UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA

DE MÉXICO
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PARTE III

ACEVES HERNÁNDEZ BRISELDA

GARCÍA MARTÍNEZ TANIA
MARTÍNEZ BURGOS JOSÉ MIGUEL
ROMERO CARRASCO JOSÉ MANUEL
 Medio de cultivo: medio de fenilalanina

Composición:

1. D-L-fenilalanina
2. Extracto de levadura
3. Cloruro de sodio
4. Fosfato de sodio
5. Agar
6. Agua destilada
7. pH inicial = 7.3
• Determina la capacidad de un organismo de desaminar la
fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad
enzimática, con la consiguiente acidez resultante.

• El aminoácido aromático fenilalanina sufre una

desaminación oxidativa catalizada por un aminoácido
oxidasa para producir el ácido cetónico.

• La desaminación oxidativa da como resultado la

extracción del grupo amino del aminoácido para formar un
doble enlace alfa-cetoácido y libre de amoniaco.

• Este es un proceso en dos etapas:

1. La extracción del hidrógeno dando un aminoácido y un
hidrógeno, se combina con el oxígeno para formar agua.
2. El aminoácido es hidrolizado en un cetoácido.
 CH2 CH COOH

- 2H
NH2 + 1/2 O
FLAVOPROTEÍNA

FENILALANINA

CH2 C COOH

O
+ NH3

AMONIACO

ÁCIDO FENILPIRÚVICO
• Como la fenilalanina se encuentra desaminada, el color producido como
consecuencia del agregado de cloruro férrico al 10% se debe a la formación
de un cetoácido, el ácido fenilpirúvico.

• La reacción positiva con este reactivo se debe a la formación de una

hidrazona. El cloruro férrico actúa como agente quelante actuando con el
ácido fenilpirúvico para formar un color verde.

• Cuando se expone al oxígeno atmosférico un tubo de cultivo con fenilalanina

después del agregar el cloruro férrico aumenta la producción y la intensidad
de la reacción positiva.

C COOH CH2 C COOH

CH2

N NHR
O + RNH - NH2

Hidracina
Ácido Fenilhidrazona
fenilpirúvico
• Consistencia del medio Reactivos adicionales

Sólido en pico de flauta Cloruro férrico 10%

• Adicionar de 4-5 gotas a un

• Inoculación tubo incubado

Estría en pico de flauta, • Hacer rotar suavemente el

inóculo denso. tubo para que el crecimiento
se separe.
• Condiciones de
incubación • Esperar de 1 a 5 minutos para
leer la reacción
Tiempo: 18 - 24 horas • Guardar los reactivos en
Temperatura 35 - 37 ° C refrigeración y colocarlos en
frascos oscuros para evitar la
descomposición.
 NEGATIVO

MEDIO NO POSITIVO
INOCULADO

NEGATIVO
• Interpretación • Aplicaciones
Esta actividad enzimática es
Positiva: Verde claro a intenso característica de todas las
en el pico de flauta. especies de Proteus y del
grupo Providencia, y se usa
para separar estos dos
Negativo: Amarillo géneros de otros miembros de
las Enterobacterias

• Reporte de resultados

Positivo (+)

Negativo(-)
Medio de cultivo: Medio SIM

Composición:
• Extracto de carne
• Peptona
• Hierro peptonizado (Indicador
de SH2)
• Tiosulfato de sodio (indicador
de SH2)
• Agar
• Agua destilada
• pH = 7.3
• Prueba de ácido sulfhídrico
La proteolisis de las proteínas en aminoácidos (aa.) individuales, algunas especies
bacterianas son capaces de liberar azufre enzimaticamente de los diferentes aa. que las
contienen, produciendo el gas ácido sulfhídrico (SH2). La peptona, cisteína y tiosulfato,
todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o
aa. que contienen azufre para producir SH2. La enzima responsable de esta actividad es
la cisteinasa.

• Primera etapa
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de
reducción que da un sulfito y un sulfato. Este es un proceso de respiración anaeróbica
donde el átomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidación de los
sustratos orgánicos. El tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es
una fuente de azufre para el organismo.

• Segunda etapa
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para
producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso.

Bacteria (medio ácido) + tiosulfato de sodio gas SH2

SH2 + iones férricos sulfuro ferroso (pp. negro)

• El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias
para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético.
Diversas enzimas intracelulares que intervienen en éste proceso reciben el
nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo de enzimas
vinculadas con la producción del indol. El principal intermediario en la
degradación del triptófano es el ácido indolpírúvico.

• La degradación del triptófano libera indol, ácido pirúvico, amoniaco y

energía. El ácido pirúvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del
ciclo glucolítico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una
gran producción de energía. El NH3 puede ser utilizado para sintetizar
nuevos aminoácidos empleando la energía que se encuentra para la reacción
anabólica.

