Extracción de ADN

Karen Pelufo- Yiseth Ramírez- Blanca Royeth- Cinthia Salcedo

Facultad de educación y ciencias-Programa de Biología-Doc Daniel Verbel

Karenpelufo_94@hotmail.com yiseramirez.yprm@gmail.com bandbamor@hotmail.com

isabela23.tokio@gmail.com

Resumen Key words: Biology, double helix-chains,

DNA, nucleotide, sugar, phosphate base,
En la década de los cincuenta, el campo de genome, extraction.
la biología fue convulsionado por el
desarrollo del modelo de la estructura Introducción
del ADN. James Watson y Francis Crick en
1953 demostraron que consiste en una doble El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente
hélice formada por dos cadenas. abreviado como ADN, es un ácido nucleico
que contiene instrucciones genéticas usadas
El ADN es un ácido nucléico formado en el desarrollo y funcionamiento de todos
por nucleótidos. Cada nucleótido consta de los organismos vivos conocidos y algunos
tres elementos: un azúcar: desoxirribosa en virus, y es responsable de su transmisión
este caso (en el caso de ARN o ácido hereditaria. El papel principal de la molécula
ribonucleico, el azúcar que lo forma es una de ADN es el almacenamiento a largo plazo
ribosa), un grupo fosfato y una base de información. (Madden, 2006)
nitrogenada.
Las unidades de éste polímero se le llaman
Actualmente es muy importante el nucleótidos que están formados a su vez de
conocimiento del ADN pues permite explicar un azúcar Desoxirribosa, un grupo fosfato y
el genoma humano. una base nitrogenada (A, G, C y T).

Palabras claves: Biología-doble hélice- Para la extracción de ADN se requirió hacer

cadenas-ADN-nucleótido-azúcar-base varias series de etapas básicas, las cuales
fosfato-genoma. son fundamentales son las siguientes:

Abstract Homogeneización de la muestra, separación

y purificación y precipitación donde en
In the 1950s, the field of biology was primer lugar se debe romper la pared celular
convulsed by the development of the DNA y la membrana plasmática
structure model. James Watson and Francis para poder acceder al núcleo de la célula.
Crick in 1953 showed that it consists of a Después debe romperse igual la membrana
double helix formed by two chains nuclear para dejar libre el ADN. Por último
DNA is a nucleic acid formed by nucleotides. hay que proteger el ADN de enzimas que
Each nucleotide consists of three elements: a puedan disminuirlo y para aislarlo hay que
sugar: deoxyribose in this case (in the case of hacer que se precipite en alcohol. (Roger,
RNA or ribonucleic acid, the sugar that forms 2006)
it is a ribose), a phosphate group and a De esta manera tener como objetivo el
nitrogenous base. desarrollo de habilidades y destrezas en
At the moment is very important the procedimientos de biología molecular y
knowledge of the DNA because it allows to posteriormente extraer ADN de bacterias.
explain the human genome and by means of Materiales y métodos
the extraction to know this chain of double
helix. -Bacteria
-microcentrifuga de mesa 7. Se centrifugo a 12.000 r.p.m
durante 15 min.
-viales 8. Se transfirió el sobrenadante a
-Vortex un nuevo tubo y se le agrego ½
del volumen en isopropanol frio y
- baño de maria a 65°C se dejó precipitando durante toda
la noche
-Buffer de extracción (NaCl 0.5 M, Tris-HCl
9. Se centrifugo a 12.000 r.p.m
0.2M, EDTA 10mM, SDS 1%, H2O)
durante 15 min.
-Proteinasa K 3µL 10. Se eliminó el sobrenadante y
posteriormente se lavó el pellet
-Acetato de amonio 7.5 M con 150 µL de etanol frio a 70%
dejando evaporar el etanol a
-Buffer TE 10: 1
temperatura ambiente.
-Cloroformo 11. Por último se agregó 150-250 µL
de TE dependiendo el tamaño
-Alcohol isoamilico del pellet.
-Nitrogeno liquido Resultados
-Isopropanol  Buffers de extracción (NaCl 0.5 M,
-Micropipetas Tris 0,2 - EDTA 10mM, SDS 1%,
proteinasa K 3 µL
-Puntas estériles

