Instituto politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria

de Ingeniería Campus Guanajuato

Laboratorio de Biotecnología Farmacéutica

Ingeniería farmacéutica

6FV1

Práctica 1: Extracción de ADN genómica de bacterias

Equipo 3

Integrantes:
Fernández Romero José María
Jaime Isaí Carlos Manuel

Fecha de entrega: 29 de agosto del 2019

Índice
1. Objetivos.......................................................................................................................2
2. Introducción..............................................................................................................2
3. Metodología...............................................................................................................5
4. Resultados...................................................................................................................7
5. Discusiones..................................................................................................................8
6. Conclusión.................................................................................................................9
7. Cuestionario.................................................................................................................9
8. Bibliografía.................................................................................................................12

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1. Objetivos

1.1 General:
 Extraer ADN genómico de una muestra bacteriana de Bacillus thuringensis para
visualizar este en electroforesis y posteriormente realizar su cuantificación.

1.2 Específicos:
 Preparar gel de agarosa para realizar la técnica de electroforesis.
 Conocer la técnica de electroforesis y describir la composición e integridad de
la muestra observada.
 Cuantificar los ácidos nucleicos mediante Nanodrop y reportar la concentración
de las muestras obtenidas.

2. Introducción

ADN
El ADN o acido desoxirribonucleico es una secuencia polinucleotídica compuesta por
cuatro bases nitrogenadas las cuales son la adenina (A), guanina (G), citosina (C), y
timina (T). Este tiene una estructura helicoidal en cadena unidos por puentes de
hidrogeno, la cual es antiparalela (orientación opuesta, 5´>3´). Además de las bases
nitrogenadas contiene unidades de fosfato y azúcar desoxirribosa entre sí.
Las bases nitrogenadas se encuentran al interior de la doble hélice, y en la parte
exterior el grupo fosfato y el azúcar, lo que le da propiedades hidrofóbicas (interior) e
hidrofóbicas (interior) al ADN.
Las bases de una cadena se unen a las bases de su contraparte mediante puentes de
hidrogeno, uniéndose una adenina (A) a una timina (T) con dos puentes de hidrogeno y
la citosina con la guanina con tres puentes de hidrogeno. (15)

Figura 1 Estructura de ADN (Bruño, recuperado 2019)

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Extracción de ADN
Es una técnica de biología molecular la cual permite tener acceso al material genético
dela celula, esta se puede resumir en 5 pasos principales los cuales son:
1. Ruptura celular: Es necesario llevar acabo la lisis de la célula para ello se utilizan
detergentes como el lauril sulfato, enzimas es actúan desestabilizando la pared
bacteriana cuando rompe las uniones glucosídicas
2. Eliminación de proteínas: Se utilizan enzimas proteolíticas, la cual degrada un
amplio espectro de proteínas naturales. La cual es conocida como digestión
enzimática
3. Eliminación de ARN: Se utiliza otra proteína (RNasa o proteinasa K) para
eliminar en su totalidad la presencia de ARN.
4. Extracción de proteínas: Este paso se lleva acabo con solventes orgánicos como
el fenol y el cloroformo.
5. Precipitación de ADN: Al realizarse en un medio acuoso, las sales presentes
actúan como quelantes que al estar en contacto con isopropanol o etanol
precipita el ADN. (14)
Espectrofotometría
Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de una
muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto
presente en una solución a una longitud de onda determinada. De este modo la
concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor de
absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260 nm. Mientras que la relación de
absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza de las muestras.
La relación A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima
tiene un valor entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una
relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por
compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280 > 2.1 podría
deberse a la presencia de ARN en la muestra.
A 230 nm absorben contaminantes como sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos. En
general, se considera que el ADN es puro cuando el radio A260/230 se sitúa en torno
1.5-2.2. Un radio menor de 1.5 indicaría presencia de contaminantes en la muestra. No
obstante, esta relación resulta mucho más variable que la relación A260/280
dependiendo de factores como la concentración de ADN o de la composición del
tampón de resuspensión de la muestra. (2)
Valores indicativos de pureza en muestras de ADN