• La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos

capaces de fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida
por la fermentación de la glucosa puede impedir el crecimiento del
organismo o inhibir la enzima. El agregado de triptófano estimula la
producción de indol mientras que la glucosa la inhibe.
• La prueba de indol se basa en la formación de un complejo de
color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído de p-
dimetilaminobenzaldehído (sustancia activa del reactivo de
Kovacs).
C O O H

N H 2 T rip to fa n a s a
N H 2O
H D e s a m in a c ió n

L - T rip tó fa n o

+ + N H 3
H 3 C C O O H
N
H

In d o l Á c id o P irú v ic o A m o n ia c o
 Xileno
P-dimetilaminobenzaldehído
Color rojo

INDOL
PIRUVATO NH3

TRIPTÓFANO
Triptofanasa

BACTERIAS
 • Determina si un organismo es
móvil o inmóvil. Las bacterias
tienen movilidad por medio de sus
flagelos, que se encuentran
principalmente entre los bacilos;
sin embargo algunas formas de
cocos son inmóviles.

• Las bacterias móviles pueden

contener un solo flagelo o muchos;
Motricas Atricas además su localización varía con
su especie bacteriana y las
condiciones de cultivo.

• A veces, las bacterias con

movilidad producen variantes no
móviles que parecen ser estables y
raramente se revierten en formas
móviles. Los organismos no
móviles carecen de flagelos.

Lofotricas Peritricas
Medios para la detección Medios para la detección
de H2S de movilidad

• Agar sulfito de bismuto

• SIM
• Agar citrato sulfuro
• Agar desoxicolato-citrato • MIO
• Medio LIA
• Medio TSI
• Agar acetato de plomo
• Agar S-S
• Agar XLD
• Medio SIM
• Consistencia del medio
Semisólido en forma vertical

• Inoculación
Picadura en forma vertical
Salmonella typhimurium, tinción de Gram.

• Condiciones de
incubación
Tiempo: 24 - 48 horas
Temperatura 35 - 37° C

Los cultivos que van a someterse a pruebas

de indol deberán ser incubados
aeróbicamente el descenso de la tensión de Klebsiella pneumoniae en sedimento,
oxígeno disminuye la producción de indol. tinción de Gram
• Reactivo de Kovacs
Composición:
a) Alcohol amílico
b) p-dimetilaminobenzaldehído
c) HCl

• Adicionar 5 gotas directamente al tubo

después de la incubación.
• Agitar suavemente
• Leer inmediatamente la reacción
 H2S NEGATIVO H2S POSITIVO

MEDIO SIN INDOL INDOL

INOCULAR NEGATIVO POSITIVO
GAS MOVILIDAD
• Ácido sulfhídrico
Positivo: Ennegrecimiento del medio
Negativo: Sin ennegrecimiento Streptococcus
pneumoniae: las
cápsulas se observan de
• Indol color blanco.
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio.
Negativa: No se produce color
Negativa: Color naranja en la superficie del medio. Indica desarrollo de
escatol, un compuesto metilado que puede ser el precursor de la formación
de indol.

La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa.

Si el cultivo de 24 horas es negativo deberá incubarse otras 24 horas y
repetirse la prueba.

• Movilidad
Positiva. Los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden
en el medio provocando turbiedad.
Negativa. Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.
Bacteria Producción Producción Movilidad
de H2S de indol
Salmonella +o- - +
thypi
Salmonella +o- - +
sp.
E. coli - + +o-
Klebsiella - +o- -
Enterobacter - - +
Citrobacter + - +
Shigella +o- +o- +o-
 Medio de cultivo: base de descarboxilasa de Moller
Crecimiento de Pseudomona
Composición: aeruginosa en agar sangre.University
1. Peptona of Missouri-Columbia,1998:
2. Extracto de carne
3. Piridoxal
4. L-lisina
5. Citrato de amonio
6. Tiosulfato de sodio
7. Glucosa
8. Agua destilada
9. Agar
10. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol
Ácido: color amarillo (pH = 5.2)
Alcalino: color púrpura (pH = 6.8)
Medio no inoculado: color púrpura intenso
brillante (pH = 6.0)
• Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un
aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina, con la
consiguiente alcalinidad.

• La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias que

poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a
los aminoácidos en su grupo carboxilo dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico. La descomposición de los
aminoácidos se produce anaeróbicamente. El proceso de
descarboxilación es irreversible, no oxidativo y requiere una
coenzima común, el fosfato de piridoxal.

• El aminoácido L-lisina sufre la descarboxilación para dar cadaverina

y CO2 por acción de la enzima específica lisina-descarboxilasa.

• El aminoácido L-arginina es catabolizado a través de dos sistemas

que pueden ocurrir simultánea o separadamente. Estos sistemas
son de arginina deshidrolasa y arginina descarboxilasa.
• Consistencia del
medio
Sólido en pico de flauta

• Inoculación
Por picadura y estría,
inóculo liviano

• Condiciones de Superficie de placa de agar EMB que ilustra el brillo verde

producido por miembros de Enterobacterias fermentadoras de
incubación lactosa, como Escherichia coli.

