Jimenez Ea

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
E.A.P. DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA
“AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE

MICROORGANISMOS DEL ORDEN DE
THRAUSTOCHYTRIALES PROVENIENTES DE LOS
MANGLARES DE TUMBES”
TESIS
Para optar el Título Profesional de
Bióloga Genetista Biotecnológica
AUTOR
Alejandra Katia Jiménez Espinoza
ASESORES
Rina Ramírez Mesías
Lima – Perú
2014
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE

MICROORGANISMOS DEL ORDEN THRAUSTOCHYTRIALES
PROVENIENTES DE LOS MANGLARES DE TUMBES
Tesis para optar al Título profesional de Bióloga Genetista

Biotecnóloga
Bach. Alejandra Katia Jiménez Espinoza
Asesora: Dra. Rina Ramírez Mesías
Asesor externo: Luis Destefano Beltrán, PhD.
Lima – Perú
2014
A mis seres queridos…
AGRADECIMIENTOS
Finalizar el presente trabajo de tesis no fue nada sencillo, fue necesario el apoyo de
muchas personas a quienes yo quiero y estimo muchísimo. Este espacio está dedicado a
todos ellos.
En primer lugar se encuentran los dos seres más importantes de mi vida, Ana Ysabel y
Luis Alberto, mis queridos padres… Simplemente GRACIAS por darme la vida, por
apoyarme en la continua lucha de mi vida y por darme la oportunidad de tener una
excelente educación.
Ana y Alfredo, mis preciados hermanos y a mi futuro esposo, Fabio… Gracias por ser
parte de mi vida y de representar esa indescriptible FELICIDAD.
A la Dra. Rina Ramírez por haber aceptado ser mi asesora, haber confiado en mi persona,
por su paciencia y que gracias a sus conocimientos, su experiencia y motivación lograron
que pudiese terminar esta tesis. Al Dr. César Córdova por haber compartido sus
conocimientos y ayudarme a salir de algunos atascos.
A mis amigos Ana, Max y José, que gracias a su compañía y hospitalidad en Tumbes me
hicieron sentir en casa a pesar que estuve lejos de mi hogar y de mis seres queridos por
un buen tiempo.
Al Fondo de Investigación y Desarrollo para la Competitividad (FIDECOM), a MARINAZUL
S.A. y sobre todo a mis jefes de trabajo Yovani y Efrain quienes gracias a su apoyo,
empuje y preocupación logré presentar esta TESIS DE PREGRADO.
Para todos ellos, simplemente GRACIAS!
i
INDICE GENERAL
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. i
ABREVIATURAS ................................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ vii
LISTA DE TABLAS ................................................................................................................ x
LISTA DE BASE DE DATOS Y PROGRAMAS BIOINFORMÁTICOS .............................. xii
RESUMEN ........................................................................................................................... xiv
ABSTRACT .......................................................................................................................... xv
I. INTRODUCCION ............................................................................................................. 1
II. MARCO TEORICO.......................................................................................................... 4
II.1 Thraustochitridos: Clasificación, características y ocurrencia ................................ 4
II.1.1 Clasificación de los Thraustochitridos .............................................................. 4
II.1.2 Características generales ................................................................................. 6
II.1.3 Distribución: Hábitats y ecosistemas de su ocurrencia ................................... 8
II.2 Aislamiento y mantenimiento de los Thraustochitridos ......................................... 12
II.2.1 Métodos de aislamiento .................................................................................. 12
II.2.2 Mantenimiento: medios de cultivos ................................................................ 13
II.3 Técnicas de identificación de Thraustochitridos.................................................... 15
II.3.1 Identificación bioquímica ................................................................................ 15
II.3.2 Identificación molecular .................................................................................. 16
II.4 Thraustochitridos: fuente alternativa de AGPIs ..................................................... 17
II.4.1 Definición e importancia de los AGPIs ........................................................... 17
II.4.2 Fuentes convencionales de AGPIs ................................................................ 20
II.4.3 Fuentes alternativas de AGPIs ω3 ................................................................. 22
III. HIPOTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................... 25
III.1 Hipótesis: ................................................................................................................ 25
ii
III.2 Objetivos: ............................................................................................................... 25
IV. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 26
IV.1 Área de estudio y colecta....................................................................................... 26
IV.2 Aislamiento, medios de cultivo y mantenimiento de Thraustochitridos ................ 31
IV.2.1 Metodología de la hoja senescente................................................................ 31
IV.2.2 Metodología por cebado ................................................................................. 34
IV.3 Identificación bioquímica: Tinción fluorescente ..................................................... 35
IV.4 Identificación molecular: Caracterización del gen 18S rRNA ............................... 36
IV.4.1 Extracción de ADN genómico......................................................................... 36
IV.4.2 PCR y secuenciamiento del gen 18S rRNA ................................................... 36
IV.4.3 Edición y obtención de la secuencia consenso ............................................. 38
IV.4.4 Alineamiento múltiple ...................................................................................... 38
IV.4.5 Caracterización de las secuencias ................................................................. 42
IV.4.6 Divergencia de las secuencias 18S rRNA ..................................................... 42
IV.4.7 Análisis filogenético molecular ....................................................................... 43
V. RESULTADOS .............................................................................................................. 45
V.1 Aislamiento y mantenimiento de cepas de thraustochitridos ................................ 45
V.1.1 Aislamiento y crecimiento ............................................................................... 45
V.2 Identificación bioquímica con tinción con acriflavina y rojo de nilo ....................... 48
V.3 Caracterización molecular del gen 18S rRNA ....................................................... 49
V.3.1 Extracción de ADN, PCR y secuenciamiento del gen 18S rRNA .................. 49
V.3.2 Ensamblaje y edición de secuencias ............................................................. 51
V.3.3 Verificación de las secuencias 18S rRNA por BLAST ................................... 54
V.3.4 Alineamiento múltiple ...................................................................................... 58
V.3.5 Divergencia en las secuencias 18S rRNA ..................................................... 59
V.3.6 Análisis filogenético ........................................................................................ 61
iii
V.3.6.1. Utilizando PAUP (Métodos MP y ML) ....................................................... 61
V.3.6.2. Utilizando Mr. Bayes (Método IB) .............................................................. 61
V.3.7 Análisis de distancias genéticas entre taxa ................................................... 64
V.3.7.1. Matriz de distancia entre géneros reportados ........................................... 64
V.3.7.2. Matriz de distancia intraespecífica ............................................................ 64
VI. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 70
VI.1 Primer reporte de Thraustochitridos en los manglares de Tumbes. ..................... 70
VI.2 Caracterización molecular de Thraustochitridos de Tumbes. ............................... 72
- Sus relaciones evolutivas basadas en el marcador molecular 18S rRNA...... 72
- Diversidad de Thraustochitridos en los Manglares de Tumbes basadas en su

divergencia genética ........................................................................................ 74
VII. CONCLUSIONES.......................................................................................................... 79
VIII. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 80
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 81
iv
ABREVIATURAS
ADN Ácido desoxirribonucleico
AG Ácido graso
AGPIs Ácidos grasos poliinsaturados
ALA Ácido alfa linolénico
AM Agua de mar
AP Agua preparada o agua de mar artificial
ARA Ácido araquidónico
ARN Ácido ribonucleico
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
C Carbono
dATP Desoxiadenosin trifosfato
dCTP Desoxicitidin trifosfato
dGTP Desoxiguanosin trifosfato
DHA Ácido docosahexanoico
dTTP Desoxitimidin trifosfato
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
EPA Ácido eicosapentanoico
FIDECOM Fondo de Investigación y Desarrollo para la Competitividad
GPY Medio Extracto de levadura, peptona y glicerol
GRAS Generally recognized as safe
H Medio H
ICBN Código Internacional de Nomenclatura Botánica
ICZN Código Internacional de Nomenclatura Zoológica
v
INRENA Instituto Nacional de Recursos Naturales
LA Ácido linoleico
min Minutos
MgCl2 Cloruro de magnesio
ML Máxima verosimilitud
MP Máxima parsimonia
m/v Masa/volumen
N Nitrógeno
NaCl Cloruro de sodio
NCBI National Center for Biotechnology Information
OMS Organización Mundial de la Salud
PAUP Phylogenetic Analysis Using Parsimony
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
SCO Single cells oil
seg Segundos
TAG Triacilglicéridos
Tris-HCl Buffer Tris-(hidroximetil)aminometano clorhidrato
ups Unidades prácticas de salinidad
ω3 Omega 3
ω6 Omega 6
18S rRNA Gen codifica subunidad menor ARN
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Formación de los ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs) de cadena larga a

partir de los ácidos insaturados de 18 carbonos (Mataix y Sánchez de Medina, 2002) ..... 19
Figura 2. Salvia hispánica (izquierda). Sacha inchi (derecha arriba) y cañamones

(derecha abajo).. ................................................................................................................... 20
Figura 3. Algunas fuentes alternativas de AGPI ω3. Thraustochitridos (Izquierda).

Bacterias (Centro). Microalgas (Derecha)............................................................................ 22
Figura 4. Muestras de agua y hojas senescentes de mangle tomadas en recipientes

plásticos. ............................................................................................................................... 26
Figura 5. Mapa de ubicación de los principales Humedales del Perú, destacando

ubicación de los Manglares de Tumbes............................................................................... 27
Figura 6. Puntos de muestreo en los manglares de Tumbes representado por color el día
de muestreo (ver Tabla 1). ................................................................................................... 28
Figura 7. Escenarios de algunos puntos de muestreo....................................................... 28
Figura 8. Material utilizado en el lavado previo de las hojas de mangle ............................ 31
Figura 9. Lavado con antibiótico, previo a la siembra de las hojas senescentes de mangle
.............................................................................................................................................. 32
Figura 10. Siembra de las hojas de mangle (Metodología de la hoja senescente) ........... 33
Figura 11. Metodología por cebado con granos de polen floral ......................................... 34
Figura 12. Extracción de ADN genómico de los aislados seleccionados (A) Lavado y lisis
de cultivo (B) Purificación (C) y Precipitación del ADN. ...................................................... 37
Figura 13. Thraustochitridos en el contorno de la hoja de mangle (400X). ........................ 45
vii
Figura 14. (A) Crecimiento de los thraustochitridos en medio sólido libres de
contaminación (B) Contaminación por bacterias (C) Contaminación por hongos.
Visualizados por microscopía óptica (400X) ........................................................................ 46
Figura 15. (A) Crecimiento de los thraustochitridos en medio sólido y (B) medio líquido
visualizado por microscopio invertido (400X). ..................................................................... 47
Figura 16. Thraustochitridos, protistas teñidos con acriflavina (pared celular: rojo;
contenido celular: azul) visualizado por microscopio confocal (400X). ............................... 48
Figura 17. Thraustochitridos, protistas teñidos con rojo de nilo (interior: amarillo-oro),
visualizado por microscopio confocal (400X). ...................................................................... 48
Figura 18. Migración en gel de agarosa 1% de las extracciones de ADN genómico. ....... 49
Figura 19. De izquierda a derecha. Carril 1: Marcador de tamaño molecular de 1000pb.

Carril 2 a 16: Amplificación del gen 18S rRNA de los aislados thraustochitridos
visualizados en gel de agarosa 1.5% ................................................................................... 50
Figura 20. Secuencia consenso obtenida por sobrelapamiento con el programa

Sequencher. .......................................................................................................................... 52
Figura 21. Ubicación de los primers internos en la secuencia del aislado 72.
FA1 (en color amarillo, posición 37-56); RA1 (en color verde, posición 605-624); F (en
color celeste, posición 387-404); R (en color rojo, posición 1254-1271); FA3 (en color
fucsia, posición 1125-1144) y RA3 (en color marrón, posición 1662-1684). ...................... 53
Figura 22. Cromatograma mostrando la posición 1360 al 1385 aproximadamente del

aislado 72, donde se identificó uno de los ruidos característicos en aislados de
Aurantiochytrium sp. Nótese la región poliT. ....................................................................... 54
Figura 23. Una de las regiones eliminadas del alineamiento múltiple por la presencia de
numerosas bases degeneradas ........................................................................................... 58
Figura 24. Alineamiento final utilizado en los análisis filogenéticos ................................... 59
viii
Figura 25. Distribución de los 56 alelos encontrados en los tres puntos de muestreo
(primer día de muestreo en color celeste; segundo día, en color naranja; tercer día, en
color rosado; en color plomo, alelos compartidos en los tres puntos) ................................ 60
Figura 26. Árbol filogenético basado en el marcador 18S rRNA de los aislados,
secuencias de thraustochitridos y labirintúlidos previamente reportadas en la base de
datos. P. micans y C. roenbergensis como grupo externo. Los números en nodo
muestran los valores de soporte del bootstrap (MP/ML), para nodos soportados por más
del 50% de 1000 réplicas. .................................................................................................... 62
Figura 27. Árbol filogenético generado por IB, basado en el marcador 18S rRNA de los
aislados, secuencias de thraustochitridos y labirintúlidos previamente reportadas en la
base de datos. P. micans y C. roenbergensis como grupo externo. La barra representa
0.06 mutaciones.................................................................................................................... 63
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Descripción de los sitios y fechas en que se obtuvieron las muestras................. 29
Tabla 2. Composición del agua de mar artificial o agua preparada (AP). .......................... 32
Tabla 3. Composición de los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de

