Análisis de Proteínas

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
Instituto de Ciencia Biomédicas
Investigación de análisis de proteínas

Bioquímica General
Dr. Edgar Manuel Diaz Acosta
Rolando Javier Lira Rivero

220103
1-Purificación de proteínas
Se encontró un artículo sobre la purificación de la proteína 8 de NIL-HSV
Se dividió en 2 partes, la preparación de las columnas de DNA-celulosa y la preparación de
extractos celulares
1 .Preparación de las columnas de DNA-celulosa
Para la preparación de la DNA-celulosa en gran concentración utilizaron una modificación de los
métodos de Alberts y de Litman .
a) DNA. Utilizaron DNA de timo de ternera, el cual se disolvió a una concentración de 2 mg/ ml en
un tampón que contenía Tris-CIH 10 mM, pH 7,4 y EDTA 1 mM. La disolución la realizaron
agitando lentamente a 4QC. El DNA nativo se desnaturalizó por medio del calentamiento de la
solución en un baño de agua a lOOQC durante 15 minutos, enfriándolo inmediatamente en un baño
de hielo para evitar la re naturalización de este. Cuando el volumen de la solución de DNA fue
superior a 50 ml, el calentamiento se realizó en alícuotas de 50 ml para que el enfriamiento
posterior no fuese demasiado lento.
b) Çelulosa. Emplearon celulosa Munktell's 410 para las columnas de DNA celulosa y celulosa
Whatman para las columnas de DNA (nativo) -celulosa. La celulosa se lavó sucesivamente por
agitación en etanol absoluto por 30 minutos, agua destilada por 30 minutos, NaOH IN por 15
minutos, agua destilada por 15 minutos, CIH IN por 15 minutos, y de nuevo agua destilada hasta
conseguir que el pH de los lavados fuese neutro. Los lavados los realizaron en probeta de 2 7
(100 g celulosa) con agitación mediante un agitador magnético, y dejaron sedimentar a continuación
la celulosa, eliminándose por succión al sobrenadante con los fines. Después de retirar el
sobrenadante de pH neutro, la celulosa se filtró bajo succión a través de papel de fibra de vidrio
Whatman GF/A en un embudo Buchner. La pasta resultante se dejó secar al aire
a temperatura ambiente.
c) Adsorción del DNA a la celulosa.
La celulosa lavada y seca se añadió poco a poco y con agitación lenta sobre la solución de DNA
(nativo o desnaturalizado) en una proporción de 1 g de celulosa por cada 6 ml de solución. La pasta
resultante la extendieron sobre una plancha de plástico, para después taparla con una gasa y secarla
con una corriente de aire frío durante toda la noche. La costra seca se despegó de
la plancha y se pulverizó en un mortero. El polvo resultante lo repartieron en alícuotas de 25 g y se
re- suspendieron en etanol absoluto, irradiándose durante una hora y media con una lámpara
germicida de luz ultravioleta, colocada a una distancia de unos 10 cm de la suspensión, para agitarse
suavemente esta durante el periodo de irradiación. Posteriormente, eliminaron el etanol por
filtración bajo succión a través de papel Whatman GF/A y la DNA-celulosa se lavó tres veces por
agitación en tapón Tris- EDTA, esto para eliminar el DNA que no se unió a la celulosa.
a 26. El sedimento lo re suspendieron de nuevo en el tampón Tris-EDTA y lo filtraron bajo succión
por papel Whatman GF/A. Finalmente, la pasta resultante fue extendida y la dejaron en un
desecador a vació.
Como siguiente paso fue la estimación del DNA absorbido a la celulosa, este fue llevado a cabo de
la siguiente manera : pesado una alícuota del polvo seco de DNA-celulosa y tras suspenderla en el
tampón Tris-EDTA, lo hirvieron durante 10 minutos con el fin de desprender el DNA fijado a la
celulosa, y a continuación, lo enfriaron rápidamente en baño de hielo. Después de eliminar la
celulosa por centrifugación, el DNA se valoró espectrofotométricamente midiendo la densidad
óptica del sobrenadante a una longitud de onda de 260 nm.
d) Preparación de las columnas de DNA-celulosa
El polvo de DNA-celulosa se re suspendió en TL f SAB y se empaquetó en columnas de vidrio,
equilibrándose on el mismo tampón. Las columnas utiliza das contenían 25, 50 6 80 g de
DNA(nativo)-celulosa 25 o 40 g de DNA (des naturalizado), conservándose a 4qC en cámara fría.
2.- Preparación de extractos celulares
Para este proceso, las células procedentes de 30-40 botellas crecidas hasta confluencia las re
suspendieron en 80 ml de tampón de sonicación, dispersándose con un homogeneizador Potter-
Elvehjem. A continuación las células se desintegraron ultrasónica mente en tres alícuotas de unos
30 ml, con un desintegrador ultrasónico MSE, mediante seis pulsos de 10 segundos a una amplitud
de oscilación de siete micras, manteniendo la suspensión en baño de hielo. El homogenado lo
centrifugaron durante 30 minutos a 12.000 rpm y 4qc en un rotor SS-34 de Sorvall para eliminar los
restos celulares. El sobrenadante lo trataron con 30 yq/ml de DNasa I libre de RNasa durante 30
minutos a temperatura ambiente y dializaron contra 75 volúmenes de tampón de diálisis durante
toda la noche y a 4qc, con un cambio de tampón a las 3 horas.
