Práctica 1

PRÁCTICA 1
TÉCNICA DE PIPETEO Y MICRODILUCIONES

COMPETENCIA
Utiliza material volumétrico empleado en microdiluciones dentro del laboratorio de
manera adecuada y responsable.
A- Manipulación de las micropipetas
CONTEXTUALIZACIÓN
Las micropipetas son dispositivos que se utilizan para medir o transvasar
pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran exactitud. Todas
las micropipetas de pistón disponen de puntas desechables para minimizar los
riesgos de contaminación. Para facilitar el uso del tipo de punta adecuado los
fabricantes han adoptado un código de color según el volumen a dispensar (Figura
1 y 2).
2‐200 µl Hasta 10 µl
100‐1000 µl
Figura 1. Puntas desechables

para micropipetas
Figura 2. Componentes de la micropipetas

OBJETIVOS
1. Conocer los componentes y los diferentes rangos de las micropipetas.
2. Realizar diluciones seriadas en tubos eppendorf para familiarizarse con el
uso de micropipetas.
3. Conocer y comprender el uso de las microdiluciones en el laboratorio de
química biológica.
INFORMACIÓN SUGERIDA PARA LA BITACORA

 Micropipetas
 Microdiluciones
 Diluciones seriadas
EQUIPOS Y MATERIALES.
 Micro pipeta de volumen variado de 2 a 50 µL
 Micro pipeta de volumen variado de 100 a 1000 µL
 Puntas desechables p/micropipetas.
 Tubos eppendorf de 1.5 ml.
 Solución de Azul brillante de Coomassie o azul de metileno
Instrucciones para el manejo de la micropipeta (Figura 2):
1. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el

volumen deseado y colocar una punta de plástico (adecuada) en la
punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen
ajuste.
2. Oprimir pistón con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo
introducir verticalmente la pipeta, hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm
dentro del líquido.
3. Liberar lentamente la presión sobre el pistón. Después de 2–3
segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta
contra la pared del recipiente.
4, 5 y 6. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere
colocar el líquido, presionar lentamente el pistón hasta el primer tope. Después
de un segundo, y sin soltar el pistón, terminar de vaciar la pipeta presionando
hasta el segundo tope.
7. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente y
descartar la punta de plástico.
Figura 2. Representación esquemática para el manejo de la micropipeta

PARA NO DAÑAR EL SISTEMA INTERNO DE PISTONES QUE POSEE LA
MICROPIPETA:
- El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta.
- Nunca posicione la micropipeta cargada con la punta hacia arriba.
- Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido.
- Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta.
Profundidad de inmersión de la punta

La profundidad de inmersión de la punta es especialmente importante en
el uso de volúmenes pequeños (Figura 4). Si la punta se sumerge demasiado,
se aspirará más líquido debido al aumento de la presión. Si por el contrario, la
punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes
burbujas y volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad adecuada
puede mejorar la precisión hasta un 5%.
Figura 4. Medidas de profundidad de inmersión

Uniformidad al pipetear
Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica adecuada al mover el
émbolo. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la
formación de aerosoles, salpicaduras y posible contaminación del eje y del
pistón, pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra. Una
velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión también hasta un 5%.
Ángulo de inmersión vertical

Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a
la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de líquido será más
pequeña y se aspirará demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el
líquido, la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del
vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de forma
vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º de ésta, puede
mejorar la precisión hasta en un 2,5%.
Técnica de dispensación
Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la
punta apoyado contra la pared del recipiente. Así se reduce o elimina el hecho
de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la
dispensación. Retirar la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por
la pared lateral para liberar cualquier líquido restante en el orificio de la punta.
Esta técnica puede mejorar la precisión hasta en un 1%.
Otra técnica consiste en emitir directamente en la superficie del líquido. Si se
dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la pipeta
manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de muestra después de
la dispensación.
Utilización de una pipeta adecuada para el volumen que se aspira
Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen máximo de la

pipeta. Seguir este consejo puede hacernos mejorar los resultados hasta en
un 1%. Cometemos mayor error trabajando por debajo del 10% del volumen
máximo de la pipeta que estamos utilizando.
PROCESO.
De manera individual realizar el siguiente procedimiento:
1. Reconocer del rango de volumen permitido por cada micropipeta.
2. En un tubo eppendorf, preparar una solución original 1:5 de colorante (con
volumen final de 500 µl, esto es: una parte de colorante más 4 partes de
diluyente)
3. Realizar una dilución doble seriada en 3, partiendo de la solución original
1:5.
Dilución Dilución doble seriada

original 1 2 3
1:5 1:10 1:20 1:40
X2 X2 X2 Factor de
dilución
A) con un volumen final de 250 µl.