Thraustochitridos. ................................................................................................................. 32
Tabla 4. Primers externos e internos utilizados para obtener la secuencia del gen 18S
rRNA...................................................................................................................................... 38
Tabla 5. Lista de las secuencias del gen 18S rRNA de especies relacionadas usadas en
este estudio como taxa de referencia para determinar el género de los aislados. ............. 40
Tabla 6. Resultados del análisis por BLAST en la base de datos del GenBank de cada
uno de los 56 alelos encontrados en el presente estudio. En todos los casos correspondió
al gen 18S rRNA; para cada alelo se presenta el mejor hit encontrado. Entre paréntesis se
indica el número de cepas por alelo..................................................................................... 55
Tabla 7. Divergencia de las secuencias del marcador 18S rRNA (en porcentajes) entre las
especies de los géneros Aplanochytrium, Oblongichytrium, Sicyoidochytrium, Ulkenia,
Botryochytrium, Japonochytrium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium y
Parietichytrium. ..................................................................................................................... 66
especies del género Aurantiochytrium con secuencias de los aislados del clado
Aurantiochytrium (Figura 26 y 27) ........................................................................................ 67
especies de los géneros Aplanochytrium, Oblongichytrium, Sicyoidochytrium, Ulkenia,
Botryochytrium, Japonochytrium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium y
Parietichytrium con secuencias de género no determinado. ............................................... 68
x
Tabla 10. Divergencia de las secuencias del gen 18S rRNA (en porcentajes) entre las
especies del género Parietichytrium con secuencias de los aislados del clado
Parietichytrium (Figura 26 y 27) ........................................................................................... 69
especies de los géneros Ulkenia y Botryochytrium con secuencias de los aislados del
clado Ulkenia y Botryochytrium (Figura 26 y 27) ................................................................. 69
xi
LISTA DE BASE DE DATOS Y PROGRAMAS BIOINFORMÁTICOS
BLAST. - El Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) encuentra regiones de similitud
local entre secuencias. El programa compara secuencias de nucleótidos o proteínas
contra secuencias de la base de datos y calcula la significancia estadística de las
coincidencias. BLAST se puede utilizar para inferir las relaciones funcionales y evolutivas
entre secuencias, así como ayudar a identificar miembros de familias de genes.
ClustalX2.1. - El programa está diseñado para (1) realizar múltiples alineamientos, (2) ver
los resultados del proceso de alineamiento, y (3) si es necesario, mejorar el alineamiento.
DNAsp. - DnaSP, DNA Sequence Polymorphism, es un paquete de software para el
análisis de polimorfismo de nucleótido de los datos de secuencia de ADN. DnaSP puede
estimar varias medidas de variación de la secuencia de ADN dentro y entre poblaciones,
así como el desequilibrio de ligamiento, la recombinación, el flujo de genes y parámetros
de conversión génica.
FigTree v.1.0.4. - FigTree está diseñado como un visor gráfico de árboles. El programa
está escrito de acuerdo a las propias necesidades del autor, por lo que, no es tan pulido y
con características más completas como tendría un programa comercial.
jModelTest. - Este programa recientemente lanzado es una herramienta independiente
utilizado para llevar a cabo la selección estadística de los modelos de mejor ajuste de
sustitución de nucleótidos sin la ayuda de PAUP*. Implementa cinco diferentes estrategias
de selección de modelo: pruebas de coeficiente de probabilidad jerárquica y dinámica
(hLRT y dLRT), criterio de información Akaike y el criterio de información bayesiano (AIC y
BIC), y un método de Teoría de la Decisión Criterio (DT).
xii
MEGA 6. - MEGA es una herramienta integrada para llevar a cabo el alineamiento de
secuencias, inferencia de árboles filogenéticos, la estimación de tiempos de divergencia,
el mining de datos en línea, la estimación de las tasas de evolución molecular, inferencia
de secuencias ancestrales, y el análisis de hipótesis evolutivas. MEGA es utilizado por los
biólogos en un gran número de laboratorios para la reconstrucción de la historia evolutiva
de las especies y deducir la magnitud y la naturaleza de las fuerzas selectivas que
determinan la evolución de los genes y las especies.
PAUP v4.0b. - PAUP * es un paquete de software utilizado para la inferencia de árboles
evolutivos. La influencia del análisis computacional de alta velocidad de datos
moleculares, morfológicos y/o de comportamiento para inferir relaciones filogenéticas se
ha expandido mucho más allá de su papel central en la biología evolutiva, ya que abarca
aplicaciones en áreas tan diversas como la biología de la conservación, ecología y
estudios forenses. El éxito de las versiones anteriores de PAUP: Análisis filogenético
Usando Parsimonia ha hecho que sea el paquete de software más utilizado para la
inferencia de árboles evolutivos.
Mr. Bayes. - MrBayes es un programa para la inferencia bayesiana y la elección del
modelo a través de una amplia gama de modelos filogenéticos y evolutivos. MrBayes
utiliza la cadena de Markov Monte Carlo (MCMC), métodos para estimar la distribución
posterior de los parámetros del modelo.
SequencherTM version 4.1.4. - Sequencher es una herramienta de la secuenciación del
ADN donde los usuarios ingresan fragmentos de secuencia. Las secuencias pueden
entonces ser examinados si presentan contaminación de vector, además el programa
tiene la capacidad de realizar poderosos alineamientos que permiten a los usuarios
localizar y montar por superposición de secuencias de una forma rápida y sencilla.
xiii
RESUMEN
Los Thraustochytriales o mejor conocidos como thraustochitridos son protistas
pertenecientes al Grupo Chromista según los análisis del gen 18S rRNA. Considerados
como una potencial fuente alternativa al aceite de pescado, estos microorganismos
oleaginosos han sido aislados de diversos ambientes a nivel mundial encontrándose
principalmente asociados a material vegetal en descomposición. Así, en este estudio se
logró aislar cepas de thraustochitridos provenientes de todos los puntos muestreados en
los manglares de Tumbes donde la caracterización bioquímica con acriflavina y rojo de
nilo confirmaron su ocurrencia y los resultados de caracterización molecular permitieron
determinar aislados pertenecientes a los géneros Aurantiochytrium (basónimo:
Shizochytrium), Parietichytrium, Botryochytrium e Ulkenia sensu stricto. Asimismo se
propone el posible descubrimiento de dos nuevas especies con potenciales
biotecnológicos en base a información proporcionada de las características observadas
en cultivo, de los análisis filogenéticos y de trabajos previos relacionadas a las cepas
Aurantiochytrium sp. 15A-14a (Genbank Accesion N° AB811008) y Schizochytrium sp. S8
(Genbank Accesion N° DQ836630), los cuales dieron el mayor hit con los aislados 75,
507, 510, 512, 523, 526, 527 y C1, respectivamente. Finalmente, el presente estudio
brindó los primeros reportes de la presencia de estos thraustochitridos en nuestro país.
Palabras claves: Thraustochitridos, Manglares de Tumbes, método de hoja senescente y
cebado, gen 18s ARNr, filogenia molecular, ácido graso poliinsaturado (AGPI).
xiv
ABSTRACT
The Thraustochytriales or commonly known as traustochytrids are protists belonging to the
Chromista group determined by the 18S rRNA gene analysis. Considered a potential
alternative source of fish oil, these oleaginous microorganisms are widely distributed in
various environments around the world. Mainly, they are associated with decaying plant
material. Thus, strains of thraustochytrids were isolated in this study. These strains were
taken from all sampled points in the mangroves of Tumbes where biochemical
characterization acriflavine and red nile confirmed their occurrence and the results of
molecular characterization allowed determining isolates belonging to the genera
Aurantiochytrium (basionym: Shizochytrium) Parietichytrium, Botryochytrium and Ulkenia
sensu stricto. It is also proposed the possible discovery of two new species with potential
biotechnological based on information provided by the characteristics observed in culture,
phylogenetic analyzes and previous work related to strains Aurantiochytrium sp. 15A-14a
(Genbank Accesion N° AB811008) y Schizochytrium sp. S8 (Genbank Accesion N°
DQ836630), which showed the best hit along with the isolates 75, 507, 510, 512, 523, 526,
527 y C1, respectively. Finally, this study provided the first reports of the presence of these
thraustochitridos in our country.
Key words: Thraustochitrids, Tumbes’s mangroves, senescent leaves and baiting
method, 18S rRNA gene, molecular phylogeny, polyunsaturated fatty acids (PUFAs).
xv
I. INTRODUCCION
En la historia de la clasificación de los Thraustochitridos, el criterio taxonómico estuvo
principalmente basado en características morfológicas por lo que fueron colocados
originalmente entre los hongos Phycomycetes (Sparrow, 1960) y posteriormente con
los Oomycetes (Kazama, 1972, 1974). Y es sabido que la caracterización morfológica
es la primera etapa en la búsqueda de nuevas cepas de microorganismos, pero
debido a la plasticidad morfológica del género causada sobre todo por las condiciones
de cultivo, incluso entre individuos de un mismo cultivo (Kazama, 1974; Bongiorni et
al., 2005), esta caracterización generalmente no es suficiente (Mo et al., 2002). Por
ello, la caracterización molecular, utilizada para explicar relaciones evolutivas y
taxonómicas de estos microorganismos fueron mejor entendidas con los análisis del
gen 18S rRNA que demostraron que los thraustochitridos son profundamente
divergentes de los oomycetes y cercanos a los labirintúlidos (Cavalier-Smith et al.,
1994; Leipe et al., 1994; Huang et al., 2003). De esta manera, los thraustochitridos
finalmente fueron designados dentro del Grupo Chromista (Heterokonta o
Stramenopiles) (Cavalier-Smith, 1993; Cavalier-Smith et al., 1994; Honda et al., 1999).
Precisamente, dentro de estos organismos stramenopiles (Heterokonta o Chromista),
los pertenecientes a la clase Labyrinthulomycetes (ICBN) o Labyrinthulea (ICZN) se
caracterizan por ser microorganismos heterotróficos, de nutrición absorbente y, se
distinguen de otros organismos fungoides por la presencia de zoosporas biflageladas
con flagelo anterior, de una red ectoplasmática producida a partir de organelas
especializadas denominadas “sagenetosomas” y de paredes celulares constituidas por
escamas delgadas derivadas del aparato de Golgi (Yokoyama y Honda, 2007). En
esta clase encontramos a los labirintúlidos y thraustochitridos, donde los primeros
1
presentan células con forma de huso que se deslizan dentro de la red ectoplasmática
que las envuelve completamente y, los segundos, poseen esporangios globosos
unidos al sustrato mediante un sistema rizoidal formado por delicados filamentos
ramificados de la red ectoplasmática que no los rodea completamente y a su vez
producen zoosporas heterocontas biflageladas (Rosa, 2006; Yokohama et al., 2007).
Estos thraustochitridos han sido aislados de un amplio rango de hábitats alrededor del
mundo, encontrándose incluso en manglares tropicales y subtropicales lo cual sugiere
un rol ecológico como degradadores de la materia orgánica en descomposición. Por lo
tanto, los manglares de nuestro país representan una gran variedad de ambientes
potenciales para explorar la presencia de estos microorganismos y hacer un primer
revelamiento de la biodiversidad de estos microorganismos para el Perú. Además,
estos microorganismos representan fuentes valiosas de nutrientes como son los
ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs), cuya importancia y conocimiento de sus
beneficios al organismo humano han sido comprendidos en los últimos años. Y junto
con algunas bacterias, levaduras y microalgas productoras de lípidos han sido
considerados microorganismos Single Cell Oil (SCO) como fuentes alternativas de
AGPIs esenciales (Ratledge, 2004), superando estos al aceite del pescado, fuente
convencional de AGPIs.
Finalmente, la obtención de aislados locales plantea la posibilidad de constituir un
cepario con organismos disponibles tanto para estudios académicos como para la
búsqueda de aislados productores de AGPIs con posibles aplicaciones
biotecnológicas. Y con esta tesis se busca proponer las bases para impulsar la
investigación, valorización y comercialización de microorganismos altamente
productores de AGPIs, como son los thraustochitridos, lo que permitirá a nuestro país
2
incursionar en la faceta biotecnológica y sería considerado valioso a nivel mundial
disponer de un cepario de estos microorganismos con potencial interés biotecnológico,
constituyendo otro aporte más al conocimiento de nuestra biodiversidad al mundo.
3
II. MARCO TEORICO
II.1 Thraustochitridos: Clasificación, características y ocurrencia
II.1.1 Clasificación de los Thraustochitridos
Entre los investigadores, siempre ha existido una confusión respecto a la
clasificación taxonómica de estos thraustochitridos y, en la historia de su
clasificación, el criterio taxonómico estuvo principalmente basado en
características morfológicas. Al ser típicamente microorganismos
quimioorganótrofos y morfológicamente parecidos a los hongos chytridiales y
oomycetes, se colocaron originalmente entre los hongos Phycomycetes
(Sparrow, 1960). Recién en los inicios de 1970, estudios de microscopía
electrónica de la ultraestructura de estos microorganismos determinaron su
relación filogenética, descubriendo que estaban relacionados vagamente a
oomycetes (Kazama, 1972, 1974). Sin embargo, sus relaciones evolutivas y
taxonómicas no fueron bien entendidas sino hasta el desarrollo de métodos de
secuenciación del ADN, así los análisis del gen 18S rRNA demostraron que
los thraustochitridos son profundamente divergentes de los oomycetes y
cercanos a los labirintúlidos (Cavalier-Smith et al., 1994; Leipe et al., 1994;
Huang et al., 2003). Además, los thraustochitridos difieren de los hongos de
varias maneras como es la composición de sus paredes celulares, las cuales
están formadas por escamas circulares derivadas del dictiosoma y dispuestas
en varias capas de polisacáridos sulfatados (galactosa y mucosa) en vez de
quitina y proteínas (Chamberlain y Moss, 1988; Hinzpeter, 2008). En
particular, los hallazgos descritos por Honda y colaboradores (1999) revelan
4
que las características morfológicas utilizadas como criterio de clasificación
para estos microorganismos deberían ser revaluadas.
Posteriormente, los thraustochitridos se designaron como un grupo único
incluyéndose dentro del Grupo Chromista (Heterokonta o Stramenopiles)
(Cavalier-Smith, 1993; Cavalier-Smith et al., 1994; Honda et al., 1999). Según
Metz (2010), dos familias pertenecientes a este linaje Stramenopiles son
Labyrinthulaceae y Thraustochytriaceae e históricamente hubo numerosas
estrategias de clasificación para estos únicos organismos, frecuentemente
clasificados bajo el Orden Thraustochytriales perteneciente al Phylum
Heterokonta.
Por otro lado, empleando el sistema taxonómico de Anderson y Cavalier-Smith
(2012), los labirintúlidos y thraustochitridos en su mayoría presentan
zoosporas flageladas y juntos constituyen la Clase heterokonta Labyrinthulea,
Subphylum Sagenista (Olive, 1975; Cavalier- Smith, 1986) del Phylum Bigyra,
el cual se compone predominantemente de diversos flagelados fagotróficos
(Cavalier-Smith, 1997; Cavalier-Smith y Chao, 2006). La clase Labyrinthulea
tiene dos órdenes, Labyrinthulida (labirintúlidos) y Thraustochytrida
(thraustochitridos), cada uno con una sola familia (Cavalier-Smith y Chao
2006; Porter, 1990).
Ello demuestra una vez más que en los protistas, el sistema de clasificación
ha sido descifrado durante décadas, siendo descrito en paralelo por zoólogos
y botánicos con nombres diferentes. Pero por razones históricas, los protistas
tradicionalmente están bajo la jurisdicción del Código Internacional de
5
Nomenclatura Botánica (ICBN) si ellos fuesen “algas” o “hongos” y, bajo la
jurisdicción del Código Internacional de Nomenclatura Zoológica (ICZN) si
ellos fuesen “protozoarios” (Adl et al., 2007).
Después de numerosas revisiones, los thraustochitridos han demostrado ser
una división distintiva y característica de los protistas. Hasta ahora, varios
géneros han sido descritos en estos microorganismos: Althornia,
Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Diplophrys, Elina,
Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium,
Sicyoidochytrium, Ulkenia y Thraustochytrium (NCBI), siendo identificadas en
el último género 13 especies (Bongiorni et al., 2005).
II.1.2 Características generales
La clase Labyrinthulomycetes (ICBN) o Labyrinthulea (ICZN) es un grupo de
los organismos Stramenopiles (=Heterokonta, Chromista), los cuales se
caracterizan por ser microorganismos heterotróficos, de nutrición absorbente
y, se distinguen de otros organismos fungoides por la presencia de zoosporas
biflageladas con flagelo anterior, de una red ectoplasmática producida a partir
de organelas especializadas denominadas “sagenetosomas” y de paredes
celulares constituidas por escamas delgadas derivadas del aparato de Golgi
(Yokoyama y Honda, 2007). La composición química de sus paredes es
inusual, habiéndose encontrado L-galactosa, galactanos sulfatados y fucosa
en diferentes especies estudiadas de Schizochytrium, Thraustochytrium y
Labyrinthuloides, respectivamente (Rosa, 2010). El resto de las organelas
presentes en el citoplasma son las típicas de una célula eucariota. En cuanto
6
a su reproducción es básicamente asexual e involucra la formación de
zoosporas a partir del clivaje progresivo de la célula vegetativa. Así las
zoosporas liberadas nadan hasta encontrar un sustrato adecuado, sobre el
que se fijan, y se diferencian en una célula vegetativa la cual madurará en un
nuevo zoosporangio (Rosa, 2010).
Este grupo de organismos fue considerado tradicionalmente como hongos
primitivos (Sparrow, 1960), y han mostrado estar emparentados con las algas
heterocontas (Diatomeas, Feofíceas, etc.) y los oomycetes (Cavalier-Smith et
al., 1994; Dick, 2001; Kirk et al., 2001). Esta clase Labyrinthulomycetes (ICBN)
o Labyrinthulea (ICZN) está conformada a su vez por labirintúlidos y
thraustochitridos. Por un lado, los labirintúlidos presentan células con forma de
huso, que se deslizan dentro de la red ectoplasmática que las envuelve
completamente; por otro lado, los thraustochitridos poseen esporangios
globosos unidos al sustrato mediante un sistema rizoidal formado por
delicados filamentos ramificados de la red ectoplasmática que no los rodea
completamente y a su vez producen zoosporas heterocontas biflageladas
(Rosa, 2006; Yokohama et al., 2007).
Los thraustochitridos han sido aislados de un amplio rango de hábitats
alrededor del mundo, encontrándose incluso en manglares tropicales y
subtropicales lo cual sugiere un rol ecológico como degradadores de la
materia orgánica en descomposición y; además, estos microorganismos
representan fuentes valiosas de nutrientes como son los ácidos grasos
poliinsaturados (AGPIs).
7
II.1.3 Distribución: Hábitats y ecosistemas de su ocurrencia
La presencia de thraustochitridos ha sido reportada a escala mundial
(Antártida, Mar del Norte, India, Micronesia, Japón, Australia, Costa Rica,
Brasil, Argentina y Chile) (Raghukumar, 1988a, 1988b, 1979; Lewis et al.,
1999; Ulken, 1966, 1983, 1990). Aunque tienden a concentrarse
principalmente en sedimentos y en columna de agua (Raghukumar et al.,
2000; Raghukumar, 2002), se encuentran en una variedad de hábitats
(Raghukumar, 2004; Fan et al., 2002) como las superficies de algas (Booth y
Miller, 1968; Haythorn et al., 1980; Miller y Jones, 1983), en ambientes
esturiales (Ulken, 1981), detritus marino, agua de mar (Goldstein y Belsky
1964; Bahnweg y Sparrow, 1972, 1974; Gaertner, 1981), suelos salinos
(Booth, 1971) e invertebrados (Ellis y Bishop, 1989; Rosa, 2010). En este
último, los thraustochitridos pueden ser parásitos en haliotis juvenil (Haliotis
kamtschatkana) y en chirla mercenaria (Mercenaria mercenaria) (Bower, 1987;
Maas et al., 1999; Mo et al., 2002; Whyte et al., 1994) así como también
pueden aparecer asociados por mutualismo en arrecifes de coral tales como
Favia sp. (Siboni et al., 2010) y Fungia granulosa (Harel et al., 2008; Chang et
al., 2011).
Al hallarse asociados a material vegetal en descomposición, especialmente en
algas y hojas de mangle, probablemente estos microorganismos cumplan una
importante función como saprobios (Raghukumar, 2002).
Los bosques de mangle, peculiares por sus características, se encuentran
distribuidos ampliamente en las regiones costeras de los trópicos y parte de
8
los subtrópicos. Los manglares latinoamericanos se hallan en los trópicos
continentales (el norte de la costa colombiana, la desembocadura del
Amazonas, regiones del suroeste brasileño, costa ecuatoriana y la costa del
extremo norte del Perú).
Si bien nuestros manglares se encuentran en una zona tropical, la mayoría de
los aislados reportados provienen de regiones templadas (Jones, 1976; Rosa,
2010), siendo su temperatura óptima de crecimiento entre los 25-30ºC,
variable según las especies utilizadas con fines de producción (Perveen et al.,
2006; Burja et al., 2006; Yokochi et al., 1998). El rango de tolerancia al pH es
amplio y generalmente abarca de 4 a 9 unidades, aunque algunas especies
son más sensibles a los cambios de este factor (Fan et al., 2002). Los
traustochitridos son primariamente marinos (Raghukumar, 2004) reportándose
por Vishniac (1960) que los niveles de NaCl necesarios para que su
crecimiento sea máximo son los característicos del mar (Rosa, 2010).
Manglares del Perú
Según la definición de la convención de Ramsar, los humedales son:
«Extensiones de marismas, pantanos, turberas o aguas de régimen natural o
artificial, permanentes o temporales, estancadas o corrientes, dulces, salobres
o saladas, incluyendo las extensiones de agua marina cuya profundidad en
marea baja no exceda de seis metros» (Ramsar, 1990). En cuanto a la
clasificación de los humedales se puede aplicar más de una, siendo la más
utilizada las propuestas por Bravo y Windevoxhel (1997), donde los manglares
se situarían en la clasificación de Sistema Estuarino, definiéndose éstos como
9
ambientes costeros que tienen conexión con mar abierto (Charcape-Ravelo y
Moutarde, 2005).
Los manglares son bosques que crecen en las aguas salobres de los
estuarios fluviales. Al noroeste del Perú, los manglares se encuentran
conformando pequeñas áreas (Figura 5), en comparación a los existentes en
otras regiones del mundo. Clüsener (1987, apud INRENA 2007-2011)
menciona que la corriente fría peruana corre paralela a la costa de sur a norte
hasta los 6º Latitud Sur impidiendo el desarrollo de manglares en la costa
peruana más al sur de esta latitud. Sin embargo, la ausencia de manglares
entre los 3º35´ y los 6º Latitud Sur se explica por factores de naturaleza
climática como edáfica, según el autor. El ecosistema manglar se localiza en
la región Tumbes, en el litoral que va desde los 3º 24' Latitud Sur (frontera con
el Ecuador, Canal Internacional y Punta de Capones) hasta los 3º 35' Latitud
Sur (Playa Hermosa), y desde los 80º13'08'' hasta los 80º31´03” Longitud
Oeste (INRENA, 2007-2011). Estos complejos boscosos presentan una biota
característica constituida por especies de mangle de los géneros Rhizophora,
Avicennia, Laguncularia y Conocarpus; se distribuyen desde Tumbes, límite
con el Ecuador, hasta San Pedro (Vice-Sechura, Piura) (Charcape-Ravelo y
Moutarde, 2005).
Ecológicamente los manglares representan un ecosistema transitorio entre
ambientes marino y costero continental donde el nivel de agua fluctúa mucho
de acuerdo con las mareas. Los bosques de mangle requieren aguas
templadas y resisten diferentes grados de salobridad, sólo la flora y fauna con
tolerancia fisiológica a los cambios permanentes pueden sobrevivir en este
10
ambiente. El clima, la naturaleza del sustrato, así como la estructura,
propiedades físicas, composición química, salinidad, acidez del suelo y los
sedimentos determinan el desarrollo, crecimiento y productividad de los
ecosistemas de manglar, características que los hacen únicos en el mundo
(INRENA, 2007-2011).
La fauna es muy diversa, desde organismos microscópicos, los menos
conocidos, hasta todos los grupos de vertebrados, a excepción de los anfibios,
que no tienen representante dentro de este sistema natural (INRENA, 2007-
2011). La fauna endémica lo constituyen la concha negra Anadara spp.; los
cangrejos violinistas Uca spp.; el cangrejo gigante Ucides spp.; caracoles
Cerithidea y Nassarius; el caracol coco Melongena patula; las ostras Ostrea
spp. (Charcape-Ravelo y Moutarde, 2005).
Dentro de los ecosistemas relacionados con los ambientes marinos, los
manglares ocupan el segundo lugar en producción de biomasa y energía,
después de los arrecifes de coral. Su gran diversidad se debe a la interacción
de las aguas dulce y salada que convergen para formar los estuarios
(Charcape-Ravelo y Moutarde, 2005), y los manglares de Tumbes no escapan
a ello.
11
II.2 Aislamiento y mantenimiento de los Thraustochitridos
II.2.1 Métodos de aislamiento
Los métodos del cebado y del sembrado directo son los recomendados para el
aislamiento de cepas de thraustochitridos. El método de cebado por polen es
el procedimiento comúnmente usado, el cual utiliza granos de polen
esterilizados y dispersados en la muestra de agua con agentes antifúngicos y
antibióticos e incubados por 1 a 2 semanas. Después de ser colonizados, los
cebos con estos microorganismos son sembrados en medio agarizado, donde
desarrollan nuevas colonias que luego son transferidas sucesivamente hasta
obtener cultivos puros (Porter, 1990). Pero, reportes previos mencionan que
algunos thraustochitridos no prosperan sobre el polen y se debe aplicar otros
cebos, como en el caso de Ulkenia amoeboidea, requiere de Artemia salina
estériles (Bahnweg y Sparrow, 1974).
Por otro lado, la metodología propuesta por Watson y Ordal (1957), consta
básicamente en la siembra directa de material en descomposición (hojas
senescentes) en medio sólido, debido a la particularidad de estos
microorganismos de hallarse asociados a material vegetal en esas
condiciones, especialmente en algas y hojas de mangle cumpliendo
probablemente una importante función como saprobios.
12
II.2.2 Mantenimiento: medios de cultivos
Los primeros esfuerzos por obtener cultivos puros corresponden a S. W.
Watson y H. S. Vishniac, quienes formularon varios medios de cultivo para
Labyrinthula (Vishniac y Watson, 1953; Vishniac, 1955). En 1957, Watson y
Ordal sembraron material (hojas con el patógeno) en un medio sólido
conteniendo 0.9 % m/v de agar y 10 % v/v de suero de caballo y posteriores
transferencias permitieron obtener el primer cultivo puro de Labyrinthula. A
este medio de cultivo lo denominaron SSA (Serum Seawater Agar) y
verificaron que también era efectivo para el crecimiento de una cepa de
Thraustochytrium. Por su parte Vishniac (1956) formuló otro medio de cultivo
para poder desarrollar estudios ecológicos. Dicho medio contenía glucosa
(0.1% m/v), hidrolizado de gelatina (0.1% m/v), extracto de hígado (0.02%
m/v), una solución de vitaminas del grupo B y agar (1.5% m/v) en agua de
mar. Y según dicho estudio, la siembra de muestras de agua de mar sobre el
mismo permitió el aislamiento de un importante número de colonias de hongos
zoospóricos, entre ellos Thraustochytriales (considerados como hongos
inicialmente). Años más tarde, Fuller y colaboradores (1964) modificaron este
medio, algunos ajustes en las concentraciones de los componentes y el
reemplazo de la solución de vitaminas del grupo B por extracto de levadura y
lo denominaron “Medio Vishniac Modificado” o KMV (Rosa, 2010).
A partir del interés que los Thraustochytriales han adquirido como productores
de AG ω3, varios grupos de investigación se abocaron al aislamiento de cepas
de estos microorganismos y para ello implementaron sus propios medios de
cultivo y los más adoptados son GPY y H (Honda et al., 1998).
13
La fuente de carbono más utilizada en los medios de cultivo para
thraustochitridos es la glucosa, aunque estos microorganismos pueden utilizar
un amplio rango de fuentes de carbono (C) así como de nitrógeno (N) para su
crecimiento (Goldstein, 1963). En los últimos años se han evaluado diferentes
fuentes de C y N para la producción de AG ω3. Entre las principales fuentes
de C utilizadas tenemos a la glucosa, maltosa, glicerol crudo, residuos de
cerveza, etc. Por otro lado, entre las fuentes de N, tenemos a la peptona,
triptona, extracto de levadura, extracto de malta, etc. (Gupta et al., 2012).
Antibióticos tales como penicilina y estreptomicina (Burja et al., 2006;
Quilodrán et al., 2010), y rifampicina y antifúngico tales como nistatina
(Jakobsen et al., 2007; Wilkens y Maas, 2012) y anfotericina B (Taoka et al.,
2010) han sido usados en medios sólidos y líquidos para minimizar el
crecimiento de bacterias y hongos (Gupta et al., 2012).
14
II.3 Técnicas de identificación de Thraustochitridos
Técnicas bioquímicas y moleculares han sido usadas recientemente para identificar
nuevos aislados de microorganismos marinos (Gupta et al., 2012). Procedimientos
de tinción usando fluorocromos para detección directa basada en características
morfológicas de los microorganismos han sido empleados (Raghukumar y
Schaumann, 1993). Identificación a nivel de especie está basada en el
secuenciamiento del gen 18S rRNA y a su vez estas secuencias obtenidas son
alineadas con secuencias de thraustochitridos disponibles para establecer la
relación evolutiva entre los aislados y las cepas reportadas en la base de datos
llevando a la identificación de los aislados.
II.3.1 Identificación bioquímica
Si bien la caracterización morfológica es la primera etapa en la búsqueda de
nuevas cepas con estos microorganismos, debido a la plasticidad morfológica
del género causada sobre todo por las condiciones de cultivo, incluso entre
individuos de un mismo cultivo (Kazama, 1974; Bongiorni et al., 2005), esta
caracterización generalmente no es suficiente (Mo et al., 2002). Por ello, una
técnica rápida de detección directa del microorganismo utiliza microscopía de
epifluorescencia y acriflavina, que involucra la reacción entre el fluorocromo
(acriflavina), la pared celular sulfatada y su núcleo (Raghukumar y
Schaumann, 1993). La pared celular fluoresce de color rojo y el núcleo azul-
verde (Naganuma et al., 1998), diferenciándose de otros protistas que sólo
fluorescen verde.
15
II.3.2 Identificación molecular
Por otro lado, la caracterización molecular, utilizada para explicar relaciones
evolutivas y taxonómicas de estos microorganismos, es una técnica que
puede ayudar en la identificación y clasificación de nuevas cepas. El gen que
codifica la subunidad menor ribosomal RNA (18S rRNA) es el estándar
utilizado para este propósito. En la búsqueda de cepas productoras de ácidos
grasos poliinsaturados como el DHA, el perfil de ácidos grasos es la
característica más importante y se ha comprobado que este perfil permite
agrupar a estos microorganismos con una aproximación muy cercana a la que
se obtiene en términos de su secuencia 18S rRNA (Huang et al., 2003).
16
II.4 Thraustochitridos: fuente alternativa de AGPIs
II.4.1 Definición e importancia de los AGPIs
Los ácidos grasos (AG), constituyentes de los triacilgliceroles (TAG), son
necesarios para todos los seres vivos, pues son fundamentales para su
crecimiento, desarrollo y reproducción. Éstos pueden ser saturados, cuando
los átomos de carbono se unen a través de enlaces simples, e insaturados, si
existen uno o más dobles enlaces, denominándose estos últimos AG
poliinsaturados (AGPI). Estos AGPIs contienen sus enlaces dobles en una
cadena de ácido graso de 18 o más átomos de carbono siendo dos de ellos
esenciales en la nutrición de animales y del ser humano, el ácido linoleico
(C18:2 ω6, LA) y ácido α-linolénico (C18:3 ω3, ALA). Estos ácidos son
precursores de la síntesis de otros AG de cadena larga y sólo son sintetizados
por vegetales; de ellos derivan las familias omega 3 (ω3) y omega 6 (ω6)
(Figura 1) (Mataix y Sánchez de Medina, 2002).
Estos AGPIs son constituyentes importantes de las membranas celulares y
forman parte de los sistemas de señales celulares y su deficiencia puede
asociarse a defectos en la función celular y eventualmente puede conducir a la
muerte. Durante la década de 1980 y principios de 1990, se hizo evidente su
creciente interés tanto en el desarrollo de recién nacidos como en la
prevención y tratamiento de una variedad de enfermedades como la
arteriosclerosis, artritis, algunos tipos de cáncer y por disminuir la incidencia
de enfermedades coronarias y cardiovasculares en general (Masson et al.,
2007; Russo, 2009). En particular los AGPIs de cadena larga de la serie ω3
17
(Figura 1) se encuentran casi de manera única en los peces y mariscos, así el
ácido eicosapentanoico (C20:5, EPA) y el ácido docosahexaenoico (22:6,
DHA), han sido objeto de diversas investigaciones debido a sus efectos
beneficiosos. Dada nuestra limitada capacidad de transformar el ALA en EPA
y casi nada de DHA lo que origina un dilema, el cuerpo necesita el DHA para
la estructura y funcionamiento del cerebro y de la retina del ojo, se estableció
entonces que era “fisiológicamente esencial” tanto en el desarrollo cerebral y
visual en infantes, así como por sus efectos positivos reportados en adultos. Y
el EPA es importante para tener vasos sanguíneos saludables, para la salud
del corazón y funcionamiento del cerebro. Además, tiene también propiedades
antiinflamatorias y anticoagulantes.
Por otro lado, los ácidos grasos ω6 también son esenciales, pero tienden a
consumirse en exceso en las dietas modernas occidentales y se estima que la
relación ω6/ω3 en la dieta de estas poblaciones se encuentra en el rango de
11:1 a 20:1. Esta relación es significativamente diferente de los valores
recomendados 1:1 a 4:1 correspondientes a la proporción encontrada en la
leche materna (Saglik y Imre, 2001; Mataix, 2002; Hinzpeter, 2008); por lo
que, una proporción alta ω6/ω3 ha sido implicada en incidencia de
enfermedades cardiovasculares (Lee y Lip, 2003), cáncer (Roynette et al.,
2004), diabetes (Seo et al., 2005), enfermedades inflamatorias (Nagel et al.,
2003), y desórdenes neuropsiquiátricos (Reddy y Yao, 2003).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha recomendado adicionar DHA
en las fórmulas de leche materna para asegurar el desarrollo del cerebro y la
visión en los infantes en el año 1975; en el año 1995 y 1996 un panel de
18
expertos en EEUU concluyó que los suplementos con ARA (de Mortierella
alpina) y DHA (de Crypthecodinium cohnii) podían ser considerados como
GRAS (Generally recognized as safe) para el uso de infantes y adultos (Ward
y Singh, 2005).
Figura 1. Formación de los ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs) de cadena
larga a partir de los ácidos insaturados de 18 carbonos (Mataix y Sánchez de
Medina, 2002)
19
II.4.2 Fuentes convencionales de AGPIs
En el mundo vegetal, las semillas de la chía o salvia hispánica poseen la
concentración más alta de ω3 conocida hasta ahora (58-65% ALA). Otras
alternativas son las semillas de lino, los cañamones, las nueces y la sacha
inchi, una variedad de maní de origen amazónico que se encuentra
principalmente en el Perú (48% ω3), pero tanto EPA como DHA no están
presentes en los vegetales superiores. Así, los AGPI ω6 como el LA se
encuentran en semillas de cártamo, girasol, poroto de soja, maíz y ajonjolí; el
ácido araquidónico (ARA) se encuentra en carnes animales, huevos y leche.
Figura 2. Salvia hispánica (izquierda). Sacha inchi (derecha arriba) y cañamones