2-Cromatografía
Se encontró un artículo sobre la separación de proteínas por cromatografía en columnas. El objetivo
de dicha práctica fue el analizar el proceso de cromatografía en columna de dos mezclas de tres
proteínas cada una y se observaron sus comportamientos respecto a las diferentes resinas utilizadas
como fases estacionarias y cómo afectan el cambio de pH en los tampones utilizados.
Junto con la columna a usar para la cromatografía, seleccionaron entre tres proteínas a utilizar, en
este caso la ribonucleasa A, glutamato deshidrogenasa y glutation reductasa. En el segundo
experimento usaron aprotinina, ferritina y anhidrasa carbonica. Después seleccionaron su fase
estacionaria(resina) basándose en el tamaño de la proteína, en este usaron para ambos experimentos
Sephacryl S-200. Luego escogieron la fase móvil(tampón) de elusión, ellos se guiaron por el punto
isoeléctrico de las proteínas, en este caso usaron Tris-HCL para ambos experimentos. Por último
sólo corrieron el programa para la cromatografía y observaron cómo las proteínas se separaron unas
de otras.
Como resultado observaron que en el primer experimento se obtuvo primero la saluda de la proteína
glutamato deshidrogenasa, seguido por la glutatión reductasa y por último la ribonucleasa A.
Observaron que fue dado así ya que todas las proteínas estaban a un pH distinto a su punto
isoeléctrico, por lo que no hubo precipitación de las proteínas y gracias a la resina usada fue que se
pudieron separar las proteínas exitosamente.
Para el segundo experimento, se obtuvo primero la salida de la proteína ferritina, para después la
salida de la anhidrasa carbónica y finalmente la aprotinina. Igualmente observaron que fue así ya
que todas estaban a un pH distinto a su punto isoeléctrico, por ello fue que no se precipitaron, y
también debido a la resina y distinto tamaño de las proteínas fue que pudieron separarse.
3-Electroforesis en gel
Se encontró un artículo sobre la confección de geles de poliacrilamida en condiciones de laboratorio
para focalización isoeléctrica, este está explicado en una serie de procesos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del lecho mixto para desionización
A 50g del intercambiador de lecho mixto (Ioneneaustauscher V, Merck) le agregaron 250 mL de
solución saturada de NaCl, la agitaron manualmente por inversión y dejaron reposar a temperatura
ambiente durante 1 hora. De esta obtuvieron dos fracciones, una fracción ligera (resina de
intercambio aniónico) y una fracción pesada (resina de intercambio catiónico). Separaron las
fracciones por medio de decantación y las lavaron con agua destilada. La fracción ligera fue re
suspendida en 10 volúmenes de NaOH 3M por 10 minutos con agitación manual. Posteriormente
esta fracción la lavaron con agua destilada hasta que alcanzara pH neutro.
La fracción pesada fue re suspendida en 3 volúmenes de HCl 3M alrededor 10 minutos agitándola
manualmente, la lavaron exhaustivamente con agua destilada hasta alcanzar pH neutro.
Ambas fracciones fueron mezcladas y se almacenaron a 40C hasta ser usadas.
Desionización de Acrilamida y Urea
Un volumen de 50 mL de cada una de las soluciones de 30% de Acrilamida (AA) y 8M de Urea, se
pasaron a un flujo de 1mL/min por una columna cromatográfica de 5mL de lecho mixto sin utilizar,
descartando los 5 primeros mL. Las soluciones de AA al 30% antes y después de la desionización,
las diluyeron hasta un 5%, y se les determinó Absorbancia (A) a 290nm, pH y conductividad. A la
solución de Urea, antes y después de la desionización se le determinó la conductividad.
Confección de geles planos
Los geles planos para focalización los confeccionaron. Emplearon moldes de cristal de 20cm x
14cm, que fueron lavados exhaustivamente con agua destilada y alcohol absoluto. Se dispuso la
junta separadora de 1mm de espesor entre una película de acetato depositado encima de uno de los
cristales y el otro cristal previamente silanizado. En ambos lados colocaron otros dos cristales de
mayor espesor y colocaron presillas en todo el perímetro. Con una pipeta o una jeringuilla llenaron
el molde con la solución de acrilamida, inclinando el cassette para evitar la formación de burbujas.
Confección de geles circulares
Sellaron tubos de cristal previamente silanizados por uno de los extremos con parafilm. Los
rellenaron con la solución de acrilamida.
Tratamiento de las muestras
Adicionaron a 10μL de plasma 100 μL de solución delipidante y mantuvieron la mezcla a 40C, 15
min o toda la noche.
