Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Ing. Geológica, Minera, Metalúrgica, Geográfica y Civil

E.A.P: INGENIERÍA METALÚRGICA

Informe N°2 del laboratorio de Biometalurgia

PROFESOR DEL CURSO:

ARIAS ARCE VLADIMIR ALEJANDRO

ALUMNO:
ATENCIA ZORRILLA DICK WAYDER

2019
 ENSAYOS DE CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS

Objetivos
• Comparar las ventajas y desventajas de cada una en función de la información que
se obtiene, del tiempo invertido y de los recursos necesarios.

 Conocer algunas de las técnicas de cuantificación directa e indirecta de

microorganismos más utilizadas.

Introducción
Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de células
microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los
directos se pueden mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de
células en cámara de Neubauer. El método de cuenta directa en cámara tiene la
ventaja de ser muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las células
viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una muestra
a partir del volumen de la cámara y de las diluciones, de la muestra que sean
necesarias. Entre los método indirectos, uno de los más utilizados es la medición de la
turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativamente rápida y que se
basa en la capacidad de las células microbianas de dispersar la luz que incide sobre
éstas. Como el tamaño de las células en una población es casi constante, el grado de
dispersión es proporcional a la concentración de células presentes pero no se puede
diferenciar la turbidez dada por células viables y no viables. La forma de cuantificar
células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer diluciones y cuenta en
placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Esta técnica se
basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su
superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, considerando la dilución.
Técnica turbidimétrica
 Encender el aparato y dejar que el Instrumento se caliente por 15 minutos.
 Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm).
 Calibrar el instrumento a 0% de trasmitancía con el botón izquierdo. Para leer
en la escala, observar la aguja a nivel de los ojos y tornar el dato donde la
aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.
 Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y
calibrar el instrumento a 100% de trasmitancía.
 Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar
perfectamente con papel suave y medir el valor de %T. 6. Calcule la
absorbancia de la fórmula A= -log (%T/100) 7. En caso de disponer de un
aparato digital ajustar las mediciones de absorbancia (D.O.).
 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer
 Se coloca 1 ml. de la muestra en un tubo de ensaye. En caso requiera dilución,
será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica.
Agregar 0.5 ml de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina.
 Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del
centro y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre
 la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una
zona cuadriculada a simple vista.
 Homogeneizar perfectamente la muestra en un vortex, tomar inmediatamente
una muestra con una pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la
cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar que la muestra se
distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación
precisa de la población microbiana.
 Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del
microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10X) la zona cuadriculada
que se muestra en la figura
 Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se
encuentra dividido en 5X5 cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que
miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su vez se encuentran
divididos en 16 cuadros más pequeños (C3) de 0.05 mm de lado.
 Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el
número de células que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor
tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde la parte
superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si te células tocan los
límites de tos cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la
parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior
o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de
contar la misma célula dos veces.
 Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de
células por ml.
 Factor de 104 por el cual se debe multiplica el número de células por cuadro
grande (C1) es porque este cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm3 (mide
1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1mm).
Técnica de dilución y siembra en placa
 Hacer diluciones decimales del cultivo de 10-3 hasta 10-6 en condiciones
estériles (Figura 8). Se colocaron en cajas de Petri con agar nutritivo por
duplicado 0.1 ml de las últimas tres diluciones.
 Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de
vidrio doblada en "L” previamente esterilizada a la flama del mechero y
enfriada.
 Dejar absorber el líquido durante 10 minutos
 Incubar las cajas en forma invertida a 35°'C durante 24-48 horas para bacterias
y levaduras y de 5-7 días para hongos filamentosos.
 Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilución donde
el número de colonias sea entre 30 y 300.
 Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio
de colonias por dilución y este número se multiplicara por el inverso de la
dilución X10 (por ajuste de volumen inoculado) para obtener el número total de
unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en la muestra original.
 CUESTIONARIO
1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa
en cámara de Neubauer para la cuantificación de microorganismos.
Esta cámara de recuento está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste
de fases. Se trata de una porta objetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en
cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones
conocidas. Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión
superficial (en especial una vez que se haya añadido la muestra líquida).
Luego se introduce por capilaridad entre la cámara y el cubre, el líquido con las células a
contar, generalmente tras una dilución previa; la cámara tiene dos zonas lo que permite
hacer dos recuentos simultáneamente. Se observa la retícula al microscopio con el
aumento adecuado y se cuentan las células.
A partir del número de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el
campo de la retícula, se calcula la concentración de células en la muestra líquida aplicada

2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico

de cuantificación de células.
Esta metodología tiene la ventaja de tener un buen límite de detección, sin embargo
consume mucho tiempo durante los plaqueos; en el caso de realizar el recuento de
bacterias a partir de muestras cuya población se desconoce se requiere realizar el
extendido de 7 diluciones y la muestra original (para cada conteo) lo que significa
consumir 8 placas de cultivo y alrededor de 25 minutos para los plaqueos, sin tomar en
consideración repeticiones. Para disminuir el tiempo de procesamiento de muestra, la
metodología ha sufrido modificaciones al paso del tiempo y en la actualidad se usan
bolitas de acrílico en lugar de un asa de vidrio para extender las muestras.
La única desventaja es que hay que tener un buen manejo de la pipeta multicanal a la
hora de dispensar en el medio de cultivo pues de otra forma el goteo podría mezclarse
con diluciones vecinas. La dispensación de cada una de las diluciones implica la toma
de puntas con la pipeta multicanal, la absorción de muestra y su colocación en el
medio de cultivo.
3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las
técnicas de cuantificación realizadas.

