Discusion Metodo de Sanger

DISCUSION
DINITROFENILACION DEL AMINOACIDO N-TERMINAL DE LA PROTEINA

Reactivo de Sanger
1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB)
Primero se lleva acabo la dinitrofenilacion con el reactivo de Sanger,en condiciones alcalinas,agregando
NaHCO3 , este medio básico permite que los grupos amino que puedan estar protonados,puedan estar en
mayor cantidad desprotonados permitiendo la dinitrofenilacion para que el grupo amino H2N pueda actuar
como Nucleofilo ya que tiene sus pares de electrones libres y lleve acabo el ataque nucleofilico atacando al
carbono con carga parcial positiva de la DNFB y el F con carga parcial negativa tome un Hidrogeno del amino
así formando el derivado.
IMAGEN 1: Se puso a reaccionar la hemoglobina con el reactivo de Sanger ,observando coloración

verdosa –café obscura ,se toma la medición de pH (tiras de pH) para asegurar las condiciones alcalinas
(entre 8 -9 ),asegurando la reacción y dejando reaccionar los Hrs.
Se TERMINA LA DINITROFENILACION
Se detiene la reacción de dinitrofenilacion agregando HCL 3N para formar condiciones de medio acido, para
volver a protonar el amino, llevando acabo una reacción de doble sustitución, donde el HCL se disocia en +H
y CL- y el ácido carbónico se separa formando CO2 + H2O .
IMAGEN 2
Observamos cómo pasa de coloración verdosa a un amarillo , lo que nos indica que la reacción se
detuvo volviendo a protonar el amino , el desprendimiento de CO2 se ve por el burbujeo , se mide
pH (tiras pH) para asegurar las condiciones acidas.
ELIMINCACION DEL DNFB QUE NO REACCIONO

Nuestro tubo contiene la hemoglobina que no reacciono, el exceso de DNFB,la hemoglobina que si
reaaciono,CO2 ,H2O Y NaCl. Se lleva acabo la extracción con éter saturado con FeSO4 en solución acuosa
__veces con mismo volumen __ mL ( ISIS DEJE ESTE ESPACIO POR QUE EN EL GRUPO DONDE REPUSE LA
PRACTICA HICIMOS 4 EXTRACIONES DE 5 ML , PERO NO SE FUE LO MISMO EN NUESTRO GRUPO ) , se agito
para mezclar ambos solventes formándonos 2 fases ,en nuestra fase ETEREA se va la sustancia no polar que
no reacciono ,siendo la DNFB que no reacciono y está en exceso la cual vamos a extraer y desechar. En
nuestra fase acuosa, tenemos la proteína dinitrofenilada y nuestra hemoglobina no dinitrofenilada.
IMAGEN 3
Se observa la separación de las 2 fases etérea (superior) y acuosa (inferior), un complejo colorido (café) por
el FeSO4 que demuestra la presencia del dinitrofluorobenceno, se observa en cada extracción un cambio de
aclaración de color café a un amarillo cada vez más claro..
Se lleva acabo baño maría , para eliminar el éter que nos quedó después de las extracciones, hasta
ya no identificar el olor del compuesto (éter).
Realizamos la centrifugación de nuestra muestra para eliminar el exceso de agua y formar un

precipitado que es nuestra proteína dinitrofenilada.
HIDROLISIS DE LA DNP-proteína
A nuestro precipitado (proteína dinitrofenilada), se le realiza hidrolisis acida con HCL 6N, aplicando
temperatura alta donde el vapor se sobre calienta a 100 °C o más en realidad, la válvula nos indica
cuando hay que disminuir la temperatura, la presión debe ser 15 lbs/plg2 la cual nos indica el
manometro, siendo más de 1 atm la que tenemos y que estamos aumentando a nuestra muestra
dentro del sistema (autoclave).
Estas condiciones de hidrolisis son muy fuertes debido a que los enlaces peptídico tienen una
energía de enlace muy alta y para tener los aminoácidos libres ya no unidos por estos enlaces
peptídicos que se generan por la pérdida de una molécula de H2O, hidrolizamos para introducir
agua y generar el rompimiento del enlace, siendo uno de estos aminoácidos el que va a estar
unido con el reactivo de Sanger y poder proceder a reconocer el aminoácido con el grupo amino
marcado.
Se realiza la EXTRACCION DEL HIDROLIZADO con éter sin Sulfato ferroso , formando de nuevo 2
fases.
En la fase Acuosa tenemos los aminoácidos que no reaccionaron con el DNFB y los DNP derivados
no terminales los cuales son polares y constituyen a la proteína , esta fase se desecha y nos
quedamos con la FASE ETERA.
En la fase etérea se encuentra DNFB, el amino dinitrofenilado y nuestros derivados DNP marcados
con el grupo R de la Histidina, Tirosina y Lisina, ya que el DNFB reacciona con los grupos imidazol,
fenólico, épsilon-amino y son DNP-aminoácidos terminales no polares lo cual queda en esta fase y
pasamos a calentar para poder secar y eliminar éter.
IDENTIFICACION DEL RESIDUO N-terminal POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL
Realizamos la cromatografía en papel de nuestros derivados dinitrofenilados de la hemoglobina

disuelta en acetona ( ISIS NO RECUERDO SI FUE CON ACETONA O ALCOHOL ).
Una vez colocada la muestra se coloca en la cámara previamente saturada con el solvente, donde
en la parte inferior tenemos el disolvente que se está evaporando a temperatura ambiente.
Este vapor que genera el ácido cítrico y citrato impregna bien para saturarlo y así corra más rápido
nuestro cromatografía y se coloque el disolvente.
Marcamos los patrones del disolvente para calcular los RF´s, observando que nuestros
aminoácidos marcados con carácter apolar por el grupo R (benceno) corren en la cromatografía
muy poco, que el Rf de la DNP valina reportado en la literatura ____ es muy parecido a nuestra
muestra problema etéreo y acuoso.
(ISIS NO HE REVISADO CUAL ES EL DATO DE REFERENCIA, POR QUE A ESTO DE RF´S CASI NO LE
ENTENDI, ESTA PARTE DE LA DISCUSIÓN DE IDENTIFICACION POR CROMATOGRAMA, NO ESTOY
MUY SEGURA DE LO QUE PUSE, POR QUE ESO DIJO EL PROFE QUE SON LOS RESULTADOS QUE
DEBEMOS TENER, PERO EN REALIDAD NO SE SI ASI NOS SALIO EN NUESTRA CROMATOGRAFIA, LA
VERDAD NO SE INTERPRETAR MUY BIEN ESTO.)

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