(derecha abajo)
Obtenido de http://amicomario.blogspot.com/2012/09/la-salvia-hispanica-comunemente-
nota.html, http://proyectosachainchi.galeon.com/, http://www.vitonica.com/alimentos-
funcionales/semillas-de-canamo-beneficios-para-el-organismo, respectivamente.
Por otro lado, la fuente convencional de AGPIs ω3 es principalmente el aceite
proveniente de peces de agua fría como el bacalao, salmón, sardina, caballa,
lacha, anchoa, atún, etc. (Medina et al., 1998).
20
Notablemente, los peces como los seres humanos, no somos capaces de
sintetizar AGPI de novo. Así, estos organismos marinos lo obtienen de
vegetales inferiores que integran el fitoplancton así como de bacterias
autotróficas marinas y protozoos componentes del zooplancton (Iwamoto y
Sato, 1986), constituyendo el fitoplancton la mayor fuente alimentaria de los
herbívoros filtradores marinos y el principal portador de los precursores: LA y
ALA. De esta manera, los peces pueden concentrar tanto EPA como DHA en
su tejido adiposo, grasa muscular, vísceras y gónadas en forma de TAG. La
composición y cantidad de AGPI ω3 en los aceites de pescado dependerá de
la especie, de la época del año y lugar geográfico donde se capture
(Hinzpeter, 2008).
Debido a que el aceite de pescado puede proveer una mezcla de AGPIs, esta
mezcla compleja de AG varía tanto en longitudes de cadena como grado de
insaturación, lo cual requiere de unos extensos y costosos pasos de refinación
y purificación para producir un producto nutraceútico o farmacéutico
conveniente (Belarbi et al., 2000). Por otro lado, las poblaciones de peces
marinos están sujetas a variaciones estacionales y climáticas (Gill y Valivety,
1997), sobrepesca, etc., que conllevan a una disminución de sus poblaciones
(Caddy y Garibaldi, 2000) y, como tal, no pueden proporcionar un suministro
constante ante la creciente demanda del mercado. Es sabido que en los
últimos años se ha dado bastante énfasis en el consumo de estas fuentes de
AGPIs ω3 (por los beneficios que aportan en su consumo), pero en un futuro
se estima que será insuficiente satisfacer esta creciente demanda mundial
conllevando a buscar nuevas fuentes alternativas de estos AGPIs.
21
II.4.3 Fuentes alternativas de AGPIs ω3
En los últimos años se ha intensificado la búsqueda de diferentes recursos
con alto contenido de AG ω3. Se ha indicado que la principal fuente se
encuentra en peces y mariscos. Sin embargo, éstos no son capaces de
sintetizar de novo, y los adquieren a través del alimento proveniente de la
cadena trófica (Hinzpeter, 2008). Microorganismos marinos tales como algas,
hongos, bacterias y ciertas especies de thraustochitridos pueden acumular
aceites bajo condiciones particulares de cultivo. Estos aceites microbianos
(SCO: Single Cell Oil) son definidos como aceites comestibles obtenidos de
microorganismos que pueden ser similares en tipo y composición a los
obtenidos de plantas y animales (Ratledge, 2005). En comparación con el uso
de aceites vegetales, los aceites microbianos ofrecen muchas ventajas: los
microorganismos tienen un ciclo de vida corto, pueden ser fácilmente
manipulados en comparación con las plantas; se ven menos afectados por
localización, temporada, y el clima como sucede en las plantas, y la
producción de aceites está sujeto a gran escala (Hong et al., 2011).
Figura 3. Algunas fuentes alternativas de AGPI ω3. Thraustochitridos

(Izquierda). Bacterias (Centro). Microalgas (Derecha)
Obtenido de: http://www.csiro.au/Organisation-Structure/National-Facilities/Australian