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Electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u
otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis
consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de
interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en
diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a
esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño.
La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están
presentes en una muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros. También es
posible determinar el tamaño absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a
una escala estándar de fragmentos de tamaño conocido. (3)

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 3. Metodología

Extracción de ADN

Tomar 40 mL de medio Decantar el Transferir a tubos falcon y

de cultivo inoculado con sobrenandante, cuidando añadir 30 uL de SDS al
Bacillus Thuringensis y la pastilla celular, 10%, y 3 uL de proteinasa
centrifugar resuspendarla en 2.368 K . Incubar por 1 h a 37 °C
6000rpm/10min/4°c mL de Buffer TE estéril (agitar cada 10 min)

Añadir 80 uL de sol.
Añadir 800 uL de sol.
Añadir 100 mL de NaCl 5 CATB/NaCl, agitar en
fenol/cloroformo/alcohol
M y agitar en vortex vortex e incubar 10 min a
isoamilico (25:24:1)
65°C

extraer el
retirar fase acuosa y
Mezclar en vortex por sobrenandante y colocar
colocar en nuevo tubo,
1min, centrifugar 5 min a en nuevo tubo, añadir 60
10000 rpm a 4 °C
repetir los dos ultimos
uL de isopropanol.
pasos una vez más.
Almacenar a 4°C

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Electroforesis

Disuélvelo un poco con agitación y

Pesar 0.3 g de agarosa y añade 30 calentar en el microondas hasta
ml de buffer TAE 1X en un matraz que se disuelva completamente,
Erlenmeyer de 250 ml. cuidando de no calentar
demasiado el buffer. aprox 60°c

Deja enfriar y adicionar 3 uL de

bromuro de etilo, colocar en el Colocar el gel en la cámara de
molde, que contendrá los peines, electroforesis y cubrir con buffer
hasta una altura de 3-5 mm. Dejar TAE 1X. (300-400 mL aprox.)
que polimerice

Sobre cada gota de buffer colocar

5 uL de cada una de las muestras ,
Colocar un 2 uL de buffer de carga
mezclar suavemente y tomar la
por cada muestra en un pedazo de
totalidad de la muestra para
parafilm.
cargar cada uno de los pozos del
gel.

Visualizar y fotografiar el gel con

Cargar el promer poso del gel con
luz UV en el transiluminador,
el marcador. Correr el gel a 100-
recuerda mantener siempre
110 volts por 25 min
cerrada la tapa.

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Cuantificación de ADN

Calibrar el equipo con

Encender el Nanodrop
agua destilada (blanco)

coloque 1 μL de las
Medir las muestras a
muestras con plásmido
las longitudes de onda
cortadas y sin cortar en
de 260-280 nm.
el nanodrop

4. Resultados
Como modificaciones al protocolo se trabajo con 40 mL de caldo nutritivo y medio
Gowda, como microorganismo se trató el Bacillus thuringensis. La primera
centrifugación fue a 6000rpm por 0 minutos a 4°C.
En nuestro caso, obtuvimos 4 pastillas de muestra ya que las cantidades de buffer TE
se cuadriplicaron para tener mejor rango de comparación entre las muestras obtenidas
las cuales se resguardaron a -20°C por 8 días hasta la siguiente sesión.
Concentración de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría
Las lecturas para la determinación de la concentración de ácidos nucleicos se
realizaron por duplicado para obtener un promedio para cada muestra, los resultados
obtenidos se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1. Concentración de ácidos nucleicos por espectrofotometría
Muestra DNA Abs 260 Abs 280 260/280 230/260
DNA (ng/µL) nm
genómico
bacterian
o
1 4074.35 81.487 39.749 2.05 1.95
2 1001.9 20.038 10.176 1.97 1.27
3 1190.75 23.815 12.073 1.98 1.22

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 4 2366.35 47.326 23.057 2.05 1.78

Electroforesis en gel

Figuras 2 y 3. Resultados de electroforesis con exposición inversa (negativo)

Figuras 4 y 5. Resultados de electroforesis con diferente exposición e inversa.