Corrida electroforética horizontal de geles planos
La electroforesis fue realizada en una cámara horizontal. La lámina de acetato con el gel se colocó
sobre una plancha de enfriamiento evitando la formación de burbujas, a la cual se le añadieron
previamente agua destilada a 40C,. Las soluciones del cátodo (1 M NaOH) y del ánodo (1 M de
H3PO4) las pusieron en contacto con su correspondiente extremo del gel a través de un puente de
papel de filtro. Antes de aplicar la muestra enfocaron previamente durante 1h a 300 Volt.
Le aplicaron 10 μL de muestra sobre papel Whatman, 0.5 cm x 1cm, colocados en el extremo del
gel más cercano al cátodo. La corrida electroforética la realizaron durante 3 horas a 500 Volt 1, 2 y
5.
Corrida electroforética de geles circulares
La electroforesis la realizaron en una cámara vertical a 40C en la cámara fría. Los tubos de vidrio
conteniendo los geles los colocaron en la cámara de electroforesis, colocando uno de los extremos
en contacto con la solución anódica (1 M de H3PO4) y el otro con la solución catódica (1 M
NaOH). Antes de aplicar la muestra se enfocaron previamente durante 1h a 300 Volt. Le aplicaron
10 μL de muestra directamente sobre el extremo del gel más cercano al cátodo. La corrida
electroforética se realizó durante 3 horas a 500 Volt 1, 2 y 5.
Tinción del gel
El gel se incubó con TCA 20% durante 10 min, luego 10 min en solución al 40% de Etanol
(ETOH), 10% de Acido acético(HAc) y 0,25% SDS. Antes de proceder a la tinción con solución de
Coomasie se incubó 2 veces durante 10 minutos en solución de 40% ETOH y 10% HAc. Se tiño 10
minutos en Coomasie Azul R-250 0.2%, 40% ETOH y 10% HAc. Finalmente, el exceso de
Coomasie fue eliminado por incubación en 40% ETOH y 10% HAc6.
Medición de pH
Una de las carrileras del gel a la cual no se le aplicó muestras la cortaron en fragmentos de 0.5cm
dejándolos cada uno en 1mL de agua destilada toda la noche a 40C. Las soluciones resultantes se
atemperaron hasta 250C y se le midió el pH 1, 2.
Análisis estadístico
Utilizaron el paquete estadístico STATISTIC versión 6.0. Aplicaron un test de student para las
muestras dependientes, esto para la determinación de diferencias significativas entre las medias de
las conductividades de las soluciones de acrilamida 30% y Urea 8M, antes y después de la
desionización. Así mismo fue aplicado también un test de student para determinar diferencias
significativas entre las medias de Absorbancia a 290nm y de pH para el caso de la solución de
Acrilamida antes y después de la desionización. Determinaron la ecuación de regresión de las rectas
obtenidas mediante el ploteo de pH en función de la distancia en el gel
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuando emplearon las soluciones de Acrilamida y Urea sin desionizar para la confección del gel
observaron que se obtuvieron patrones electroforéticos con bandas difusas. Argumentaron que esto
ha sido reportado por otros autores que este efecto se debe a la presencia de iones en el gel, entre los
que se encuentra el ión acrilato.
Llevaron a cabo la desionización de las soluciones tanto de Acrilamida como de la Urea. Para ello
comentan que fue necesario la preparación de intercambiador de lecho mixto. Observaron que el
proceso de desionización fue controlado mediante la disminución de la conductividad para ambas
soluciones. Además fueron monitoreando tanto el pH como la A a 290nm para el caso de la
Acrilamida. Obtuvieron diferencias significativas en los valores de conductividad de ambas
soluciones antes y después del tratamiento, para una p< 0.05. Comentan que entonces hubo una
disminución significativa de la conductividad luego del proceso de desionización.
En el caso de la Acrilamida también monitorearon el aumento del pH y la disminución de la DO a
290nm como parámetros indicadores del proceso de desionización. Ellos obtuvieron diferencias
significativas en los valores de pH y A 290nm de la solución de Acrilamida antes y después del
proceso de desionización. Argumentan que estos resultados corresponden con lo reportado
anteriormente, ya que hubo hay un aumento del pH y una disminución de la Absorbancia a 290nm.
Además los valores de pH se encuentran por encima de 5, lo cual se reporta para soluciones de AA
donde fue eliminado el ión acrilato.
Empleando las soluciones desionizadas de Acrilamida y Urea obtuvieron patrones electroforéticos
con bandas definidas en geles planos. También realizaron la electroforesis de geles circulares,
obteniendo también bandas definidas. Así probaron la efectividad de las soluciones en dos
formatos diferentes.
Para verificar la formación del gradiente a lo largo del gel, midieron el pH de una carrilera donde no
se aplicó muestra, la cual de fraccionó en segmentos de 0.5cm. Al plotear el pH obtenido en función
de la distancia y hacer la regresión lineal de la función, obtuvieron un coeficiente de regresión de
0.99. Lo cual en su interpretación indicó que el pH mantuvo una relación lineal con la distancia de
manera significativa. El rango de pH que se formó se encontró entre pH 7.3 y 4.9
correspondiéndose a los valores que esperaron según la anfolina que emplearon.

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