National-Algae-Culture-Collection/Bioapplications-of-algae.aspx,
http://www.afinidadelectrica.com.ar/articulo.php?IdArticulo=136 y http://wood-pellet-
ireland.blogspot.com/2011/07/algae-pre-historic-and-furure-oil.html, respectivamente.
22
Actualmente estos SCO son ampliamente aceptados en el mercado y su
producción se está expandiendo y diversificando cada día. Los esfuerzos
realizados en los últimos años se han dirigido hacia el desarrollo de
tecnologías como el avance de la biología molecular y las técnicas de ADN
recombinante que ayudan al desarrollo y optimización de estos procesos de
producción a nivel comercial (Hinzpeter, 2008).
Entre los microorganismos capaces de producir aceites microbianos
encontramos a las bacterias, donde algunas especies (Shewanella, Colwelia y
Moritella) tienen la capacidad de producir solamente un AG, a diferencia de la
compleja mezcla producida por microalgas o acumulada en los peces (Rusell
y Nichols, 1999). La desventaja radica en sus concentraciones lipídicas bajas
(Nichols y McMeekin, 2002), su contenido inusual de otros lípidos y que
requieren condiciones de cultivo dificultosas, por lo que, no son consideradas
como sistemas adecuados con fines productivos (Ratledge y Wynn, 2001).
Entre los hongos, el género Mortierella destaca por ser una promisoria fuente
de aceites microbianos rica en varios tipos de AGPIs C20, pero su producción
es 1 ó 2 veces menor a la producción obtenida por algas.
Otra fuente alternativa son las microalgas, microorganismos diversos que
incluyen al fitoplancton. Ellas constituyen un reservorio de compuestos
bioactivos (AG, pigmentos y vitaminas). En la producción de AG destacan los
géneros Porphyridium, Nannochloropsis, Phaeodactylum, y el dinoflagelado
marino Cryptocodinium cohnii, cuyos aceites resultantes están libres del olor y
sabor característico del aceite de pescado. Sin embargo, el principal obstáculo
23
para la producción comercial de algas se debe a que la mayor parte de ellas
son fotoautótrofas obligadas y además no acumulan los AGPIs como
triacilgliceroles relacionados principalmente por la limitación de luz y la
acumulación de oxígeno (Barbosa, 2003). Y la alternativa a los
fotobioreactores es utilizar algas con capacidad de crecer heterotróficamente
en fermentadores convencionales.
A diferencia de éstos, los cultivos heterotróficos de thraustochitridos presentan
altas concentraciones de AGPI ω3, especialmente DHA y, varias cepas son
capaces de producir un único AGPI, lo que ha despertado recientemente un
particular interés biotecnológico por su importancia en la salud humana y en la
acuicultura (Lewis et al., 1999), y además considerados como potenciales
candidatos para muchas otras aplicaciones por producir ciertos metabolitos
secundarios (Fan y Chen, 2007). Diversos estudios han demostrado la
capacidad de algunas cepas de thraustochitridos, principalmente los géneros
Schizochytrium y Thraustochytrium, por producir gran cantidad de biomasa y
lípidos con alta proporción de AGPI (Bowles et al., 1999). En general, estos
microorganismos son capaces de acumular más del 50% de su peso seco
como lípidos, del cual más del 25% es normalmente DHA, almacenándose en
las paredes y membranas celulares como material de reserva en forma de
TAG (Nichols y McMeekin, 2002).
Actualmente los microorganismos marinos heterótrofos que son utilizados en
procesos comerciales para la producción de AGPIs ω3, particularmente DHA,
son el dinoflagelado marino Crypthecodinium cohnii y los géneros de
traustochitridos, Thraustochytrium y Schizochytrium (Ward y Singh, 2005).
24
III. HIPOTESIS Y OBJETIVOS
III.1 Hipótesis:
Los microorganismos eucariontes pertenecientes al Orden Thraustochytriales se
encuentran en diversos ambientes esturiales y salinos por lo que es posible
encontrar cepas de estos microorganismos productores de ácidos grasos
poliinsaturados (AGPIs) en los manglares de Tumbes.
III.2 Objetivos:
General:
 Caracterizar molecularmente microorganismos del orden Thraustochytriales
obtenidos de los manglares de Tumbes con capacidad de crecimiento
heterotrófico en cultivo.
Específicos:
 Aislar cepas de thraustochitridos a partir de muestras colectadas en los
manglares de Tumbes.
 Corroborar su capacidad de producción de ácidos grasos poliinsaturados
mediante la detección de cuerpos lipídicos en su citoplasma.
 Caracterizar molecularmente las cepas de thraustochitridos para el
reconocimiento de género y/o especie.
25
IV. MATERIAL Y MÉTODOS
La presente tesis estuvo subvencionada por un proyecto FIDECOM, el cual se
desarrolló en las instalaciones del centro de Investigación BIOTEC C.M.C –
MARINAZUL S.A. del Grupo D&C, en la ciudad de Tumbes. Estos proyectos
involucran la asociación Empresa-Universidad, y es así que esta tesis, uno de los
componentes del proyecto de BIOTEC, fue supervisada por el Dr. Luis Destefano de la
UPCH, quien para la UNMSM representa mi asesor externo.
IV.1 Área de estudio y colecta
Las muestras de agua y hojas senescentes de mangle fueron tomadas en
recipientes plásticos estériles de 100mL (Figura 4), utilizando uno por punto
muestreado en los Manglares de Tumbes (Figuras 5, 6 y 7). En cada uno de los
puntos se midieron los valores de salinidad, temperatura y pH. Las salinidades se
estimaron con un refractómetro RHS-10 (Huake Instrument Co., China), el cual
detectó valores de 10 a 33‰ (Tabla 1).
Figura 4. Muestras de agua y hojas senescentes de mangle tomadas en recipientes

plásticos
26
Figura 5. Mapa de ubicación de los principales Humedales del Perú, destacando
ubicación de los Manglares de Tumbes
27
Figura 6. Puntos de muestreo en los manglares de Tumbes representado por color
el día de muestreo (ver Tabla 1)
Figura 7. Escenarios de algunos puntos de muestreo
28
Tabla 1. Descripción de los sitios y fechas en que se obtuvieron las muestras
Recolección Fecha Datos del sitio N° cepas

obtenidas
Zona Coordenadas Temperatura Salinidad pH
Estación 1-Puerto
1 13/06/2012 25/ Final del - 27 27 8 5
camino
Latitud 3°27´15.55´´S
Estación 2-Puerto
Longitud
2 13/06/2012 25/ Camino 27 26 7.5 11
80°16´17.72´Ó
intermedio Altitud 30 pies
Estación 3-Puerto
3 13/06/2012 - 26.9 26 7.5 11
25
Latitud 3°27´05.07´´S
Estación 1- Longitud
4 13/06/2012 27.5 27 7.5 11
Algarrobo 80°16´30.45´Ó Altitud
33 pies
Latitud 3°27´23.23´´S
Estación 4-
Longitud
5 13/06/2012 Campamento 80°16´14.57´Ó
27.4 24 7.5 6
Puerto 25 Altitud 56 pies
Latitud 3°27´20.22´´S
Estación 2-Campo Longitud
6 13/06/2012 27.5 26 7.5 8
Paracas/Algarrobo 80°16´51.42´Ó
Altitud 56 pies
Estación 1-Estación
7 13/06/2012 - 28 24 8 6
de bombeoParacas
Latitud 3°25´54.83´´S
Estación 1-El Longitud
8 13/06/2012 80°19´20.88´´0
27.3 30 7.5 10
Bendito/playa
Altitud 62 pies
Latitud 3°27´02.71´´S
9 13/06/2012 26.1 30 8 10
Bendito/pueblo 80°19´03.09´Ó
Altitud 43 pies
Latitud 3°28´13.62´´S
Estación 3-Entrada Longitud
10 13/06/2012
al SERNANP 80°17´53.30´Ó 28 25 8 7
Altitud 53 pies
Latitud 3°29´43.37´´S
Longitud
11 14/06/2012 Estación 1-Jeli 80°22´30.96´Ó
26.5 30 7.5 7
Altitud 20 pies
Estación 2-
12 14/06/2012 Langostinera - 26.4 30 7.5 7
Slava/Jeli
Latitud 3°30´4´´S
Estación 3-Camino
13 14/06/2012
a Jeli
Longitud 80°22´27´´W 25.5 30 7 15
Altitud 30 pies
Latitud 3°30´10.22´´S
Estación 1-Puerto Longitud
14 14/06/2012
Pizarro/La Ramada 80°23´50.64´Ó 25.4 28 7.5 9
Altitud -13 pies
Latitud 3°30´14.03´´S
Estación 2-Puerto Longitud
15 14/06/2012
80°23´49.77´Ó
25.7 28 7 10
Pizarro/La Ramada
Altitud - 13 pies
29
Continuación de la Tabla 1…
Recolección Fecha Datos del sitio N° cepas

Zona Coordenadas Temperatura Salinidad pH obtenidas
Latitud 3°29´47.50´´S
16 14/06/2012
80°22´57.32´Ó
25.6 29 7 7
Pizarro/Jeli
Altitud 23 pies
Estación 3-La
17 14/06/2012 - 26.4 28 7 10
Ramada
Latitud 3°30´57.30´´S
18 14/06/2012
Mocho 80°25´34.84´Ó 26.5 28 7.5 7
Altitud 108 pies
Latitud 3°30´47.94´´S
19 14/06/2012
80°25´37.18´Ó 26.4 26 7 10
Mocho
Altitud 39 pies
Estación 4- Latitud 3°31´26.90´´S
Langostinera Longitud
20 14/06/2012
80°25´56.64´Ó Altitud 27.8 28 8 6
Camarones-La
Ramada 52 pies
Latitud 3°30´19.48´´S
Langostinera Las Longitud
21 14/06/2012
Palmeras 80°26´20.44´Ó 27.6 12.5 7.5 9
Altitud 20 pies
Langostinera Las
22 14/06/2012
Palmeras (2)
- 25.9 17 7.5 8
Estación 5-estación Latitud 3°30´56.40´´S
de bombeo Longitud
23 05/07/2012 Langostinera Mar 80°30´20.91´Ó 26.2 32 7 8
Norte Altitud 56 pies
Latitud 3°31´29.96´´S
Estación 4- cerca de Longitud
24 05/07/2012 boca de playa 80°30´27.36´Ó 25.8 33 7.5 8
Altitud 252 pies
Latitud 3°30´39.79´´S
25 05/07/2012 80°30´01.15´Ó 25.9 32 7.5 14
Embarque Rodas
Altitud 417 pies
Latitud 3°30´23.56´´S
Estación 2-Dren Longitud
26 05/07/2012 Canela 80°29´48.98´Ó 26.2 30 7 15
Altitud 226 pies
Latitud 3°31´37.96´´S
Estación 3-Estación Longitud
27 05/07/2012 80°30´30.98´Ó 26 32 8 9
de bombeo Rodas
Altitud 227 pies
Latitud 3°34´37.62´´S
Estación 1-Estero La Longitud
28 05/07/2012 Chepa (1) 80°31´57.96´Ó 25.8 30 7 8
Altitud 59 pies
Latitud 3°34´38.88´´S
Estación 2-Estero La Longitud
29 05/07/2012 Chepa (2) 80°31´56.21´Ó 26.2 30 7 9
Altitud 176 pies
Latitud 3°34´23.79´´S
Estación 3-Dren Longitud
30 05/07/2012 Piojo 80°31´49.65´Ó 28.6 10 7 7
Altitud 46 pies
N° total de aislados 268
30
IV.2 Aislamiento, medios de cultivo y mantenimiento de Thraustochitridos
A continuación se describe las dos metodologías empleadas en los aislamientos de
estos microorganismos:
IV.2.1 Metodología de la hoja senescente
El mismo día del muestreo, el material colectado se dispuso en placas Petri
empleando la metodología propuesta por Watson y Ordal (1957).
El procedimiento inicial consistió en el lavado previo de las hojas con agua de
mar con antibiótico (0.001g/mL) (Figura 8 y 9) y su posterior sembrado en
placas con medio agarizado (Figura 10). Agua de mar (AM) y agua de mar
artificial o agua preparada (AP) al 15% y 70% (Tabla 2) fueron utilizadas en la
elaboración del medio agarizado o sólido [extracto de levadura 1g L -1, peptona
1 g L-1, y agar 13 g L-1], suplementado con estreptomicina y ampicilina (30 mg
L-1 de cada uno) para eliminar la flora bacteriana (Tabla 3).
Figura 8.
Material utilizado en el
lavado previo de las
hojas de mangle
31
Figura 9.
Lavado con antibiótico, previo a
la siembra de las hojas
senescentes de mangle
Tabla 2. Composición del agua de mar artificial o agua preparada (AP)
Composición del agua

Componentes
de mar artificial (g/L)
Carbonato de sodio 0.2
sulfato de magnesio 6.78
cloruro de magnesio 5.38
cloruro de potasio 0.72
cloruro de sodio 27.5
cloruro de calcio 1.4
Tabla 3. Composición de los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de

Thraustochitridos
Composición del medio (g/L)

Componentes
Agar Caldo YPG
Extracto de
1 2
levadura
Agua peptona 1 2
Agar 13 -
Glucosa - 10
Estreptomicina 0.3 0.15
Ampicilina 0.3 0.15
32
Figura 10.
Siembra de las
hojas de mangle
(Metodología de la
hoja senescente)
Cada una de las muestras colectadas de los diferentes puntos de muestreo se
sembraron en 4 medios sólidos diferentes: AM15%, AM70%, AP15% y
AP70%, para evaluar el crecimiento de los thraustochitridos. Las primeras
colonias individuales de thraustochitridos obtenidas fueron transferidas
sucesivamente a los mismos medios iniciales (AM15%, AM70%, AP15% y
AP70%) hasta obtener cultivos puros, libres de microorganismos
contaminantes como hongos, bacterias y levaduras.
33
IV.2.2 Metodología por cebado
Por otro lado, no solo se utilizó la metodología de la hoja senescente. Se
colocó aproximadamente 7 mL de muestra de agua, colectada en cada uno de
los diferentes puntos de muestreo, en placas Petri con granos de polen floral
como cebos (Figura 11). Una vez que los cebos fueron colonizados, se
transfirieron a medio agarizado suplementado con antibióticos en la
concentración indicada anteriormente (30 mg L-1 de cada uno). Los cebos con
thraustochitridos sembrados en el medio agarizado, desarrollaron nuevas
colonias que luego fueron transferidas sucesivamente hasta obtener cultivos
puros (Porter, 1990).
Figura 11.
Metodología por cebado
con granos de polen floral
34
Para ambas metodologías, en las muestras donde se observó, por microscopía
óptica, más de un tipo morfológico de thraustochitrido sobre el medio sólido, se
realizaron varios aislamientos para una misma muestra, cuando se reconocieron
distintos tipos de colonias que pudieran diferir en alguno de sus rasgos. Una vez
purificada la muestra, los traustochitridos fueron sembrados en medio líquido
[extracto de levadura 2g L-1, peptona 2 g L-1, y glucosa 10 g L-1] preparado en agua
de mar y/o agua preparada suplementado con antibióticos, para observar por
microscopio invertido las distintas morfologías que puedan desarrollar, y así poder
tener un criterio más de evaluación.
Finalmente, estos microorganismos fueron mantenidos en medio sólido [extracto
de levadura 1g L-1, peptona 1 g L-1, y agar 13 g L-1] preparado en agua preparada
suplementado con antibióticos. La incubación se realizó a temperatura ambiente
de Tumbes (aproximado 25° C). Subcultivos fueron realizados cada 1 ó 2 meses.
IV.3 Identificación bioquímica: Tinción fluorescente
La identificación directa de los thraustrochitridos se llevó a cabo por tinción con
acriflavina mientras que la detección de cuerpos lipídicos en su citoplasma fue por
tinción con rojo nilo. Para la tinción con los fluorocromos (acriflavina o rojo nilo), el
procedimiento es el mismo: en un microtubo, se adicionó 300ul de cultivo puro y
acriflavina o rojo nilo al 1% por un lapso de 20min a temperatura ambiente,
seguidamente pasos de centrifugación y lavado son llevados a cabo, la muestra se
resuspendió finalmente en 100ul de medio de cultivo para ser montada en lámina y
su posterior observación al microscopio confocal de barrido láser (Olympus
FLUOVIEW FV1000).
35
IV.4 Identificación molecular: Caracterización del gen 18S rRNA
IV.4.1 Extracción de ADN genómico
Los microorganismos crecieron en medio líquido [extracto de levadura 2g L-1,
peptona 2 g L-1, y glucosa 10 g L-1] preparado en agua preparada (AP). Las
suspensiones celulares fueron centrifugadas a 13000 rpm (tubos 1.5ml) por 10
min a 4°C. El pellet celular lavado y pesado se resuspendió con buffer de lisis
(Tris-HCl 20mM, pH 8; EDTA 10mM; SDS 0.5%; NaCl 50mM) (1ml de buffer
de extracción por 100mg de pellet húmedo) y con 100ug mL-1 de proteinasa K
por 45 minutos a 50°C. Luego de esto, el ADN fue extraído inicialmente con
fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). La fase acuosa se extrajo dos
veces con un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). El ADN
genómico fue precipitado de la fase acuosa con etanol 100% y acetato de
sodio 3M, posteriormente lavado con etanol 70%, secado y resuspendido en
40ul de buffer Tris-EDTA. Finalmente, 100 ug mL-1 de RNAasa A fue añadido
a cada microtubo e incubados a 37°C por un tiempo adicional de 15 min.
Posteriormente conservado a -20°C (Figura 12).
IV.4.2 PCR y secuenciamiento del gen 18S rRNA
Para amplificar una región del gen 18S rRNA se utilizaron los primers JVF (5´-
TTGATCCTGCCAGTAGTCATAT-3´) y JVR (5´-CAAACCTTGTTACGACTTCA
-3´) (Quilodrán et al., 2010). La PCR se llevó a cabo en un volumen de 50ul
usando Master Mix 2X (FERMENTAS), los primers JVF/JVR y ADN de
thraustochitrido. Un volumen de 1ul de ADN de thraustochitrido fue añadido a
49ul de reacción de PCR el cual contiene principalmente 0.2mM
36
deoxinucleosidotrifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 0.025U/ul Taq
polimerasa, 2.5mM MgCl2 y 0.4uM de primer JVF y JVR, respectivamente.
Para la amplificación (Termociclador Veriti 96-Applied Biosystems®) se utilizó
el siguiente programa: denaturación a 95ºC por 5 min, 33 ciclos de
amplificación (45 seg a 95ºC, 45 seg a 62ºC y 90 seg a 72ºC) con una etapa
de elongación final de 7 min a 72ºC. Los productos de PCR fueron migrados
mediante una electroforesis de gel de agarosa al 1.5% y visualizados
(Transiluminador UV-Cleaver Scientific Ltda®). Finalmente, los productos de
PCR fueron enviados a secuenciar en ambos sentidos con el servicio de
secuenciación de Macrogen-USA con los cebadores JVF, JVR y otros primers
que corresponden a regiones internas de la cadena molde (Mo et al., 2002)
(Tabla 4).
Figura 12. Extracción de ADN genómico de los aislados seleccionados (A)

