Materiales y Métodos

Materiales y Mtodos Ligacin y clonacin de DNA de genes de toxina binaria de Bacillus sphaericus Primero se obtuvo el fragmento a clonar por
medio de enzimas de restriccin de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se obtuvo el inserto con extremos BamHI y EcoRI. Se cort el vector, el plsmido pCR 2,1-TOPO con los extremos complementarios. El gen y el vector se purificaron por columna. Los DNAs del vector y del inserto fueron resuspendidos en un buffer TE (100 ug/mL)y luego se procedi a la ligacin. La ligacin del vector (1,1uL) y del inserto (1,9 uL) se realiz con ligasa T4 (1uL) que es ms eficiente con extremos cohesivos, agua MilliQ (5uL) y buffer ligasa (1 uL), durante 16 a 24 horas a 14 C para llevar a cabo la reaccin de ligacin en un tubo eppendorf de 0,2 mL. La transformacin de la cepa de E. coli se realiz mezclando las clulas con el producto de ligacin y sembrndolas luego en LB en un medio con ampicilina y X-gal para luego seleccionar las bacterias transformadas. Luego se procedi al anlisis de las colonias transformantes teniendo en cuenta el color de la colonia (azul o blanco) Aislamiento de DNA plasmdico Para el aislamiento de pDNA, se utiliz un protocolo del mtodo de lisis alcalina, que consiste en tres pasos principales. Primero se hizo lisis celular de la cepa de E.coli, por medio de una solucin de lisis (lisozima, TRIS HCl pH 8,0, EDTA pH 8,0, Glucosa), SDS (NaOH 0,2 M, SDS 1% el NaOH utilizado para obtener el pH deseado. A partir de esta lisis, se tomaron 25 uL de cultivo ON, se centrifug y se utiliz el sobrenadante (1,5 uL) para proceder a la PCR. La cepa de E. coli fue cultivada en agar LB (triptona 1%, extracto de levadura 0,5% y NaCl 1%), con ampicilina por 15 a 140 rpm y luego se adicionaron 100 ul de solucin de lisis despus de haber descartado el sobrenadante. Luego se trat con solucin SDS y una solucin de sal alta para finalmente re suspender en 20 ul de solucin de TE-RNAsa e incubamos por 4 horas a 37C y luego se guardaron las clulas a -20C. Restriccin de pDNA del producto de ligacin Para la restriccin del DNA plasmdico del producto de ligacin, con las enzimas de restriccin EcoRI y BamHI, utilizando el DNA, agua estril, el buffer y las enzimas, para luego centrifugar a 4000 rpm por 5 segundos para luego incubar a 37C en un bao mara. La reaccin se inactivo calentando a 75C por 5 minutos. Finalmente se hizo una electroforesis en un gel de agarosa al 1% Extraccin de la toxina binaria Para la realizacin de la extraccin de la toxina binaria a partir de esporas de Bacillus sphaericus se centrifugaron las esporas a 12.000 r.p.m. durante 3 minutos. Luego, se resuspendieron y se dejaron en hielo por 1 hora. Despus, se centrifugaron a 12.000 r.p.m. por 10 minutos y se
pas el sobrenadante a otro tubo y se adicion 1 volumen de acetato de sodio 1M de pH 5,0. Se centrifug el producto a 12.000 r.p.m. por 15 minutos y finalmente se resuspendi Extraccin de la toxina binaria a partir de cultivos de Escherichia coli Para realizar la extraccin de la toxina binaria a partir de cultivos de E. coli, se utiliz buffer de lisis, Tris HCl a 50 nM, EDTA a 1 mM y NaCl a 100 mM. La cepa fue cultivada en 3 mL de LB, y luego subcultivada en LB con 50 ug/mL de Ampicilina, se incub a 37C y 140 r.p.m hasta tener una absorbancia entre 0,3 y 0,5 a 600 nm. Posteriormente, se adicion IPTG 1mM y se incub de 4 a 5 horas a 37C y 140 r.p.m. para centrifugar de nuevo a 12000 r.p.m. por 5 minutos. Se resuspendi el producto en 90 mL sw buffer de lisis con 2,5 mL de lisozima (10 mg/mL) y se incub a 37C por 50 minutos. La cepa se centrifug a 12000 r.p.m durante 5 minutos para luego resuspenderla en Buffer de lisis (90 mL), se adicion Triton-X (1 mL 50%) y se incub por 5 minutos a 25C. Se resuspendi de nuevo en NaOH (500 mL, 0,05 M) y se dej enfriar en hielo por 1 hora para luego volver a centrifugar a 12 r.p.m por 10 minutos. Despus, se pas el sobrenadante a otro tubo y se adicion 1 volumen de acetato de sodio (1 M, pH 5), se centrifug de nuevo a 12000 r.p.m, por 15 minutos y finalmente se resuspendi en un buffer de fosfato pH 7,0

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