 Técnicas en cámara de Neubauer

-Medicina
-Biología

 Técnicas de dilución y siembra de placa

-Medicina
-Biología
 CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

Objetivos

 Conocer las fases de una curva de crecimiento en un cultivo de bacterias.

 Aprender a calcular parámetros cinéticos (u, t&) característicos de las especies

bacterianas.

Introducción
En un sistema biológico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las
estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Según ello, el aumento de
la masa celular producido por acumulación de productos de reserva (glucógeno,
poliβhidroxibutirato) no constituyen crecimiento. Se puede considerar como
crecimiento al incremento de células individuales por un lado, y por otro lado se puede
considerar al crecimiento del número de células (proliferación de la población). En lo
que se refiere al crecimiento de células individuales, este consiste en el aumento del
tamaño y peso de las células que precede a la división celular. Esta división trae
aparejada un aumento en el número de células (proliferación de la población). Las
bacterias se dividen por fisión binaria, a través de la una cual célula madre al alcanzar
un determinado volumen se divide dando dos células hijas. El proceso de fisión binaria
consiste en la autoduplicación del material hereditario seguido de la repartición en las
dos células hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y
formación de la pared celular
Ciclo normal del crecimiento Las poblaciones microbianas raramente mantienen un
crecimiento exponencial prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estaría
tapada de una masa microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento está
normalmente limitado por el agotamiento de nutrientes o por la acumulación de
productos del mismo metabolismo microbiano, que les son tóxicos a la población. La
consecuencia es que el crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta
detenerse. En la figura 4 se presenta la gráfica de una curva típica de crecimiento
bacteriana. Como se puede observar, en la gráfica se ha relacionado el tiempo
transcurrido con el logaritmo del número de células bacterianas. Cuando se realiza
este tipo de gráficas se obtiene una línea recta, sin embargo en esta sólo un sector
(fase exponencial) corresponde a una recta.
Es posible distinguir cuatro fases: 1) fase de latencia o de retardo 2) fase exponencial
3) fase estacionaria 4) fase de muerte En la fase de latencia existe un aparente reposo
en el que las células sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metabólica
que deben llevar adelante. Cuando se hacen mediciones del número de células en
distintos tiempos dentro de esta fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio,
interiormente las células trabajan activamente adaptando el equipo enzimático al
medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso de los nutrientes que este
medio le aporta, por lo tanto es la fase de adaptación al medio, con aumento de la
masa celular pero no del número de células. La edad del inóculo va a influir en el
tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulación de materiales tóxicos y
a la falta de nutrientes esenciales dentro de la célula durante el crecimiento anterior.
En general, inóculos viejos alargan la fase de latencia.
Pasado este período, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento
exponencial, donde la velocidad de crecimiento es máxima. La velocidad de
crecimiento que alcanza un cultivo, depende del tipo de microorganismo que se trate y
diversos factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenación, etc. La
velocidad de crecimiento comenzará a disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la
fase estacionaria, ya que cambios en la composición y concentración de nutrientes
entre el cultivo del inóculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la
regulación de la actividad enzimática. Esta fase se presenta por agotamiento del
suministro de algún nutriente esencial o por acumulación de productos metabólicos
que sean tóxicos. También puede ser por la disminución de la oxigenación o cambios
en las condiciones de pH del medio de cultivo (acidificación o alcalinización): En esta
fase se equilibran el número de células nuevas con el número de células que mueren.
Por último, el cultivo entra en la fase de muerte, en la que el número de células que
mueren se va haciendo mayor. Cátedra
La pendiente de esta fase puede ser más o menos pronunciada de acuerdo al tipo de
microorganismo de que se trate. Suelen presentarse pendientes menos bruscas
cuando el microorganismo presenta alguna forma de resistencia (esporas, glicocalix).
 CUESTIONARIO
1. ¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos
a nivel celular que ocurren en cada una de las etapas de crecimiento?

El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria en dos células hijas en

un proceso llamado fisión binaria. Suponiendo que no se produzca ningún caso
de mutación las células hijas resultantes serán genéticamente idénticas a la
célula original. De este modo tiene lugar la "duplicación local" de la población
bacteriana. Las dos células hijas creadas tras la división no sobreviven
necesariamente. Sin embargo, si el número de supervivientes supera la unidad,
en promedio, la población bacteriana experimenta un crecimiento exponencial.
La medición de una curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un
cultivo ha sido tradicionalmente una parte de la formación de todos
los microbiólogos.

2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución

o eliminación de la fase lag. ¿Qué condiciones la incrementaría?

Si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la

fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros
constituyentes de las células son bajos, y las células deben reponerlos en el
medio fresco.
Necesidad de neutralizar sustancias tóxicas en el medio fresco.
Porque se produce dilución de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las
bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar
una concentración de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, éste no
“arranca”.