Lavado y lisis de cultivo (B) Purificación (C) y Precipitación del ADN
37
Tabla 4. Primers externos e internos utilizados para obtener la secuencia
del gen 18S rRNA
PRIMERS EXTERNOS AUTOR

JVF 5´-TTGATCCTGCCAGTAGTCATAT-3´ Quilodrán et al. , 2010
JVR 5´-CAAACCTTGTTACGACTTCA- 3´ Quilodrán et al. , 2010
PRIMERS INTERNOS AUTOR
FA1 5´-AAAGATTAAGCCATGCATGT-3´ Mo et al ., 2002
RA1 5´-AGCTTTTTAACTGCAACAAC-3´ Mo et al ., 2002
F 5´-GGGAGCCTGAGAGACGGC-3´ Mo et al ., 2002
R 5´-GGCCATGCACCACCACCC-3´ Mo et al ., 2002
FA3 5´-CTTAAAGGAATTGACGGAAG-3´ Mo et al ., 2002
RA3 5´-CAATCGGTAGGTGCGACGGGCGG-3´ Mo et al ., 2002
IV.4.3 Edición y obtención de la secuencia consenso
Las secuencias obtenidas por los primers internos (FA1/RA1, F/R y FA3/RA3)
y externos (JVF/JVR) fueron ensambladas con el programa SequencherTM
versión 4.1.4. (Gene Codes Corporation, USA) generándose así la secuencia
consenso. Además, con este programa se logró visualizar los archivos de
cromatograma (extensión .ab1) por lo que permitió la edición de la secuencia
consenso de cada aislado.
IV.4.4 Alineamiento múltiple
Secuencias del gen 18S rRNA de cepas de traustochitridos reportados,
labirintúlidos y de los outgroup fueron obtenidas del GenBank (Tabla 5) y
añadidas al grupo de secuencias de los aislados para su posterior
alineamiento múltiple en ClustalX2.1 (Larkin et al., 2007).
38
Así, el primer paso para un análisis filogenético es el alineamiento de
secuencias de nucleótidos o de sus respectivos aminoácidos, de tal manera
que, ellos sean homólogos en cada posición. Sin embargo, no todo el
alineamiento de secuencias homólogas será útil para la reconstrucción
filogenética y es recomendable remover regiones muy divergentes y de
muchos gaps (Castresana, 2000). Basándose en ello, se identificaron en el
alineamiento múltiple cuatro regiones en las posiciones 186-195, 614-976,
1294-1303 y 1416-1440, las cuales fueron retiradas del alineamiento con el
programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
39
Tabla 5. Lista de las secuencias del gen 18S rRNA de especies relacionadas usadas en este
estudio como taxa de referencia para determinar el género de los aislados
Número de
Taxón Cepa Referencia
Accesión
Género Aurantiochytrium
Aurantiochytrium limacinum SL1101 JN986842.1 Nie, 2012 (inédito)
Jaritkhuan et al., 2006
Schizochytrium limacinum - DQ100294.1
(inédito)
Schizochytrium limacinum OUC101 HM042905.2 Li et al., 2010 (inédito)
Schizochytrium mangrovei RCC893 DQ367049.1 Tsui et al., 2009
Género Botryochytrium
Botryochytrium radiatum SEK
AB355410.1 Yokohama et al., 2007
353(RT0304)
Género Japonochytrium
Japonochytrium sp. ATCC 28207 AB022104.1 Honda et al., 1999
Género Parietichytrium
Parietichytrium sp. BAFCcult 3109 HQ228977.1 Rosa et al., 2010
Parietichytrium sarkarianum - AB355411.1 Yokohama et al., 2007
Género Sicyiodochytrium
Sicyoidochytrium minutum - AB355412.1 Yokohama et al., 2007
Género Schizochytrium
Schizochytrium aggregatum - AB022106.1 Honda et al., 1999
Género Oblongichytrium
Oblongichytrium minutum
(basónimo Schizochytrium - AB022108.1 Honda et al., 1999
minutum)
Oblongichytrium
multirudimentale (basónimo
- AB022111.1 Honda et al., 1999
Thraustochytrium
multirudimentale)
40
… Continuación de la Tabla 5
Género Thraustochytrium
Thraustochytrium KMPB N-BA-
AB022109 Honda et al., 1999
aggregatum 110
Thraustochytrium aureum Shene et al., 2010
- GU933120.1
(inédito)
Thraustochytrium kinnei Cavalier-Smith et al.,
KMPB 1694d L34668.1
1994
Thraustochytrium KMPB N-BA-
AB022113.1 Honda et al., 1999
pachydermum 114
Thraustochytrium striatum ATCC 24473 AB022112.1 Honda et al., 1999
Género Ulkenia
Ulkenia profunda - AB022114.1 Honda et al., 1999
Ulkenia visurgensis - AB022116.1 Honda et al., 1999
Ulkenia radiata
- AB022115.1 Honda et al., 1999
(Botryochytrium radiatum)
Otras cepas
Aplanochytrium kerguelense - AB022103.1 Honda et al., 1999
Labyrinthula sp. AN-1565 AB022105.1 Honda et al., 1999
Outgroups
Cafeteria roenbergensis - L27633.1 Leipe et al., 1994
Prorocentrum micans - M14649.1 Maroteaux et al., 1985
41
IV.4.5 Caracterización de las secuencias
Finalmente las secuencias resultantes fueron usadas para hacer la
identificación genética de los microorganismos aislados, comparándolas con
secuencias de microorganismos disponibles en la base de datos del banco de
genes (GenBank database) (Nacional Center for Biotechnology Information,
USA: NCBI Home page http://www.ncbi). Y la búsqueda de secuencias
homólogas más cercanas fue realizada utilizando el programa BLAST
(Altschul et al., 1990) disponible en NCBI web servidor.
El análisis de sitios conservados, variables e informativos fue realizado en
MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
IV.4.6 Divergencia de las secuencias 18S rRNA
Los alelos fueron encontrados usando el programa DNAsp (Librado y Rozas,
2009). La distancia genética entre los aislados y secuencias de géneros
reportados de thraustochitridos fue calculada con el programa MEGA 6
utilizando el modelo Kimura 2-parámetros (Kimura, 1980).
42
IV.4.7 Análisis filogenético molecular
En la identificación genética de los microorganismos aislados, un análisis
adicional al BLAST es la construcción de un árbol filogenético, el cual resulta
adecuado en la determinación del género y/o especie de los aislados.
Los análisis filogenéticos de los alelos encontrados con secuencias de
microorganismos representantes de thraustochitridos, labirintúlidos y
outgroups (Prorocentrum micans y Cafeteria roenbergensis) se realizaron con
varios métodos.
El análisis de máxima parsimonia (MP) y máxima verosimilitud (ML) se
llevaron a cabo con el programa PAUP v4.0b (Swofford, 1998). Para este
último análisis previamente se requiere la información del modelo de
sustitución nucleotídica que mejor se adapte a las secuencias, lo que fue
proporcionado por el programa jModelTest (Darriba et al., 2002), el cual
selecciona el modelo adecuado según el criterio de información de Akaike
(AIC) (Posada y Buckley, 2004).
La información proporcionada por jModelTest fue utilizada para el análisis de
máxima verosimilitud (ML) por PAUP. Para los análisis de MP y ML, el soporte
de los nodos se calculará a partir de 1000 submuestras mediante el test de
bootstrap (Felsenstein, 1985).
43
El análisis de inferencia bayesiana (IB) se realizó utilizando el programa Mr.
Bayes (Huelsenbeck y Ronquist, 2001) con los parámetros propuestos por el
programa jModeltest. En el análisis se asegura conseguir al menos mil
muestras de la distribución de probabilidad posterior. Además, se considera
una desviación estándar por debajo de 0.05, por lo que se agregó más
generaciones hasta que el valor cayó por debajo de 0.01.
Los árboles reultantes de estos análisis fueron visualizados Figtree v.1.0.4
(Rambaut, 2006-2012).
44
V. RESULTADOS
V.1 Aislamiento y mantenimiento de cepas de Thraustochitridos
V.1.1 Aislamiento y crecimiento
En el contorno de las hojas de mangle (Figura 13) y adheridos al grano de
polen crecieron los microorganismos de interés. El proceso de aislamiento
culminó hasta obtenerlas en cultivo puro, seleccionándolas en base a
características morfológicas observadas en placa como fueron la coloración
de la colonia, textura, tamaño, presencia de red ectoplasmática, etc. que
permitieron reducir el número de cepas redundantes por lo que se aislaron
entre 5 a 15 cepas para cada uno de los 30 puntos de muestreo (Tabla 1). Por
otro lado, los valores de temperatura fluctuaron entre 25. 4 y 28.6°C, los
valores de pH entre 7-8 y los valores de salinidad fluctuaron entre 10 y 33‰
(Tabla 1); en esto último, los valores más altos implican muestras de agua
provenientes de zonas aledañas al mar.
Figura 13. Thraustochitridos en el contorno de la hoja de mangle (400X)
45
(A)
(B)
(C)
Figura 14. (A) Crecimiento de los Thraustochitridos en medio sólido libres de

contaminación (B) Contaminación por bacterias (C) Contaminación por hongos.
Visualizados por microscopía óptica (400X)
46
La eliminación de la flora bacteriana y hongos fue bastante difícil, a pesar del uso
de antibióticos (Figura 14). Para el segundo caso, se probó utilizar Nistatina (10
mg L-1) como antifúngico demostrando erradicar problemas de contaminación
causado por este microorganismo (Gupta et al., 2012). Inicialmente se había
optado utilizar Fluconazol, pero inhibía el crecimiento de los thraustochitridos.
Los thraustochitridos crecieron tanto en medio al 15% como al 70%, observándose
un óptimo crecimiento en esta última concentración (Figura 15).
(A)
(B)
Figura 15. (A) Crecimiento de los Thraustochitridos en medio sólido y (B) medio
líquido visualizado por microscopio invertido (400X).
47
V.2 Identificación bioquímica con tinción con acriflavina y rojo de nilo
En esta etapa solo se pudo realizar la identificación bioquímica para los
primeros 50 aislados por un inconveniente técnico con el equipo. La tinción con
acriflavina, permitió confirmar la ocurrencia de thraustochitridos en los
manglares de Tumbes al fluorescer la pared celular de color rojo y su
contenido celular de color azul-verde (Figura 16). Por otro lado, se corroboró la
presencia de un ambiente rico en lípidos en el interior de estos
microorganismos, visualizándose una fuerte emisión de color amarillo-oro al
ser teñidos los aislados con rojo de nilo (Figura 17).
Figura 16. Thraustochitridos, protistas

teñidos con acriflavina (pared celular:
rojo; contenido celular: azul)
visualizado por microscopio confocal
(400X)
Figura 17. Thraustochitridos, protistas

teñidos con rojo de nilo (interior:
amarillo-oro), visualizado por
microscopio confocal (400X)
48
V.3 Caracterización molecular del gen 18S rRNA
V.3.1 Extracción de ADN, PCR y secuenciamiento del gen 18S rRNA
Con los aislados que presentaron las características morfológicas reportadas
para thraustochitridos se realizaron las extracciones de ADN basándose en la
metodología propuesta por Lippmeir y colaboradores (2009). La presencia y la
calidad del ADN extraído de las muestras se confirma tanto por migración en
gel de agarosa al 1% como por la capacidad de amplificación por PCR. El
ADN extraído está presente, intacto y es amplificable (Figura 18).
Figura 18. Migración en gel de agarosa 1% de las extracciones de ADN genómico
La amplificación con los primers JVF/JVR dio una banda ultravioleta en el
transiluminador mayor a 1000 pb y la aparición de una única banda por
muestra es prueba de la amplificación específica (Figura 19). Inicialmente, con
las primeras amplificaciones con estos primers había la presencia de smear,
por lo que se optó disminuir el número de ciclos, evaluar otras temperaturas
de annealing, concentración de ADN y cloruro de magnesio (MgCl2).
49
Figura 19. De izquierda a derecha. Carril 1: Marcador de tamaño molecular de
1000pb. Carril 2 a 16: Amplificación del gen 18S rRNA de los aislados
Thraustochitridos visualizados en gel de agarosa 1.5%
50
V.3.2 Ensamblaje y edición de secuencias
Alineamientos de las secuencias de cada juego de primer interno se realizaron
con el programa SequencherTM Versión 4.1.4 (Gene Codes Corporation, USA),
luego estos contigs generados por cada juego de primer se ensamblaron
nuevamente para generar la secuencia consenso cuyo tamaño aproximado
fue de 1700 pb (Figura 20) lo cual es compatible a lo observado en gel (Figura
19). En la figura 21 se esquematiza las posiciones de hibridacion de los
primers. La secuencia consenso obtenida fue editada teniendo la certeza de la
base a modificar y tomando como referencia los archivos de cromatograma.
En los casos donde había ambigüedad de base se optó colocar
degeneraciones.
Un caso particular sucedió solo en las secuencias que posteriormente
identificaríamos como del género Aurantiochytrium, donde se observó un ruido
constante en las posiciones 578 al 602 y 1360 al 1385 aproximadamente
(Figura 22).
Finalmente, las secuencias del gen 18S rRNA generadas para todos los 268
aislados fueron guardadas en un archivo de texto cuyo análisis ayudó en la
identificación y clasificación de los aislados.
51
52
Figura 20. Secuencia consenso obtenida por sobrelapamiento con el programa Sequencher
FA1/RA1
AAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAGCGATTGTACTGTGAGACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTAATAATTTCTTCGGTAGTTTCT
TTTATATGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAATAATACATGCTGTAAGAGCCCTGTATGGGGCTGCACTTATTAGATTGAAGCCGATTTTATTGGTGAAT
CATGATAATTGAGCAGATTGACTTTTTTAGTCGATGAATCGTTTGAGTTTCTGCCCCATCAGTTGTCGACGGTAGTGTATTGGACTACGGTGACTATAA
CGGGTGACGGAGAGTTAGGGCTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCATATCCAAGGATAGCAGCAGGCGCGTAAATTACC
CACTGTGGACTCCACGAGGTAGTGACGAGAAATATCGATGCGAAGCGTGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAGAGCAATGTAAAACCCTCATCGAGG
ATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAGAAGCATATGCTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCT
F/R
CTGTGGACTCCACGAGGTAGTGACGAGAAATATCGATGCGAAGCGTGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAGAGCAATGTAAAACCCTCATCGAGGAT
CAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAGAAGCATATGCTAAA GTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG
AATTTCTGGCATGGGCGACCGGTGCTTTCCCTGAATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTCTCATTTTTTTTTTGGGGAGAAATCTTTC
ACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCA
CGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGG
CATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTG
CGATTGTTGGGTGCTTTATTAAGGGCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAA CTT
AAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACT
FA3/RA3
TTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTAT GGGTGGTGGTGC
ATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACATAGT
GCGTTTTAACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTTCGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGC
GCGTTACACTGATGGGTTCATCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTGATCAAGAGTGCTTGGTCGGAAGGCCTGGCTAATCCTTGGAACGCTCATCGTGCTGGG
GCTAGATTTTTGCAATTATTAATCTCCAACGAGGAATTCCTAGTAAACGCAAGTCATCAGCTTGCATTGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACA CCGC
CCGTCGCACCTACCGATTG
SECUENCIA CONSENSO GENERADA PARA EL AISLADO 72

AAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAGCGATTGTACTGTGAGACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTAATAATTTCTTCGGTAGTTTCT
TTTATATGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAATAATACATGCTGTAAGAGCCCTGTATGGGGCTGCACTTATTAGATTGAAGCCGATTTTATTGGTGAAT
CATGATAATTGAGCAGATTGACTTTTTTAGTCGATGAATCGTTTGAGTTTCTGCCCCATCAGTTGTCGACGGTAGTGTATTGGACTACGGTGACTATAA
CGGGTGACGGAGAGTTAGGGCTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCATATCCAAGGATAGCAGCAGGCGCGTAAATTACC
CACTGTGGACTCCACGAGGTAGTGACGAGAAATATCGATGCGAAGCGTGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAGAGCAATGTAAAACCCTCATCGAGG
ATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAGAAGCATATGCTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGT
TGAATTTCTGGCATGGGCGACCGGTGCTTTCCCTGAATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTCTCATTTTTTTTTTGGGGAGAAATCTT
TCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTG
CACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAA
GGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACT
TGCGATTGTTGGGTGCTTTATTAAGGGCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAAC
TTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGG
TAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTAT GGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCG
TTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACATAGTGCGTTTTAACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAA
GTTCGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGTTACACTGATGGGTTCATCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTGATCAA
GAGTGCTTGGTCGGAAGGCCTGGCTAATCCTTGGAACGCTCATCGTGCTGGGGCTAGATTTTTGCAATTATTAATCTCCAACGAGGAATTCCTAGTAA
ACGCAAGTCATCAGCTTGCATTGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTG
Figura 21. Ubicación de los primers internos en la secuencia del aislado 72.
FA1 (en color amarillo, posición 37-56); RA1 (en color verde, posición 605-624);
F (en color celeste, posición 387-404); R (en color rojo, posición 1254-1271); FA3
(en color fucsia, posición 1125-1144) y RA3 (en color marrón, posición 1662-
1684)
53
Figura 22. Cromatograma mostrando la posición 1360 al 1385 aproximadamente del
aislado 72, donde se identificó uno de los ruidos característicos en aislados de
Aurantiochytrium sp. Nótese la región poliT.
V.3.3 Verificación de las secuencias 18S rRNA por BLAST
Los resultados de la búsqueda de secuencias homólogas con BLAST (Tabla
6), mostraron que la mayor parte de los aislados de este estudio tuvieron un
mejor hit con secuencias de Schizochytrium limacinum y Aurantiochytrium sp.,
donde el primero fue redenominado posteriormente como Aurantiochytrium
limacinum por Yokohama y Honda (2007).
Por otro lado, algunos aislados tuvieron un mejor hit con secuencias de
Parietichytrium sp., Botryochytrium sp., Ulkenia aff. visurgensis y en algunos
casos el mejor hit fue con secuencias que tienen una asignación taxonómica a
nivel de familia.
54
Tabla 6. Resultados del análisis por BLAST en la base de datos del GenBank de cada uno de
los 56 alelos encontrados en el presente estudio. En todos los casos correspondió al gen
18S rRNA; para cada alelo se presenta el mejor hit encontrado. Entre paréntesis se indica el
número de cepas por alelo
Alelo Cepa/aislado Mejor hit en BLASTn Número de Valor