5. Discusiones
Para la lectura del gel de electroforesis, como se puede observar no se pudo llevar a
cabo una correcta visualización del ADN debido a que se trabajó con un inóculo viejo y
no se pudo recuperar el ADN puesto que ya estaba en fase de muerte, se puede
observar solo la presencia del ARN metabolizándose a proteína. (4)
En cuanto a la determinación de la concentración de ácidos nucleicos para nuestras
cuatro muestras tenemos que nuestro ADN tiene pureza óptima ya que los rangos de la

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relación 260/280 van de 1.98 a 2.05 y de acuerdo con la literatura, para una pureza
óptima se tiene un rango de 1.8 a 2 para esta relación.
No obstante para la relación 230/260 dos de nuestras muestras, 2 y 3, presentan nivel
no tan puro de ADN ya que los valores obtenidos son de 1.27 y 1.22 respectivamente,
de acuerdo con la literatura consultada (2), si hay un valor menor a 1.5 en esta relación
de absorbancia, el ADN presenta una contaminación con sales, carbohidratos o
fenoles, esto puede ser debido a que durante el proceso de extracción no se llevó a
cabo un lavado adecuado de nuestras pastillas quedando así residuos de fase acuosa
en nuestras muestras.

6. Conclusión

Se logró realizar el tratamiento de extracción de ADN genómico a partir de la muestra

bacteriana que se nos proporcionó, Bacillus thuringensis, para su posterior
cuantificación y visualización por medio de espectrofotometría y electroforesis
respectivamente, sin embargo, se pudo observar que no hubo presencia de ADN en el
gel de agarosa, esto debido a lo ya mencionado con anterioridad al tratarse de un
inóculo viejo. Respecto a la espectrofotometría se obtuvieron resultados favorables al
tener niveles de pureza óptimos en dos de nuestras muestras (1 y 4).

7. Cuestionario

1. Mencione la función de cada uno de los compuestos que se utilizan

durante la práctica:
 Buffer TE: Solución amortiguadora empleada en las técnicas de
extracción de ADN o ARN cuyo fin es la protección de estos, se usa pH
de 7.5 para ARN y pH 8 para ADN (5)

 SDS: (Dodeceil Sulfato de sodio) es un detergente que actúa como

agente solubilizante de proteínas y membranas. (7)

 Proteinasa K: Proteína que usada en la digestión de proteínas de ácidos

nucleicos.(8)

 NaCl: Aumenta el poder iónico de la solución buffer y ocasiona la

precipitación del ADN. (7)
 CTAB/NaCl: Forman complejos que permiten la precipitación del ADN.(7)

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  Solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico: Esta mezcla orgánica
elimina lípidos de membranas, inhibidores y contaminantes. (8)
 Isopropanol: Ayuda a la concretar y desalinizar la extracción de ácidos
nucleicos en soluciones acuosas.

 Agarosa: En gel permite la separación de moléculas de ADN y ARN por

su tamaño.
 Buffer TAE 1X: Como su nombre lo indica es una solución tamponadora
 Bromuro de etidio: Permite observar de mejor manera la detención de la
migración de las moléculas, ya que proporciona mayores niveles de
florescencia. (/)
 Marcador: Funciona como estándar de tamaño de la molécula de ADN.
(7)
2. Identifique 5 protocolos de biología molecular dependen de la extracción
de ADN, cite al menos un estudio que utilice cada protocolo:

PCR: Reacción en cadena de polimerasa, permite la replicación de secuencias

de ADN, un ejemplo de su uso es en la “Estandarización y validación clínica de
las pruebas de PCR para diagnóstico de toxoplasmosis cerebral en pacientes
infectados por el VIH”(10)

Electroforesis: Permite conocer el tamaño de las secuencias de ADN, un

ejemplo de su uso Electroforesis capilar como una nueva estrategia en la
medicina de diagnóstico clínico.(13)