1. Disponer de tres tubos eppendorf en la gradilla y rotularlos con su
número correspondiente
2. Añadir a cada tubo 250 µl del diluyente.
3. Tomar 250 µl de la solución original (1:5), depositarla en el primer tubo y
homogenizar sin burbujear.
4. Tomar del tubo 1 250 µl de la dilución y transferirla al segundo tubo,
homogenizar y repetir el procedimiento con el tubo 3 y al final desechar
250 µl del tubo 3.

original 1 2 3
Solución de 100 µl
“Principio activo”
Diluyente 400 µl 250 µl 250 µl 250 µl
Volumen de 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl
Transferencia
Dilución lograda 1:5 1:10 1:20 1:40
Volumen final 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl
B) con un volumen final de 300 µl.

1. En un tubo eppendorf, preparar una solución original 1:5 de colorante
(con volumen final de 600 µl, esto es: una parte de colorante más 4
partes de diluyente)
2. Disponer de tres tubos eppendorf en la gradilla y rotularlos con su
número correspondiente
3. Añadir a cada tubo 300 µl del diluyente
4. Tomar 300 µl de la solución original (1:5), depositarla en el primer
tubo y homogenizar sin burbujear.
5. Tomar del tubo uno 300 µl de la dilución y transferirla al segundo
tubo, homogenizar y repetir el procedimiento con el tubo 3 y al final
desechar 300 µl del tubo 3.
original 1 2 3
Solución de 120 µl
Transferencia
3. siguiendo los ejemplos anteriores, ahora realizar una dilución quíntuple seriada
en 4, partiendo de una dilución de 1:5.
Dilución Dilucion doble seriada

original 1 2 3 4
1:5 1:25 1:125 1:625 1:3125
X5 X5 X5 X5 Factor de
dilución
A) con un volumen final de 240 µl.

original 1 2 3
Solución de 60 µl
Transferencia
4. siguiendo los ejemplos anteriores, ahora realizar una dilución seriada
logarítmica decimal en 5, partiendo de una dilución
de 10 µg/ml.
Dilución seriada logarítmica decimal
1 2 3 4 5
1:10 1:100 1:1000 1:10,000 1:100,000
ó ó ó ó ó
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
X 10 X 10 X 10 X 10 Factor de
dilución
A) con un volumen final de 1000 µl (1 ml).
Dilución logarítmica 1:10 1:100 1:1000 1:10,000 1:100,000

decimal
Solución original 100 µl
10 µg/ml
Diluyente 900 µl
Volumen de 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl cero
Transferencia
Volumen final 900 µl 900 µl 900 µl 900 µl 1 ml
Factor de dilución X 10 X 10 X 10 X 10 X 10
¿Cada ml 1000 100 10 1 µg/ml. 0.1
contiene? µg/ml. µg/ml. µg/ml. µg/ml.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Galileo, la ciencia a tu alcance. Uso correcto de la micropipeta. Consultado el

13 de julio de 2015.
https://www.labmerchant.com/cmsAdmin/uploads/uso-correcto-
icropipetas_001.pdf
[2] Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72:248-54
[3] Bollag, D. M., Rozycki, M. D. y Edelstein S. J. (1996) Protein Method, Segunda
Edición,WileyLiss, Inc., New York.

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A- Manipulación de las micropipetas

Figura 1. Puntas desechables

Figura 2. Componentes de la micropipetas

INFORMACIÓN SUGERIDA PARA LA BITACORA

Instrucciones para el manejo de la micropipeta (Figura 2):

1. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el

Figura 2. Representación esquemática para el manejo de la micropipeta

- El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta.

- Nunca posicione la micropipeta cargada con la punta hacia arriba.

- Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido.

- Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta.

Profundidad de inmersión de la punta

Figura 4. Medidas de profundidad de inmersión

Ángulo de inmersión vertical

Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen máximo de la

Dilución Dilución doble seriada

A) con un volumen final de 250 µl.

Dilución Dilución doble seriada

B) con un volumen final de 300 µl.

Dilución Dilucion doble seriada

A) con un volumen final de 240 µl.

A) con un volumen final de 1000 µl (1 ml).

Dilución logarítmica 1:10 1:100 1:1000 1:10,000 1:100,000

[1] Galileo, la ciencia a tu alcance. Uso correcto de la micropipeta. Consultado el

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