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    Extracción Filamentosos-1

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    El documento describe protocolos para la extracción de ADN de hongos filamentosos. Incluye pasos para la extracción de ADN mitocondrial y nuclear, como la lisis de la pared celular, rotura de membranas, purificación y precipitación del ADN. También presenta una minipreparación rápida de ADN para PCR que involucra cultivar hongos, disgregar el micelio, lisis celular, precipitación y resuspender el ADN. El mayor reto es romper las estructuras de la pared celular fúngica sin da

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    El documento describe protocolos para la extracción de ADN de hongos filamentosos. Incluye pasos para la extracción de ADN mitocondrial y nuclear, como la lisis de la pared celular, rotura de membranas, purificación y precipitación del ADN. También presenta una minipreparación rápida de ADN para PCR que involucra cultivar hongos, disgregar el micelio, lisis celular, precipitación y resuspender el ADN. El mayor reto es romper las estructuras de la pared celular fúngica sin da

    Descripción original:

    Hongos Adn

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    El documento describe protocolos para la extracción de ADN de hongos filamentosos. Incluye pasos para la extracción de ADN mitocondrial y nuclear, como la lisis de la pared celular, rotura de membranas, purificación y precipitación del ADN. También presenta una minipreparación rápida de ADN para PCR que involucra cultivar hongos, disgregar el micelio, lisis celular, precipitación y resuspender el ADN. El mayor reto es romper las estructuras de la pared celular fúngica sin da

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    EXTRACCIN DE ADN DE HONGOS

    FILAMENTOSOS

    Los hongos poseen un genoma complejo


    consistente en:

    ADN nuclear (n ADN)


    ADN mitocondrial (mt ADN)
    en algunos casos ADN plasmdico

    EXTRACCIN DE ADN DE HONGOS


    FILAMENTOSOS

    Extraccin de ADN mitocondrial


    Pasos ms importantes: No necesita tratamiento con fenol, ni la
    utilizacin de bis-bencimida.
    1.- Lisis de la pared: Zymoliasa, 37C.
    2.- Rotura de la membrana celular: Buffer de lisis, 4C.
    Centrifugar a 15.000g.
    3.- Purificacin de mitocondrias: Ultracentrifugacin en
    gradiente de sacarosa. Extraccin de las mitocondrias.
    Centrifugar 40.000 g.
    4.- Rotura de la membrana mitocondrial: SDS, Proteinasa
    K, 37C, 3horas. Centrifugar a 17.000 g, 4C.
    5.- Extraccin y precipitacin del ADN mitocondrial.
    Isopropanol, etanol.

    PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN


    DE HONGOS FILAMENTOSOS
    Etapa microbiolgica
    1. - Se inocula 100 ml de Medio de cultivo lquido con conidios y se
    incuba en agitacin orbital (150 rpm) a 28C durante el tiempo
    necesario.

    2. - El micelio se recoge sobre un filtro de nylon (200 mm de dimetro


    de poro) y se seca con la ayuda de papel absorbente hasta eliminar la
    humedad. Una vez seco, se aplana formando una capa lo ms fina
    posible y se liofiliza para desecarlo completamente.

    PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN


    DE HONGOS FILAMENTOSOS
    Etapa biologa molecular
    Lisis de la pared celular y la membrana plasmtica

    3. - Se pesan 0,06 g del micelio liofilizado dentro de un tubo eppendorf


    y se tritura con la ayuda de un clip de metal. Es muy importante que
    se consiga una trituracin adecuada, pues el rendimiento de la
    extraccin depende del grado de fragmentacin del micelio.

    4. - Se aaden 600 l de Solucin de Lisis y se incuba en un bao a


    65C durante una hora.

    PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN


    DE HONGOS FILAMENTOSOS
    Digestin y/o precipitacin de protenas (purificacin)
    5. - Se aade igual volumen de fenol/cloroformo/isoamlico (500
    l ) y se agita hasta que se mezclan todas las fases. Una vez mezcladas
    las fases, se centrifuga durante 15 min. a 12000 rpm.
    6. - Se recoge la fase acuosa (arriba) en un eppendorf limpio, y se le
    aade Acetato potsico 5M y ClNa 4M hasta conseguir una
    concentracin final de 1.8 M y 1 M respectivamente. Luego se deja en
    hielo durante 30 min.
    7. - Se centrifuga 10 min. a 12000 rpm para precipitar restos de
    protenas. Y se recoge el sobrenadante en un tubo eppendorf limpio.

    PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN


    DE HONGOS FILAMENTOSOS
    Extraccin y Precipitacin del ADN con
    solventes orgnicos (concentracin)
    8. - El DNA se precipita con 0.54 volmenes de isopropanol. Si el
    rendimiento en ADN es alto, ste precipita en forma de ovillo y se
    puede extraer con una punta estril.
    9. - El DNA recogido se pasa a un nuevo tubo eppendorf al que se
    aade 500 l de etanol al 70%.
    10. - Centrifugar 5 min. a 12000 rpm. Descartar el sobrenadante.
    11. - Secar al vaco.
    12. - Resuspender el pellet en 200 l de Solucin TE. Guardar en la
    heladera al menos 2 horas para que se resuspenda el DNA. Luego
    conservarlo a 20C.

    PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN


    DE HONGOS FILAMENTOSOS

    El mayor problema que presenta la obtencin de ADN


    total de especies fngicas es la rotura y, sobre todo, la
    eliminacin de las estructuras que forman parte de la
    pared celular de los hongos. Es importante disponer de un
    micelio joven donde estas estructuras estn en menor
    proporcin. Adems una vez obtenido el DNA es
    importante eliminar el RNA si lo que queremos es hacer
    RFLPs de mtDNA.

    PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN


    DE HONGOS FILAMENTOSOS
    9.- Se preparan tubos eppendorf nuevos con 400 l de agua

    estril. Se recoge el ovillo y se resuspende en el agua.


    10.- Se aaden 3 l de RNAsa (500 mg/ml) y se ponen en un
    bao de agua a 37C durante 30 min. para eliminar el RNA de la
    extraccin.
    11.- Se aaden 2 volmenes de etanol absoluto (100%) y se
    centrifuga 10 min. a 12000 rpm.
    12. - Secar al vaco.
    13. - Resuspender el pellet en 200 l de Solucin TE. Guardar
    en la heladera al menos 2 horas para que se resuspenda el
    DNA. Luego conservarlo a 20C.

    Minipreparacin rpida de ADN para PCR.


    (Tcnica de Liu y col. 2000)

    Cultivar los hongos en medio de cultivo por 7 das a 28oC.


    Una pequea porcin del micelio se rasp del cultivo, se coloc en un
    tubo eppendorf de 1,5 ml conteniendo 500 l de solucin amortiguadora
    de extraccin, tratando de disgregar el micelio con la punta de un clip
    flameado.
    Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    Agregar 150 l de KAc 3 M (pH= 4,8). Centrifugar por 2 minutos a
    10000 rpm.
    Agregar al sobrenadante un volumen igual de isopropanol. Centrifugar
    2 minutos a 10000 rpm.
    Lavar el precipitado con etanol al 70%. Centrifugar 1 minuto a 10000
    rpm. Eliminar el sobrenadante, secar el pellet por 10 minutos a 37oC.
    Resuspender el ADN en 50 l de agua desionizada ultrapura estril.
    Guardar a 20oC.

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