Temperatura: 35 – 37°C
Tiempo: 18 – 24 horas
• K/K = azul de Prusia /azul de Prusia
Desaminación oxidativa / descarboxilación
• K/A= azul de prusia / lila
No desaminación
• Producción de H2S = Ennegrecimiento del medio
• Producción de gas = Burbujas o levantamiento del
medio del tubo.
• A = Ácido
• K = Alcalino
• N = Neutra
• R = Rojo
(desaminación
oxidativa) Encarta, 2002
 K/K

H2S

K/A

GAS

MEDIO PRODUCCIÓN DE K/K

H2S
NO INOCULADO
Especie Superficie Fondo Gas H2S
bacteriana inclinada
E. coli K KoN -o+ -
Shigella K A - -
Salmonella K K - +o-
thypi
S. parathipy K A +o- -o+
Otras K KoN - +
Salmonellas
Arizona K KoN - +
Citrobacter K A -o+ +o-
Edwarsiella K K - o+ +
Klebsiella K K oN +o- -
Enterobacter K A +o- -
cloacae
E. aerogenes K KoN + -
E. hafniae K KoN -o+ -
Proteus R A - -
vulgaris
P. mirabilis R A - -
P. morganii KoR A - -
P. rettgeri R A - -
Providencia R A - -
 AGAR HIERRO DE KLIGER (KIA)
COMPOSICIÓN

Extracto de carne 3g
Extracto de levadura 3g
Peptona 15 g
Lactosa 10 g
Glucosa (Dextrosa) 1g
Citrato de amonio férrico 0.5 g
Cloruro de sodio 5g
Tiosulfato de sodio 0.3 g
Rojo de Fenol 0.024 g
Medio no inoculado: anaranjado rojizo (pH = 7.4)
Ácido: amarillo
Alcalino: rojo
 PRINCIPIO

• Determinar la capacidad de un
microorganismo para:
• A) Fermentar un carbohidrato específico
incorporado en un medio de desarrollo
basal .
• B) Producir gas
• C) Producir H2S gaseoso
 BIOQUÍMICA
• La fermentación tiene lugar en aerobiosis como en
anaerobiosis.
• En el pico de flauta la glucosa es catabolizada inicialmente
por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, para producir ácido
pirúvico.
• b- galactosidasa
• Lactosa glucosa + lactosa
• EMP
• Glucosa o galactosa ácido pirúvico
• ciclo de Krebbs
• Ácido pirúvico CO2 + H2O + energía
• aerobio
 BIOQUÍMICA

• En el fondo se metaboliza por la vía de EMP a ATP y

ácido pirúvico, que luego se convierte en los
productos finales estables

• Glucosa ácidos orgánicos

Aldehídos
glucosa Alcoholes
CO2 + H2
 FORMACIÓN DE H2S
• PASO 1

Bacteria + tiosulfato de sodio H2S gaseoso

(en ambiente
ácido)

PASO 2

H2S + iones férricos sulfuro ferroso

precipitado negro insoluble
• CONSISTENCIA DEL MEDIO
Sólido en pico de flauta

• INOCULACIÓN
• Picadura y estría en pico de flauta

• CONDICIONES DE INCUBACIÓN
Tiempo: 18 - 24 horas
Temperatura: 35 - 37 ° C
RESULTADOS INTERPRETACIÓN
1.- Rojo en pico de flauta:
alcalino; degradación aeróbica
de glucosa
Amarillo en capa profunda:
ácido; degradación anaeróbica
de la glucosa

REPORTE DE
RESULTADOS
1.- K / A (Fermentación de
glucosa)

MEDIO
1)
NO INOCULADO
K/A
RESULTADOS INTERPRETACIÓN

2.- Amarillo en pico: ácido

Amarillo en capa profunda: ácido

3. Rojo en pico de flauta: alcalino

Sin cambio de color en capa
profunda: alcalina.

REPORTE DE
RESULTADOS
2.- A/A (Fermentación de glucosa y
lactosa)

3.- K/K (No fermentación de glucosa

y lactosa) ó
K/ sin cambios (No fermentación
2) 3) de glucosa y lactosa)
A/A K/K
RESULTADOS INTERPRETACIÓN
PRODUCCIÓN DE H2S.
Hay presencia de precipitado negro,
diseminación del color negro en
el fondo, anillo negro en la parte
superior del fondo.
PRODUCCIÓN DE GAS (CO2 y H2)
A) AERÓGENO: presencia de
burbujas fragmentación o
desplazamiento.
B) ANAERÓGENO. No produce gas.

REPORTE DE
RESULTADOS
K/A; gas; H2S
H2S GAS
K/K; gas
• Las reacciones en el medio KIA se usa para
identificar a los miembros de la familia
Enterobacteriacea (entéricos), estos son
gram negativos, catalasa positivos.

• Ya que estos fermentan la glucosa con

producción de ácido.