Clonación de ADN recombinante: Permite expresar un gen de interés dentro de

otro organismo, ejemplo de aplicación es para el “sistema de expresión para
proteínas terapéuticas recombinantes.”(11)

Identificación de Bacterias: Permite identificar bacterias por medio de ARNs o la

expresión o anulación de genes, ejemplo de aplicación es en la “Detención e
identificación de bacterias causantes de enfermedades por alimentos mediante
PCR.”(12)

Cuantificación de ADN/ARN: Permite obtener un valor de la cantidad de material

genético y determinar la pureza de la extracción. Ejemplo de aplicación
“Microarreglos de ADN”

3. ¿De qué manera cuantificarías el DNA en caso de no contar con

espectrofotómetro?

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 Existen dos métodos principales para cuantificación de ADN, uno de ellos es por
medio de espectrofotometría y el otro es por visualización, siendo este último el
método indirecto más recomendable para la determinación de la concentración
de ADN en una muestra mediante la visualización de un gel de electroforesis en
el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas.

4. Menciona otra tinción que podrías utilizar para la visualización de AND en

geles de agarosa

Existen tinciones alternativas comerciales como el SYBR Gold, que es un

colorante muy sensible y con gran afinidad por el ADN, se utiliza en dilución
1/10000 en agua, para el teñido del gel tras la electroforesis. (13)

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8. Bibliografía

1. Prácticas de Biología molecular. Cuantificación y control de calidad del DNA.

Recuperado de https://portal.uah.es/portal/.pdf el 26-agosto-2019
2. Genómica. (2008). Preparación de Geles de Agarosa para Electroforesis. febrero
20, 2018, de UASLP Sitio web:
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Mol_GelAgarosa.pdf
3. Fierro, F. (2010). Electroforesis de ADN. febrero 20, 2018, de inecc Sitio web:
https://micrositios.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf
4. Fuentes, X. (1997). “Bioquímica clínica y patología molecular l”. Reverté.
Barcelona, España.
5. Laboratorio de Genómica Viral y Humana, Facultad de Medicina UASLP(2008)
Preparación de Buffer Tris 10mM-EDTA. Recuperado 19/08/2019 de:
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Mol_Buffer_TE.pdf
6. Salvarrieta, J. (2002) Teoría y Práctica para la extracción y purificación del ADN
de palmera de aceite. Laboratorio de Marcadores Moleculares, Área de
Fisiología y Mejoramiento. Bogota, Colombia. Recuperado 2019:
http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdf
7. Velazco, R. (2005) Marcadores moleculares y la extracción de ADN.
ASUBAGROIN FCA Unicauca. Recuperado 2019 de:
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8. SIGMA ALRICH (S.f) Proteinasa K. Recueprado 2019 de:
https://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-
explorer/analytical-enzymes/proteinase-k.html
9. Gutiérrez, C. (s.f) La Reacción en cadena de la polimerasa, Lab de Virología
Molecular, Recuperado 2019 de: http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2010/C
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10. Zapata, N. P., & Marin, J. G. (2011). Estandarización y validación clínica de la
prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para diagnóstico de
toxoplasmosis cerebral en pacientes infectados por el VIH. Infectio, 7(1).
11. Serrano, M. E. D., & Espuñes, T. D. R. S. (2006). Sistemas de expresión para
proteínas terapéuticas recombinantes. Revista Mexicana de Ciencias
Farmacéuticas, 37(1), 38-44.
12. Herrera, R. A. R., & Flores, T. G. (2006). Detección e identificación de bacterias
causantes de enfermedades transmitidas por alimentos mediante la reacción en
cadena de la polimerasa. Bioquimia, 31(2), 69-76.
13. Fierro, F.(s.f) Electroforesis de ADN. Recuperado 2019 de:
https://micrositios.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf
14. Zavala J. (2005) Manual de Técnicas Basicas de Biología Molecular. Ediciones
de la Universidad Autónoma de Yucatán, México.

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15. Nelson, D. & Cox, M (2001) Principios de bioquímica, (3ra edición). Barcelona,
España, Editorial Omega

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