Identidad
accesión E
1 3 5 7 10-13 21 25 27 30
32 34 35-40 42 44 46 50
51 53-56 58 60-63 66 68
69 71 73 76-80 84-87 89
90 93-98 100-108 111 113
119 122 124 128 130 131
137 143-147 149 150 151
154 155 157 161-163 165
Schizochytrium limacinum
1 (200) 167-175 201-204 206 209- HM042911.2 0.0 99%
isolate OUC175
224 226-229 231 234-239
241 242 245-252 257 258
303-306 308-312 314 316-
319 321 322 324-328 330-
335 337-340 501-503 508
511 513 516-522 524 525
528 529 531 532 534-539
C3 C4
2 (1) Schizochytrium limacinum
230 HM042912.2 0.0 99%
isolate OUC191
3 (1) Aurantiochytrium sp. LY-
59 JX847370.1 0.0 98%
2012
329 JX847370.1 0.0 97%
2012
20 JX847370.1 0.0 97%
2012
323 JX847370.1 0.0 98%
2012
24 JX847370.1 0.0 98%
2012
255 JX847370.1 0.0 98%
2012
207 JX847370.1 0.0 98%
2012
72 JX847370.1 0.0 99%
2012
112 JX847370.1 0.0 98%
2012
28 JX847370.1 0.0 98%
2012
45 JX847370.1 0.0 98%
2012
313 JX847370.1 0.0 98%
2012
55
6 JX847370.1 0.0 98%
2012
31 JX847370.1 0.0 98%
2012
65 JX847370.1 0.0 97%
2012
52 JX847370.1 0.0 98%
2012
8 121 506 530 JX847370.1 0.0 98%
2012
4 JX847370.1 0.0 98%
2012
540 JX847370.1 0.0 97%
2012
315 JX847370.1 0.0 98%
2012
91 JX847370.1 0.0 98%
2012
48 134 225 232 244 JX847370.1 0.0 98%
2012
509 JX847370.1 0.0 98%
2012
123 JX847370.1 0.0 98%
2012
92 JX847370.1 0.0 98%
2012
208 JX847370.1 0.0 98%
2012
140 JX847370.1 0.0 98%
2012
114 JX847370.1 0.0 98%
2012
240 JX847370.1 0.0 98%
2012
243 JX847370.1 0.0 98%
2012
16 JX847370.1 0.0 98%
2012
18 JX847370.1 0.0 98%
2012
88 JX847370.1 0.0 98%
2012
C8 JX847370.1 0.0 98%
2012
256 JX847370.1 0.0 98%
2012
82 JX847370.1 0.0 98%
2012
43 JX847370.1 0.0 98%
2012
19 JX847370.1 0.0 98%
2012
56
514 JX847370.1 0.0 99%
2012
33 JX847370.1 0.0 98%
2012
43 (1) Schizochytrium sp. AMCQS1 JX993843.1 0.0 98%
526
Aurantiochytrium sp. 18W AB811030.1 0.0 98%
44 (1) Schizochytrium sp. AMCQS1 JX993843.1 0.0 98%
75
Aurantiochytrium sp. 18W AB811028.1 0.0 98%
45 (1) 507 Aurantiochytrium sp. 18W AB811028.1 0.0 98%
46 (2) 510 512 Aurantiochytrium sp. 15A AB811008.1 0.0 98%
49 (1) C1 Thraustochytriidae sp. T65 DQ836629.1 0.0 98%
50 (1) 120 Parietichytrium sarkarianum AB355411.1 0.0 97%
51 (1) 117 Parietichytrium sp. 9F-4a g AB810975.1 0.0 97%
52 (1) 118 Parietichytrium sarkarianum AB355411.1 0.0 97%
53 (1) 307 Parietichytrium sp. 6F-2a AB810971.1 0.0 98%
54 (1) 49 Parietichytrium sp. 6F-2a AB810973.1 0.0 98%
55 (4) 541 542 544 548 Botryochytrium sp. TMR16 AB810986.1 0.0 99%
56 (3) Ulkenia aff. visurgensis
543 545 546 HQ228961.1 0.0 98%
BAFCcult 3484
57
V.3.4 Alineamiento múltiple
El alineamiento múltiple de las secuencias del 18S rRNA resultó en 1582 sitios
alineados, pero se detectó zonas de ruido o bases degeneradas que era
imprescindible eliminar, como es visualizado en las Figuras 22 y 23. El
alineamiento muestra una zona de ruido imposible de determinar la base
correcta durante la edición de la secuencia y, según lo comentado líneas
arriba, ello se observó solo en secuencias de Aurantiochytrium sp., que
conformaban la mayor parte de los aislados.
Figura 23. Una de las regiones eliminadas del alineamiento múltiple por la
presencia de numerosas bases degeneradas
Tras eliminar las cuatro regiones de las posiciones 186-195, 614-976, 1294-
1303 y 1416-1440, el alineamiento resultó en 1175 sitios alineados
detectándose varias zonas de inserción o deleción denominados indels. La
Figura 24 nos muestra los dos primeros indels del alineamiento.
58
El alineamiento final presentó 579 sitios conservados, 586 posiciones
variables y 449 sitios informativos.
Figura 24. Alineamiento final utilizado en los análisis filogenéticos
V.3.5 Divergencia en las secuencias 18S rRNA
Con las secuencias preparadas para el análisis filogenético, fue necesario
previamente determinar el número de alelos presentes entre los 268 aislados
por lo que se realizó un nuevo alineamiento de solo estas 268 secuencias del
gen 18S rRNA.
El alineamiento resultó en 1136 sitios alineados con 809 sitios conservados,
324 sitios variables y 305 sitios parsimoniosamente informativos. Utilizando el
programa DNAsp se encontraron 56 alelos (Figura 25) entendiéndose éstos
por variantes de la secuencia 18S rRNA.
Los resultados de la búsqueda de secuencias homólogas para cada uno de
los alelos con BLAST, se muestra en la Tabla 6.
59
Figura 25. Distribución de los 56 alelos encontrados en los tres puntos de muestreo (primer
día de muestreo en color celeste; segundo día, en color naranja; tercer día, en color rosado;
en color plomo, alelos compartidos en los tres puntos)
60
V.3.6 Análisis filogenético
V.3.6.1 Utilizando PAUP (Métodos MP y ML)
La figura 26 muestra el árbol filogenético generado por PAUP utilizando el
método máxima parsimonia (MP). El análisis de máxima verosimilitud (ML) en
el cual se aplicaron los parámetros del modelo de sustitución nucleotídica
propuesto por el jModelTest (TrN+I+G: G= 0.5200, I= 0.2380), también nos
muestra resultados similares, ambos revelan tres grandes linajes de taxa: los
labirintúlidos y los thraustochitridos, ya previamente reportado en otros
trabajos (Honda et al., 1999; Leander y Porter, 2001). Este árbol muestra que
dentro del linaje que comprende a los thraustochitridos, nuestros aislados se
encuentran ubicados en los clados de los principales géneros, presentando
similitudes con Aurantiochytrium, Parietichytrium, Botryochytrium y Ulkenia.
Esta relación cercana está soportada por altos valores de bootstrap (mayores
al 70%).
V.3.6.2 Utilizando Mr. Bayes (Método IB)
Por otro lado, el análisis de inferencia bayesiana (Figura 27) también presentó
resultados similares a los análisis anteriores, confirmando el soporte de los
grupos de secuencias propuestos.
En este análisis no se muestran valores de bootstrap, sino valores de
probabilidad posterior para cada clado. Los clados obtuvieron altos índices de
probabilidad posterior (mayores a 0.9).
61
Botryochytrium
Ulkenia sensu stricto
Parietichytrium
Aurantiochytrium
Oblongichytrium
Figura 26. Árbol filogenético basado en el marcador 18S rRNA de los aislados, secuencias de
thraustochitridos y labirintúlidos previamente reportadas en la base de datos. P. micans y C.
roenbergensis como grupo externo. Los números en nodo muestran los valores de soporte del
bootstrap (MP/ML), para nodos soportados por más del 50% de 1000 réplicas
62
Botryochytrium
Parietichytrium
Ulkenia sensu stricto
Aurantiochytrium
Oblongichytrium
Figura 27. Árbol filogenético generado por IB, basado en el marcador 18S rRNA de los aislados,
secuencias de thraustochitridos y labirintúlidos previamente reportadas en la base de datos. P.
micans y C. roenbergensis como grupo externo. La barra representa 0.06 mutaciones
63
V.3.7 Análisis de distancias genéticas entre taxa
V.3.7.1 Matriz de distancia entre géneros reportados
Este análisis se realizó entre las secuencias de los diferentes géneros
reportados para los thraustochitridos (Tabla 7). En cuanto a las diferencias
observadas, por ejemplo entre Aplanochytrium sp. y los otros géneros
propuestos en el análisis, la divergencia entre Oblongichytrium sp.,
Sicyoidochytrium sp., Ulkenia sp., Botryochytrium sp., Japonochytrium sp.,
Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp.,
Parietichytrium sp. con Aplanochytrium sp., fue entre un 5.37-5.72%, 16.39-
16.67%, 14.83-15.43%, 14.15-15.03%, 15.33%, 13.15-22.84%, 21.13-22.13%,
18.45-19.05%, 18.18-18.60%, respectivamente.
Por último, los valores de divergecia encontrados entre especies del mismo
género son: en Aplanochytrium valores entre 0.41-0.65%; en Oblongichytrium,
2.97%; en Sicyoidochytrium, 0%; en Ulkenia, 0.16-4.6%; en Botryochytrium,
0.73%; en Thraustochytrium, 7.85-22.44%; en Schizochytrium, 2.55%; en
Aurantiochytrium, 0.41-6.35%; en Parietichytrium, 0.24%.
V.3.7.2 Matriz de distancia intraespecífica
Por otro lado, la matriz de divergencia realizada para Aurantiochytrium (Tabla
8) mostró que posee entre 0-1.8% de divergencia entre las secuencias de la
especie A. limacinum analizadas; y cuando son comparadas éstas con
secuencias de Aurantiochitrium sp.15A-14a y secuencias de los aislados 75,
507, 510, 512, 523, 526 , la divergencia varía en 6.85-8.71% y, a su vez entre
éstas es de un 0.38-0.37%.
64
Finalmente, cuando las secuencias de A. limacinum son comparadas con el
aislado C1, la divergencia presenta valores de divergencia entre un 6.85-
7.06%. Adicionalmente, se calculó una matriz de divergencia entre los géneros
reportados en la base de datos con las secuencias de los aislados en cuestión
(75, 510, 512 y C1) (Tabla 9).
La matriz de divergencia realizada para Parietichytrium (Tabla 10) mostró
valores entre 0-0.64%.
La matriz de divergencia realizada para Ulkenia (Tabla 11) mostró valores
entre 0-0.64% y para Botryochytrium valores entre 0-0.18%.
65
Tabla 7. Divergencia de las secuencias del marcador 18S rRNA (en porcentajes) entre las especies de los géneros
Aplanochytrium, Oblongichytrium, Sicyoidochytrium, Ulkenia, Botryochytrium, Japonochytrium, Thraustochytrium,
Schizochytrium, Aurantiochytrium y Parietichytrium
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
1 Aplanochytrium kerguelense 0.00
2 Aplanochytrium minutum 0.65 0.00
3 Aplanochytrium stocchinoi 0.57 0.41 0.00
4 Oblongichytrium minutum 5.72 5.90 5.72 0.00
5 Oblongichytrium multirudimentale 5.63 5.63 5.37 2.97 0.00
6 Sicyoidochytrium minutum 16.67 16.39 16.58 17.31 17.10 0.00
7 Sicyoidochytrium sp. 16.67 16.39 16.58 17.31 17.10 0.00 0.00
8 Ulkenia amoeboidea 15.43 15.33 15.34 14.96 15.05 18.11 18.11 0.00
9 Ulkenia profunda 14.83 14.83 14.94 14.56 14.36 17.32 17.32 4.60 0.00
10 Ulkenia visurgensis 15.23 15.13 15.14 14.76 14.85 18.12 18.12 0.16 4.42 0.00
66
11 Botryochytrium radiatum 14.64 14.15 14.44 14.24 13.96 16.56 16.56 10.71 10.34 10.52 0.00
12 Botryochytrium sp. 15.03 14.44 14.73 14.53 14.25 16.96 16.96 10.62 10.34 10.43 0.73 0.00
13 Japonochytrium sp. 15.33 15.23 15.24 14.76 14.95 18.22 18.22 0.24 4.51 0.08 10.62 10.52 0.00
14 Thraustochytrium aggregatum 17.97 17.76 17.77 17.26 16.34 19.32 19.32 17.66 17.27 17.56 17.02 17.54 17.66 0.00
15 Thraustochytrium aureum 12.98 13.37 13.18 13.00 13.09 14.74 14.74 10.90 9.04 10.71 8.21 8.94 10.61 14.72 0.00
16 Thraustochytrium kinnei 22.73 22.84 22.84 22.41 21.86 22.47 22.47 19.52 19.52 19.31 17.76 18.48 19.42 22.10 15.32 0.00
17 Thraustochytrium pachydermum 15.48 15.57 15.38 14.72 13.61 18.74 18.74 16.55 16.39 16.35 17.18 17.27 16.45 17.74 16.59 24.44 0.00
18 Thraustochytrium striatum 13.64 13.15 13.34 13.37 13.07 16.45 16.45 10.90 10.72 10.71 9.60 9.87 10.81 15.54 7.85 16.64 15.85 0.00
19 Schizochytrium sp. 21.40 21.29 21.19 22.26 21.00 20.85 20.85 17.52 17.35 17.32 16.17 16.47 17.42 22.47 15.68 19.34 23.22 17.81 0.00
20 Schizochytrium aggregatum 22.13 22.03 21.69 22.55 21.18 22.40 22.40 18.12 17.97 17.91 16.77 17.07 18.02 22.77 16.07 20.41 24.31 18.11 2.55 0.00
21 Aurantiochytrium sp. 18.89 18.57 18.47 19.05 18.21 18.46 18.46 16.81 16.65 16.71 16.41 16.81 16.82 19.75 14.41 23.16 19.73 15.53 17.97 19.02 0.00
22 Aurantiochytrium mangrovei 18.88 18.46 18.66 18.70 17.96 19.28 19.28 16.88 16.81 16.68 16.07 16.67 16.78 19.87 13.80 22.34 18.95 14.67 20.87 21.84 6.35 0.00
23 Aurantiochytrium limacinum 18.56 18.15 18.35 18.49 17.85 18.97 18.97 16.67 16.61 16.47 15.98 16.57 16.57 19.65 13.50 22.56 18.53 14.37 20.77 21.63 6.35 0.41 0.00
24 Parietichytrium sarkarium 18.39 18.60 18.40 17.57 17.59 18.57 18.57 15.15 14.08 14.95 9.76 10.31 15.05 20.48 12.78 19.29 20.23 14.35 18.22 19.17 20.02 19.86 19.87 0.00
25 Parietichytrium sp. 18.18 18.39 18.19 17.47 17.49 18.68 18.68 15.05 13.98 14.85 9.48 10.03 14.96 20.38 12.59 19.19 20.13 14.26 18.33 19.28 19.92 19.75 19.76 0.24 0.00
Tabla 8. Divergencia de las secuencias del marcador 18S rRNA (en porcentajes) entre las especies del género Aurantiochytrium
con secuencias de los aislados del clado Aurantiochytrium (Figura 26 y 27)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
1 Aurantiochytrium sp. 15A-14a 0.00
2 Aurantiochytrium limacinum OUC191 7.36 0.00
3 Aurantiochytrium limacinum SL1101 7.26 0.09 0.00
4 Aurantiochytrium mangrovei 7.36 0.19 0.09 0.00
5 Aurantiochytrium limacinum OUC192 7.36 0.28 0.19 0.28 0.00
6 Aurantiochytrium limacinum OUC191 7.26 0.09 0.00 0.09 0.19 0.00
7 Thraustochytriidae sp. MBIC11087 0.00 7.36 7.26 7.36 7.36 7.26 0.00
8 1 3 5 7 10-13 21 25_27 30_32 …534-539 C3 C4
7.26 0.09 0.00 0.09 0.19 0.00 7.26 0.00
9 C1 3.64 6.95 6.85 6.95 7.06 6.85 3.64 6.85 0.00
10 514 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.00
11 75 0.28 7.47 7.36 7.47 7.47 7.36 0.28 7.36 3.74 7.47 0.00
12 526 0.28 7.47 7.36 7.47 7.47 7.36 0.28 7.36 3.74 7.47 0.00 0.00
13 507 0.28 7.47 7.36 7.47 7.47 7.36 0.28 7.36 3.74 7.47 0.00 0.00 0.00
14 510 512 0.28 7.47 7.36 7.47 7.47 7.36 0.28 7.36 3.74 7.47 0.00 0.00 0.00 0.00
15 527 0.37 7.57 7.47 7.57 7.57 7.47 0.37 7.47 3.83 7.57 0.09 0.09 0.09 0.09 0.00
16 523 0.28 7.47 7.36 7.47 7.47 7.36 0.28 7.36 3.74 7.47 0.00 0.00 0.00 0.00 0.09 0.00
17 4 7.57 0.37 0.28 0.37 0.47 0.28 7.57 0.28 7.16 0.37 7.67 7.67 7.67 7.67 7.78 7.67 0.00
18 509 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.00
19 45 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.68 7.57 0.47 0.28 0.00
20 313 7.57 0.37 0.28 0.37 0.47 0.28 7.57 0.28 7.16 0.37 7.68 7.68 7.68 7.68 7.78 7.68 0.56 0.37 0.09 0.00
21 123 8.51 1.41 1.32 1.41 1.51 1.32 8.51 1.32 8.09 1.41 8.62 8.62 8.62 8.62 8.61 8.62 1.60 1.41 1.51 1.60 0.00
22 88 7.57 0.37 0.28 0.37 0.47 0.28 7.57 0.28 7.16 0.37 7.67 7.67 7.67 7.67 7.78 7.67 0.56 0.37 0.47 0.56 1.03 0.00
23 C8 7.26 0.09 0.00 0.09 0.19 0.00 7.26 0.00 6.85 0.09 7.36 7.36 7.36 7.36 7.47 7.36 0.28 0.09 0.19 0.28 1.32 0.28 0.00
24 92 7.78 0.56 0.47 0.56 0.66 0.47 7.78 0.47 7.36 0.56 7.88 7.88 7.88 7.88 7.98 7.88 0.75 0.37 0.66 0.75 1.22 0.37 0.47 0.00
25 240 8.30 1.03 0.94 1.03 1.13 0.94 8.30 0.94 7.88 1.03 8.40 8.40 8.40 8.40 8.51 8.40 1.22 1.03 1.03 1.13 1.89 1.03 0.94 1.22 0.00
67
26 82 7.57 0.56 0.47 0.56 0.66 0.47 7.57 0.47 7.16 0.56 7.67 7.67 7.67 7.67 7.78 7.67 0.75 0.56 0.56 0.47 1.60 0.56 0.47 0.75 0.85 0.00
27 43 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.47 0.28 0.19 0.28 1.32 0.28 0.19 0.47 0.94 0.47 0.00
28 52 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.47 0.28 0.19 0.28 1.32 0.28 0.19 0.47 1.13 0.66 0.19 0.00
29 33 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.05 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.47 0.28 0.37 0.47 1.32 0.28 0.19 0.47 1.13 0.66 0.37 0.19 0.00
30 140 7.57 0.37 0.28 0.37 0.47 0.28 7.57 0.28 7.16 0.37 7.67 7.67 7.67 7.67 7.78 7.67 0.56 0.37 0.47 0.37 1.60 0.56 0.28 0.75 1.22 0.56 0.47 0.47 0.47 0.00
31 114 7.67 0.47 0.37 0.47 0.56 0.37 7.67 0.37 7.26 0.47 7.78 7.78 7.78 7.78 7.88 7.78 0.66 0.47 0.56 0.47 1.70 0.66 0.37 0.66 1.32 0.66 0.56 0.56 0.56 0.09 0.00
32 315 7.57 0.37 0.28 0.37 0.47 0.28 7.57 0.28 7.16 0.37 7.67 7.67 7.67 7.67 7.78 7.67 0.56 0.37 0.47 0.37 1.60 0.56 0.28 0.75 1.22 0.56 0.47 0.47 0.47 0.19 0.28 0.00
33 243 8.50 1.22 1.13 1.22 1.32 1.13 8.50 1.13 8.09 1.03 8.61 8.61 8.61 8.61 8.71 8.61 1.41 1.22 1.32 1.41 1.89 1.03 1.13 1.03 1.51 1.41 1.13 1.13 1.13 1.03 0.94 1.22 0.00
34 16 7.88 0.66 0.56 0.66 0.75 0.56 7.88 0.56 7.47 0.47 7.99 7.99 7.99 7.99 8.09 7.99 0.85 0.66 0.37 0.47 1.70 0.85 0.56 0.85 1.41 0.94 0.56 0.56 0.75 0.66 0.56 0.66 0.94 0.00
35 18 7.78 0.56 0.47 0.56 0.66 0.47 7.78 0.47 7.36 0.37 7.88 7.88 7.88 7.88 7.98 7.88 0.75 0.56 0.47 0.37 1.60 0.56 0.47 0.56 1.41 0.75 0.47 0.28 0.47 0.56 0.47 0.56 1.03 0.47 0.00
36 208 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.47 0.28 0.37 0.47 1.32 0.28 0.19 0.47 1.13 0.66 0.37 0.19 0.19 0.28 0.37 0.28 0.94 0.56 0.47 0.00
37 91 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.19 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.37 0.28 0.28 0.28 0.19 0.28 0.19 1.22 0.66 0.37 0.28 0.00
38 112 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.00
39 8 121 506 530 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.22 0.19 0.09 0.37 1.03 0.56 0.28 0.09 0.09 0.37 0.47 0.37 1.03 0.66 0.37 0.09 0.19 0.19 0.00
40 19 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.47 0.28 0.19 0.28 1.32 0.28 0.19 0.47 1.03 0.56 0.37 0.19 0.19 0.47 0.56 0.47 1.13 0.56 0.47 0.19 0.28 0.28 0.09 0.00
41 48 134 225 232 244 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.09 0.19 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.09 0.09 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.47 0.37 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.00
42 256 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.00
43 28 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.47 0.09 0.37 0.47 1.51 0.47 0.19 0.47 1.13 0.66 0.37 0.37 0.37 0.47 0.56 0.47 1.32 0.75 0.66 0.37 0.28 0.28 0.28 0.37 0.28 0.09 0.00
44 31 7.67 0.66 0.56 0.66 0.75 0.56 7.67 0.56 7.47 0.66 7.78 7.78 7.78 7.78 7.88 7.78 0.47 0.66 0.75 0.85 1.70 0.85 0.56 1.03 1.51 1.03 0.75 0.75 0.75 0.85 0.94 0.85 1.70 1.13 1.03 0.75 0.66 0.66 0.66 0.75 0.66 0.66 0.75 0.00
45 540 7.78 0.75 0.66 0.75 0.85 0.66 7.78 0.66 7.57 0.75 7.88 7.88 7.88 7.88 7.99 7.88 0.56 0.75 0.85 0.94 1.80 0.94 0.66 1.13 1.60 1.13 0.85 0.85 0.85 0.94 1.03 0.94 1.80 1.22 1.13 0.85 0.75 0.56 0.75 0.85 0.75 0.75 0.85 0.28 0.00
46 20 7.78 0.56 0.47 0.56 0.66 0.47 7.78 0.47 7.36 0.56 7.88 7.88 7.88 7.88 7.99 7.88 0.56 0.56 0.66 0.75 1.80 0.75 0.47 0.94 1.41 0.94 0.66 0.66 0.66 0.75 0.85 0.75 1.60 1.03 0.94 0.66 0.56 0.37 0.56 0.66 0.56 0.56 0.66 0.47 0.56 0.00
47 329 7.47 0.28 0.19 0.28 0.37 0.19 7.47 0.19 7.06 0.28 7.57 7.57 7.57 7.57 7.67 7.57 0.28 0.28 0.37 0.47 1.51 0.47 0.19 0.66 1.13 0.66 0.37 0.37 0.37 0.47 0.56 0.47 1.32 0.75 0.66 0.37 0.28 0.28 0.28 0.37 0.28 0.28 0.37 0.37 0.47 0.28 0.00
48 65 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.19 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.47 0.56 0.37 0.09 0.00
49 6 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.47 0.75 0.37 0.28 0.19 0.00
50 323 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.19 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.47 0.56 0.56 0.28 0.19 0.19 0.00
51 59 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.66 0.56 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.00
52 72 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.66 0.75 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.00 0.00
53 230 7.36 0.00 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.66 0.75 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.00
54 207 7.36 0.09 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.95 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.66 0.75 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.09 0.00
55 24 7.36 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.36 0.09 6.85 0.19 7.47 7.47 7.47 7.47 7.57 7.47 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.66 0.75 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.00
56 255 7.16 0.19 0.09 0.19 0.28 0.09 7.16 0.09 6.75 0.19 7.26 7.26 7.26 7.26 7.36 7.26 0.37 0.19 0.28 0.37 1.41 0.37 0.09 0.56 1.03 0.56 0.28 0.28 0.28 0.37 0.47 0.37 1.22 0.66 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.28 0.19 0.19 0.28 0.66 0.75 0.56 0.28 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.00
Tabla 9. Divergencia de las secuencias del marcador 18S rRNA (en porcentajes) entre las especies de los géneros
Aplanochytrium, Oblongichytrium, Sicyoidochytrium, Ulkenia, Botryochytrium, Japonochytrium, Thraustochytrium,
Schizochytrium, Aurantiochytrium y Parietichytrium con secuencias de género no determinado
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
1 Aplanochytrium kerguelense 0.00
2 Aplanochytrium minutum 0.65 0.00
3 Aplanochytrium stocchinoi 0.57 0.00 0.00
4 Oblongichytrium minutum 5.58 5.76 5.58 0.00
5 Oblongichytrium multirudimentale 5.58 5.58 5.32 2.91 0.00
6 Sicyoidochytrium minutum 16.58 16.19 16.38 17.03 17.00 0.00
7 Sicyoidochytrium sp. 16.58 16.18 16.38 17.03 17.00 0.08 0.00
8 Ulkenia amoeboidea 15.72 15.93 15.93 15.26 15.25 18.13 18.13 0.00
9 Ulkenia profunda 15.31 15.32 15.42 14.75 14.54 17.43 17.43 4.71 0.00
10 Ulkenia visurgensis 15.52 15.72 15.73 15.06 15.05 18.13 18.14 0.16 4.54 0.00