 El proceso para extraer el ADN

bacteriano consistió en disolver la
pared celular con una “mezcla
digestiva” bufferada (buffer de
extracción) está contenía las enzimas
necesarias para la realización de la
digestión
1. Se adicionó 600 µL de buffer de
extracción, NaCl 0.5 M, Tris-
0.2M, EDTA 10mM, SDS 1%,
proteinasa K
2. Se agitó en el vortex para
 Se agregaron las bacterias
homogenizar la solución.
3. Se incubó a 65°C por una hora
con agitaciones por inversión de
5 min. Cada 15 min de
incubación.
4. Se agregó 150 µL de acetato de
amonio 7.5 M, se agitó por 15 a
20 min a temperatura ambiente.
5. Se centrifugó a 12.000 r.p.m por
15 min
6. Se transfirió el sobrenadante a
un tubo eppendorf nuevo y se le
agrego 250 µL de cloroformo
alcohol isoamilico (24: 1) y se
mezcló por inversión durante 10
a 15 min.
 Se agitó en el vortex

 Se transfirió el sobrenadante, se le
agrego 250 µL de cloroformo y se
agitó por inversión durante 15 min.

 Se incubo a una temperatura entre

60 °C y 65 ° C por 30 min

 Se centrifugo nuevamente a 12.000

r.p.m durante 15 min.

 Extracción final del ADN

 Se centrifugo a 12.000 r.p.m durante

15 min.
 reactivos utilizados para esta práctica.
Finalmente conocer los pasos fundamentales
que se necesitan para la extracción de un
ácido nucleico.

Cuestionario

-¿Existen diferencias significativas en los

procesos de extracción de ADN de células
procariotas, vegetales y animales?
Justifique su respuesta

Las células vegetales son distinguibles de las

células animales por su pared celular rígida y
orgánulos como el cloroplasto. También
contienen proteínas y enzimas que juegan un
papel en la fotosíntesis. Algunas células de
las plantas son poliploides, lo que significa
que tienen más de una copia de cada
cromosoma por célula. Los procesos
Discusión celulares que ocurren en las plantas tales
como la fotosíntesis producen una gama de
La proteína k se le agrego con el fin de metabolitos secundarios. Las células
facilitar la lisis y además sirve para degradar animales no tienen una pared celular, pero
algunas proteínas, de esta forma limpiar la todavía necesitan ser tratadas con productos
solución y obtener una muestra mucho más químicos como el dodecilsulfato sódico
pura. (SDS) para romper la membrana celular para
En el momento en que se extrajo el ADN la liberar el ADN genómico.
cantidad que se obtuvo fue mínima, debido a Por otra parte, el ADN genómico de las
diversos factores; en primer instancia se plantas es más difícil de extraer a causa de la
encuentra la forma en que se manipularon pared celular de la planta, que se elimina por
los diversos reactivos o la cantidad de homogeneización o mediante la adición de
material que se utilizó para dicha extracción. celulosa para degradar la celulosa que forma
También pudo influir el hecho de que en el la pared celular. Los leucocitos de sangre
momento en que se colocaron los tubos de periféricos son una fuente principal de ADN
eppendorf en la incubadora esta no se genómico en animales, pero la recogida de
encontraba en el estado en que se requería muestras es difícil ya que la sangre debe ser
por lo tanto el proceso se detuvo unos retirada del animal. La sangre contiene una
minutos. serie de compuestos como proteínas, lípidos,
glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas y
Para la degradación de la fracción proteica plasma, que pueden contaminar la muestra
asociada al ADN se consigue mediante la de ADN.
acción de una proteasa, ésta
-¿Se podrán realizar análisis de un
fracción proteica puede
organismo sin tener que realizar procesos
precipitarse mejor con la ayuda de las sales
de extracción de ADN? Justifique
como el acetato de amonio
Teniendo en cuenta que cada parte del ser
Conclusión
humano posee ADN pensamos que para un
A partir de la realización de esta práctica se análisis siempre va a ser necesaria la
logró concluir que: A través de un método extracción de ADN, de esta manera poder
sencillo se puede extraer ADN de bacterias.
Conocer las características de los distintos
 comprobar o conocer aquello que resulte purificación de DNA se metodologías más
necesario saber. destacan los que sencillas es la que
emplean gradientes de utilizaremos en este
-Qué características posee la bacteria que
cloruro de cesio y los que trabajo práctico y
hace difícil su identificación por métodos
incluyen extracciones con consiste en la utilización
tradicionales y que procedimientos
moleculares se utilizan en la actualidad
solventes orgánicos en de un detergente suave
para su identificación; describe presencia del detergente como es el SDS para el
brevemente. catiónico CTAB (bromuro lisado de las células que
de se combina con el
Actualmente, la identificación bacteriana se hexadeciltrimetilamonio). calentamiento de la
realiza por medio de métodos muestra de manera de
convencionales, basados en las favorecer la
características fenotípicas, puesto que su solubilización del
realización y coste los hace más asequibles. material.
Los métodos genotípicos suelen reservarse
para las bacterias que no se pueden
identificar con métodos convencionales.

