contaminación y el otro es haciendo uno del nanodrop, por medio de
espectrofotometría.
7. ¿Qué intercalantes son usados en el gel de agarosa y como funcionan?
Se mencionaron dos intercalantes que suelen usar, uno es el red gel y el otro es el
bromuro de etilio (se ha dejado en decadencia su uso) su funcionamiento es que se
adhieren al ‘esqueleto’ del ADN y así cuando se lo someten a rayos UV desprenden
fluorescencia.
 8. Discuta los resultados de calidad obtenidos por los grupos A1 y A2.
Existe una gran diferencia entre los datos obtenidos entre ambos grupos, pues en la
lectura de nanodrop de 260/280 se deternino 1,63 para el grupo A2; mientras que
para el grupo A1 se determino 1,18.
Estos datos denotan una gran diferencia en las muestran obtenidas en ambos grupos y
sobre todo se puede plantear varias explicaciones para la variación, El intervalo de
un ADN puro oscila entre 1,80 a 2,1. Así que la muestra del grupo A2, es la que esta
mas cercana a ese número, por lo tanto es la que presenta menos contaminantes o
interferencias, pues la muestra del grupo A1 al tener un número muy lejano del
intervalo se asume que presenta otras moléculas que no son de importancia para la
extracción.
Así que se asume que el procedimiento realizado en el grupo A2 es lo más cercano a
lo determina por el protocolo de extracción, sobre todo en lo que respecta a la
actividad enzimática, pues esa etapa es la presenta mas importancia, y existe la
posibilidad que el grupo A1 haya cometido algunos errores en esa etapa.

6. CONCLUSIONES
° Se logro conocer el protocolo de extracción de ADN usando el kit de extracción.
° Al terminar la clase práctica se logró familiarizarse con los instrumentos de Biología
molecular.
° Se determino que la muestra del grupo A2 es lo mas cercano a una adecuada muestra
de ADN mediante la lectura de espectrofotómetro.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

William J. Thieman, Michael A. Palladino. Introducción a la Biotecnología. Segunda

edición. Madrid: Pearson education, 2010.
Francisco G. Bolivar. Fundamentos y casos exitosos de la Biotecnología moderna.
México: Editorial Rosa campos de la Rosa, 2004.