11 Botryochytrium radiatum 14.83 14.33 14.62 14.04 13.85 16.48 16.49 10.77 10.30 10.58 0.00
68
12 Botryochytrium sp. 15.02 14.53 14.82 14.34 14.14 16.89 16.90 10.68 10.30 10.49 0.65 0.00
13 Japonochytrium sp. 15.62 15.83 15.83 15.06 15.16 18.24 18.24 0.24 4.63 0.08 10.68 10.58 0.00
14 Thraustochytrium aggregatum 18.27 18.37 18.37 17.36 16.54 18.18 18.19 17.36 17.27 17.25 16.83 17.35 17.36 0.00
15 Thraustochytrium aureum 13.63 13.83 13.63 13.36 13.26 14.93 14.93 10.97 9.28 10.78 8.17 8.90 10.68 14.31 0.00
16 Thraustochytrium kinnei 22.10 21.99 21.99 21.14 20.91 21.62 21.63 19.02 19.11 18.81 17.36 18.08 18.92 21.71 14.72 0.00
17 Thraustochytrium pachydermum 15.08 15.17 14.98 14.23 13.21 18.88 18.98 16.87 16.39 16.67 17.30 17.40 16.77 17.35 17.11 23.48 0.00
18 Thraustochytrium striatum 14.01 13.81 14.01 13.54 13.34 16.66 16.67 10.97 10.88 10.78 9.47 9.74 10.88 15.23 8.08 16.13 15.94 0.00
19 Schizochytrium sp. 21.32 21.31 21.20 21.75 20.40 20.58 20.69 16.91 16.83 16.70 15.47 15.77 16.81 21.72 15.17 19.27 22.50 17.42 0.00
20 Schizochytrium aggregatum 22.17 22.17 21.84 22.27 21.11 21.79 21.90 17.72 17.45 17.51 16.28 16.58 17.62 21.91 15.46 19.58 23.83 17.60 2.65 0.00
21 Aurantiochytrium sp. 19.22 18.90 18.80 19.09 18.34 18.35 18.35 17.41 16.61 17.30 16.30 16.59 17.41 19.87 14.18 22.63 19.44 15.82 18.40 19.45 0.00
22 Aurantiochytrium mangrovei 18.97 18.35 18.55 18.70 18.26 19.23 19.33 17.50 17.09 17.29 15.47 16.06 17.39 19.66 13.86 21.74 19.06 15.25 20.68 21.44 6.74 0.00
23 Aurantiochytrium limacinum 18.77 18.26 18.45 18.50 18.06 18.92 19.02 17.50 16.99 17.29 15.47 15.97 17.39 19.46 13.86 21.84 18.85 15.25 20.47 21.11 6.66 0.00 0.00
24 Parietichytrium sarkarium 17.97 17.97 17.77 16.96 16.97 18.30 18.30 14.55 13.37 14.35 9.45 10.00 14.46 19.97 12.18 18.89 19.61 13.45 17.92 18.87 19.50 19.13 19.35 0.00
25 Parietichytrium sp. 17.98 17.97 17.77 17.07 17.08 18.52 18.52 14.46 13.48 14.26 9.17 9.72 14.36 19.97 12.19 19.00 19.73 13.56 18.24 19.20 19.61 19.24 19.46 0.41 0.00
26 510 512 19.64 19.52 19.42 19.39 18.64 18.67 18.66 17.51 16.60 17.41 15.98 16.49 17.52 19.64 14.18 22.53 19.65 15.92 18.31 19.23 0.98 6.47 6.20 19.70 19.82 0.00
27 75 19.85 19.73 19.63 19.60 18.85 18.88 18.87 17.40 16.80 17.30 15.78 16.28 17.41 19.76 14.27 22.75 19.87 16.13 18.41 19.45 1.15 6.56 6.29 19.92 19.81 0.00 0.00
28 C1 19.07 18.87 19.18 18.50 17.84 18.14 18.24 16.75 16.16 16.65 15.08 15.56 16.75 19.09 13.56 21.72 19.51 14.76 19.04 19.76 3.93 5.93 5.93 19.81 19.92 0.04 0.04 0.00
especies del género Parietichytrium con secuencias de los aislados del clado
Parietichytrium (Figura 26 y 27)
1 2 3 4 5 6 7
1 Parietichytrium sarkarianum 0.00
2 Parietichytrium sp. BAFCcult 3109 0.36 0.00
3 307 0.64 0.46 0.00
4 49 0.64 0.46 0.00 0.00
5 120 0.18 0.18 0.64 0.64 0.00
6 117 0.18 0.18 0.64 0.64 0.00 0.00
7 118 0.18 0.18 0.64 0.64 0.00 0.00 0.00
especies de los géneros Ulkenia y Botryochytrium con secuencias de los aislados del clado
Ulkenia y Botryochytrium (Figura 26 y 27)
1 2 3 4 5 6 7 8
1 Ulkenia profunda 0.00
2 Japonochytrium sp. ATCC 28207 5.42 0.00
3 543 545 546 5.03 0.55 0.00
4 Ulkenia visurgensis 5.03 0.37 0.18 0.00
5 Ulkenia radiata 12.14 13.24 13.02 12.80 0.00
6 Botryochytrium radiatum 12.13 13.02 12.80 12.58 0.28 0.00
7 Botryochytrium sp. 12.03 13.12 12.91 12.69 0.18 0.09 0.00
8 541 542 544 548 12.03 13.12 12.91 12.69 0.28 0.18 0.09 0.00
69
VI. DISCUSIÓN
VI.1 Primer reporte de Thraustochitridos en los manglares de Tumbes
La presencia de thraustochitridos ha sido registrada a escala mundial y en diversos
hábitats (Raghukumar, 2004), y los manglares de Tumbes no escapan de ello,
observándose representantes en todos los puntos muestreados a pesar del cambio
de salinidad en ciertos puntos (valores de 10 a 33‰, Tabla 1). Está reportado que el
rango de tolerancia a la salinidad es variable según las especies, en general es
amplio, y algunas cepas pueden prosperar a salinidades tan bajas como 2 g L-1
(Burja et al., 2006); pero los mejores valores de crecimiento se registran entre los
niveles de 15 a 35 g L-1 (Fan et al., 2002), que corresponden al 50-100% de la
concentración del agua de mar, lo cual corrobora a lo observado en este estudio
donde el crecimiento óptimo de los aislados fue a una concentración del 70%.
Además, se comprueba nuevamente que estos microorganismos se hallan
asociados a material vegetal en descomposición, como son las hojas caídas del
mangle. Probablemente estos microorganismos cumplan una importante función
como saprobios, en virtud de su condición de heterótrofos absortivos produciendo
enzimas extracelulares (celulasas, amilasas y proteasas) (Raghukumar, 2002) y el
método de epifluorescencia que utiliza acriflavina no solo ha permitido determinar su
ocurrencia sino estimar su abundancia relativa, donde altas densidades de estos
microorganismos se traduce en una alta tasa de remineralización de la materia
orgánica (Raghukumar y Schaumann, 1993).
Con respecto a los ecosistemas muestreados en Latinoamérica, los únicos registros
previos fueron gracias a los estudios de Ulken en los manglares de Brasil (1966 y
1983) y Costa Rica (Ulken et al., 1990); Hinzpeter, en Puerto Montt, Chile (2008,
70
2009) quien determinó en la época de muestreo en esta zona costera, una salinidad
y temperatura promedio del agua de un 30‰ y 12,89 ± 2,70 º C, respectivamente.
De igual manera, Rosa (2010), determinó en los humedales de Argentina, valores
de ph de 7.8, temperaturas oscilantes entre -2 a 23°C y valores de salinidad entre
23 y 36.5 ups. Estas condiciones no fueron similiares a lo encontrado en los
manglares de Tumbes, donde se registró una temperatura entre 25.4-28.6°C, un pH
entre 7-8 y valores oscilantes de salinidad entre 10-33‰. Ante estas condiciones
cambiantes, es probable que estos microorganismos hayan desarrollado
mecanismos de adaptación sintetizando AG para contrarrestar las variables
adversas sobre la fluidez de su membrana (Nichols et al., 1993; 2002).
Estos reportes y el aportado por esta tesis suman una importante información
acerca de la ocurrencia de estos microorganismos en sitios poco caracterizados,
como son los estuarios templados o las lagunas salinas continentales.
71
VI.2 Caracterización molecular de Thraustochitridos de Tumbes
Si bien las características de las colonias resultaron de suma utilidad para reconocer
distintos tipos morfológicos de thraustochitridos durante la etapa inicial de
aislamiento, es necesario considerar que los estudios en cultivo han demostrado
que la caracterización morfológica de los aislamientos en estos protistas no es una
tarea sencilla debido a las variaciones morfológicas que se observan, incluso entre
individuos de un mismo cultivo (Kazama, 1974; Bongiorni et al., 2005) y, resulta
imprescindible la realización de otro tipo de estudio como es la caracterización
molecular del gen 18S rRNA (Honda et al., 1999; Leander et al., 2004; Huang et al.,
2003), que permite reducir el tiempo de selección de cepas y sobretodo definir
criterios taxonómicos más seguros.
 Sus relaciones evolutivas basadas en el marcador molecular 18S rRNA
En la obtención del árbol filogenético, se utilizaron secuencias de thraustochitridos
reportados en la base de datos. Al inicio del análisis era confuso el árbol generado
con dichas secuencias. Esto es, debido a la asignación taxonómica equivocada que
brindaron algunos investigadores en estudios iniciales con estos microorganimos y
que el error aún persiste en la base de datos del GenBank. Por lo tanto, en los
análisis posteriores se procedió a redenominar las secuencias con la asignación
taxonómica correcta basándose en los trabajos de Yokohama y Honda (2007) y
Yokohama y colaboradores (2007), en el cual se hace una redenominación de
diferentes grupos de thraustochitridos.
Los árboles generados corroboran una vez más lo reportado previamente: las
características morfológicas no revelan precisamente las relaciones evolutivas entre
72
thraustochitridos (Huang et al., 2003). Un ejemplo, Schizochytrium aggregatum y S.
limacinum, ambos exhiben divisiones binarias sucesivas de las células vegetativas,
lo cual fue considerado criterio clave para la identificación del género
Schizochytrium (Goldstein y Belsky, 1964; Moss, 1986). Sin embargo, el segundo
fue redenominado como Aurantiochytrium limacinum (basónimo: S. limacinum) y
tanto Schizochytrium aggregatum como A. limacinum aparecen en grupos dispersos
dentro del árbol filogenético (Figura 26 y 27). Así, con el estudio de Yokohama y
Honda (2007) se hace una redenominación de éstos en los grupos Shizochytrium
sensu estricto (incluye S. agregatum) y emergen los nuevos géneros
Aurantiochytrium (basónimo: S. limacinum y S. mangrovei) y Oblongichytrium
(basónimo: S. minutum).
Basándose en esta redenominación, la mayoría de nuestros aislados (alelos 1 al 49)
forman parte del clado Aurantiochytrium (Tabla 6; Figura 26 y 27). Dentro de este
grupo, los aislados 75, 507, 510, 512, 523, 526, 527 (alelos 43 al 48) y C1 (alelo 49)
forman un clado bien definido junto con la secuencia de Aurantiochytrium sp. 15A-
14a y Thraustochytriidae sp. MBIC11087, formando el grupo hermano de la especie
Aurantiochytrium limacinum.
Adicionalmente, se observó solo en estos aislados que forman parte de este clado
Aurantiochytrium, un ruido en determinadas posiciones de su secuencia que fue
constante solo entre estos aislados y no observándose en las demás cepas. Si bien
la presencia de este ruido complicó la edición de la secuencia, posiblemente se
trataría de que este género presenta un alto número de copias del 18S r RNA en su
genoma (Nakazawa et al., 2014) tal como se ha observado también en ciliados y
dinoflagelados (Potvin y Love-joy, 2009) o bien es ocasionado por la presencia de
microsatélites o de largos homopolímeros como los poliT que fueron reconocidos en
73
dichas regiones (Figura 22) (Macrogen Sequencing Trouble shooting guide,
https://dna.macrogen.com/eng/support/ces/guide/troubleshooting.jsp).
Similarmente a lo anterior, Yokohama y coloboradores (2007) realizaron también un
rearreglo taxonómico para el género Ulkenia, éste fue recaracterizado y tres nuevos
géneros establecidos: Ulkenia sensu stricto, Sicyoidochytrium, Botryochytrium y
Parietichytrium.
En los árboles se puede identificar claramente a estos cuatro grupos: las cepas 541,
542, 544 y 548 forman parte del clado Botryochytrium (anteriormente identificadas
como U. radiata y U. profunda), seguido se encuentra el clado Ulkenia sensu
estricto que incluye a U. visurgensis y U. profunda donde se ubican los aislados
543, 545 y 546 y finalmente las cepas 49, 117, 118, 120 y 307 forman parte del
clado Parietichytrium (Figura 26 y 27).
 Diversidad de Thraustochitridos en los Manglares de Tumbes basadas en su
divergencia genética
Cuando se refiere a estudios de divergencia intra o interespecífica se estila utilizar
secuencias de ADN mitocondrial (ADNm), el cual se caracteriza por revelar una alta
tasa evolutiva y presentarse en gran número de copias por célula (Rand, 2001) si es
comparado con el ADN nuclear, el cual está sometido a efectos homogenizadores.
Así, el potencial de divergencia intraespecífica es mucho más alto en el ADNm
(Barth et. al., 2006), pero en este estudio, no es necesario tener una mejor
resolución a este nivel bastando revelar notables diferencias entre los géneros. Así
el conocimiento de variación genética en protistas es muy limitado (Barth et. al.,
2006), y para este grupo de thraustochitridos solo existe un reporte de Huang y
74
colaboradores (2003) quienes comparan secuencias de S. limacinum con
secuencias de sus aislados.
Para tal caso se procedió a estimar las distancias genéticas entre cepas de
thraustochitridos publicados en la base de datos. Con los resultados obtenidos,
tanto en el análisis filogenético como en el análisis de la matriz de divergencia
genética se demuestra claramente la diferencia entre géneros, lo que se ve reflejado
sea ubicándose éstos en clados diferentes (Figura 26 y 27) u obteniendo valores
altos de divergencia (Tabla 7-11), que fluctuaron entre un 8.21-24.44% entre
géneros de thraustochitridos ya reportados (Tabla 7). Caso peculiar, es el género
Thraustochytrium, donde la divergencia genética de sus diferentes especies osciló
entre un 7.85 a 24.44% (Tabla 7), salvo esta excepción, la comparación de
secuencias entre especies de un mismo género revelaron valores bajos que
oscilaban entre un 0.16-6.35 % (Tabla 7).
Estos resultados son comparables con lo obtenido por Huang y colaboradores
(2003), quienes encontraron valores de divergencia de un 2% y 20.1% cuando una
cepa ubicada en el clado de A. limacinum es comparada con secuencias de A.
limacinum y S. aggregatum, respectivamente, notándose una menor divergencia
(2%) cuando son secuencias de la misma especie.
Con respecto a este estudio, en el clado Aurantiochytrium (Figura 26 y 27), la matriz
resultante de distancias (Tabla 8) muestra valores que fluctuaron entre un 0-8.62%
donde los valores más altos corresponden a cepas diferentes a la especie A.
limacinum. Éstas corresponden a los aislados 75, 507, 510, 512, 523, 526, 527, C1
(sombreado en plomo) y, así como lo muestra el análisis filogenético (Figura 26 y
75
27), éstos divergen del grupo de A. limacinum entre un 6.85-7.57%, donde los
valores más altos corresponden a los aislados 75, 507, 510, 512, 523, 526 y 527, ya
que el aislado C1 presentó una divergencia de entre 6.85-6.95% con A. limacinum y
de un 3.74-3.83% con los aislados antes mencionados. Este resultado también es
reflejado en el análisis filogenético (Figura 26 y 27) donde estas cepas se
encontraban formando un clado diferente al grupo A. limacinum, soportado por
valores de bootstrap confiables, posiblemente tratándose de dos nuevas especies
de este género. Esta afirmación se corrobora nuevamente con los resultados
mostrados en la Tabla 9, donde estos aislados presentan una divergencia entre un
5.93- 6.29% con la especie A. limacinum y entre un 0.98-3.93% con
Aurantiochytrium sp. 15A-14a (Genbank Accesion N° AB811008).
Estos resultados estarían indicando que pertenecerían a especies diferentes, lo que
estaría corroborado con características morfológicas observadas en medio de
cultivo, donde los aislados 75, 507, 510, 512, 523, 526, 527 tuvieron un crecimiento
lento, de aspecto grumoso en medio líquido y coloración naranja en su cultivo
celular; características que fueron contrastantes a lo observado en aislados de la
especie A. limacinum, cuyo crecimiento fue rápido y de color crema (Honda et al.,
1998). Estudios de producción de escualeno en thrastochitridos, determinaron que
esta cepa de referencia, Aurantiochytrium sp. 15A-14a (Genbank Accesion N°
AB811008), presentaba una óptima producción de escualeno y el cual está
relacionado con el color naranja de las colonias (Nakazawa et al., 2014), esto último
fue una característica observada en los aislados 75, 507, 510, 512, 523, 526 y 527.
Por otro lado, al analizar más al aislado C1 el cual tuvo un mejor hit con
Thraustochytriidae sp. T65 (Genbank Accesion N° DQ836629.1)(Jakobsen et al.,
76
2007) en un 98% de identidad (Tabla 6), se ha reportado que en esta cepa así como
en Schizochytrium sp. S8 (Genbank Accesion N° DQ836630), producen de novo el
(-)-proto-quercitol y la glicina-betaína, considerados ambos como una habilidad de
protección ante muchas condiciones adversas como son la temperatura, salinidad,
stress por alta osmolaridad externa (Jakobsen et al., 2007). Estudios adicionales de
caracterización lipidica podrían reforzar la hipótesis de que las cepas 75, 507, 510,
512, 523, 526, 527 y C1 constituyen linajes independientes a A. limacinum, donde
su respectivo perfil lipídico permitiría agrupar a estos microorganismos con una
aproximación muy cercana a la que se obtiene en términos de su secuencia 18S
rRNA (Huang et al., 2003).
Con respecto al clado Parietichytrium, los valores de divergencia observados
fluctuaron entre un 0-0.64% entre los aislados 49, 117, 118, 120 y 307 con
secuencias reportadas de la especie Parietichytrium sarkarianum (Tabla 10),
confirmando el resultado observado en el análisis filogenético (Figura 26 y 27).
Con respecto al clado Botryochytrium, los valores de divergencia observados
fluctuaron entre un 0.09-0.28% entre los aislados 541, 542, 544 y 548 con
secuencias reportadas de Botryochytrium spp. y Ulkenia radiata (Tabla 11),
confirmando el resultado observado en el análisis filogenético (Figura 26 y 27).
Finalmente, en el clado Ulkenia sensu stricto, los valores de divergencia observados
fluctuaron en un 0.55% entre los aislados 543, 545 y 546 con Japonochytrium sp. y
en un 0.18% con Ulkenia visurgensis, tratándose posiblemente de aislados de ésta
ultima especie.
77
Esta tesis buscó dar un aporte más al conocimiento de nuestra biodiversidad al
mundo, reportando los primeros aislamientos de thraustochitridos en nuestro país,
en los manglares de Tumbes, donde las condiciones tanto de pH (valores de 7 a 8)
como los valores fluctuantes de salinidad (10-33‰) fueron propicios para su
ocurrencia. Por otro lado, la caracterización molecular de estos microorganismos
permitió no solo la identificación de nuevas especies sino también de potenciales
aislados productores de AGPIs con posibles aplicaciones biotecnológicas como son
las cepas 75, 507, 510, 512, 523, 526, 527, C1 y, que en esta tesis, solo se ha
demostrado su capacidad de sintetizar ácidos grasos con la tinción rojo de nilo que
resultó positiva. La información proporcionada por esta tesis constituye punto de
partida para realizar estudios posteriores de microorganismos altamente
productores de AGPIs, como son los thraustochitridos, lo que permitirá a nuestro
país incursionar en la faceta biotecnológica.
78
VII. CONCLUSIONES
 Las metodologías empleadas en el estudio (hoja senescente y granos de
polen) permitieron aislar con éxito las 268 colonias de thraustochitridos en
medios de cultivo básicos, donde la caracterización morfológica preliminar
(observaciones de los rasgos de las colonias en medio sólido) resultaron útiles
para mostrar que los aislamientos constituyen cepas individuales
representantes de al menos gran parte de la biodiversidad de thraustochitridos
de los manglares de Tumbes.
 En la identificación bioquímica, luego de confirmar la identidad de estos
microorganismos con acriflavina, la presencia de lípidos con rojo de nilo fue
determinante para la continuación del estudio con este microorganismo.
 Los Manglares de Tumbes no escapan a la presencia de estos
microorganismos thraustochitridos y basado en los análisis filogenéticos, los
aislados se encontraron ubicados en clados de importantes géneros como
Aurantiochytrium (basónimo: Shizochytrium), Parietichytrium, Botryochytrium e
Ulkenia sensu stricto.
 Los resultados de divergencia genética lograron corroborar los resultados
obtenidos en el análisis filogenético, proponiendo el posible descubrimiento de
dos nuevas especies con potenciales biotecnológicos en base a los
resultados.
79
VIII. RECOMENDACIONES
 Es necesario considerar que los estudios en cultivo han mostrado que la
caracterización morfológica de los aislamientos no es una tarea sencilla
resultando imprescindible la realización de otro tipo de estudios que
complementen la información actualmente disponible para la identificación de
estos organismos y que permitan definir criterios taxonómicos más seguros
como es la caracterización molecular utilizando el gen 18S rRNA.
 Con la caracterización no sólo bioquímica y molecular sino complementarlo
con estudios de perfil lipídico, de caracterización de pigmentos, etc. permitirá
identificar nuevos aislados con gran potencial biotecnológico como parecen
ser las dos nuevas especies identificadas en el presente estudio y, se propone
seguir con la investigación y valorización de estos microorganismos altamente
productores de AGPIs, lo que permitirá a nuestro país incursionar en una
faceta biotecnológica así como constituir un aporte más al conocimiento de
nuestra biodiversidad al mundo.
80
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