Los esquemas tradicionales de identificación

fenotípica bacteriana se basan en las
características observables de las bacterias, -¿Cómo distinguiría si posee una muestra
como su morfología, desarrollo, y de DNA contaminada con Fenol? ¿Y si
estuviera contaminada con proteínas?
propiedades bioquímicas y metabólicas. El ¿Qué haría en cada caso?
cultivo, cuando es factible, continúa siendo el
método diagnóstico de elección; permite el La muestra está contaminada por proteínas o
aislamiento del microorganismo implicado, fenoles. En el caso de contaminación por
su identificación, el estudio de sensibilidad a proteínas será necesario llevar a cabo un
los antimicrobianos y facilita la aplicación de tratamiento adicional para eliminar las
marcadores epidemiológicos. En el cultivo es proteínas presentes en la solución de ADN
esencial la correcta elección del medio de (por ejemplo, adición de proteinasa K). Si la
crecimiento y las condiciones de incubación. contaminación se debe a la presencia de
En el proceso de identificación bacteriana fenoles es necesario limpiar la muestra con
tradicional, la experiencia del microbiólogo cloroformo, alcohol isoamílico y etanol.
es fundamental para la elección de una
*Los contaminantes del ADN como los
prueba o una bacteria de pruebas de forma
fenoles pueden ser determinados mediante
secuencial, en función de la fiabilidad de las
la evaluación del material extraído a
mismas, del género o de la especie
absorbancias de 230nm.
bacteriana que se pretende identificar, del
origen del aislado bacteriano, así como del *Este método de cuantificación debe
coste de las mismas. realizarse en espectrofotómetros que tangas
filtros para luz ultravioleta
-¿Cuáles son las diferencias significativas
entre la extracción de ADN y la de ARN? *Una relación menor de 1,8 indica la
Diferencias entre la extracción presencia de proteínas u otros
DNA RNA contaminantes.
Entre los métodos de Una de las
*Una relación de 2 indica que la muestra
puede estar contaminada con cloroformo o
fenol.
Bibliografía

-MADDEN D. Discovering DNA. Science in

School 1: Spring 2006.
http://www.scienceinschool.org.

-ROGERS, S.O.; BENDICH, A.J. 2006.

Extraction of DNA from plant tissues. Plant
Molecular Biology Manual. A6: 1- 10. Kluwer
Academic Publishers, Belgium.

-“Journal of chimical Education”; hígado y

cebollas: extracción de ADN de tejido de
plantas y animales; Karen. Nordell; 1999

-USC: Extracción de ADN de células de

plantas y animales.