E.A.P. DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA

“AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE

Tesis para optar al Título profesional de Bióloga Genetista

Bach. Alejandra Katia Jiménez Espinoza

Asesora: Dra. Rina Ramírez Mesías

Asesor externo: Luis Destefano Beltrán, PhD.

apoyarme en la continua lucha de mi vida y por darme la oportunidad de tener una

parte de mi vida y de representar esa indescriptible FELICIDAD.

por su paciencia y que gracias a sus conocimientos, su experiencia y motivación lograron

conocimientos y ayudarme a salir de algunos atascos.

Al Fondo de Investigación y Desarrollo para la Competitividad (FIDECOM), a MARINAZUL

empuje y preocupación logré presentar esta TESIS DE PREGRADO.

Para todos ellos, simplemente GRACIAS!

II. MARCO TEORICO.......................................................................................................... 4

II.1 Thraustochitridos: Clasificación, características y ocurrencia ................................ 4

II.1.1 Clasificación de los Thraustochitridos .............................................................. 4

II.1.2 Características generales ................................................................................. 6

II.1.3 Distribución: Hábitats y ecosistemas de su ocurrencia ................................... 8

II.2 Aislamiento y mantenimiento de los Thraustochitridos ......................................... 12

II.2.1 Métodos de aislamiento .................................................................................. 12

II.2.2 Mantenimiento: medios de cultivos ................................................................ 13

II.3 Técnicas de identificación de Thraustochitridos.................................................... 15

II.3.1 Identificación bioquímica ................................................................................ 15

II.3.2 Identificación molecular .................................................................................. 16

II.4 Thraustochitridos: fuente alternativa de AGPIs ..................................................... 17

II.4.1 Definición e importancia de los AGPIs ........................................................... 17

II.4.2 Fuentes convencionales de AGPIs ................................................................ 20

II.4.3 Fuentes alternativas de AGPIs ω3 ................................................................. 22

III. HIPOTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................... 25

III.1 Hipótesis: ................................................................................................................ 25

IV. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 26

IV.1 Área de estudio y colecta....................................................................................... 26

IV.2 Aislamiento, medios de cultivo y mantenimiento de Thraustochitridos ................ 31

IV.2.1 Metodología de la hoja senescente................................................................ 31

IV.2.2 Metodología por cebado ................................................................................. 34

IV.3 Identificación bioquímica: Tinción fluorescente ..................................................... 35

IV.4 Identificación molecular: Caracterización del gen 18S rRNA ............................... 36

IV.4.1 Extracción de ADN genómico......................................................................... 36

IV.4.2 PCR y secuenciamiento del gen 18S rRNA ................................................... 36

IV.4.3 Edición y obtención de la secuencia consenso ............................................. 38

IV.4.4 Alineamiento múltiple ...................................................................................... 38

IV.4.5 Caracterización de las secuencias ................................................................. 42

IV.4.6 Divergencia de las secuencias 18S rRNA ..................................................... 42

IV.4.7 Análisis filogenético molecular ....................................................................... 43

V.1 Aislamiento y mantenimiento de cepas de thraustochitridos ................................ 45

V.1.1 Aislamiento y crecimiento ............................................................................... 45

V.3 Caracterización molecular del gen 18S rRNA ....................................................... 49

V.3.2 Ensamblaje y edición de secuencias ............................................................. 51

V.3.3 Verificación de las secuencias 18S rRNA por BLAST ................................... 54

V.3.4 Alineamiento múltiple ...................................................................................... 58

V.3.5 Divergencia en las secuencias 18S rRNA ..................................................... 59

V.3.6 Análisis filogenético ........................................................................................ 61

V.3.6.2. Utilizando Mr. Bayes (Método IB) .............................................................. 61

V.3.7 Análisis de distancias genéticas entre taxa ................................................... 64

V.3.7.1. Matriz de distancia entre géneros reportados ........................................... 64